Summary
Benmetastasmodeller utvecklar inte metastaser enhetligt eller med 100% förekomst. Direkt intraosseös tumörcellsinjektion kan resultera i embolisering av lungan. Vi presenterar vår teknik modellering primära bentumörer och benmetastaser med hjälp av solid tumörtransplantatimplantation i ben, vilket leder till reproducerbar engraftment och tillväxt.
Abstract
Primära bentumörer eller benmetastaser från solida tumörer resulterar i smärtsamma osteolytiska, osteoblastiska eller blandade osteolytiska / osteoblastiska lesioner. Dessa lesioner äventyrar benstrukturen, ökar risken för patologiska frakturer och lämnar patienter med begränsade behandlingsalternativ. Primära bentumörer metastaserar till avlägsna organ, med vissa typer som kan sprida sig till andra skelettplatser. Nya bevis tyder dock på att cancerceller som har spridit sig till ben med många solida tumörer kan vara den primära källan till celler som i slutändan metastaserar till andra organsystem. De flesta syngena eller xenograftmusmodeller av primära bentumörer involverar intraosseös (ortotopisk) injektion av tumörcellsuspensioner. Vissa djurmodeller av skelettmetastaser från solida tumörer beror också på direkt beninjektion, medan andra försöker rekapitulera ytterligare steg i benmetastaseringskaskaden genom att injicera celler intravaskulärt eller i organet i den primära tumören. Ingen av dessa modeller utvecklar emellertid benmetastaser på ett tillförlitligt sätt eller med en incidens på 100%. Dessutom har direkt intraossös injektion av tumörceller visat sig vara associerad med potentiell tumörembolisering av lungan. Dessa emboliska tumörceller transplanterar men rekapitulerar inte den metastatiska kaskaden. Vi rapporterade en musmodell av osteosarkom där färska eller kryokonserverade tumörfragment (bestående av tumörceller plus stroma) implanteras direkt i proximal tibia med hjälp av en minimalt invasiv kirurgisk teknik. Dessa djur utvecklade reproducerbar engraftment, tillväxt och över tiden osteolys och lungmetastaser. Denna teknik har mångsidigheten att användas för att modellera solid tumörbenmetastasering och kan lätt använda transplantat bestående av en eller flera celltyper, genetiskt modifierade celler, patienthärledda xenotransplantat och / eller märkta celler som kan spåras genom optisk eller avancerad bildbehandling. Här demonstrerar vi denna teknik, modellering av primära bentumörer och benmetastaser med hjälp av solid tumörtransplantatimplantation i ben.
Introduction
Musmodeller av sjukdomar hos människor och djur blir allt populärare inom biomedicinsk forskning. Nyttan med att använda möss i detta sammanhang är att deras anatomi och fysiologi är mycket lik människor. De har en relativt kort graviditetsperiod och tid i postnatalt liv för att uppnå mognad och är till stor del förknippade med en relativt låg kostnad och enkel bostad, även om ökande kostnader för utveckling eller inköp är förknippade med högre grader av genetisk modifiering, immunbrist och / eller humanisering1. Användning av inavlade stammar resulterar i en i stort sett enhetlig djurpopulation före inkludering i studien. En fullständig kunskap om deras genom tyder på en hög grad av likhet med människor. Ortologa molekylära mål för många sjukdomsprocesser har identifierats i musgenomet och det finns nu ett omfattande bibliotek av musspecifika reagens som är lätta att få. Därför ger de möjlighet till analys med relativt hög genomströmning på ett snabbare och billigare sätt jämfört med större djurmodeller1. Dessutom, med tillkomsten av genetiska redigeringsstrategier som möjliggör överuttryck eller radering av vissa gener antingen globalt eller på ett celltypspecifikt sätt och / eller konstitutivt eller på ett inducerbart sätt, representerar de ett mycket biologiskt användbart modellsystem för undersökning av sjukdomar hos människor och djur2.
Cancer är ett område där musmodeller har stor nytta. Genetiska musmodeller av cancer är beroende av modulering av uttrycket av antingen onkogener eller tumörsuppressorgener, ensamma eller i kombination, för att celler ska genomgå onkogen transformation. Injektionen av primära eller etablerade tumörcellinjer i möss utförs också. Införandet av antingen cellinjer eller vävnader från människor eller andra djurarter, inklusive möss, är fortfarande den mest använda modellen för cancer in vivo. Användningen av celler och vävnader från olika arter (xenotransplantat) hos immunsupprimerade möss utförs oftast2. Användningen av transplantattumörceller eller vävnader där både värden och mottagaren är av samma art möjliggör emellertid interaktion med ett intakt immunsystem i kombination med samma värdmusstam i syngena system3.
