Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dobbel direkte injeksjon av blod inn i Cisterna Magna som modell av Subaraknoid blødning

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Vi beskrev i denne protokollen en standardisert subaraknoid blødning (SAH) musemodell ved en dobbel injeksjon av autolog fullblod inn i cisterna magna. Den høye graden av standardisering av dobbeltinjeksjonsprosedyren representerer en mellom-til-akutt modell av SAH med relativ sikkerhet angående dødelighet.

Abstract

Blant slag representerer subaraknoid blødning (SAH) som er påfølgende til brudd på en cerebral arteriell aneurisme 5-9%, men er ansvarlig for ca 30% av den totale slagrelaterte dødeligheten med en viktig sykelighet når det gjelder nevrologisk utfall. En forsinket cerebral vasospasme (CVS) kan forekomme oftest i forbindelse med en forsinket cerebral iskemi. Ulike dyremodeller av SAH blir nå brukt, inkludert endovaskulær perforering og direkte injeksjon av blod i cisterna magna eller til og med den prechiasmatic sisternen, hver viser forskjellige fordeler og ulemper. I denne artikkelen presenteres en standardisert musemodell av SAH ved dobbel direkte injeksjon av bestemte volumer av autologt fullblod inn i cisternamagnaten. Kort tid ble mus veid og deretter bedøvet ved isofluraninnånding. Deretter ble dyret plassert i en liggende stilling på et oppvarmet teppe som opprettholder en rektal temperatur på 37 ° C og plassert i en stereotaktisk ramme med en cervical bend på ca 30 °. Når den er på plass, ble spissen av en langstrakt glassmikropipett fylt med homolog arterielt blod tatt fra halspulsåren til en annen mus på samme alder og kjønn (C57Bl/6J) plassert i rett vinkel i kontakt med atlanto-occipital membran ved hjelp av en mikropulator. Deretter ble 60 μL blod injisert i cisterna magna etterfulgt av en 30 ° nedadgående tilt av dyret i 2 minutter. Den andre infusjonen av 30 μL blod inn i cisterna magna ble utført 24 timer etter den første. Den individuelle oppfølgingen av hvert dyr utføres daglig (nøye evaluering av vekt og velvære). Denne prosedyren tillater en forutsigbar og svært reproduserbar fordeling av blod, sannsynligvis ledsaget av intrakranielt trykkøkning som kan etterlignes ved en tilsvarende injeksjon av en kunstig cerebral spinalvæske (CSF), og representerer en akutt til mild modell av SAH som induserer lav dødelighet.

Introduction

Subaraknoid blødning (SAH) står for opptil 5% av alle slagtilfeller og utgjør en relativt vanlig patologi med en forekomst på 7,2 til 9 pasienter per 100.000 per år, med en dødelighet på 20% -60% avhengig avstudien 1,2,3. I den akutte fasen skyldes dødeligheten alvorlighetsgraden av blødning, rebleeding, cerebral vasospasme (CVS) og/ eller medisinske komplikasjoner4. Hos overlevende er tidlig hjerneskade (EBI) forbundet med parenchymal forlengelse av blødning og brå økning i intrakranielt trykk, noe som kan resultere i primær cerebral iskemi5 og umiddelbar død i ca 10% -15% avtilfellene 6. Etter den første "akutte" fasen av SAH, avhenger prognosen av forekomsten av "sekundær" eller forsinket cerebral iskemi (DCI), påvist hos nesten 40% av pasientene ved cerebral computertomografi, og hos opptil 80% av pasientene etter magnetisk resonansavbildning (MR)7,8. I tillegg til CVS som oppstår mellom 4 og 21 dager etter aneurismebrudd hos et flertall av SAH-pasienter, kan DCI9 skyldes multifaktorielle diffuse hjerneskader sekundært til mikrotrombosedannelse, redusert cerebral perfusjon, nevroinflammasjon og kortikale spredningsdepresjon (CSD)10,11,12,13. Dette påvirker 30% av SAH overlevende og påvirker kognitive funksjoner, inkludert synsminne, verbal hukommelse, reaksjonstid, og utøvende, visuospatial ogspråkfunksjoner 14 svekke dagliglivet15. Gjeldende standardbehandling for å forhindre CVS og/eller de dårlige kognitive resultatene hos SAH-pasienter er basert på blokkering av Ca2+ signalisering og vasokonstriksjon ved å bruke Ca2+ kanalhemmere som nimodipin. Nyere kliniske studier rettet mot vasokonstriksjon viste imidlertid dissosiasjon mellom pasientens nevrologiske utfall og forebygging av CVS16, noe som tyder på mer komplekse patofysilogiske mekanismer involvert i SAH-langsiktige konsekvenser. Derfor er det et medisinsk behov for større forståelse av antall patologiske hendelser som følger med SAH og utviklingen av gyldige og standardiserte dyremodeller for å teste originale terapeutiske inngrep.

