Summary
Här presenteras metoder för att förstå anti-cancer effekter av Lactobacillus cell-free supernatant (LCFS). Kolorektal cancer cellinjer visar celldöd när behandlas med LCFS i 3D kulturer. Processen att generera sfäroider kan optimeras beroende på byggnadsställningen och de analysmetoder som presenteras är användbara för att utvärdera de involverade signalvägarna.
Abstract
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att utvärdera cancercellsdödsfall i tredimensionella (3D) sfäroider av multicellulära typer av cancerceller med hjälp av supernatanter från Lactobacillus fermentumcellkultur , som betraktas som probiotikakulturer. Användningen av 3D-kulturer för att testa Lactobacillus cellfria supernatant (LCFS) är ett bättre alternativ än att testa i 2D-monoskikt, särskilt som L. fermentum kan producera anti-cancereffekter i tarmen. L. fermentum supernatant identifierades att ha ökade anti-proliferative effekter mot flera kolorektal cancer (CRC) celler i 3D kultur villkor. Intressant nog var dessa effekter starkt relaterade till kulturmodellen, vilket visar den anmärkningsvärda förmågan hos L. fermentum att inducera cancercelldöd. Stabila sfäroider genererades från olika CRCs (kolorektal cancerceller) med hjälp av protokollet som presenteras nedan. Detta protokoll för att generera 3D-sfäroid är tidsbesparande och kostnadseffektivt. Detta system utvecklades för att enkelt undersöka anti-cancer effekter av LCFS i flera typer av CRC sfäroider. Som förväntat inducerade CRC sfäroider med LCFS starkt celldöd under experimentet och uttryckte specifika apoptos molekylära markörer som analyseras av qRT-PCR, western blotting och FACS analys. Därför är denna metod värdefull för att utforska cellens livskraft och utvärdera effekten av anti-cancerläkemedel.
Introduction
Probiotika är de mest fördelaktiga mikroorganismerna i tarmen som förbättrar immunhomeostas och värdenergimetabolism1. Probiotika från Lactobacillus och Bifidobacterium är de mest avancerade i sitt slag som finns i tarmarna2,3. Tidigare undersökningar har visat att Lactobacillus har hämmande och antiproliferativa effekter på flera cancerformer, inklusive kolorektal cancer4. Dessutom förhindrar probiotika inflammatoriska tarmsjukdomar, Crohns sjukdom och ulcerös kolit5,6. De flesta studier med probiotika utfördes dock i tvådimensionella (2D) monoskikt som odlas på fasta ytor.
Artificiella odlingssystem saknar miljöegenskaper, vilket inte är naturligt för cancerceller. För att övervinna denna begränsning har tredimensionella (3D) odlingssystem utvecklats7,8. Cancerceller i 3D visar förbättringar när det gäller grundläggande biologiska mekanismer, såsom cell livskraft, spridning, morfologi, cellcellskommunikation, läkemedelskänslighet och in vivo relevans9,10. Dessutom är sfäroider gjorda av multicellulära typer av kolorektal cancer och är beroende av cellcellsinteraktioner och den extracellulära matrisen (ECM)11. Vår tidigare studie har rapporterat att probiotiska cellfria supernatant (CFS) som produceras med Lactobacillus fermentum visade anti-cancer effekter på 3D kulturer av kolorektal cancer (CRC) celler12. Vi föreslog att CFS är en lämplig alternativ strategi för att testa probiotiska effekter på 3D-sfäroider12.
Här presenterar vi ett tillvägagångssätt som kan rymma multicellulära typer av 3D-kolorektal cancer för analys av terapeutiska effekter av probiotiskt cellfritt supernatant (CFS) på flera 3D-kolorektal cancer mimicry system. Denna metod ger ett sätt att analysera relaterade probiotiska och anti-cancer effekter in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriella cellkulturer och beredning av Lactobacillus cellfri supernatant (LCFS)
OBS: Steg 1.2 – 1.9 utförs i en anaerob kammare.