Primära bentumörer eller benmetastaser från solida tumörer resulterar i smärtsamma osteolytiska, osteoblastiska eller blandade osteolytiska / osteoblastiska lesioner 3,4. Dessa tumörer äventyrar benstrukturen, ökar risken för patologisk fraktur och lämnar patienter med begränsade behandlingsalternativ. Primära bentumörer metastaserar till avlägsna organ, med vissa typer som kan sprida sig till andra skelettplatser. Hos bröstcancerpatienter är ben det vanligaste stället för första metastasering och det vanligaste första stället för presentation av metastaserad sjukdom 5,6. Dessutom finns disseminerade tumörceller (DTC) i benmärgen före diagnos av och förutsäger utvecklingen av metastaser i andra organ7. Därför tror man att cancerceller som finns i ben är källan till celler som i slutändan metastaserar till andra organsystem. Det finns många musmodeller av solida tumörmetastaser som utvecklar metastaser främst i lung- och lymfkörtlarna, och beroende på tumörtyp och injektionsteknik, potentiellt andra organsystem3. Det saknas dock musmodeller av benmetastaser som på ett tillförlitligt sätt reproducerbart producerar platsspecifika skelettmetastaser och utvecklar benmetastaser innan möss når tidiga borttagningskriterier från primär tumörbörda eller metastasering till andra organ. Vi har rapporterat en modell av den primära bentumören osteosarkom som bygger på kirurgisk implantation av ett fast tumörallograft i proximal tibia hos möss8. Bentumörer bildades hos 100% av mössen och 88% utvecklade lungmetastaser. Denna incidens av metastaser överstiger vad som vanligen rapporteras kliniskt hos människor (~20-50%), men är av stort intresse eftersom lungan är den vanligaste platsen för metastaser för osteosarkom 9,10,11. Även om denna modell är fördelaktig vid modellering av primära bentumörer, har den också stor nytta vid modellering av benmetastaser från andra osteotropa solida tumörer såsom bröst-, lung-, prostata-, sköldkörtel-, lever-, njur- och gastrointestinala tumörer.
Anledningen till utvecklingen av denna modell var att utveckla ett alternativ till den traditionella intraosseösa injektionen, vanligtvis i proximal tibia eller distalt lårben, för att modellera primära bentumörer eller benmetastaser12. Vårt primära mål var att lindra en känd begränsning av denna teknik, dvs tumörembolisering av lungan. Detta resulterar i engraftment av dessa emboliska tumörceller och "artefaktisk metastasering" som inte rekapitulerar den fullständiga metastatiska kaskaden från en etablerad primär bentumör som metastaserar till lungorna 8,13. Detta skulle också vara situationen när en etablerad benmetastas sprider sig till en avlägsen plats. Dessutom utvecklades denna teknik också för att producera en modell av benmetastaser som skulle säkerställa en större förekomst av engraftment och tillväxt av tumörer i ben och på en enhetlig plats jämfört med ortotopisk eller intravaskulär injektionsteknik. Denna modell har tydliga fördelar jämfört med dessa beskrivna tekniker. Denna modell innebär kontrollerad, konsekvent leverans av tumörceller i benet. Det undviker också artefaktisk lungmetastasering efter lungembolisering och etablerar en enhetlig studiepopulation vid baslinjen. Det finns fördelen med platsspecifika tumörer med denna modell utan risk för tidiga borttagningskriterier till följd av primära tumörer eller metastaser till andra organ. Slutligen har denna modell stor nytta för modifiering, inklusive användning av patient-härledda xenotransplantat.
Den presenterade modellen har likheter med direkt cellsuspension, injektion i ben, efter ett kirurgiskt tillvägagångssätt följt av antingen injektion genom cortex eller leverans i märghålan efter att ha gjort en liten defekt i cortex (med eller utan brotschning ut ur medulärhålan)8,14,15,16,17 . Implantationen av en tumörallograft gör emellertid denna teknik tydligt annorlunda. Syftet med denna rapport var därför att demonstrera denna modell av primära bentumörer och benmetastaser från solida tumörer, vilket övervinner många begränsningar av tidigare beskrivna modeller. Forskargrupper med erfarenhet av cellodling, musmodeller, musanestesi och kirurgi samt musanatomi är väl rustade för att reproducera vår teknik för att modellera primära bentumörer eller benmetastaser hos möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av den institutionella djurvårds- och användningskommittén vid University of Cambridge, Cambridge, Storbritannien.
1. Beredning av cellinjer
- Odla cellinjer i enlighet med laboratoriets standardcellodlingsprotokoll för traditionell cellodling eller injektion i möss. Standardprotokoll som används här är tillväxt i Dulbeccos modifierade Eagles medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS), L-glutamin och penicillin / streptomycin (nedan känt som komplett tillväxtmedium).
OBS: I detta experiment används Abrams osteosarkomceller i Balb / c Foxn1 nu / nu-möss . För bröstcancerstudier används 4T1-celler i Balb/c-möss och EO771-celler i C57BL/6-möss. - Odla celler i antingen ventilerade vävnadsodlingskolvar eller 6-brunnsplattor för vävnadsodling vid 37 °C i 5 %CO2.
- Passera cellinjen av intresse och förbered cellerna för injektion när cellerna når ett sammanflöde som vanligtvis används med injektion av dessa celler i möss.
2. Djur
- Använd Balb / c Foxn1 nu / nu-möss minst 6-8 veckors ålder för subkutan tumörgenerering för att säkerställa att djuren är bortom den snabba tillväxtfasen och har uppnått vuxen ålder och skelettmognad.