Bruddet på en intrakraniell aneurisme som for det meste er ansvarlig for SAH hos mennesker, er sannsynligvis vanskelig å etterligne i prekliniske dyremodeller. For tiden kan aneurismebruddet og SAH-situasjonen foreløpig testes ved perforering av den midterste hjernearterien (endovaskulær punkteringsmodell) som er ansvarlig for CVS og sensitivomotoriske dysfunksjoner hos mus17,18. På grunn av mangel på mulig kontroll over blødningsoppståret og spredning av blod i denne modellen, har andre metoder blitt utviklet hos gnagere for å generere SAH-modeller uten endovaskulær brudd. Mer presist består de av direkte administrering av arterielt blod inn i subaraknoidrommet gjennom en enkelt eller en dobbel injeksjon i magnakisterna19 eller en enkelt injeksjon i den prechiasmatiske sisternen20. Den største fordelen med disse musemodellene uten endovaskulær brudd er muligheten til å reprodusere kirurgisk prosedyre og kvaliteten og mengden av den injiserte blodprøven. En annen fordel med denne modellen over modellen ved endovaskulær perforering er spesielt bevaring av dyrets generelle velvære. Faktisk er denne operasjonen mindre invasiv og teknisk mindre utfordrende enn det som kreves for å generere et halsbånd. I denne siste modellen må dyret intuberes og mekanisk ventileres, mens et monofilament settes inn i den ytre halspulsåren, og avanserte inn i den indre halspulsåren. Dette fører sannsynligvis til forbigående iskemi på grunn av fartøyobstruksjon av ledningsbanen. Følgelig er komorbiditeten (moribund tilstand, viktig smerte og død) forbundet med kirurgi mindre viktig i dobbel injeksjonsmodell sammenlignet med endovaskulær perforeringsmodell. I tillegg til å være en mer konsekvent SAH, den doble direkte injeksjon metoden er i samsvar med dyrevelferd i forskning og testing (redusert tid under anestesi, smerte fra vev avbrudd i kirurgi og nød) og fører til et minimum totalt antall dyr som brukes til protokollen studien og personell trening.

