Summary
Ici, des méthodes sont présentées pour comprendre les effets anticancéreux du surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS). Les lignées cellulaires du cancer colorectal montrent des décès cellulaires lorsqu’elles sont traitées avec LCFS dans des cultures 3D. Le processus de génération de sphéroïdes peut être optimisé en fonction de l’échafaudage et les méthodes d’analyse présentées sont utiles pour évaluer les voies de signalisation impliquées.
Abstract
Ce manuscrit décrit un protocole pour évaluer les décès de cellules cancéreuses dans les sphéroïdes tridimensionnels (3D) de types multicellulaires de cellules cancéreuses en utilisant des surnageants issus de la culture cellulaire Lactobacillus fermentum, considérés comme des cultures probiotiques. L’utilisation de cultures 3D pour tester le surnageant sans cellules de Lactobacillus (LCFS) est une meilleure option que les tests dans des monocouches 2D, d’autant plus que L. fermentum peut produire des effets anticancéreux dans l’intestin. L. fermentum surnageant a été identifié pour posséder des effets anti-prolifératifs accrus contre plusieurs cellules du cancer colorectal (CCR) dans des conditions de culture 3D. Fait intéressant, ces effets étaient fortement liés au modèle de culture, démontrant la capacité notable de L. fermentum à induire la mort des cellules cancéreuses. Des sphéroïdes stables ont été générés à partir de divers CRC (cellules cancéreuses colorectales) en utilisant le protocole présenté ci-dessous. Ce protocole de génération de sphéroïde 3D est un gain de temps et rentable. Ce système a été développé pour étudier facilement les effets anticancéreux du LCFS dans plusieurs types de sphéroïdes du CCR. Comme prévu, les sphéroïdes CRC traités avec LCFS ont fortement induit la mort cellulaire au cours de l’expérience et ont exprimé des marqueurs moléculaires d’apoptose spécifiques tels qu’analysés par qRT-PCR, Western blotting et ANALYSE FACS. Par conséquent, cette méthode est précieuse pour explorer la viabilité cellulaire et évaluer l’efficacité des médicaments anticancéreux.
Introduction
Les probiotiques sont les micro-organismes les plus avantageux dans l’intestin qui améliorent l’homéostasie immunitaire et le métabolisme énergétique de l’hôte1. Les probiotiques de Lactobacillus et Bifidobacterium sont les plus avancés de son genre trouvés dans l’intestin2,3. Des recherches antérieures ont montré que Lactobacillus a des effets inhibiteurs et antiprolifératifs sur plusieurs cancers, y compris le cancer colorectal4. De plus, les probiotiques préviennent les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse5,6. Cependant, la plupart des études avec des probiotiques ont été réalisées dans des monocouches bidimensionnelles (2D) qui sont cultivées sur des surfaces solides.
Les systèmes de culture artificielle manquent de caractéristiques environnementales, ce qui n’est pas naturel pour les cellules cancéreuses. Pour surmonter cette limitation, des systèmes de culture tridimensionnels (3D) ont étédéveloppés7,8. Les cellules cancéreuses en 3D montrent des améliorations en termes de mécanismes biologiques de base, tels que la viabilité cellulaire, la prolifération, la morphologie, la communication cellule-cellule, la sensibilité aux médicaments et la pertinence in vivo9,10. De plus, les sphéroïdes sont fabriqués à partir de types multicellulaires de cancer colorectal et dépendent des interactions cellule-cellule et de la matrice extracellulaire (ECM)11. Notre étude précédente a rapporté que le surnageant sans cellules probiotiques (SFC) produit à l’aide de Lactobacillus fermentum a montré des effets anticancéreux sur des cultures 3D de cellules du cancer colorectal (CCR)12. Nous avons proposé que le SFC soit une stratégie alternative appropriée pour tester les effets probiotiques sur les sphéroïdes 3D12.
Ici, nous présentons une approche qui peut accueillir des types multicellulaires de cancer colorectal 3D pour l’analyse des effets thérapeutiques du surnageant sans cellules probiotiques (SFC) sur plusieurs systèmes de mimétisme du cancer colorectal 3D. Cette méthode fournit un moyen pour l’analyse des effets probiotiques et anticancéreux connexes in vitro.