- Förbered en MRS agarplatta och buljong som innehåller L-cystein och sterilisera genom autoklavering.
- Förinkubera MRS-agarplattan i H2 anaerob kammare som hålls vid 37 °C med 20 ppm syre.
- Tina lactobacillus bakterielager och inokulera agarplattan med bakteriekulturen (Figur 1A i).
- Inkubera bakterier i 2- 3 dagar i H2 anaerob kammare vid 37 °C och 20 ppm syre tills enstaka bakteriekolonier erhålls.
- Tvätta och torka hungate typ aneroba odlingsrör. Autoklav odlingsröret vid 121 °C i 15 min.
- Inkubera sedan röret i H2 anaerob kammare vid 37 °C och 20 ppm syre för att avlägsna syre.
- Placera 2 - 3 ml MRS-buljong i röret. Försegla röret med en butylgummipropp och skruva på locket.
- Skaffa en enda koloni med en slinga och placera den i odlingsröret på 1,5 ml med 500 μL 1x PBS. (Figur 1A ii).
- Suspendera kolonin med en 1 ml spruta (figur 1A (iii). Gör detta genom att sätta in nålen på 1 ml-sprutan i mitten av rörlocket, aspirera den upphängda kolonin och sedan återanvända den i MRS-buljongmedierna. (Figur 1A iv).
- Inkubera MRS-buljongmedierna i en shakerinkubator i 2 dagar (37 °C, 5 % CO2, 200 varv/min).
- Mät den optiska densiteten (OD) med hjälp av en spektrofotometer för att övervaka bakteriella tillväxtkurvor tills absorbansen vid OD620 når till 2,0.
- Separera bakteriepellets och konditionerade medier genom att centrifugera vid 1 000 x g i 15 minuter. Tvätta de insamlade bakteriepelletsna med 1x PBS och återanvänd i 4 ml RPMI 1640 kompletterat med 10% fetala nötkreatursserum. Ta inte med antibiotika i mediet.
- Håll bakteriepelletsen i RPMI och inkubera i en shakerinkubator i 4 timmar vid 37 °C med 5 % CO2 med en hastighet av 100 varv/min.
- För beredning av det probiotiska supernatanten, ta bort bakteriepelleten via centrifugering vid 1000 x g, i 15 min vid 4 °C. Sterilfiltrering av det återvunna supernatanten med ett filter på 0,22 μm och förvara vid −80 °C tills det används.
2. Generering av sfäroider
-
Förbereda kolorektal cancer cellinjer
- Odla DLD-1, HT-29 och WiDr cellinjer som monolayers tills 70-80% sammanflöde och inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator (Tillväxtmedium: RPMI som innehåller 10% fetala nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin).
- För celler som odlas i 100 mm Petri-skål, tvätta plattan två gånger med 4 ml 1x PBS. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin-EDTA och inkubera Petri-skålen i 2 min vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator för att skilja cellerna åt.
- Efter inkubation, kontrollera cellen dissociation under ett mikroskop och neutralisera trypsin-EDTA med 5 ml tillväxtmedium.
- Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör på 15 ml och centrifugera i 3 min vid 300 x g.
- Kassera supernaten och återanvänd försiktigt med 3 ml tillväxtmedier.
- Räkna cellerna med trypanblått för att bestämma livskraftiga celler med hjälp av en hemocytometer. (Figur 1B i)
-
Sfäroidbildning
- Späd cellerna från 2,1,5 för att erhålla 1 - 2 x 10 5 celler/ml (figur 1B ii)i ett koniskt rör på 15 ml
- Tillsätt den slutliga koncentrationen på 0,6% metylcellulosa till cellfjädringen och överför de utspädda cellerna till en steril behållare.