Videre tillater dette implementering av samme protokoll til transgene mus, noe som fører til en optimalisert patologisk forståelse av SAH og muligheten for komparativ testing av potensielle terapeutiske forbindelser. Her presenterer vi en standardisert musemodell av subaraknoid blødning (SAH) ved en dobbel daglig påfølgende injeksjon av autolog arterielt blod inn i cisterna magna i 6-8 uker gamle mannlige C57Bl/6J mus. Den største fordelen med denne modellen er kontrollen av blødningsvolumet sammenlignet med den endovaskulære perforeringsmodellen, og forsterkning av blødningshendelsen uten en drastisk økning av intrakranielt trykk21. Nylig har den doble direkte injeksjonen av blod inn i cisternamagnaten blitt godt beskrevet på de eksperimentelle og fysipatologiske problemene hos mus. Faktisk har vi nylig demonstrert CVS av store cerebrale arterier (basilær (BA), midten (MCA) og fremre (ACA) cerebrale arterier), cerebrovaskulær fibrin deponering og celle apoptose fra dag 3 (D3) til 10 (D10), sirkulasjonsfeil av paravaskulær cerebrospinalvæske ledsaget av endrede sensitivomotoriske og kognitive funksjoner hos mus, 10 dager etter SAH i denne modellen22. Dermed gjør det denne modellen mestret, validert og karakterisert for kortsiktige og langvarige hendelser etter SAH. Det bør være ideelt egnet for prospektiv identifisering av nye mål og for studier på potente og effektive terapeutiske strategier mot SAH-assosierte komplikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble utført under tilsyn av H. Castel i samsvar med den franske etiske komité og retningslinjer i Europaparlamentsdirektivet 2010/63/EU og Rådet for beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål. Dette prosjektet ble godkjent av den lokale CENOMEXA og de nasjonale etikkkomiteene for dyreforskning og testing. Hann C57Bl/6J Rj mus (Janvier), i alderen 8–12 uker, ble plassert under kontrollerte standard miljøforhold: 22 °C ± 1 °C, 12 timer/12 timer lys/mørk syklus, og vann og mat tilgjengelig ad libitum.

1. Oppsett av SAH kirurgi og forberedelse til injeksjon

  1. Før begynnelsen av operasjonen, trekk et tilstrekkelig antall glasskapillærer ved hjelp av en mikropipettetrekker. Injeksjonspipetten skal ha en innvendig diameter på 0,86 mm og ytre diameter på 1,5 mm.
  2. Forbered den kunstige cerebrospinalvæsken (aCSF) for sham-tilstanden.
    1. Forbered en løsning med 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4,1,3 mM MgCl2,10 mM glukose, 26,2 mM NaHCO3 i H2O, pH 7,4.
    2. Gass aCSF med 95% O2 og 5% CO2 for 15 min, og deretter legge til 2,5 mM CaCl2.
    3. Steriliser oksygenert aCSF med et filterapparat på 0,22 μm. ACSF-løsningen kan være stabil i 3-4 uker ved 4 °C. Hvis kontaminering (oppløsning blir overskyet) eller en deponeringsformasjon har dukket opp, kast og lag frisk aCSF.
  3. Innsamling av blod fra en homolog mus donor
    1. Isoler halspulsåren langs luftrøret og samle den maksimale mengden blod ved punktering av halspulsåren.
    2. I praksis plasserer du musen i et anestesikammer og laster kammeret med 5% isofluran til dyret mister bevisstheten.
    3. Kontroller mangelen på reflekser ved å klemme en av to bakben for å tillate innstilling av kirurgisk eksperimentell prosedyre.
    4. Coat en 1 ml sprøyte med en heparinoppløsning ved hjelp av en 26 G kanyle (heparinnatrium). Dette vil forhindre blodkoagulasjon i løpet av de neste trinnene.
    5. Monter dyret plassert i dorsal decubitus med bena fra hverandre, og nesen i en anestesimaske (anestesi vedlikehold med 2 til 2,5% isofluran).
    6. Isoler halspulsåren langs luftrøret ved å dissekere omohyoid muskelen langsgående. Når arterien er isolert, sett nålen mot hjertet ved hjelp av mikrodissecting kroken og tang og samle maksimalt blod via punktering av halspulsåren (60 μL er nødvendig per SAH mus).
    7. Ofre den bedøvede donormusen umiddelbart etter blodinnsamling ved hjelp av cervical dislokasjon.

