Summary
Botmetastasemodellen ontwikkelen metastase niet uniform of met een 100% incidentie. Directe intra-osseuze tumorcelinjectie kan leiden tot embolisatie van de long. We presenteren onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot, wat leidt tot reproduceerbare transplantatie en groei.
Abstract
Primaire bottumoren of botmetastasen van solide tumoren resulteren in pijnlijke osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische / osteoblastische laesies. Deze laesies brengen de botstructuur in gevaar, verhogen het risico op pathologische fracturen en laten patiënten achter met beperkte behandelingsopties. Primaire bottumoren metastaseren naar verre organen, waarbij sommige typen zich kunnen verspreiden naar andere skeletlocaties. Recent bewijs suggereert echter dat met veel solide tumoren, kankercellen die zich naar het bot hebben verspreid, de primaire bron kunnen zijn van cellen die uiteindelijk uitzaaien naar andere orgaansystemen. De meeste syngenetische of xenograft-muismodellen van primaire bottumoren omvatten intra-osseuze (orthotopische) injectie van tumorcelsuspensies. Sommige diermodellen van skeletmetastase van solide tumoren zijn ook afhankelijk van directe botinjectie, terwijl anderen proberen extra stappen van de botmetastatische cascade samen te vatten door cellen intravasculair of in het orgaan van de primaire tumor te injecteren. Geen van deze modellen ontwikkelt echter botmetastase op betrouwbare wijze of met een incidentie van 100%. Bovendien is aangetoond dat directe intra-osseuze injectie van tumorcellen geassocieerd is met potentiële tumorembolisatie van de long. Deze embolische tumorcellen engraferen maar recapituleren de gemetastaseerde cascade niet. We rapporteerden een muismodel van osteosarcoom waarbij verse of gecryopreserveerde tumorfragmenten (bestaande uit tumorcellen plus stroma) rechtstreeks in het proximale scheenbeen worden geïmplanteerd met behulp van een minimaal invasieve chirurgische techniek. Deze dieren ontwikkelden reproduceerbare transplantatie, groei en, na verloop van tijd, osteolyse en longmetastase. Deze techniek heeft de veelzijdigheid om te worden gebruikt om solide tumorbotmetastase te modelleren en kan gemakkelijk grafts gebruiken die bestaan uit een of meerdere celtypen, genetisch gemodificeerde cellen, van de patiënt afgeleide xenografts en / of gelabelde cellen die kunnen worden gevolgd door optische of geavanceerde beeldvorming. Hier demonstreren we deze techniek, waarbij we primaire bottumoren en botmetastasen modelleren met behulp van implantatie van solide tumortransplantaat in bot.
Introduction
Muismodellen van ziekten bij mens en dier worden steeds populairder in biomedisch onderzoek. Het nut van het gebruik van muizen in deze context is dat hun anatomie en fysiologie erg lijken op mensen. Ze hebben een relatief korte draagtijd en tijd in het postnatale leven om volwassen te worden, en worden grotendeels geassocieerd met relatief lage kosten en gemak van huisvesting, hoewel toenemende kosten van ontwikkeling of aankoop geassocieerd zijn met grotere graden van genetische modificatie, immunodeficiëntie en / of humanisatie1. Het gebruik van inteeltstammen resulteert in een grotendeels uniforme dierpopulatie voorafgaand aan de opname in het onderzoek. Een volledige kennis van hun genoom suggereert een hoge mate van gelijkenis met mensen. Orthologe moleculaire doelwitten voor veel ziekteprocessen zijn geïdentificeerd in het muizengenoom en er is nu een uitgebreide bibliotheek van muisspecifieke reagentia die gemakkelijk verkrijgbaar zijn. Daarom bieden ze de mogelijkheid voor een relatief hoge doorvoeranalyse op een snellere en goedkopere manier in vergelijking met grotere diermodellen1. Bovendien, met de komst van genetische bewerkingsstrategieën die de overexpressie of deletie van bepaalde genen mogelijk maken, hetzij globaal, hetzij op een celtypespecifieke manier en / of constitutief of op een induceerbare manier, vertegenwoordigen ze een zeer biologisch nuttig modelsysteem voor het onderzoek van ziekten bij mens en dier2.
Kanker is een gebied waarin muismodellen een groot nut hebben. Genetische muismodellen van kanker vertrouwen op modulatie van de expressie van oncogenen of tumorsuppressorgenen, alleen of in combinatie, voor cellen om oncogene transformatie te ondergaan. De injectie van primaire of gevestigde tumorcellijnen in muizen wordt ook uitgevoerd. De introductie van cellijnen of weefsels van mensen of andere diersoorten, waaronder muizen, blijft het meest gebruikte model van kanker in vivo. Het gebruik van cellen en weefsels van verschillende soorten (xenografts) bij immuungecompromitteerde muizen wordt het meest uitgevoerd2. Het gebruik van allograft tumorcellen of weefsels waarbij zowel de gastheer als de ontvanger van dezelfde soort zijn, maakt echter de interactie met een intact immuunsysteem mogelijk in combinatie met dezelfde gastheermuizenstam in syngenetische systemen3.