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Protocol
1. Cultures cellulaires bactériennes et préparation du surnageant sans cellules lactobacillus (LCFS)
REMARQUE : Les étapes 1.2 à 1.9 sont effectuées dans une chambre anaérobie.
- Préparer une plaque de gélose MRS et un bouillon contenant de la L-cystéine et stériliser par autoclavage.
- Pré-incuber la plaque de gélose MRS dans une chambre anaérobieH2 maintenue à 37 °C avec 20 ppm d’oxygène.
- Décongeler le stock bactérien de Lactobacillus et inoculer la plaque de gélose avec la culture bactérienne (Figure 1A (i)).
- Incuber les bactéries pendant 2 à 3 jours dans une chambre anaérobie H2 à 37 °C et 20 ppm d’oxygène jusqu’à l’obtention de colonies bactériennes uniques.
- Lavez et séchez le tube de culture anérobie de type Hungate. Autoclaver le tube de culture à 121 °C pendant 15 min.
- Ensuite, incuber le tube dans une chambre anaérobieH2 à 37 °C et 20 ppm d’oxygène pour éliminer l’oxygène.
- Placer 2 à 3 mL de bouillon MRS dans le tube. Scellez le tube avec un bouchon en caoutchouc butyle et vissez le bouchon.
- Obtenez une seule colonie avec une boucle et placez-la dans le tube de culture de 1,5 mL avec 500 μL de 1x PBS. (Figure 1A (ii)).
- Suspendre la colonie à l’aide d’une seringue de 1 mL (Figure 1A (iii)). Pour ce faire, insérez l’aiguille de la seringue de 1 mL au centre du couvercle du tube, en aspirant la colonie en suspension, puis en la réutilisant dans le bouillon MRS. (Figure 1A (iv)).
- Incuber le bouillon MRS dans un incubateur shaker pendant 2 jours (37 °C, 5% CO2, 200tr/min).
- Mesurez la densité optique (OD) à l’aide d’un spectrophotomètre pour surveiller les courbes de croissance bactérienne jusqu’à ce que l’absorbance à OD620 atteigne 2,0.
- Séparer les pastilles bactériennes et le milieu conditionné par centrifugation à 1 000 x g pendant 15 min. Laver les granulés bactériens collectés avec 1x PBS et ressuspendre dans 4 mL de RPMI 1640 complété par 10% de sérum bovin fœtal. N’incluez pas d’antibiotiques dans le milieu.
- Maintenir les granulés bactériens dans rpmI et les incuber dans un incubateur agitateur pendant 4 h à 37 °C avec 5 % de CO2 à une vitesse de 100 tr/min.
- Pour la préparation du surnageant probiotique, retirer la pastille bactérienne par centrifugation à 1000 x g,pendant 15 min à 4 °C. Filtrer stérilement le surnageant récupéré à l’aide d’un filtre de 0,22 μm et conserver à −80 °C jusqu’à son utilisation.
2. Génération de sphéroïdes
-
Préparation de lignées cellulaires de cancer colorectal
- Cultiver les lignées cellulaires DLD-1, HT-29 et WiDr en monocouches jusqu’à 70-80% de confluence et incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 (Milieu de croissance: RPMI contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine).
- Pour les cellules cultivées dans une boîte de Petri de 100 mm, laver la plaque deux fois avec 4 mL de 1x PBS. Ajouter 1 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % et incuber la boîte de Petri pendant 2 min à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pour dissocier les cellules.
- Après l’incubation, vérifier la dissociation cellulaire au microscope et neutraliser la trypsine-EDTA avec 5 mL de milieu de croissance.
- Transférer les cellules dissociées dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 3 min à 300 x g.
- Jeter le surnageant et resussuspener doucement avec 3 mL de milieu de croissance.
- Comptez les cellules avec du bleu de trypan pour déterminer les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre. (Figure 1B (i))
-
Formation de sphéroïdes
- Dans un tube conique de 15 mL, diluer les cellules à partir du 2.1.5 pour obtenir 1 - 2 x 105 cellules/mL (Figure 1B (ii))
- Ajouter la concentration finale de méthylcellulose à 0,6 % à la suspension cellulaire et transférer les cellules diluées dans un réservoir stérile.