2. Animal (8-10-uker gamle C57BL / 6J mannlige mus) forberedelse

  1. Vei hver mus nøyaktig ved hjelp av en elektronisk balanse. I den nåværende studien ville mus ha kroppsvekt innenfor området 20 til 25 gram like før operasjonen.
  2. Som tidligere forklart (se trinn 1.3.2 og 1.3.3), indusere anestesi av mus som skal opereres.
  3. Barber nakken og rommet mellom ørene med en egnet elektrisk klippemaskin.
  4. Monter dyret plassert i ventral decubitus med bena fra hverandre og nesen i en anestesimaske (anestesivedlikehold med 2 og 2,5% isofluran) på en stereotaktisk ramme.
  5. Kontroller at musen sover og at hodet er riktig blokkert.
  6. Injiser subkutant 100 μL buprenorfin (0,1 mg/kg) med en 26 G kanyle i korsryggen for å unngå smerte etter oppvåkning.
  7. Unngå tørre øyne ved hjelp av beskyttende flytende gel og opprettholde en intrarektal temperatur på 37 °C ved hjelp av et automatisk regulert elektrisk teppe.
  8. Behandle det bakre nakkebarberte området med en antiseptisk løsning (povidon-jod eller klorhexidin ved hjelp av en steril bomullsvei).
  9. Forhåndsteriliser alle instrumenter som berører det tilberedte hud-/subkutane vevet (oppvarming til 200 °C i 2 timer) og håndter aseptisk.

3. SAH induksjon

  1. På den første dagen (D-1)
    1. Klipp et 1 cm snitt med tynn saks i bakre nakke, etterfulgt av separasjon av muskler langs midtlinjen for å få tilgang til sisternamagnaten.
    2. Klipp spissen av den tomme glasspipetten med tynn saks. Deretter tilpasser du til en sprøyte som er koblet til en fleksibel silikonkontakt.
    3. Overfør henholdsvis 60 μL blod eller aCSF (for SAH eller sham-tilstand) i et 0,5 ml rør ved hjelp av en presisjonsmikropipette.
    4. Sug inn i glasspipetten 60 μL blod for SAH-tilstanden eller 60 μL aCSF for sham-tilstanden.
    5. For injeksjon, installer pipetten på stereotaktisk ramme ved hjelp av en ring eller blå-tack og sakte bringe pipette spissen til membranen på grensesnittet med cisterna magna.
    6. Sett pipettespissen langsomt inn i atlanto-occipitalmembranen inn i cisternamagnaten, ved hjelp av en mikromanipulator av den stereotaktiske rammen.
    7. Koble pipetten som tidligere var fylt med blod eller aCSF, til sprøyten som er klar for trykkinduksjon.
    8. Injiser ved å trykke på stempelet med lav hastighet rundt 10 μL/min, for å unngå akutt intrakranielt trykk.
    9. Under injeksjonen overvåker du respirasjonsfrekvensen nøye og rektaltemperaturen.
    10. På slutten av injeksjonen, ta forsiktig av pipetten via mikromanipulatoren og sørg visuelt for at det ikke er noen lekkasje under tilbaketrekking.
    11. Oppnå hemostase ved hjelp av en absorberbar hemostat og kjør to suturer med flettet ikke-absorberbar suturing tråd.
    12. Umiddelbart etter operasjonen isolerer og plasserer du musen i avslåde decubitus og dekker den med et overlevelsesteppe i en åpen boks for varigheten av utvinningen.
  2. Andre induksjonsdag (D0)
    1. Etter 24 timer induserer anestesi (se trinn 1.3.2 og 1.3.3). Injiser 100 μL buprenorfin igjen (0,1 mg/kg) og forhindrer tørre øyne ved hjelp av beskyttende flytende gel (se trinn 2,7 og 2,8).
    2. Installer dyret på stereotaktisk ramme som dagen før.
    3. Fjern forsiktig suturene med mikroscissorer.
    4. Forbered atlanto-occipital membranen som før og påfør antiseptisk forberedelse på det barberte området av nakken med en steril bomullsstang.
    5. Injiser 30 μL blod eller aCSF med lav hastighet (se trinn 3.1.2 til 3.1.8). Overvåk respirasjonshastigheten og rektaltemperaturen.
    6. På slutten av injeksjonen, ta forsiktig av pipetten og kontroller fraværet av blodlekkasje under tilbaketrekking.
    7. Oppnå hemostase og kjør to suturer med flettet absorberbar suturing tråd.