OBS: För varje cellinje bör mängden metylcellulosa som behövs titreras och bestämmas i enlighet därmed. - Använd en flerkanalspipett för att dela ut 200 μL celler till varje brunn i en ultralåg fastsättning 96-brunns rund bottenmikroplatta. (Figur 1B iii)
- Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator i 24 - 36 h.
- Efter 24 - 36 timmar, observera plattan under ett lätt mikroskop för att säkerställa sfäroidbildning.
3. Behandling av 3D-kolorektalcancerceller med LCFS
- Generera sfäroider enligt beskrivningen i steg 2 och 3.
- Innan du utför LCFS-behandlingen, tina den frysta LCFS vid rumstemperatur (RT) i 10- 20 min.
- Inokulera LCFS-stamlösningen till ett tillväxtmedium. Seriellt utspädd till 25%, 12,5% och 6% i tillväxtmediet (dvs. 25% LCFS = 150 μL tillväxtmedium + 50 μL LCFS).
- Ta ut cellkulturplattan som innehåller sfäroider från inkubatorn och ta bort så mycket av tillväxtmediet som möjligt från varje brunn med en 200 μL-pipett.
- Tillsätt tillväxtmedierna med LCFS på cellerna och inkubera vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 24- 48 h.
OBS: Volymen som ska användas beror på plåtstorleken enligt följande: 2 ml för 6-brunns cellkulturplattor; 200 μL för 96-brunns cellkulturplattor.
4. Cellens livskraft för sfäroider
- Förbered 8 - 10 LCFS-behandlade kolorektal cancer sfäroider i ogenomskinliga väggade multi-well plattor (cell livskraft analyser utförs 48 h efter LCFS behandling).
- Tina cellens livsduglighetsreagens (se materialförteckningen)vid 4 °C över natten.
- Balansera cellens livsduglighetsreagens till rumstemperatur före användning.
- Innan du utför analysen, ta bort 50% av tillväxtmedierna från sfäroiderna.
- Tillsätt 100 μL cellviabilitetsreagens till varje brunn.
OBS: Volymen som ska användas beror på plåtstorleken enligt följande: 100 μL för 96-brunns cellkulturplattor. - Blanda reagenset kraftigt i 5 minuter för att främja celllys.
- Inkubera i 30 min – 2 h vid 37 °C.
- Spela in luminiscensen.
5. Kvantitativ analys av polymeraskedjans reaktion i realtid för sfäroider
- För varje tillstånd, förbered 10- 15 sfäroider i ett 2 ml-rör och centrifugera i 3 minuter vid 400 x g.
- Kassera supernaten och tvätta sfäroiderna två gånger i 1 ml iskall 1x PBS.
OBS: Undvik centrifugation, låt sfäroiderna sätta sig. - Aspirera så mycket av 1x PBS som möjligt och isolera RNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit.
- Syntetisera cDNA från 1 μg RNA med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens protokoll.
- Förbereda en huvudmix för att köra alla prover i tre exemplar (se tabell 1 och tabell 2).
- Utför förstärkningen i en 20 μL av mallens huvudblandning i varje qPCR-platta väl.
- Blanda reaktionerna väl och snurra vid behov.
- Kör prover enligt instrumenttillverkarens rekommendationer(tabell 3).
6. Västerländsk blotting från sfäroider
OBS: När du samlar in sfäroider, använd en 200 μL pipett och skär änden av spetsarna för att undvika att störa deras struktur.
- För varje tillstånd, förbered 30 - 40 sfäroider i ett 2 ml-rör.
- Placera röret på is och låt sfäroiderna sätta sig ner till botten av 2 ml-röret.
- Kassera supernaten och tvätta sfäroiderna två gånger i 1 ml iskall 1x PBS
OBS: Undvik centrifugation, låt sfäroiderna sätta sig. - Aspirera så mycket av 1x PBS som möjligt och tillsätt RIPA-buffert med en proteashämmarcocktail (10 sfäroider = 30 μL RIPA-buffert).