Primaire bottumoren of botmetastasen van solide tumoren resulteren in pijnlijke osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische/osteoblastische laesies 3,4. Deze tumoren brengen de botstructuur in gevaar, waardoor het risico op pathologische fracturen toeneemt en patiënten beperkte behandelingsopties hebben. Primaire bottumoren metastaseren naar verre organen, waarbij sommige typen zich kunnen verspreiden naar andere skeletlocaties. Bij borstkankerpatiënten is bot de meest voorkomende plaats van eerste metastase en de meest voorkomende eerste plaats van presentatie van gemetastaseerde ziekte 5,6. Bovendien zijn gedissemineerde tumorcellen (DTC's) aanwezig in het beenmerg voorafgaand aan de diagnose van en voorspellen ze de ontwikkeling van metastase in andere organen7. Daarom wordt aangenomen dat kankercellen in het bot de bron zijn van cellen die uiteindelijk uitzaaien naar andere orgaansystemen. Er bestaan veel muismodellen van solide tumormetastase die metastase ontwikkelen, voornamelijk in de long- en lymfeklieren, en afhankelijk van het tumortype en de injectietechniek, mogelijk andere orgaansystemen3. Muismodellen van botmetastasen ontbreken echter die betrouwbaar, reproduceerbaar plaatsspecifieke skeletmetastase produceren en botmetastase ontwikkelen voordat muizen vroege verwijderingscriteria bereiken van primaire tumorbelasting of metastase naar andere organen. We hebben een model van het primaire bottumorosteosarcoom gerapporteerd dat afhankelijk is van de chirurgische implantatie van een solide tumorallograft in het proximale scheenbeen van muizen8. Bottumoren gevormd in 100% van de muizen en 88% ontwikkelde longmetastase. Deze incidentie van metastase overtreft wat gewoonlijk klinisch wordt gemeld bij mensen (~ 20-50%), maar is van groot belang omdat de long de meest voorkomende plaats van metastase is voor osteosarcoom 9,10,11. Hoewel dit model voordelig is bij het modelleren van primaire bottumoren, heeft het ook een groot nut bij het modelleren van botmetastasen van andere osteotrope solide tumoren zoals borst-, long-, prostaat-, schildklier-, lever-, nier- en gastro-intestinale tumoren.
De reden voor de ontwikkeling van dit model was om een alternatief te ontwikkelen voor de traditionele intra-botinjectie, meestal in het proximale scheenbeen of distale dijbeen om primaire bottumoren of botmetastase te modelleren12. Ons primaire doel was om een bekende beperking van deze techniek te verlichten, d.w.z. tumorembolisatie van de long. Dit resulteert in de engraftment van deze embolische tumorcellen en "artefactuele metastase" die niet de volledige metastatische cascade van een gevestigde primaire bottumor die uitzaait naar de longensamenvatten 8,13. Dit zou ook de situatie zijn wanneer een gevestigde botmetastase zich verspreidt naar een verre locatie. Bovendien werd deze techniek ook ontwikkeld om een model van botmetastase te produceren dat een grotere incidentie van engraftment en groei van tumoren in bot en op een uniforme plaats zou garanderen in vergelijking met orthotopische of intravasculaire injectietechnieken. Dit model heeft duidelijke voordelen ten opzichte van deze beschreven technieken. Dit model omvat gecontroleerde, consistente afgifte van tumorcellen in het bot. Het vermijdt ook artefactuele longmetastase na longembolisatie en stelt een uniforme basislijnstudiepopulatie vast. Er is het voordeel van locatiespecifieke tumoren met dit model zonder het risico van vroege verwijderingscriteria als gevolg van primaire tumoren of metastase naar andere organen. Ten slotte heeft dit model een groot nut voor modificatie, inclusief het gebruik van van de patiënt afgeleide xenografts.
Het gepresenteerde model heeft overeenkomsten met directe celsuspensie-injectie in bot na een chirurgische aanpak gevolgd door injectie door de cortex of afgifte in de mergholte na het maken van een klein defect in de cortex (met of zonder ruiming uit de medullaire holte)8,14,15,16,17. De implantatie van een tumor allograft maakt deze techniek echter duidelijk anders. Daarom was het doel van dit rapport om dit model van primaire bottumoren en botmetastase van solide tumoren aan te tonen, dat veel beperkingen van eerder beschreven modellen overwint. Onderzoeksgroepen met ervaring in celkweek, muismodellen, muisanesthesie en chirurgie en muisanatomie zijn goed uitgerust om onze techniek te reproduceren om primaire bottumoren of botmetastasen bij muizen te modelleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de institutionele dierverzorgings- en gebruikscommissie van de Universiteit van Cambridge, Cambridge, VK.
1. Bereiding van cellijnen
- Kweek cellijnen in overeenstemming met de standaard celkweekprotocollen van het laboratorium voor traditionele celkweek of injectie in muizen. Standaardprotocollen die hier worden gebruikt, zijn groei in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met 10% foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline / streptomycine (hierna bekend als volledig groeimedium).
OPMERKING: In dit experiment worden Abrams osteosarcoomcellen gebruikt in Balb/c Foxn1 nu/nu-muizen . Voor borstkankerstudies worden 4T1-cellen in Balb / c-muizen en EO771-cellen in C57BL / 6-muizen gebruikt. - Kweek cellen in geventileerde weefselkweekkolven of 6-well weefselkweekplaten bij 37 °C in 5% CO2.