REMARQUE: Pour chaque lignée cellulaire, la quantité de méthylcellulose nécessaire doit être titrée et déterminée en conséquence. - Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 200 μL de cellules à chaque puits d’une microplaque inférieure ronde à 96 puits à fixation ultra-faible. (Figure 1B (iii))
- Incuber la plaque à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5 % pendant 24 à 36 h.
- Après 24 à 36 h, observez la plaque au microscope optique pour assurer la formation de sphéroïdes.
3. Traitement des cellules cancéreuses colorectales 3D avec LCFS
- Générez des sphéroïdes comme décrit aux étapes 2 et 3.
- Avant d’effectuer le traitement LCFS, décongeler le LCFS congelé à température ambiante (RT) pendant 10 à 20 min.
- Inoculer la solution stock LCFS dans un milieu de croissance. Diluer en série à 25 %, 12,5 % et 6 % dans le milieu de croissance (c.-à-d. 25 % de LCFS = 150 μL de milieu de croissance + 50 μL de LCFS).
- Retirez la plaque de culture cellulaire contenant des sphéroïdes de l’incubateur et retirez autant que possible le milieu de croissance de chaque puits à l’aide d’une pipette de 200 μL.
- Ajouter le milieu de croissance avec LCFS sur les cellules et incuber à 37 °C dans un incubateur àCO 2 à 5% pendant 24 à 48 h.
REMARQUE: Le volume à utiliser dépendra de la taille de la plaque comme suit: 2 mL pour les plaques de culture cellulaire à 6 puits; 200 μL pour les plaques de culture cellulaire à 96 puits.
4. Viabilité cellulaire des sphéroïdes
- Préparer 8 à 10 sphéroïdes du cancer colorectal traités par LCFS dans des plaques multi-puits à paroi opaque (les tests de viabilité cellulaire sont effectués 48 h après le traitement par LCFS).
- Décongeler le réactif de viabilité cellulaire (voir tableau des matériaux)à 4 °C pendant la nuit.
- Équilibrez le réactif de viabilité cellulaire à la température ambiante avant utilisation.
- Avant d’effectuer le test, retirez 50% des milieux de croissance des sphéroïdes.
- Ajouter 100 μL de réactif de viabilité cellulaire à chaque puits.
REMARQUE: Le volume à utiliser dépendra de la taille de la plaque comme suit: 100 μL pour les plaques de culture cellulaire à 96 puits. - Mélanger vigoureusement le réactif pendant 5 min pour favoriser la lyse cellulaire.
- Incuber pendant 30 min – 2 h à 37 °C.
- Enregistrez la luminescence.
5. Analyse quantitative en temps réel de la réaction en chaîne de la polymérase pour les sphéroïdes
- Pour chaque condition, préparer 10 à 15 sphéroïdes dans un tube de 2 mL et centrifuger pendant 3 min à 400 x g.
- Jetez le surnageant et lavez les sphéroïdes deux fois dans 1 mL de PBS glacé 1x.
REMARQUE: Évitez la centrifugation, laissez les sphéroïdes s’installer. - Aspirer autant de PBS 1x que possible et isoler l’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce.
- Synthétisez l’ADNc à partir de 1 μg d’ARN à l’aide d’un kit disponible dans le commerce selon le protocole du fabricant.
- Préparez un mélange principal pour exécuter tous les échantillons en trois exemplaires (voir tableau 1 et tableau 2).
- Effectuez l’amplification dans un mélange maître de 20 μL dans chaque puits de plaque qPCR.
- Mélangez bien les réactions et faites tourner si nécessaire.
- Exécuter des échantillons conformément aux recommandations du fabricant de l’instrument (Tableau 3).
6. Western blotting des sphéroïdes
REMARQUE: Lors de la collecte des sphéroïdes, utilisez une pipette de 200 μL et coupez l’extrémité des pointes pour éviter de perturber leur structure.
- Pour chaque condition, préparez 30 à 40 sphéroïdes dans un tube de 2 mL.
- Placez le tube sur de la glace et laissez les sphéroïdes se déposer au fond du tube de 2 mL.
- Jeter le surnageant et laver les sphéroïdes deux fois dans 1 mL glacé 1x PBS
REMARQUE: Évitez la centrifugation, laissez les sphéroïdes s’installer. - Aspirer autant de PBS que possible et ajouter un tampon RIPA avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase (10 sphéroïdes = 30 μL de tampon RIPA).