- Lysa cellerna genom att pipetting upp och ner och utföra ultraljudsbehandling i 30 s med 30 s vila på is i 10 cykler.
- Centrifugera proteinet lyser vid 15000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Bestäm proteinkoncentrationen för varje celllyat.
- Koka varje celllyat i en provbuffert vid 100 °C i 10 min före lastning.
- Ladda lika stora mängder protein i SDS-PAGE-geléns brunnar och kör gelén i 1 - 2 h vid 100 V.
- Överför proteinet från gelén till PVDF-membranet.
- Efter överföring, blockera membranet i 1 timme vid rumstemperatur med en blockeringsbuffert (5% skummjölk + TBS med 0,05% interpolering-20).
- Inkubera membranet med 1:1 000 utspädningar av primär antikropp(tabell 4)i 1x TBST med 5% BSA-buffert vid 4 °C över natten.
- Tvätta membranet tre gånger med TBST, 15 min för varje tvätt.
- Inkubera membranet med 1:2 500 utspädningar av sekundär antikropp i blockeringsbufferten vid rumstemperatur i 2 timmar (se Materialförteckning).
- Tvätta membranet tre gånger med TBST, 15 min för varje tvätt.
- Förbered membranet för HRP-detektion med ett chemiluminescerande substrat.
- Skaffa chemiluminescenta bilder.
7. Propidium Iodide (PI) färgning av sfäroider
- Förbered 5-10 sfäroider enligt beskrivningen i steg 4.1 och placera sfäroiderna i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Späd ut ett 1 mg/ml lager av PI 1:100 i 1x PBS.
- Ta bort 50% av mediet från varje brunn på 96-brunnsplattan.
- Tillsätt 100 μL av PI-lösningen till varje brunn och placera brunnarna i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 10-15 min.
- Tvätta ut PI-lösningen med 1x PBS.
- Tillsätt 200 μL tillväxtmedium och ta en bild med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Analysera fluorescensintensiteten med bild J för att få sfäroidens livskraftsräkning.
8. FACS-analys av sfäroider
- Generera sfäroider enligt beskrivningen tidigare.
- För varje tillstånd, förbered 30 - 40 sfäroider i ett FACS-rör och centrifugera i 3 minuter vid 400 x g och RT.
- Aspirera supernatanten och tvätta sfäroiderna i 3 ml 1x PBS och centrifugera sedan vid 400 x g i 3 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och tillsätt 200 μL 0,25% Trypsin-EDTA och inkubera sedan vid RT i 2 -3 min.
INkubationstiden beror på sfäroidstorleken och celltypen. - Tillsätt 1 ml FACS-buffert och ta försiktigt avstånd från sfäroiderna med en 200 μL-pipett.
- Centrifugera de dissocierade cellerna vid 400 x g och 4 °C i 3 min.
OBS: FACS-buffert = 1x PBS + 2,5% FBS, filtrerad med ett 0,22 μm toppfilter. - Kassera supernatanten och tillsätt 7-AAD/Annexin V-reagens (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/prov).
- Virvel försiktigt cellerna och inkubera i 13 - 30 min på RT i mörkret.
- Tillsätt 500 μL FACS-buffert och filtrera cellerna med hjälp av koniska polystyrenteströr för att ta bort aggregerade celler.
- Centrifugera vid 400 x g och 4 °C i 3 min.
- Tillsätt 500 μL bindningsbuffert i Annexin V till varje rör och återanvänd.