- Passeer de cellijn van belang en bereid de cellen voor op injectie wanneer de cellen een samenvloeiing bereiken die vaak wordt gebruikt bij injectie van deze cellen in muizen.
2. Dieren
- Gebruik Balb/c Foxn1 nu/nu-muizen van ten minste 6-8 weken oud voor het genereren van subcutane tumoren om ervoor te zorgen dat de dieren voorbij de snelle groeifase zijn en de volwassenheid en skeletrijpheid hebben bereikt.
- Gebruik mannelijke of vrouwelijke muizen. Maak uitzonderingen bij het selecteren van hormoongevoelige cellijnen (bijvoorbeeld borstkankercellen bij vrouwelijke muizen en prostaatkankercellen bij mannelijke muizen).
- Gebruik voor xenograftexperimenten immunodeficiënte athymische naaktmuizen op basis van het feit dat de cellijn onder normale omstandigheden niet compatibel is met een intact muisimmuunsysteem.
- Voor allograft-experimenten met muizencellijnen wordt dit ook aanbevolen op basis van ongelijksoortige genetische en immuunachtergronden van muizen. Gebruik voor syngenetische experimenten echter dieren van dezelfde stam als de cellijn van belang.
- Gezelschapsdieren bij standaarddichtheden, afhankelijk van het houderijbeleid van de instelling.
3. Subcutane tumoren
- Oogst cellijnen uit cultuur door trypsinisatie en resuspendien in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Beoordeel de levensvatbaarheid van cellen en bepaal de celdichtheid met behulp van de trypan blue-uitsluitingsmethode. Gebruik een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen. Een minimale levensvatbaarheid van de cel van 90% moet worden gebruikt voor injectie in muizen om subcutane tumoren te creëren.
- Pas de celdichtheid aan om 1-2 x 105 cellen te injecteren in een eindvolume van 0,1 tot 0,15 ml (100 tot 150 μl) steriele PBS. Houd de cellen op ijs tot de injectie.
- Als alternatief, pellet cellen door centrifugeren op 800 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg en suspensie de gepelletiseerde cellen opnieuw in onverdund steriel keldermembraanmatrixmedium om 1-2 x 105 cellen te verkrijgen in een eindvolume van 0,1 tot 0,15 ml (100 tot 150 μl). Houd de cellen op ijs tot verder gebruik.
- Verdoof muizen om te worden gebruikt voor subcutane tumorgroei met isofluraan in zuurstofanesthesie. Gebruik een inductiedosis van 5% isofluraan in 2 L/min zuurstof en een onderhoudsdosis van 2-3% isofluraan in 2 L/min zuurstof. Controleer op het ontbreken van knipper- of pedaalreflexen voordat u verder gaat.
OPMERKING: Isofluraan is een inhalatie-anestheticum. Gebruik isofluraan in een goed geventileerde ruimte met geschikte opvang- en gasopvangsystemen. Raadpleeg het veterinaire personeel van de instelling om een plan te ontwikkelen voor anesthesie-inductie, onderhoud en monitoring, en zorg ervoor dat het laboratoriumpersoneel de juiste training heeft in anesthesiemonitoring en het hanteren van inhalatie-anesthetica. - Verwijder haar uit het dorsale gebied van de thorax of buik van verdoofde muizen met ontharingsoplossing of met een elektrische tondeuse. Ontharingsoplossing heeft de voorkeur om mogelijk trauma aan de huid te minimaliseren. Sla deze stap over als u athymische naaktmuizen gebruikt.
- Reinig het bereide gebied met een wattenstaafje van 70% ethanol voordat de celsuspensie wordt geïnjecteerd.
- Gebruik een tuberculinespuit van 1 ml met een naald van 27 G om cellen subcutaan over het dorsale gebied van de thorax of buik te injecteren, niet te worden beïnvloed door beweging van de schouderbladen. Als alternatief injecteer de cellen subcutaan als een suspensie in in de handel verkrijgbare extracellulaire matrix.
OPMERKING: Injectie in in de handel verkrijgbare extracellulaire matrix zal de migratie van de celsuspensie in de onderhuidse ruimte beperken omdat deze matrices stollen bij kamertemperatuur. - Herstel de muizen op een verwarmingskussen in individuele kooien totdat ze ambulant zijn. Muizen kunnen dan in hun normale kooien worden geplaatst met schoon, droog beddengoed.
- Controleer de grootte van de onderhuidse tumor boven de dorsale thorax of buik met een schuifmaat en meet wekelijks het lichaamsgewicht om ervoor te zorgen dat de onderhuidse tumoren niet zweren of muizen voldoen aan de criteria voor vroege verwijdering zoals vastgesteld door de commissie voor dierverzorging en -gebruik van de instellingen. Een maximale tumorgrootte van 15 mm in elke dimensie wordt aanbevolen om het risico op huidzweren of centrale tumornecrose te verminderen.
OPMERKING: Raadpleeg de lokale richtlijnen om de maximaal toelaatbare tumorgrootte/-volume te bepalen. - Euthanaseer muizen met subcutane tumoren na drie tot vier weken door CO 2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Volg het aanvaardbare beleid van de instelling voor muizeneuthanasie.