- Lysez les cellules en pipetant de haut en bas et effectuez une sonication pendant 30 s avec 30 s de repos sur la glace pendant 10 cycles.
- Centrifuger les lysates de protéines à 15000 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Déterminer la concentration en protéines pour chaque lysate cellulaire.
- Avant le chargement, faire bouillir chaque lysate de cellule dans un tampon d’échantillon à 100 °C pendant 10 min.
- Chargez des quantités égales de protéines dans les puits du gel SDS-PAGE et faites fonctionner le gel pendant 1 à 2 h à 100 V.
- Transférer la protéine du gel à la membrane PVDF.
- Après le transfert, bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon bloquant (5% de lait écrémé + TBS avec 0,05% de Tween-20).
- Incuber la membrane avec 1:1 000 dilutions d’anticorps primaires (Tableau 4) dans 1x TBST avec un tampon BSA à 5% à 4 °C pendant la nuit.
- Lavez la membrane trois fois avec TBST, 15 min pour chaque lavage.
- Incuber la membrane avec 1:2 500 dilutions d’anticorps secondaires dans le tampon bloquant à température ambiante pendant 2 h (voir Tableau des matériaux).
- Lavez la membrane trois fois avec TBST, 15 min pour chaque lavage.
- Préparer la membrane pour la détection HRP avec un substrat chimiluminescent.
- Acquérir des images chimiluminescentes.
7. Coloration à l’iodure de propidium (PI) des sphéroïdes
- Préparer 5 à 10 sphéroïdes comme décrit à l’étape 4.1 et placer les sphéroïdes dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
- Diluer un stock de 1 mg/mL de PI 1:100 dans 1x PBS.
- Retirer 50 % du milieu de chaque puits de la plaque de 96 puits.
- Ajouter 100 μL de la solution PI à chaque puits et placer les puits dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 10 à 15 min.
- Lavez la solution PI avec 1x PBS.
- Ajouter 200 μL de milieu de croissance et prendre une image à l’aide d’un microscope à fluorescence. Analysez l’intensité de fluorescence à l’aide de l’image J pour obtenir le nombre de viabilité du sphéroïde.
8. Analyse FACS des sphéroïdes
- Générez des sphéroïdes comme décrit précédemment.
- Pour chaque condition, préparez 30 à 40 sphéroïdes dans un tube FACS et centrifugez pendant 3 min à 400 x g et RT.
- Aspirer le surnageant et laver les sphéroïdes dans 3 mL de 1x PBS, puis centrifuger à 400 x g pendant 3 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant et ajouter 200 μL de 0,25% de trypsine-EDTA, puis incuber à RT pendant 2 à 3 min.
REMARQUE: Le temps d’incubation dépend de la taille du sphéroïde et du type de cellule. - Ajouter 1 mL de tampon FACS et dissocier délicatement les sphéroïdes à l’aide d’une pipette de 200 μL.
- Centrifuger les cellules dissociées à 400 x g et 4 °C pendant 3 min.
REMARQUE: Tampon FACS = 1x PBS + 2,5% FBS, filtré à l’aide d’un filtre supérieur de 0,22 μm. - Jeter le surnageant et ajouter le réactif 7-AAD/Annexin V (7AAD (5 μL), Annexin V (5 μL)/échantillon).
- Vortexez doucement les cellules et incubez pendant 13 à 30 minutes à RT dans l’obscurité.
- Ajouter 500 μL de tampon FACS et filtrer les cellules à l’aide de tubes à essai coniques en polystyrène pour éliminer les cellules agrégées.
- Centrifuger à 400 x g et 4 °C pendant 3 min.
- Ajouter 500 μL de tampon de liaison Annexin V à chaque tube et resuspend.
- Analysez à l’aide d’un cytomètre en flux.