- Analysera med hjälp av en flödescytometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver protokollet att erhålla sfäroider från olika kolorektal cancer cellinjer. Tillskott med metylcellulosa krävdes för att generera sfäroider. Vi presenterar också en metod för LCFS beredning och presentera en modell för att studera korrelationen mellan probiotika och kolorektal cancer. Sfäroidbildning och LCFS-förberedelseprotokoll illustreras schematiskt i figur 1A,B. Som visas i figur 2Aomvandlar metylcellulosakoncentrationen på 0,6 % cancercellerna till kompakta sfäroider. Detta resultat indikerar att sfäroider kan genereras från flera typer av kolorektal cancer med hjälp av vårt metylcellulosa protokoll. Därefter behandlades sfäroiderna med 25% LCFS och morfologi studerades efter 48 h med hjälp av ett lätt mikroskop. Som visas i figur 3Auppvisade sfäroiderna hos de grupper som behandlades med LCFS störda ytor. För att undersöka anti-cancer effekter av LCFS vid lämpliga koncentrationer, sfäroider behandlades för 48 h med olika doser av LCFS: 0 (kontroll), 6%, 12,5%, och 25%. Störningar i sfäroid morfologi observerades i sfäroider som behandlats med 25% LCFS, som visas i figur 3B. Dessutom behandlades sfäroiderna med 25% LCFS för 24 h och 48 h, och störningar i sfäroid morfologi observerades efter 48 h behandling. Mikroskopiska bilder av sfäroiderna visas i figur 3C.
Efter 48 timmar bedömdes proverna med cellens livskraftsanalys, och kolorektal cancercellsdöd observerades vid behandling med LCFS på ett dosberoende sätt, högre LCFS-mängden högre än den observerade celldöden (figur 3D). Vi färgade sedan proverna med propidiumididid (PI) för att observera apoptos. Som förväntat var induktion av apoptos beroende av LCFS- dosen(figur 4A,B,C). RT-PCR utfördes för att upptäcka förändringar i molekylära markörer för apoptos, dvs. BAX, BAK och NOXA (figur 5A, B). Slutligen studerades apoptosmarkörer med hjälp av western blotting och annexin V/7AAD genom FACS(figur 6A,B,C,D). Dessa observationer visar att LCFS effektivt inducerad apoptos i 3D-modellen.
Figur 1: Schematisk representation av sfäroidbildning och LCFS-preparat.
A)Schematiska representationsbilder av LCFS-generation protokollet markeras med (i-iv) (B) Schematik av metylcellulosamedierad sfäroidbildning markeras med (i-iii). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Metylcellulosamedierad sfäroidbildning.
A)Representativa bilder av metylcellulosamedierad sfäroidbildning av HT-29, DLD1 och WiDr. Cellerna såddes i ultralåg fastsättning 96-brunns runda bottenplattor med metylcellulosakoncentrationer på 0,1-1,2% för 48 h. Skalstreck 10 μm (n=3 för varje experiment). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Utvärdering av LCFS-koncentration och sfäroidmorfologi.
A)Representativa bilder av HT-29 behandlade med LCFS i 48 timmar. Skala stången 100 μm. (B) HT-29, DLD1 och WiDr sfäroider behandlas med ökande doser av LCFS för 48 h. Alla sfäroider hade stört kanterna vid 12,5-25% LCFS. Skala bommar för 20 μm (n=3 för varje experiment) (C) sfäroid morfologier av HT-29, DLD1 och WiDr sfäroider behandlas med 25% LCFS för 24 och 48 h. Skalstreck 20 μm (n = 3) (D) Uppmätt cellens livskraft, visad som medelvärde ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 för varje experiment). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Propidiumididfärgning av sfäroiderna.
Representativa bilder av PI färgning i (A) HT-29, (B) DLD1 och (C) WiDr sfäroider efter 48 h av LCFS behandling. Bilderna förvärvades med hjälp av ett fluorescensmikroskop och ökningen av PI-intensiteten mättes med bild J. Scale bar 10 μm. Medelvärdet ± SEM visas. , P < 0,05 (n = 3 för varje experiment). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Apoptos markörer identifierades med hjälp av qRT-PCR.
Apoptos markörer, såsom BAX, BAK och NOXA, kvantifierades. mRNA kvantifiering presenteras som ett relativt uttryck normaliseras till (A) β-aktin och (B) 18s rRNA. Medelvärdet ± SEM visas. , P < 0,05 (n=3 för varje experiment). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Apoptos markörer fastställdes via western blotting och FACS analys av sfäroider.