- Använd antingen manliga eller kvinnliga möss. Gör undantag när du väljer hormonresponsiva cellinjer (t.ex. bröstcancerceller hos honmöss och prostatacancerceller hos hanmöss).
- För xenograftexperiment, använd immunbristfälliga athymiska nakna möss baserat på att cellinjen är inkompatibel med ett intakt musimmunsystem under normala förhållanden.
- För allograftexperiment med murina cellinjer rekommenderas detta också baserat på olika musgenetiska och immunbakgrunder. För syngena experiment, använd dock djur av samma stam som cellinjen av intresse.
- Husdjur vid standardtätheter beroende på institutionens djurhållningspolitik.
3. Subkutana tumörer
- Skörda cellinjer från odling genom trypsinisering och resuspendera i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Bedöm cellviabilitet och bestäm celldensiteten med trypanblå uteslutningsmetoden. Använd en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare för att räkna cellerna. En minsta cellviabilitet på 90% ska användas för injektion i möss för att skapa subkutana tumörer.
- Justera celldensiteten för att injicera 1-2 x 105 celler i en slutlig volym av 0,1 till 0,15 ml (100 till 150 μL) steril PBS. Håll cellerna på is tills injektion.
- Alternativt pelletsceller genom centrifugering vid 800 x g i 5 min. Kassera supernatanten och suspendera de pelleterade cellerna igen i outspätt sterilt basalmembranmembranmedium för att erhålla 1-2 x 105 celler i en slutlig volym av 0,1 till 0,15 ml (100 till 150 μl). Håll cellerna på is tills vidare användning.
- Bedöva möss som ska användas för subkutan tumörtillväxt med isofluran i syreanestesi. Använd en induktionsdos på 5 % isofluran i 2 l/min syrgas och en underhållsdos på 2-3 % isofluran i 2 l/min syrgas. Kontrollera om det inte finns blink- eller pedalreflexer innan du fortsätter.
OBS: Isofluran är ett inhalationsbedövningsmedel. Använd isofluran i ett väl ventilerat utrymme med lämpliga rensnings- och frigasuppsamlingssystem. Rådgör med institutionens veterinärpersonal för att utveckla en plan för anestesiinduktion, underhåll och övervakning, och se till att laboratoriepersonalen har lämplig utbildning i anestesiövervakning och hantering av inhalationsanestesimedel. - Ta bort hår från dorsala regionen i bröstkorgen eller buken hos bedövade möss med depileringslösning eller med en elektrisk klippare. Depilating lösning är att föredra för att minimera potentiella trauma på huden. Hoppa över det här steget om du använder atymiska nakna möss.
- Rengör det förberedda området med en 70% etanolpinne före injektion av cellsuspensionen.
- Använd en 1 ml tuberkulinspruta med en 27 G nål för att injicera celler subkutant över bröstkorgens eller bukens dorsala område, för att inte påverkas av axelbladens rörelse. Alternativt injiceras cellerna subkutant som en suspension i kommersiellt tillgänglig extracellulär matris.
OBS: Injektion i kommersiellt tillgänglig extracellulär matris kommer att begränsa migrationen av cellsuspensionen i det subkutana utrymmet eftersom dessa matriser stelnar vid rumstemperatur. - Återställ mössen på en värmedyna i enskilda burar tills de är ambulerande. Möss kan sedan placeras i sina vanliga burar med rent, torrt strö.
- Övervaka storleken på den subkutana tumören som ligger över dorsala bröstkorgen eller buken med en bromsok och mäta kroppsvikt varje vecka för att säkerställa att de subkutana tumörerna inte sår eller möss uppfyller kriterier för tidig borttagning som fastställts av institutionernas djurvårds- och användningskommitté. En maximal tumörstorlek på 15 mm i vilken dimension som helst rekommenderas för att minska risken för hudsår eller central tumörnekros.
OBS: Konsultera lokala riktlinjer för att bestämma maximal tillåten tumörstorlek / volym. - Avliva möss som bär subkutana tumörer efter tre till fyra veckor genom CO2-inandning följt av cervikal dislokation. Följ institutionens acceptabla policyer för museutanasi.
- Skörda subkutana tumörer med aseptisk kirurgisk teknik. Sterilisera huden som ligger över tumören som tidigare med 70% etanol efter borttagning av håret (om tillämpligt). Snitt genom huden som ligger över tumören med ett skalpellblad # 15 (med eller utan skalpellbladhandtag). Kraftigt dissekera tumören från de omgivande bifogade mjuka vävnaderna med ett par sterila kirurgiska saxar.
- Placera tumören i 6-brunns vävnadsodlingsplattor som innehåller fullständigt tillväxtmedium och haka i flera små fragment av förutbestämd storlek (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm - 0,25 mm 3 upp till 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm3) med ett # 15 skalpellblad (med eller utan skalpellbladhandtag).