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Representative Results
Nous décrivons le protocole d’obtention de sphéroïdes à partir de diverses lignées cellulaires de cancer colorectal. Une supplémentation en méthylcellulose était nécessaire pour générer des sphéroïdes. Nous présentons également une méthode de préparation de LCFS et présentons un modèle pour étudier la corrélation entre les probiotiques et le cancer colorectal. Les protocoles de formation de sphéroïdes et de préparation LCFS sont illustrés schématiquement à la Figure 1A,B. Comme le montre la figure 2A,une concentration de méthylcellulose de 0,6 % transforme les cellules cancéreuses en sphéroïdes compacts. Ce résultat indique que les sphéroïdes peuvent être générés à partir de plusieurs types de cancer colorectal en utilisant notre protocole de méthylcellulose. Ensuite, les sphéroïdes ont été traités avec 25% de LCFS et la morphologie a été étudiée après 48 h à l’aide d’un microscope optique. Comme le montre la figure 3A,les sphéroïdes des groupes traités par LCFS présentaient des surfaces perturbées. Pour étudier les effets anticancéreux du LCFS à des concentrations appropriées, les sphéroïdes ont été traités pendant 48 h avec diverses doses de LCFS: 0 (témoin), 6%, 12,5% et 25%. Des perturbations de la morphologie des sphéroïdes ont été observées chez les sphéroïdes traités avec 25 % de LCFS, comme le montre la figure 3B. De plus, les sphéroïdes ont été traités avec 25% de LCFS pendant 24 h et 48 h, et des perturbations de la morphologie des sphéroïdes ont été observées après 48 h de traitement. Des images microscopiques des sphéroïdes sont montrées à la figure 3C.
Après 48 h, les échantillons ont été évalués avec un test de viabilité cellulaire, et la mort cellulaire du cancer colorectal a été observée lors du traitement par LCFS d’une manière dose-dépendante, plus la quantité de LCFS plus élevée que la mort cellulaire observée (Figure 3D). Nous avons ensuite coloré les échantillons avec de l’iodure de propidium (IP) pour observer l’apoptose. Comme prévu, l’induction de l’apoptose dépendait de la dose de LCFS(Figure 4A, B, C). La RT-PCR a été réalisée pour détecter les changements dans les marqueurs moléculaires de l’apoptose, c’est-à-dire BAX, BAK et NOXA(Figure 5A,B). Enfin, les marqueurs de l’apoptose ont été étudiés à l’aide du transfert western et de l’annexine V/7AAD par l’intermédiaire du FACS(Figure 6A, B, C, D). Ces observations montrent que le LCFS a effectivement induit l’apoptose dans le modèle 3D.
Figure 1 : Représentation schématique de la formation des sphéroïdes et de la préparation du LCFS.
(A) Les images de représentation schématique du protocole de génération LCFS sont marquées par (i-iv) (B) Les schémas de la formation de sphéroïdes médiés par la méthylcellulose sont marqués par (i-iii). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Formation de sphéroïdes médiés par la méthylcellulose.
(A) Images représentatives de la formation de sphéroïdes médiés par la méthylcellulose de HT-29, DLD1 et WiDr. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques de fond rondes à 96 puits à très faible fixation avec des concentrations de méthylcellulose de 0,1 à 1,2% pendant 48 h. Barre d’échelle 10 μm (n = 3 pour chaque expérience). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la concentration de LCFS et de la morphologie des sphéroïdes.
(A) Images représentatives du HT-29 traité avec LCFS pendant 48 h. Barre d’échelle 100 μm. (B) Sphéroïdes HT-29, DLD1 et WiDr traités avec des doses croissantes de LCFS pendant 48 h. Tous les sphéroïdes avaient des bords perturbés à 12,5-25% LCFS. Barre d’échelle 20 μm (n = 3 pour chaque expérience) (C) Morphologies sphéroïdes des sphéroïdes HT-29, DLD1 et WiDr traités avec 25% LCFS pendant 24 et 48 h. Barre d’échelle 20 μm (n = 3) (D) Viabilité cellulaire mesurée, indiquée en moyenne ± SEM. ***, P < 0,05 (n = 3 pour chaque expérience). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coloration à l’iodure de propidium des sphéroïdes.
Images représentatives de la coloration PI dans (A) HT-29, (B) DLD1 et (C) WiDr sphéroïdes après 48 h de traitement LCFS. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope à fluorescence et l’augmentation de l’intensité pi a été mesurée à l’aide de la barre d’échelle de l’image J. 10 μm. La moyenne ± SEM est affichée. , P < 0,05 (n = 3 pour chaque expérience). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Les marqueurs d’apoptose ont été identifiés à l’aide de la qRT-PCR.