I figuren visas västra uppblåsthet av (A) HT-29, (B) DLD1 och (C) WiDr-celler efter LCFS-behandling. PARP1, BCL-XL och p-IκBα upptäcktes. β användes som intern kontroll. D)FACS-analys av apoptos i HT-29, DLD1 och WiDr-sfäroider inkuberade med LCFS. Apoptotiska celler upptäcktes av ökningen av fluorescens intensiteten i Annexin V-FITC. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Reaktion | Volym per enstaka 20 μL |
| 2X qPCR-blandning | 10 μL |
| Främre primer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Omvänd primer (10 pmols/μL) | 1 μL |
| cDNA (50 ng/μL) | 1 μL |
| PCR-vatten av PCR-klass | 7 μL |
Tabell 1: PCR-reaktionsblandning.
| Abc-bok | Sekvens |
| BAX-Framåt | CCCGAGAGGTCTTTCCGAG (CCCGAGAGGTCTTTCCGAG) |
| BAX-Omvänd | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT (CCAGCCCATGATGGTTCTGAT) |
| BAK-Framåt | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA (OLIKA) |
| BAK-Omvänd | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Framåt | ACCAAGCCGGATTTGCGATT (PÅ ANDRA) |
| NOXA-Omvänd | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| 18s rRNA-Framåt | GATGGGCGGCGGAAAAATAG (PÅ GATGGGCGGCGGAAAATAG) |
| 18s rRNA-Reverse | GCGTGGATTCTGCATAATGGT (GCGTGGATTCTGCATAATGGT) |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAAKT |
| β-Actin-Reverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT (GAAGCATTTGCGGTGGACGAT) |
Tabell 2: Primersekvenser som används i qRT-PCR-analys.
| Etapp | Temp (ºC) | Tid |
| Inledande denaturering | 95 | 10 min |
| 40 cykler: | ||
| Steg 1 | 95 | 15 sek |
| Steg 2 | 60 | 60 sek |
| Smältkurva steg | 95 | 15 sek |
| 60 | 60 sek | |
| 95 | 15 sek | |
Tabell 3: qRT-PCR-villkor.
| Antikropp | Utspädning |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β -aktin (C4) | 1:1000 |
| Get antimus IgG (H+L) | 1:2500 |
| Get antikanin IgG (H+L) | 1:2500 |
Tabell 4: Antikroppar som används vid western blot-analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vävnadsmikromiljön, inklusive närliggande celler och den extracellulära matrisen (ECM), är grundläggande för vävnadsgenerering och avgörande för kontrollen av celltillväxt och vävnadsutveckling13. 2D-kulturer har dock flera nackdelar, såsom störningar i cellinteraktioner, liksom förändringar i cellmorfologi, extracellulära miljöer och tillvägagångssättet i division14. 3D-cellkultursystem har studerats noggrant för att bättre reproducera in vivo-effekter, och har visat sig vara mer exakta system för in vitro-cancertestning15,16. Det finns ett behov av modellsystem för att mer exakt förutsäga personliga svar på kemoterapeutiskamedel 17.
3D byggnadsställningar utvecklades för vävnadsteknik. Det fungerar som en surrogatförlust av ECM, som representerar det tillgängliga utrymmet för tumörceller. Dessutom ger byggnadsställningen fysiska interaktioner för cell vidhäftning och spridning och gör att celler bildar lämpliga rumsliga fördelningar och cell-ECM- eller cellcellsinteraktioner18. Den metylcellulosapolymeren (MC) har kontinuerligt studerats för att bestämma dess lämplighet vid generering av MC-baserade hydrogelsystem för applikationer i 3D-cellkulturteknik19,20. Den intakta införlivandet av dessa hydrogeler i biomaterial som 3D-cellnätverk är dock fortfarande tekniskt utmanande21. Därför rekommenderar sfäroidbildningsprotokollet som presenteras här titreringen av MC-koncentrationer och optimering med olika tidpunkter för varje CRC-cellinje. Cellinjespecifika egenskaper, såsom cellaggregering, livskraft och död, kan avsevärt påverka vart och ett av de tillstånd vi testade. Denna metod kan ge ett sätt att generera enhetliga sfäroider för testning av LCFS på cancerceller.