- Behåll tumörfragment i sterilt komplett tillväxtmedium vid rumstemperatur tills tiden för intratibial implantation. För cellinjer som bär luciferas eller fluorescerande reportergener, använd ex-vivo bioluminescerande eller fluorescerande avbildning för att bekräfta tumörens livskraft före intratibial implantation i möss.
- För kryokonservering, placera flera fragment i samma kryovial i komplett tillväxtmedium kompletterat med 20% FBS och 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Frys gradvis med ett kommersiellt kryokonserveringssystem vid –80 °C och lagra långsiktigt i flytande kväve. Bevara tumörfragment för efterföljande analys, men inte för framtida implantation, genom snäppfrysning med nedsänkning av flytande kväve. Förvara dessa frysta tumörfragment under lång tid vid –80 °C.
OBS: Det har tidigare rapporterats att snapfrysta tumörer inte kommer att transplantera och växa in vivo8.
4. Kirurgisk implantation av subkutana tumörfragment
- Ta färska eller kryokonserverade fragment av subkutan tumör till rumstemperatur i fullständigt tillväxtmedium före kirurgisk implantation.
- Bedövar möss av den stam som är av intresse med isofluran i syreanestesi enligt beskrivningen i avsnitt 3. Kontrollera om det saknas pedalreflexer innan du fortsätter. Administrera subkutant buprenorfin i en dos på 0,02-0,05 mg/kg för att ge perioperativ analgesi. Detta kan upprepas var 6-8 h i den postoperativa perioden, om det behövs.
- Ta bort hår på höger knäled och proximal skenben i bakbenet med hårborttagningslösning för att minimera det potentiella traumat på huden.
- Skrubba det förberedda området med kirurgiskt antiseptiskt medel. Skrubba först med en 70% etanolpinne och skrubba sedan med omväxlande klorhexidin och saltlösning.
- Visualisera det proximala skenbenet som regionen bara distalt mot knäleden medan du böjer och förlänger leden.
- Skapa ett 3-4 mm snitt i nivå med det proximala skenbenet på den mediala aspekten av lemmen med ett skalpellblad #15 (med eller utan skalpellbladshandtag). Snitt genom huden och subkutan vävnad för att exponera den mediala cortexen i proximal tibia.
- Applicera försiktigt tryck med spetsen på en 25 G nål, samtidigt som du roterar spetsen, för att skapa ett litet hål i mediala cortex i proximal tibia. Gör detta hål ungefär 2 mm distalt mot knäleden vid en punkt som är lika långt mellan kraniala och kaudala tibialcortexer. Välj nålstorlek beroende på tumörfragmentens storlek.
- Använd sterila pincett för att plocka upp och sätta in tumörfragmenten i medulärhålan i den proximala skenbenet. Använd en 27 till 30 G nål för att manipulera tumörfragmentet i medulärkanalen. Beroende på storleken på tumörfragmenten, implantera minst 0,5 mm3 total tumörvolym i varje skenben. Detta kan kräva implantation av 1 eller flera tumörfragment beroende på storleken på tumörfragment som skapas.
OBS: Modifieringar för att förhindra eller begränsa förskjutning av transplantatet utanför benet skulle vara placering av benvax eller bencement i bendefekten eller antingen gelskum eller ett subkutant fetttransplantat över hålet i benet. - Applicera hudkanterna med sterilt flytande vävnadslim eller en enda hudsutur. Använd inte sårklämmor på den här webbplatsen. Var försiktig om du använder fluorescensavbildning under den postoperativa perioden, eftersom både vävnadslim och sutur har potential att fluorescera.
- Återställ mössen på en värmedyna i enskilda burar tills de är ambulerande.
5. Seriell bedömning och slutpunktsbedömning
- Bedöva möss med isofluran i syreanestesi som beskrivits tidigare.
- Utvärdera tibial tumörtillväxt icke-invasivt genom antingen veckovis digital radiografi, bioluminescens eller fluorescensavbildning (om du använder celler som uttrycker luciferas eller en fluorescerande reportergen). Bromsokmätningar av lemmen vid implantationsstället kan också utföras hos vakna möss.
- Förutom den traditionella övervakningen av tumörbärande möss (kroppsvikt, aktivitetsnivå, andningsfrekvens, grooming, hållning, mentation och beteende) övervaka möss varje vecka för tecken på hälta i bakbenen, svullnad och infektion i operationsområdet.