- Oogst subcutane tumoren met behulp van aseptische chirurgische techniek. Steriliseer de huid boven de tumor zoals voorheen met 70% ethanol na verwijdering van het haar (indien van toepassing). Insnijd door de huid boven de tumor met een # 15 scalpelmesje (met of zonder een scalpelmesje). Ontleed de tumor scherp uit de omliggende aangehechte zachte weefsels met een steriele chirurgische schaar.
- Plaats de tumor in 6-well weefselkweekplaten met volledig groeimedium en gehakt in meerdere kleine fragmenten van vooraf bepaalde grootte (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm - 0,25 mm3 tot 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm3) met een # 15 scalpelmes (met of zonder een scalpelmeshandvat).
- Behoud tumorfragmenten in steriel volledig groeimedium bij kamertemperatuur tot het moment van intratibiale implantatie. Voor cellijnen die luciferase- of fluorescerende reportergenen dragen, gebruikt u ex-vivo bioluminescente of fluorescerende beeldvorming om de levensvatbaarheid van de tumor te bevestigen voorafgaand aan intratibiale implantatie in muizen.
- Plaats voor cryopreservatie meerdere fragmenten in dezelfde cryoviaal in volledig groeimedium aangevuld met 20% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Vries geleidelijk in met behulp van een commercieel cryopreservatiesysteem bij –80 °C en bewaar langdurig in vloeibare stikstof. Bewaar tumorfragmenten voor latere analyse, maar niet voor toekomstige implantatie, door te bevriezen met behulp van vloeibare stikstofonderdompeling. Bewaar deze bevroren tumorfragmenten langdurig bij –80 °C.
OPMERKING: Er is eerder gemeld dat snap bevroren tumoren niet in vivo8 zullen enten en groeien.
4. Chirurgische implantatie van subcutane tumorfragmenten
- Breng verse of gecryopreserveerde fragmenten van subcutane tumor op kamertemperatuur in volledig groeimedium voorafgaand aan chirurgische implantatie.
- Verdoof muizen van de betreffende stam met behulp van isofluraan in zuurstofanesthesie zoals beschreven in rubriek 3. Controleer op het ontbreken van pedaalreflexen voordat u verder gaat. Dien subcutaan buprenorfine toe in een dosis van 0,02-0,05 mg/kg om peri-operatieve analgesie te verkrijgen. Dit kan elke 6-8 uur in de postoperatieve periode worden herhaald, indien nodig.
- Verwijder haar op het rechter kniegewricht en het proximale scheenbeen van de achterhand met een ontharingsoplossing om het potentiële trauma aan de huid te minimaliseren.
- Schrob het voorbereide gebied met chirurgisch antisepticum. Schrob eerst met een 70% ethanoldoekje en schrob vervolgens met afwisselend chloorhexidine en zoutoplossing scrub.
- Visualiseer het proximale scheenbeen als het gebied net distaal is van het kniegewricht tijdens het buigen en strekken van het gewricht.
- Maak een incisie van 3-4 mm ter hoogte van het proximale scheenbeen op het mediale aspect van de ledemaat met een # 15 scalpelblad (met of zonder een scalpelmeshandvat). Insnijd door de huid en het onderhuidse weefsel om de mediale cortex van het proximale scheenbeen bloot te leggen.
- Oefen zachte druk uit met de punt van een naald van 25 G, terwijl u ook de punt draait, om een klein gaatje in de mediale cortex van het proximale scheenbeen te creëren. Maak dit gat ongeveer 2 mm distaal van het kniegewricht op een punt op gelijke afstand tussen de craniale en caudale tibiale cortex. Selecteer de naaldgrootte afhankelijk van de grootte van de tumorfragmenten.
- Gebruik een steriele tang om de tumorfragmenten op te pakken en in te brengen in de medullaire holte van het proximale scheenbeen. Gebruik een naald van 27 tot 30 G om het tumorfragment in het medullaire kanaal te manipuleren. Afhankelijk van de grootte van de tumorfragmenten, implanteert u minimaal 0,5 mm3 totaal tumorvolume in elk scheenbeen. Dit kan implantatie van 1 of meer tumorfragmenten vereisen, afhankelijk van de grootte van de gecreëerde tumorfragmenten.
OPMERKING: Wijzigingen om verplaatsing van het transplantaat buiten het bot te voorkomen of te beperken, zijn het plaatsen van botwas of botcement in het botdefect of gelschuim of een onderhuids vettransplantaat over het gat in het bot. - Breng de huidranden aan met steriele vloeibare weefsellijm of een enkele huidhechting. Gebruik geen wondclips op deze site. Wees voorzichtig bij het gebruik van fluorescentiebeeldvorming in de postoperatieve periode, omdat zowel weefsellijmen als hechtingen het potentieel hebben om te fluoresceren.
- Herstel de muizen op een verwarmingskussen in individuele kooien totdat ze ambulant zijn.
5. Seriële en eindpuntbeoordeling
- Verdoof muizen met isofluraan in zuurstofanesthesie zoals eerder beschreven.