Les marqueurs de l’apoptose, tels que BAX, BAK et NOXA, ont été quantifiés. La quantification de l’ARNm est présentée comme une expression relative normalisée à(A)β-actine et(B)18s ARNr. La moyenne ± SEM est affichée. , P < 0,05 (n = 3 pour chaque expérience). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Les marqueurs d’apoptose ont été déterminés par transfert Western et analyse FACS des sphéroïdes.
La figure montre des transferts occidentaux de cellules (A) HT-29, (B) DLD1 et (C) WiDr après traitement LCFS. PARP1, BCL-XL et p-IκBα ont été détectés. β-actine a été utilisé comme contrôle interne. (D) Analyse FACS de l’apoptose dans les sphéroïdes HT-29, DLD1 et WiDr incubés avec LCFS. Les cellules apoptotiques ont été détectées par l’augmentation de l’intensité de fluorescence de l’annexine V-FITC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Réaction | Volume par single 20 μL |
| 2X mélange qPCR | 10 μL |
| Amorce avant (10 pmols/μL) | 1 μL |
| Apprêt inversé (10 pmols/μL) | 1 μL |
| ADNc (50 ng/μL) | 1 μL |
| Eau de qualité PCR | 7 μL |
Tableau 1 : Mélange réactionnel PCR.
| Amorce | Séquence |
| BAX-Forward | CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG |
| BAX-Reverse | CCAGCCCATGATGGTTCTGAT |
| BAK-Forward | ATGGTCACCTTACCTCTGCAA |
| BAK-Inverse | TCATAGCGTCGGTTGATGTCG |
| NOXA-Forward | ACCAAGCCGGATTTGCGATT |
| NOXA-Reverse | ACTTGCACTTGTTCCTCGTGG |
| ARNr-Forward de 18 s | GATGGGCGGCGGAAAATAG |
| 18s RRNA-Inverse | GCGTGGATTCTGCATAATGGT |
| β-Actin-Forward | TCCTGTGGCATCCACGAAACT |
| β-Actine-Inverse | GAAGCATTTGCGGTGGACGAT |
Tableau 2 : Séquences d’amorce utilisées dans l’analyse qRT-PCR.
| Étape | Température (ºC) | Heure |
| Dénaturation initiale | 95 | 10 min |
| 40 cycles: | ||
| Étape 1 | 95 | 15 secondes |
| Étape 2 | 60 | 60 secondes |
| Étage de courbe de fusion | 95 | 15 secondes |
| 60 | 60 secondes | |
| 95 | 15 secondes | |
Tableau 3 : Conditions de la qRT-PCR.
| Anticorps | Dilution |
| PARP 1 (C2-10) | 1:1000 |
| BCL-XL (H-5) | 1:1000 |
| p-IκBα (B-9) | 1:1000 |
| β-actine (C4) | 1:1000 |
| IgG anti-souris chèvre (H+L) | 1:2500 |
| IgG anti-lapin de chèvre (H+L) | 1:2500 |
Tableau 4 : Anticorps utilisés dans l’analyse par transfert western.
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Discussion
Le microenvironnement tissulaire, y compris les cellules voisines et la matrice extracellulaire (ECM), est fondamental pour la génération de tissus et crucial dans le contrôle de la croissance cellulaire et du développement tissulaire13. Cependant, les cultures 2D présentent plusieurs inconvénients, tels que la perturbation des interactions cellulaires, ainsi que des altérations de la morphologie cellulaire, des environnements extracellulaires et de l’approche de la division14. Les systèmes de culture cellulaire 3D ont été rigoureusement étudiés pour mieux reproduire les effets in vivo, et ont été prouvés comme des systèmes plus précis pour les tests in vitro du cancer15,16. Il est nécessaire que les systèmes modèles prédisent plus précisément les réponses personnalisées aux agents chimiothérapeutiques17.