- Övervaka det hudkirurgiska såret under de första 10-14 dagarna för överdriven rodnad, svullnad, dränering och sårdehiscens tills hudsåret är läkt. Efter 4-5 veckor, utvärdera möss i enlighet med utvärderingen av studieutfallet, antingen levande eller efter eutanasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett positivt resultat skulle vara förknippat med tumörgravering och progressiv tumörtillväxt över tiden. Beroende på tumörtyp kan intraosseös tumörtillväxt associeras med progressiv hälta i bakbenen, men många tumörer orsakar inte hälta trots tecken på åtföljande bensjukdom. Framgångsrik engraftment dokumenterades med avancerad avbildning, varigenom det skulle finnas progressiva radiografiska, μCT- eller μMRI-förändringar i den proximala skenbenet associerade med benfenotypen för cellinjen av intresse (osteolytisk, osteoblastisk eller blandad osteolytisk / osteoblastisk metastas) (figur 1) 8. I vår tidigare rapport var den kortikala defekten som skapades för tumörtransplantatimplantation synlig i proximal tibia 1 vecka efter implantation (figur 1A). Vid vecka 2 fanns det synlig osteolys och benremodellering intill kortikala defekten. Från vecka 2-5 skedde progressiv benförstöring och bildandet av nytt ben i samband med tumörgravering och tillväxt (Figur 1B-E). För cellinjer med rapportgener skulle benförändringar åtföljas av ökningar av fluorescens- eller bioluminiscensavbildningsutgångar över tiden. Akut hälta kan vara en indikator på förestående eller faktisk patologisk benfraktur, vilket kräver omedelbar och noggrann röntgenundersökning av musen och eventuellt tidigt avlägsnande från studien. Beroende på tumörcellinjen som studeras kan benförstöring ske snabbt, långt före metastasering. Detta är av särskild betydelse i studier med primära bentumörer, eftersom möss kan behöva tas bort från studien före utveckling av kliniskt relevant metastasering, nämligen till lungan. I dessa fall rekommenderas kirurgisk amputation av den tumörbärande extremiteten för att möjliggöra studier av minimal kvarvarande sjukdom och efterföljande metastaser vid användning av primära bentumörer, som vi tidigare rapporterat 4,8. Medan fullständig amputation av bakbenen hos människor vanligtvis inte utförs, är detta standard för vård inom veterinärmedicin, varav likheterna i de kliniska och molekylära egenskaperna hos humant och hundosteosarkom är väldokumenterade. Amputation av bakben hos möss är därför relevant för många djurcellinjer. Dessutom är amputation en livskraftig behandlingsmetod hos möss eftersom lemsparande procedurer som används hos människor inte kan uppnås hos små gnagare som möss. Hos möss med primära bentumörer kan aptitlöshet, progressiv viktminskning, allmänt dåligt kroppstillstånd och andningssvårigheter (ökad hastighet eller ansträngning) signalera utvecklingen av tumörmetastaser till lungan och andra organ. Bekräftelse genom bioluminescerande avbildning, μCT eller μMRI-avbildning rekommenderas för att bekräfta metastasering, och drabbade djur bör avlivas.
Ett negativt resultat, troligen till följd av avsaknad av tumörgravering, bör misstänkas om det inte finns några tecken på progressiva förändringar (osteolytiska, osteoblastiska eller blandade osteolytiska / osteoblastiska lesioner, beroende på cellinjen som studeras) vid röntgen eller μCT-undersökning av den implanterade skenbenet. För cellinjer som bär reportergener skulle bristen på en ökning av fluorescens- eller bioluminescenssignalering över tid genom optisk avbildning också stödja en slutsats att tumören har misslyckats med att engagera sig. Brist på eller dålig engraftment kan associeras med infektion i operationsområdet. Detta skulle dock uppvisa specifika kliniska tecken som rodnad, svullnad eller urladdning oftast under den tidiga postoperativa perioden (första 1-2 veckor efter operationen). Djur kan potentiellt också vara febrila och visa brist på aktivitet eller böjd hållning i den tidiga postoperativa perioden på grund av infektion i operationsområdet. Skörd och underhåll av allotransplantat under sterila förhållanden under beredning och korrekt steril förberedelse av lemmen, steril intraoperativ teknik och fullständig sårförslutning minimerar sannolikheten för en postoperativ kirurgisk sårkomplikation som resulterar i infektion och misslyckande av tumörgravering.
I vår tidigare rapport8, när vi inkluderade både de rapporterade pilot- och definitiva studierna, utvecklades 16 av 16 möss (100%) implanterade med osteosarkomfragment till osteolytiska benskador och 14 av dessa 16 möss (88%) utvecklade metastaser. Alla metastaser observerades i lungan och diagnostiserades genom histologi så tidigt som 3 veckor efter implantation8. Ytterligare djur som obducerades 1 (n=2) och 2 (n=2) veckor efter implantation visade inga tecken på lungmetastaser.
Figur 1: Seriell radiografi. Seriell radiografi (i ordning) utförd varje vecka vid (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 och (E) 5 veckor efter intratibial implantation av ett subkutant tumörallograft med användning av en primär bentumörcellinje (osteosarkom). Med tiden var det progressiv benförstöring och bildandet av nytt ben i samband med tumörgravering och tillväxt. Denna siffra har ändrats med tillstånd från ref8. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna rapport dokumenterar vår modell för att skapa primära bentumörer eller benmetastaser efter intratibial implantation av en tumörallograft. Vi anser att det finns flera kritiska steg i denna process. Ett säkert anestesiplan bör upprättas för både subkutan injektion av tumörcellsuspensionen och intratibiell placering av de resulterande tumörfragmenten. Det bör finnas steril förberedelse av operationsområdet för både avlägsnande av subkutan allograft och intratibiell placering av allograften. Tumörallograftfragment bör skapas enhetligt för efterföljande intratibiell implantation. En defekt av lämplig storlek i proximal skenben bör skapas för implantation av tumörfragment. Det kirurgiska hudsåret ska stängas helt för att minska risken för postoperativa sårkomplikationer. Det sista kritiska steget är att om extracellulär matris används som en del av tumörcellsuspensionen för subkutan injektion, ska tillverkarens rekommenderade hanteringsinstruktioner användas för att undvika stelning av suspensionen före injektion. Korrekt steril förberedelse av lemmen, steril intraoperativ teknik och fullständig sårförslutning minimerar sannolikheten för en postoperativ kirurgisk sårkomplikation.