- Evalueer tibiale tumorgroei niet-invasief door wekelijkse digitale radiografie, bioluminescentie of fluorescentiebeeldvorming (als cellen luciferase of een fluorescerend reportergen worden gebruikt). Remklauwmetingen van de ledemaat op de plaats van implantatie kunnen ook worden uitgevoerd bij wakkere muizen.
- Naast de traditionele monitoring van tumordragende muizen (lichaamsgewicht, activiteitsniveau, ademhalingsfrequentie, verzorging, houding, mentatie en gedrag) controleert u muizen wekelijks op tekenen van kreupelheid van de achterpoten, zwelling en infectie van de operatieplaats.
- Controleer de huidchirurgische wond gedurende de eerste 10-14 dagen op overmatige roodheid, zwelling, drainage en wonddehiscentie totdat de huidwond is genezen. Evalueer na 4-5 weken muizen in overeenstemming met de evaluatie van de onderzoeksresultaten, levend of na euthanasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een positief resultaat zou geassocieerd zijn met tumortransplantatie en progressieve tumorgroei in de loop van de tijd. Afhankelijk van het tumortype kan intraossale tumorgroei worden geassocieerd met progressieve kreupelheid van de achterpoten, maar veel tumoren veroorzaken geen kreupelheid ondanks tekenen van bijbehorende botziekte. Succesvolle transplantatie werd gedocumenteerd met geavanceerde beeldvorming, waarbij er progressieve radiografische, μCT- of μMRI-veranderingen in het proximale scheenbeen zouden optreden die geassocieerd zijn met het botfenotype van de cellijn van belang (osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische / osteoblastische metastase) (figuur 1)8. In ons vorige rapport was het corticale defect dat ontstond voor implantatie van tumortransplantaat 1 week na implantatie zichtbaar in het proximale scheenbeen (figuur 1A). In week 2 was er zichtbare osteolyse en botremodellering naast het corticale defect. Vanaf week 2-5 was er progressieve botdestructie en de vorming van nieuw bot geassocieerd met tumortransplantatie en -groei (figuur 1B-E). Voor cellijnen met reportergenen zouden botveranderingen gepaard gaan met een toename van fluorescentie of bioluminescentiebeeldvormingsoutputs in de loop van de tijd. Acute kreupelheid kan een indicator zijn van dreigende of feitelijke pathologische botbreuken, waardoor onmiddellijke en zorgvuldige radiografische evaluatie van de muis en mogelijk vroege verwijdering uit het onderzoek noodzakelijk is. Afhankelijk van de tumorcellijn die wordt bestudeerd, kan botvernietiging snel optreden, ruim voor metastase. Dit is van specifiek belang in studies met primaire bottumoren, omdat muizen mogelijk uit het onderzoek moeten worden verwijderd voorafgaand aan de ontwikkeling van klinisch relevante metastase, namelijk naar de longen. In deze gevallen wordt chirurgische amputatie van de tumordragende ledemaat aanbevolen om de studie van minimale restziekte en daaropvolgende metastase mogelijk te maken bij gebruik van primaire bottumoren, zoals we eerder hebben gemeld 4,8. Hoewel volledige amputatie van de achterpoten bij mensen meestal niet wordt uitgevoerd, is dit de standaardzorg in de diergeneeskunde, waarvan de overeenkomsten in de klinische en moleculaire kenmerken van osteosarcoom bij mens en hond goed gedocumenteerd zijn. Amputatie van de achterpoten bij muizen is daarom relevant voor veel dierlijke cellijnen. Bovendien is amputatie een levensvatbare behandelingsmethode bij muizen, omdat ledemaatsparende procedures die bij mensen worden gebruikt, niet haalbaar zijn bij kleine knaagdieren zoals muizen. Bij muizen met primaire bottumoren kunnen inappetijtelijkheid, progressief gewichtsverlies, algemene slechte lichaamsconditie en ademhalingsmoeilijkheden (verhoogde snelheid of inspanning) de ontwikkeling van tumormetastase naar de longen en andere organen signaleren. Bevestiging door bioluminescente beeldvorming, μCT of μMRI-beeldvorming wordt aanbevolen om metastase te bevestigen en aangetaste dieren moeten worden geëuthanaseerd.
Een negatief resultaat, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van het ontbreken van tumortransplantatie, moet worden vermoed als er geen aanwijzingen zijn voor progressieve veranderingen (osteolytische, osteoblastische of gemengde osteolytische/osteoblastische laesies, afhankelijk van de cellijn die wordt bestudeerd) bij radiografie of μCT-onderzoek van het geïmplanteerde scheenbeen. Voor cellijnen die reportergenen dragen, zou het ontbreken van een toename van fluorescentie- of bioluminescentiesignalering in de loop van de tijd door optische beeldvorming ook een conclusie ondersteunen dat de tumor er niet in is geslaagd om te transplanteren. Gebrek aan of slechte transplantatie kan worden geassocieerd met infectie van de operatieplaats. Dit zou echter specifieke klinische symptomen vertonen, zoals roodheid, zwelling of afscheiding, meestal in de vroege postoperatieve periode (eerste 1-2 weken na de operatie). Dieren kunnen mogelijk ook koortsig zijn en een gebrek aan activiteit of gebogen houding vertonen in de vroege postoperatieve periode als gevolg van infectie op de operatieplaats. Het oogsten en onderhouden van de allografts onder steriele omstandigheden tijdens de voorbereiding en de juiste steriele voorbereiding van de ledemaat, steriele intraoperatieve techniek en volledige wondsluiting zal de kans op een postoperatieve chirurgische wondcomplicatie die resulteert in infectie en falen van tumortransplantatie minimaliseren.