L’échafaudage 3D a été développé pour l’ingénierie tissulaire. Il agit comme une perte de substitution de l’ECM, représentant l’espace disponible des cellules tumorales. En outre, l’échafaudage fournit des interactions physiques pour l’adhésion et la prolifération cellulaires et amène les cellules à former des distributions spatiales appropriées et des interactions cellule-ECM ou cellule-cellule18. Le polymère de méthylcellulose (MC) a été continuellement étudié pour déterminer son aptitude à générer des systèmes d’hydrogel à base de MC pour des applications dans l’ingénierie de la culture cellulaire 3D19,20. Cependant, l’incorporation intacte de ces hydrogels dans des biomatériaux tels que les réseaux de cellules 3D reste techniquement difficile21. Par conséquent, le protocole de formation de sphéroïdes présenté ici recommande le titrage des concentrations de MC et l’optimisation avec différents points temporels pour chaque lignée cellulaire CRC. Les caractéristiques spécifiques à la lignée cellulaire, telles que l’agrégation cellulaire, la viabilité et la mort, peuvent affecter de manière significative chacune des conditions que nous avons testées. Cette méthode peut fournir un moyen de générer des sphéroïdes uniformes pour tester le LCFS sur les cellules cancéreuses.
Les probiotiques, qui sont des bactéries bénéfiques, produisent des métabolites actifs qui peuvent potentiellement imiter les effets anticancéreux. Ainsi, notre étude a été conçue pour isoler les bactéries lactiques (LAB) et tester les effets anticancéreux de leurs extraits métaboliques à partir de surnageants sans cellules (SFC). Nos études ont fourni une méthode pour observer les effets des surnageants sans cellules de L. fermentum qui induisent la mort cellulaire apoptotique dans les cellules cancéreuses colorectales dans un système 3D. Les niveaux d’ARNm des marqueurs d’apoptose impliqués dans les voies apoptotiques sont considérablement induits après l’exposition au LCFS dans des conditions 3D. De plus, des niveaux réduits de PARP1 et de BCL-XL ont été exprimés dans le contrôle des sphéroïdes 3D traités par LCFS par rapport au contrôle de la figure 4C, D,E. Une inhibition de l’activation de NF-κB a également été observée dans des cultures 3D après traitement par LCFS. Pris ensemble, les avantages de la culture de cellules en 3D comprennent l’augmentation des interactions cellule-cellule et des réponses aux molécules de signalisation pour mieux imiter les systèmes in vivo. Le transfert Western à l’aide de sphéroïdes peut conduire à des informations quantitatives sur l’état de diverses molécules de signalisation.
Les lignées cellulaires ont certaines limites en tant que modèles précliniques de la recherche sur le cancer. Récemment, les organoïdes du cancer ont été utilisés dans la modélisation de la thérapie anticancéreuse personnalisée22,23. Le traitement du LCFS avec des probiotiques dans les organoïdes devrait être utilisé comme une plate-forme puissante pour tester les effets anticancéreux. De plus, nous n’avons testé qu’une seule des espèces de Lactobacillus parmi les différents probiotiques du modèle cancéreux. Divers probiotiques sont également testés pour la prévention des troubles métaboliques, immunologiques et neurologiques24,25,26. LCFS des espèces Bifidobacterium, Saccharomyces, Streptococcus, Enterococcuset Akkermansia sont des candidats potentiels pour tester les avantages pour la santé à travers divers types de modèles demaladies 27,28,29.