Funktioner hos den implanterade tumören och den kirurgiska tekniken är avgörande för framgångsrika och reproducerbara resultat för införlivande i din studiepopulation. Inledningsvis bör det verifieras att tumören xenograft / allograft implanteras direkt i tibias medullära hålighet, så att tumörvävnaden är helt inne i benet. Modifieringar för att förhindra eller begränsa förskjutning av transplantatet utanför benet skulle initialt vara placering av benvax eller bencement i bendefekten eller antingen gelskum eller ett subkutant fetttransplantat över hålet i benet. Ett alternativ skulle vara att sätta in tumörallograft genom ett hål på den laterala aspekten av proximal tibia, skapad under kranial tibialmuskeln. Närvaron av kranial tibialmuskeln skulle då fungera som ett biologiskt skydd över bendefekten, vilket begränsar potentiell förskjutning av tumörallograften. Detta är dock ett mer aggressivt kirurgiskt tillvägagångssätt med potential för neuromuskulärt trauma på den laterala aspekten av proximal tibia. Försiktighet bör vidtas för att säkerställa att tumörtransplantaten skapas för att vara av enhetlig storlek före implantation. Med detta sagt bör tumörallotransplantat inte överstiga 1 mm i någon dimension, eftersom större tumörstorlekar i något biologiskt system är mindre benägna att transplantera än mindre transplantat när det inte finns en direkt, omedelbar vaskulär tillförsel till transplantatet vid implantationstillfället. Vi har rapporterat framgångsrika resultat med en slutlig implanterad tumörvolym på 0,5 mm 3 men förväntar oss att kombinerade tumörfragmentvolymer upp till 1 mm3 kommer att uppnå framgångsrika resultat. Den maximala implanterbara tumörfragmentvolymen har emellertid inte fastställts. Jämfört med kryokonserverad vävnad är färska tumörxenotransplantat och allotransplantat mer benägna att överleva, även om vi inte har observerat ett problem med övningen att använda noggrant kryokonserverade tumörallotransplantat. Snap-frysta allotransplantat ska inte implanteras. Dessutom kommer dissektion av kapseln och den yttre delen av den subkutana tumören att förhindra något bidrag från detta lager av tumören, som till stor del är fibröst och vaskulär med ett signifikant immuninfiltrat snarare än att till stor del bestå av tumörceller korrekt. En alternativ metod för att skapa tumörallotransplantat från den större tumörmassan direkt med ett skalpellblad är att använda en liten biopsinål som skapar en cylindrisk tumörkärna som sedan kan skäras till en fördefinierad längd före implantation. Användning av en biopsinål eller kärnbiopsi stans kan vara fördelaktigt för att skapa enhetliga tumörfragment för implantation, för efter att två enhetliga dimensioner (bredd och djup) har skapats genom biopsiprocessen kan de sedan skäras till en lämplig längd före implantation. Om rapportgener såsom luciferas eller fluorescerande proteiner används i de implanterade tumörcellerna, kommer utvärdering av tumörfragment vid implantationstidpunkten eller 1 vecka efter implantation att indikera relativt bidrag från tumörceller i de implanterade tumörfragmenten, såväl som livskraft.
Som med alla procedurer finns det begränsningar utöver våra rapporterade fördelar med denna teknik. Metastasering är en flerstegsprocess som kräver att en cell från sin primära plats framgångsrikt utför invasion in i och migration genom den extracellulära matrisen, intravaserar tumörens blodtillförsel, överlever i cirkulation tills den anländer till sin slutliga metastatiska destination, extravaserar in i det egentliga organet och sedan antingen stannar i vilande tillstånd eller prolifererar för att skapa en metastatisk skada, och modifiering av den normala vävnadsarkitekturen för att bli en kliniskt detekterbar metastasering18. För närvarande används musmodeller av benmetastaser förlitar sig till stor del på antingen direkt ortotopisk injektion av tumörceller i den primära tumörens normala plats, intravaskulär injektion i hjärtats vänstra kammare eller perifert i svansvenerna (laterala eller dorsala kaudala vener) eller direkt intraossös injektion av tumörcellsuspensionen3. Nya rapporter som försöker förbättra benmetastasmodeller har dock förespråkat injektion i illiac-, caudal- eller lårbensartärerna 19,20,21. Alla dessa metoder innehåller ett eller flera steg inom benmetastaseringskaskaden, förutom direkt intraossös injektion eller i vårt fall implantation av en tumörallograft, som endast modellerar slutvävnadsmodifiering. Därför är detta en inneboende begränsning av vår teknik. En ytterligare begränsning är att det, som för närvarande beskrivs, kräver förökning av allotransplantaten i en mellanliggande musvärd, vilket kräver användning av ytterligare möss och resulterar i implantation av en tumör som inte är 100% rena tumörceller. Allograftet kommer att ha ett visst stromalt bidrag från tumörer som växer på en subkutan plats. Ett potentiellt alternativ för att minimera detta subkutana stromabidrag skulle vara injektion av celler subkutant i ett biologiskt substrat såsom en extracellulär matris eller byggnadsställning. Alternativt kan ortotopisk injektion i tumörens primära plats, följt av tumöravlägsnande och transplantatberedning utföras.