In ons vorige rapport8, wanneer zowel de gerapporteerde pilot als de definitieve studies werden opgenomen, evolueerden 16 van de 16 muizen (100%) geïmplanteerd met osteosarcoomfragmenten naar osteolytische botlaesies en 14 van deze 16 muizen (88%) ontwikkelden metastase. Alle metastasen werden waargenomen in de longen en gediagnosticeerd door histologie al 3 weken na implantatie8. Extra dieren die na 1 (n=2) en 2 (n=2) weken na implantatie obductie werden verricht, vertoonden geen aanwijzingen voor longmetastasen.
Figuur 1: Seriële radiografie. Seriële radiografie (in volgorde) wekelijks uitgevoerd bij (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 en (E) 5 weken na intratibiale implantatie van een subcutane tumor allograft met behulp van een primaire bottumorcellijn (osteosarcoom). Na verloop van tijd was er progressieve botvernietiging en de vorming van nieuw bot geassocieerd met tumortransplantatie en groei. Dit cijfer is met toestemming gewijzigd ten opzichte van ref8. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport documenteert ons model om primaire bottumoren of botmetastase te creëren na de intratibiale implantatie van een tumor allograft. Wij zijn van mening dat er verschillende cruciale stappen in dit proces zijn. Een veilig anesthetisch vlak moet worden vastgesteld voor zowel subcutane injectie van de tumorcelsuspensie als intratibiale plaatsing van de resulterende tumorfragmenten. Er moet een steriele voorbereiding van de operatieplaats zijn voor zowel verwijdering van het subcutane allograft als intratibiale plaatsing van het allograft. Tumor allograft fragmenten moeten uniform worden gemaakt voor daaropvolgende intratibiale implantatie. Een defect van de juiste grootte in het proximale scheenbeen moet worden gecreëerd voor implantatie van tumorfragmenten. De chirurgische huidwond moet volledig worden gesloten om het risico op postoperatieve wondcomplicaties te verminderen. De laatste kritieke stap is dat als extracellulaire matrix wordt gebruikt als onderdeel van de tumorcelsuspensie voor subcutane injectie, het gebruik van door de fabrikant aanbevolen hanteringsinstructies moet worden uitgevoerd om stolling van de suspensie voorafgaand aan de injectie te voorkomen. Een goede steriele voorbereiding van de ledemaat, steriele intraoperatieve techniek en volledige wondsluiting zullen de kans op een postoperatieve chirurgische wondcomplicatie minimaliseren.
Kenmerken van de geïmplanteerde tumor en de chirurgische techniek zijn van cruciaal belang voor succesvolle en reproduceerbare resultaten voor opname in uw onderzoekspopulatie. In eerste instantie moet worden geverifieerd dat de tumor xenograft / allograft rechtstreeks in de medullaire holte van het scheenbeen wordt geïmplanteerd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het tumorweefsel zich volledig in het bot bevindt. Wijzigingen om verplaatsing van het transplantaat buiten het bot te voorkomen of te beperken, zijn in eerste instantie het plaatsen van botwas of botcement in het botdefect of gelschuim of een onderhuids vettransplantaat over het gat in het bot. Een alternatief zou zijn om de tumor allograft in te brengen door een gat op het laterale aspect van het proximale scheenbeen, gecreëerd onder de craniale tibiale spier. De aanwezigheid van de craniale tibiale spier zou dan dienen als een biologische dekking over het botdefect, waardoor potentiële verplaatsing van de tumor allograft wordt beperkt. Dit is echter een agressievere chirurgische benadering met het potentieel voor neuromusculair trauma op het laterale aspect van het proximale scheenbeen. Er moet voor worden gezorgd dat de tumorallografts vóór de implantatie van uniforme grootte worden gemaakt. Dat gezegd hebbende, mogen tumorallografts in geen enkele dimensie groter zijn dan 1 mm, omdat grotere tumorgroottes in elk biologisch systeem minder snel engraft dan kleinere grafts wanneer er geen directe, onmiddellijke vasculaire toevoer naar het transplantaat wordt verstrekt op het moment van implantatie. We hebben succesvolle resultaten gemeld met een uiteindelijk geïmplanteerd tumorvolume van 0,5 mm 3, maar verwachten dat gecombineerde tumorfragmentvolumes tot 1 mm3 succesvolle resultaten zullen opleveren. Het maximale implanteerbare tumorfragmentvolume is echter niet bepaald. In vergelijking met gecryopreserveerd weefsel hebben verse tumor xenografts en allografts meer kans om te overleven, hoewel we geen probleem hebben waargenomen met de praktijk van het gebruik van zorgvuldig gecryopreserveerde tumor allografts. Snap-frozen allografts mogen niet worden geïmplanteerd. Bovendien zal dissectie van de capsule en het buitenste deel van de onderhuidse tumor elke bijdrage van deze laag van de tumor voorkomen, die grotendeels vezelig en vasculair is met een significant immuuninfiltraat in plaats van grotendeels uit tumorcellen zelf te bestaan. Een alternatieve methode voor het maken van tumor allografts van de grotere tumormassa direct met een scalpelblad is door een kleine biopsienaald te gebruiken die een cilindrische tumor "kern" creëert die vervolgens vóór implantatie tot een vooraf gedefinieerde lengte kan worden gesneden. Het gebruik van een biopsienaald of kernbiopsiepons kan nuttig zijn bij het creëren van uniforme tumorfragmenten voor implantatie, want nadat twee uniforme afmetingen (breedte en diepte) zijn gecreëerd door het biopsieproces, kunnen ze vervolgens vóór implantatie op een geschikte lengte worden gesneden. Als reportergenen zoals luciferase of fluorescerende eiwitten worden gebruikt in de geïmplanteerde tumorcellen, zal evaluatie van tumorfragmenten op het moment van implantatie of 1 week na implantatie de relatieve bijdrage van tumorcellen in de geïmplanteerde tumorfragmenten aangeven, evenals levensvatbaarheid.