Probiotika, som är fördelaktiga bakterier, producerar aktiva metaboliter som potentiellt kan efterlikna anti-cancer effekter. Således utformades vår studie för att isolera mjölksyrabakterier (LAB) och testa anti-cancereffekterna av deras metabola extrakt från cellfria supernatants (CFS). Våra studier gav en metod för att observera effekterna av L. fermentum cell-fria supernatants som inducerar apoptotisk celldöd i kolorektal cancerceller i ett 3D-system. MRNA nivåer av apoptos markörer inblandade i apoptotiska vägar induceras dramatiskt efter LCFS exponering i 3D villkor. Dessutom uttrycktes de minskade nivåerna av PARP1 och BCL-XL i den LCFS-behandlade 3D-sfäroidkontrollen jämfört med kontrollen i figur 4C,D,E. Hämning av NF- κB aktivering observerades också i 3D kulturer efter behandling med LCFS. Sammantaget inkluderar fördelarna med odlingsceller i 3D att öka cellcellsinteraktioner och svar på signalmolekyler för att bättre efterlikna in vivo-system. Västerländsk blotting med hjälp av sfäroider kan leda till kvantitativa insikter om tillståndet hos olika signalmolekyler.
Cellinjer har vissa begränsningar som prekliniska modeller av cancerforskning. Nyligen har cancerorganoider använts vid modellering av personlig anti-cancerbehandling22,23. Behandlingen av LCFS med probiotika i organoider förväntas användas som en kraftfull plattform för att testa anti-cancer effekter. Dessutom testade vi bara en av Lactobacillus-arterna bland de olika probiotika i cancermodellen. Olika probiotika testas också för förebyggande av metaboliskt syndrom, immunologiska och neurologiska störningar24,25,26. LCFS från Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcusoch Akkermansia arter är potentiella kandidater för testning av hälsofördelar genom olika typer av sjukdom modeller27,28,29.
Baserat på denna studie kan man dra slutsatsen att förståelsen för signalering i sfäroider och de olika svaren på LCFS-behandling i 3D-modeller kan vara fördelaktig för att testa anti-cancereffekter med den metod som vi föreslog. Dessutom kan 3D-cancermodeller ge flera fördelar som inte är möjliga med traditionella 2D-monoskikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga relevanta finansiella upplysningar.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av "Etablering av mätstandarder för kemi och strålning", bidragsnummer KRISS-2020-GP2020-0003 och "Utveckling av mätstandarder och teknik för biomaterial och medicinsk konvergens", bidragsnummer KRISS-2020-GP2020-0004-program, finansierade av Korea Research Institute of Standards and Science. Denna forskning stöddes också av ministeriet för vetenskap och IKT (MSIT), Koreas nationella forskningsstiftelse (NRF-2019M3A9F3065868), ministeriet för hälsa och välfärd (MOHW), Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, HI20C0558), Handels-, industri- och energiministeriet (MOTIE) och Korea Evaluation Institute of Industrial Technology (KEIT, 20009350). ORCID ID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang: 0000-0002-5924-9674; Seil Kim: 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee: 0000-0002-2495-1439; Jina Lee: 0000-0002-3661-3701). Vi tackar Chang Woo Park för hjälp med experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
References
- Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
- Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
- Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
- Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
- Harish, K., Varghese, T.
- Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
- Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557 (2019).
- Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886 (2018).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
- Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
- Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
- Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
- Drost, J., Clevers, H.
- Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
- Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F.
- Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
- Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
- Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711 (2019).
- Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).