Metoden som beskrivs i denna rapport har viktiga fördelar jämfört med befintliga metoder för modellering av primära bentumörer eller benmetastaser efter direkt intraossös injektion av tumörceller. Som diskuterats har vi och andra observerat direkt embolisering av lungorna och tillfällig omedelbar död efter intratibial injektion av en cellsuspension 8,13. Detta är resultatet av en trycksatt injektion av tumörceller i märghålan, varefter tumörceller kommer in i perifer blodtillförsel genom benmärgs vaskulära sinusoider och transporteras till lungan genom venös retur. Dessa händelser är mekaniskt jämförbara med den som observerats med pulmonell eller venös tromboembolism associerad med trycksatt placering av implantat i märghålan associerad med total ledartroplastik hos människor och djur. Vi och andra antar att detta emboliska fenomen i lungorna kan vara cellinjespecifikt (opublicerade observationer). Mycket detaljerade steg har dock rapporterats för att begränsa skapandet av dessa emboliska artefaktiska metastaser12. Inledningsvis bör det finnas adekvat trypsinisering och skapande av en enhetlig encellssuspension för injektion, som bör förvaras på is för att förhindra cellklumpning. Nålen ska placeras ordentligt genom den proximala tibialtillväxtplattan, varefter små injektionsvolymer (~ 10 μL) och motståndsfria injektioner i märghålan ska utföras. Trots detta kan tumörcellleverans till lungorna, och även till andra organ, lätt observeras genom bioluminescensavbildning efter intraosseösa och intravaskulära injektionstekniker, vilket tyder på att det är möjligt att celler som genererar denna bioluminescerande signal i lungorna och andra organ kan ge upphov till avlägsen metastasering (opublicerade observationer)3. Vi har funnit att en annan fördel med denna teknik är att en enda tumör växer på ett enhetligt benställe inom studiepopulationen, vilket minskar variationen mellan djur och djur. Detta möjliggör upprättandet av en enhetlig studiepopulation och enkel jämförelse mellan behandlingsgrupper. Detta står i kontrast till benmetastaser som utvecklas efter ortotopisk eller intravaskulär injektion, där det är möjligt för celler att metastasera till olika skelettplatser och växa med olika kinetik, vilket gör jämförelser mellan studiegrupper utmanande. Tumörtillväxt på en anatomisk plats efter implantation av våra tumörtransplantat undviker också möjligheten att möss avlägsnas på grund av metastaser till andra organsystem eller primär tumörbörda, vilket kan ses med intravaskulära och ortotopiska injektionstekniker. Dessutom har vi observerat en 100% engraftment efter tumörtransplantatimplantation, vilket stöder en enhetlig studiepopulation och undviker onödig användning av ytterligare möss för att uppnå lämpliga provstorleksnummer. Detta övervinner också begränsningen av ofullständig och felaktig injektion efter perkutan injektion av tumörcellssuspensioner i ben.
Denna teknik har en stor grad av mångsidighet vilket har resulterat i modifieringar som för närvarande används i vår forskning och har potential för stor nytta för framtida applikationer. Initialt, medan vi använder proximal tibia som vår intraosseösa implantationsplats, kan andra vanliga platser för primära bentumörer eller benmetastaser lätt användas, inklusive men inte begränsat till distala lårben och proximal humerus. Det kirurgiska tillvägagångssättet för dessa platser såväl som för områden som bäckenet och ryggraden kräver emellertid ett gradvis mer omfattande kirurgiskt tillvägagångssätt jämfört med proximal tibia. Dessutom gynnas inte platser som bäckenet, ryggraden, skallen, radien och ulna av adekvat benlager för tumörimplantation. För beninvasiva maligniteter, såsom med orala tumörer, kan placering av tumörtransplantaten intill ben eller inom orofarynx också rekapitulera progressionen av invasiva tumörer 3,22. In vitro- och in vivo-experiment använder ofta samodlings- eller saminjektionstekniker för att bestämma effekterna av olika celltyper på en celltyp av intresse. Därför finns potentialen för injektion av två eller flera celltyper samtidigt för att skapa subkutana tumörer, som sedan kan implanteras i ben med hjälp av denna teknik. Genmodifierade celler kan användas ensamma eller i kombination med andra normala eller genetiskt modifierade celler för att skapa tumörtransplantat. Med det växande intresset för precisionsmedicin och skapandet av in vitro- och in vivo-modeller av mänsklig cancer blir patient-härledd xenografttransplantation till möss allt populärare. Nyligen har en modell av benmetastaser för bröstcancer beskrivits där patienthärledda xenotransplantat implanterade ortotopiskt metastaserade till mänskliga benskivor implanterade subkutant i nakna möss23. Från detta kunde patient-härledda xenotransplantat implanteras direkt i ben med hjälp av vår modell, utan behov av en mellanliggande värd för subkutan förökning. Detta skulle möjliggöra snabb utvärdering av tumörkinetik och förmåga att utvärdera flera behandlingskombinationer potentiellt från bara en enda patientbiopsi, vilket inte kräver en stor tumörmassa för allograftberedning. Den ökande användningen av organoider i cancerforskning skulle också kunna användas i vår modell24. Detta skulle kräva nål- eller pipettinjektion av dessa cellaggregat genom hålet i tibialcortexen. Vi rekommenderar därför tätning av kortikal defekt (som diskuterats ovan) för att begränsa möjligheten till organoidmigration utanför ben- och märghålan. Som vi har utfört kan celler märkas och spåras genom optisk (bioluminescens eller fluorescens) eller avancerad (digital radiografi, μCT eller μMRI) avbildning som möjliggör bedömning av tumörtillväxt över tid. Detta har också fördelen att minimera antalet djur eftersom samma djur avbildas över tiden.