Zoals bij elke procedure, zijn er beperkingen naast onze gerapporteerde voordelen van deze techniek. Metastase is een proces met meerdere stappen waarbij een cel vanaf zijn primaire locatie met succes invasie in en migratie door de extracellulaire matrix moet uitvoeren, de bloedtoevoer van de tumor intravaseert, in circulatie overleeft totdat deze aankomt op zijn uiteindelijke gemetastaseerde bestemming, extravaseert in het orgaan zelf en vervolgens in een slapende toestand blijft of prolifereert om een gemetastaseerde laesie te creëren, en wijziging van de normale weefselarchitectuur om een klinisch detecteerbare metastase te worden18. Momenteel gebruikte muismodellen van botmetastase zijn grotendeels afhankelijk van directe orthotopische injectie van tumorcellen op de normale plaats van de primaire tumor, intravasculaire injectie in de linkerkamer van het hart of perifeer in de staartaders (laterale of dorsale caudale aderen), of directe intra-boteuze injectie van de tumorcelsuspensie3. Recente rapporten die proberen botmetastasemodellen te verbeteren, hebben echter gepleit voor injectie in de illiacale, caudale of femorale slagaders 19,20,21. Al deze methoden omvatten een of meer stappen binnen de botmetastatische cascade, behalve directe intra-botinjectie of in ons geval implantatie van een tumorallograft, die alleen eindweefselmodificatie modelleert. Daarom is dit een inherente beperking van onze techniek. Een bijkomende beperking is dat, zoals momenteel beschreven, het vereist dat de allografts in een tussenliggende muisgastheer worden gepropageerd, wat het gebruik van extra muizen vereist en resulteert in de implantatie van een tumor die niet 100% zuivere tumorcellen is. Het allograft zal een zekere stromale bijdrage bezitten die wordt geleverd door tumoren die op een onderhuidse locatie groeien. Een mogelijk alternatief om deze subcutane stromale bijdrage te minimaliseren zou de injectie van cellen subcutaan in een biologisch substraat zoals een extracellulaire matrix of steiger zijn. Als alternatief kan orthotopische injectie in de primaire plaats van de tumor, gevolgd door tumorverwijdering en transplantaatvoorbereiding worden uitgevoerd.
De methode die in dit rapport wordt beschreven, heeft belangrijke voordelen in vergelijking met bestaande methoden voor het modelleren van primaire bottumoren of botmetastase na de directe intra-osseuze injectie van tumorcellen. Zoals besproken, hebben wij en anderen directe embolisatie van de longen waargenomen en af en toe onmiddellijke dood na intratibiale injectie van een celsuspensie 8,13. Dit is het gevolg van een injectie onder druk van tumorcellen in de mergholte, waarna tumorcellen via vasculaire sinusoïden in het beenmerg de perifere bloedtoevoer binnendringen en door veneuze terugkeer naar de longen worden gebracht. Deze voorvallen zijn mechanistisch vergelijkbaar met die waargenomen bij pulmonale of veneuze trombo-embolie geassocieerd met plaatsing van implantaten onder druk in de mergholte geassocieerd met totale gewrichtsartroplastiek bij mensen en dieren. Wij en anderen veronderstellen dat dit embolische fenomeen voor de longen cellijnspecifiek kan zijn (ongepubliceerde waarnemingen). Er zijn echter zeer gedetailleerde stappen gemeld om de creatie van deze embolische artefactuele metastasen te beperken12. In eerste instantie moet er voldoende trypsinisatie zijn en een uniforme eencellige suspensie voor injectie worden gemaakt, die op ijs moet worden opgeslagen om celklontering te voorkomen. De naald moet op de juiste manier door de proximale tibiale groeischijf worden geplaatst, waarna kleine injectievolumes (~ 10 μL) en weerstandsvrije injecties in de mergholte moeten worden uitgevoerd. Desondanks kan de afgifte van tumorcellen aan de longen, en ook aan andere organen, gemakkelijk worden waargenomen door bioluminescentiebeeldvorming na intra-osseuze en intravasculaire injectietechnieken, wat suggereert dat het mogelijk is dat cellen die dit bioluminescente signaal in de longen en andere organen genereren, aanleiding kunnen geven tot metastase op afstand (ongepubliceerde waarnemingen)3. We hebben ontdekt dat een ander voordeel van deze techniek is dat een enkele tumor groeit op een uniforme botplaats binnen de onderzoekspopulatie, waardoor de variabiliteit van dier tot dier wordt verminderd. Dit maakt het mogelijk om een uniforme onderzoekspopulatie op te zetten en een vergelijking tussen behandelingsgroepen te maken. Dit in tegenstelling tot botmetastasen die zich ontwikkelen na orthotopische of intravasculaire injectie, waarbij het mogelijk is voor cellen om te metastaseren naar verschillende skeletlocaties en te groeien met verschillende kinetiek, waardoor vergelijkingen tussen studiegroepen een uitdaging vormen. Tumorgroei op één anatomische plaats na implantatie van onze tumorallografts vermijdt ook de mogelijkheid dat muizen worden verwijderd als gevolg van metastase naar andere orgaansystemen of primaire tumorbelasting, zoals te zien is bij intravasculaire en orthotopische injectietechnieken. Bovendien hebben we een 100% engraftment waargenomen na implantatie van tumorallograft, wat een uniforme onderzoekspopulatie ondersteunt en onnodig gebruik van extra muizen vermijdt om geschikte steekproefgrootteaantallen te bereiken. Dit overwint ook de beperking van onvolledige en onnauwkeurige injectie na percutane injectie van tumorcelsuspensies in bot.