Sur la base de cette étude, on peut conclure que la compréhension de la signalisation dans les sphéroïdes et les différentes réponses au traitement LCFS dans les modèles 3D peuvent être bénéfiques pour tester les effets anticancéreux en utilisant la méthode que nous avons proposée. De plus, les modèles de cancer 3D peuvent offrir plusieurs avantages qui ne sont pas possibles avec les monocouches 2D traditionnelles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune information financière pertinente.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par les programmes « Établissement de normes de mesure pour la chimie et le rayonnement », numéro de subvention KRISS-2020-GP2020-0003, et « Développement de normes et de technologies de mesure pour les biomatériaux et la convergence médicale », numéro de subvention KRISS-2020-GP2020-0004, financé par l’Institut coréen de recherche sur les normes et les sciences. Cette recherche a également été soutenue par le ministère des Sciences et des TIC (MSIT), la Fondation nationale de recherche de Corée (NRF-2019M3A9F3065868), le ministère de la Santé et du Bien-être (MOHW), l’Institut coréen de développement de l’industrie de la santé (KHIDI, HI20C0558), le ministère du Commerce, de l’Industrie et de l’Énergie (MOTIE) et l’Institut coréen d’évaluation de la technologie industrielle (KEIT, 20009350). NUMÉRO ORCID (Hee Min Yoo: 0000-0002-5951-2137; Dukjin Kang : 0000-0002-5924-9674; Seil Kim : 0000-0003-3465-7118; Joo-Eun Lee : 0000-0002-2495-1439; Jina Lee : 0000-0002-3661-3701). Nous remercions Chang Woo Park pour son aide dans les expériences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 15-well, 15 µl |
Biorad | 4561036 | Pkg of 10 |
| Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 100 covers |
| 10x transfer buffer | Intron | IBS-BT031A | 1 L |
| 10X Tris-Glycine (W/SDS) | Intron | IBS-BT014 | 1 L |
| Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube, Polypropylene, Clear, Nonsterile, 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case | Corning | SCT-200-C | 500 Tubes/Pack, 10 Packs/Case |
| BD Difco Bacto Agar | BD | 214010 | 500 g |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | DF0881-17-5 | 500 g |
| CellTiter-Glo 3D Cell viability assay | Promega | G9681 | 100μl/assay in 96-well plates |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | vial of 20 tablets |
| Corning Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium, PH 7.4 ± 0.1 | Corning | 21-040-CV | 500 mL |
| EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer Membranes | fisher Scientific | IPVH00010 | 26.5cm x 3.75m roll; Pore Size: 0.45um |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 25/Pack, 500/Case |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | 500 mL |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 25 x 20 µl rxns #1708890 | Biorad | 1708890 | 25 x 20 µL rxns |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Biorad | 1725121 | 5 x 1 mL |
| Lactobacillus fermentum | Korean Collection for Type Cultures | KCTC 3112 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| Methyl Cellulose (3500-5600mPa·s, 2% in Water at 20°C) | TCI | M0185 | 500 g |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | 20 plates |
| Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized | Millipore | SLGS033SB | 250 |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD | Biolegend | 640934 | 100 tests |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Introgen | P1304MP | 100 mg |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | 250 mL |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | 250 |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-119 | 500 mL |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | 100 mL |
| Name of Materials/Equipment/Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| anti - p-IκBα (B-9) | Santa cruze | sc-8404 | 200 µg/mL |
| anti-BclxL (H-5) | Santa cruze | sc-8392 | 200 µg/mL |
| anti-PARP 1 (C2-10) | Santa cruze | sc-53643 | 50 µl ascites |
| anti-β-actin (C4) | Santa cruze | sc-47778 | 200 µg/mL |
| BD FACSVerse | BD Biosciences | San Diego, CA, USA | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioT | S1LFA | |
| CO2 incubator | Thermo fisher | HERAcell 150i | |
| Conical tube 15 ml | SPL | 50015 | |
| Conical tube 50 ml | SPL | 50050 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate | Sigma-Aldrich | CLS3471 | |
| Costar 50 mL Reagent Reservoirs, 5/Bag, Sterile | Costar | 4870 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermofisher | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | invitrogen | AMQAF1000 | |
| EnSpire Multimode Reader | Perkin Elmer | Enspire 2300 | |
| Eppendorf Research Plus Multi Channel Pipette, 8-channel | Eppendorf | 3122000051 | |
| FlowJo software | TreeStar | Ashland, OR, USA | |
| Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 115-035-062 | 1.5 mL |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson immunoresearch | 111-035-144 | 2.0 mL |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad Software | Inc., San Diego, CA, USA | |
| ImageJ | NIH | ||
| ImageQuant LAS 4000 mini | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Incubated shaker | Lab companion | SIF-6000R | |
| Multi Gauge Ver. 3.0, | Fujifilm | Tokyo, Japan | |
| Optical density (OD)LAMBDA UV/Vis Spectrophotometers | Perkin Elmer | Waltham, MA, USA | |
| Phase-contrast microscope | Olympus | Tokyo, Japan | |
| SPL microcentrifuge tube 1.5mL | SPL | 60015 | |
| SPL Multi Channel Reservoirs, 12-Chs, PS, Sterile | SPL | 21012 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | Waltham, MA, USA | |
| Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processors | SONICS-vibra cell | VC 505 | 500 Watt ultrasonic processor |
| Vinyl Anaerobic Chamber | COY LAB PRODUCTS |
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