Sammanfattningsvis demonstrerar denna rapport vår teknik modellering av primära bentumörer och benmetastaser med hjälp av solid tumörtransplantatimplantation i ben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Hildreth finansierades av NIH under Award Number K01OD026527. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH: s officiella åsikter.
Acknowledgments
Författarna erkänner det kritiska bidraget från Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP till utvecklingen av denna teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 scalpel blade | Henry Schein Ltd. | 75614 | None |
| 6-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture |
| Abrams osteosarcoma cell line | Not applicable | Not applicable | None |
| Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s) | VetEquip | 901805 | None |
| Animal weighing scale | Kent Scientific | SCL- 1015 | None |
| BALB/c nude mouse (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6-8 weeks of age. Male or female mice |
| Bone cement | Depuy Synthes | 160504 | Optional use instead of bone wax |
| Bone wax | Ethicon | W31G | Optional |
| Buprenorphine | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats |
| Carbon dioxide euthanasia station | N/A | N/A | Should be provided within animal facility |
| Cell culture incubator set at 37 °C and 5% carbon dioxide | Heraeus | Various | None |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetoquinol | 411412 | None |
| Cryovials (2 ml) | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| D-luciferin (Firefly), potassium salt | Perkin Elmer | 122799 | Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene |
| Digital caliper | Mitutoyo | 500-181-30 | Can be manual |
| Digital microradiography cabinet | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | Optional to evaluate bone response to tumor growth |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 1371171000 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | None |
| Ethanol (70%) | Sigma Aldrich | 2483 | None |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | None |
| Forceps, Dumont | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | None |
| Freezer (– 80 °C) | Sanyo | MDF-794C | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | Can also use automated cell counter, if available |
| Hypodermic needles (27 gauge) | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles |
| Ice | N/A | N/A | Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage |
| Iris scissors | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Ltd. | 1182098 | None |
| IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system | Perkin Elmer | CLS136334 | Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes |
| L-glutamine | Thermofisher scientifc | 25030081 | None |
| Liquid nitrogen | British Oxygen Corporation | NA | Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments |
| Liquid nitrogen dewar, 5 litres | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| Matrigel® Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | Optional. Also available in 10 ml size (354230) |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes |
| Mr. Frosty freezing containiner | Fisher Scientific | 10110051 | Optional if cryopreserving tumor fragments |
| NAIR Hair remover lotion/oil | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | Can alternatively use an electric clipper with fine blade |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | None |
| Scalpel handle, #7 Short | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | User preference as long as it accepts #15 scalpel blade |
| Small animal heated pad | VetTech | HE006 | None |
| Stereomicroscope | GT Vision Ltd. | H600BV1 | None |
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine |
| Tissue adhesive (sterile) | 3M Corporation | 84-1469SB | Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size) |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | None |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | Use 0.05%-0.25% |
| Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations) | Becton Dickinson | 309659 | Slip tip preferred over Luer |
| Vented tissue culture flasks, T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | Can also use smaller or larger flasks, as needed |
References
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
- Simmons, J. K., et al.
- Wolfe, T. D., et al. Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice. Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- James, J. J., et al. metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Chaffee, B. K., Allen, M. J. A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis. In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).
- Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma. Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).
- Huang, X., et al. Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study. Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).
- Li, W., Zhang, S. Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases. Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Maloney, C., et al. Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model. Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis. BoneKey Reports. 5, 777 (2016).
- Marques da Costa, M. E., et al. Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice. Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).
- Raheem, O., et al. A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions. Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).
- Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma. Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Yu, C., et al. Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).
- Kuchimaru, T., et al. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).
- Haley, H. R., et al. Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice. Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).
- Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma. Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).
- Lefley, D., et al. Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts. Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