Deze techniek heeft een grote mate van veelzijdigheid die heeft geresulteerd in modificaties die momenteel worden gebruikt in ons onderzoek en heeft het potentieel voor groot nut voor toekomstige toepassingen. In eerste instantie, terwijl we het proximale scheenbeen gebruiken als onze intra-botimplantatieplaats, kunnen andere veel voorkomende plaatsen van primaire bottumoren of botmetastase gemakkelijk worden gebruikt, inclusief maar niet beperkt tot het distale dijbeen en proximale opperarmbeen. De chirurgische benadering van deze plaatsen en van gebieden zoals het bekken en de wervelkolom vereist echter een geleidelijk uitgebreidere chirurgische aanpak in vergelijking met het proximale scheenbeen. Bovendien worden plaatsen zoals het bekken, de wervelkolom, de schedel, de radius en de ellepijp niet geprofiteerd van voldoende botvoorraad voor tumorimplantatie. Voor botinvasieve maligniteiten zoals bij orale tumoren kan plaatsing van de tumorallografts naast het bot of in de orofarynx ook de progressie van invasieve tumoren recapituleren 3,22. In vitro en in vivo experimenten maken vaak gebruik van co-cultuur of co-injectie technieken om de effecten van verschillende celtypen op een celtype van belang te bepalen. Daarom bestaat het potentieel voor injectie van twee of meer celtypen tegelijkertijd om de onderhuidse tumoren te creëren, die vervolgens met behulp van deze techniek in het bot kunnen worden geïmplanteerd. Genetisch gemodificeerde cellen kunnen alleen of in combinatie met andere normale of genetisch gemodificeerde cellen worden gebruikt om de tumor allografts te maken. Met de groeiende interesse in precisiegeneeskunde en het creëren van in vitro en in vivo modellen van menselijke kanker, wint patiënt-afgeleide xenografttransplantatie in muizen aan populariteit. Onlangs is een model van botmetastase bij borstkanker beschreven waarbij patiënt-afgeleide xenografts orthotopisch geïmplanteerd naar menselijke botschijven subcutaan geïmplanteerd in naakte muizen23. Hieruit konden patiënt-afgeleide xenografts direct in bot worden geïmplanteerd met behulp van ons model, zonder de noodzaak van een tussengastheer voor subcutane voortplanting. Dit zou de snelle evaluatie van tumorkinetiek mogelijk maken en het vermogen om meerdere behandelingscombinaties mogelijk te evalueren van slechts één patiëntbiopsie, zonder een grote tumormassa voor allograftpreparatie. Het toenemende gebruik van organoïden in kankeronderzoek zou ook kunnen worden gebruikt in ons model24. Dit zou naald- of pipetinjectie van deze celaggregaten door het gat in de tibiale cortex vereisen. We raden daarom aan om het corticale defect af te dichten (zoals hierboven besproken) om de mogelijkheid van organoïde migratie buiten de bot- en mergholte te beperken. Zoals we hebben uitgevoerd, kunnen cellen worden gelabeld en gevolgd door optische (bioluminescentie of fluorescentie) of geavanceerde (digitale radiografie, μCT of μMRI) beeldvorming waarmee de tumorgroei in de loop van de tijd kan worden beoordeeld. Dit heeft ook het voordeel dat het aantal dieren wordt geminimaliseerd, omdat dezelfde dieren in de loop van de tijd worden afgebeeld.
Samenvattend demonstreert dit rapport onze techniek voor het modelleren van primaire bottumoren en botmetastase met behulp van solide tumortransplantaatimplantatie in bot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Hildreth werd gefinancierd door de NIH onder awardnummer K01OD026527. Inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de NIH.
Acknowledgments
De auteurs erkennen de kritische bijdrage van Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP aan de ontwikkeling van deze techniek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