4. Postoperativ oppfølging og slutt på eksperimentet

  1. Umiddelbart etter operasjonen isolerer og plasserer musen i nedgang decubitus med et overlevelsesteppe på ryggen i en åpen boks under utvinning.
  2. Vei og følg nøye daglig oppførselen til hver mus til offer (f.eks D7 etter operasjonen).
  3. Blant humane endepunkter er et betydelig vekttap (> 15% av vekten) klassisk lagt merke til. En "hunched back" holdning, langsomme bevegelser, prostrasjon, unormale vokaliseringer av skade og / eller betydelig aggressiv oppførsel er også viktige tegn på dyrelidelser. Hvis noen av disse tegnene eller en kombinasjon av tegn vises, forsterkes overvåkingen av dyret innen timer etter utseendet. Hvis dyrets velferd forverres eller ikke blir bedre innen 48 timer, vil det bli vurdert at et nivå av utålelig lidelse er nådd, og eutanasi utføres.
  4. På tidspunktet for valget, ofre bedøvet mus ved halshugging, og høste hjerner for videre analyser.
  5. Utfør eutanasi (halshugging) etter isofluran anestesi (5%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksperimentell tidslinje, prosedyre, oppfølging og dødelighet
Figur 1A og figur 1B oppsummerer SAH-modellprotokollen ved dobbel intrakransisk injeksjon av blod. Kort sagt, på den første dagen av SAH induksjon (D-1), 60 μL blod trukket tilbake fra en homolog mus eller 60 μL kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) ble injisert i cisterna magna i SAH eller sham forhold, henholdsvis. Neste dag (D0) ble 30 μL blod trukket tilbake fra en homolog mus eller 30 μL aCSF injisert i cisterna magna i SAH eller Sham forhold, henholdsvis. Tjuefire timer etter operasjonen, mus drap og hjerneanalyse lov til å observere blodfordelingen i paravaskulære rom som illustrert i figur 1C. Som en følsom indikator for generell velferd fra D1 til offer, ble kroppsvekten daglig vurdert fra D1 til D8 og viste en betydelig redusert kroppsvektøkning i SAH sammenlignet med sham dyr fra D1 til D8 (Figur 1D), noe som tyder på en langvarig gjenopprettingsprosess og langvarige patologiske hendelser etter SAH. Postoperativ dødelighet var 26,7 % ved D7, og de fleste dyrene døde på D1 eller D4 etter operasjonen (figur 1D). Transcardial perfusjon av indisk blekk ved D5 aktivert observasjon av makroskopiske CVS som illustrert i figur 1C.

Cerebral vasospasme etter SAH
Som vist av El Amki et al.22,CVS av basilær arterie (BA), midten cerebral arterie (MCA) og fremre cerebral arterie (ACA) var til stede i SAH modell ved dobbel intrakransnal injeksjon av blod i enten ACA, MCA eller BA fra D3 til D10 etter operasjonen. Kort (Figur 2A), etter mus offer og halshugging, hjerner ble høstet og post-fast i 4% paraformaldehyd (PFA), og deretter frosset ved -80 ° C, før de ble skåret i 20 μm tverrgående skiver ved hjelp av en kryostat. Hematoksylin og eosinfarging ble utført for BA (interaural 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) og ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) for å tillate CVS-identifikasjon via systematisk bildeoppkjøp av fargede skiver ved hjelp av et mikroskopmontert kamera. For å evaluere fraværet eller tilstedeværelsen av makroskopisk CVS ble lumenområdet /veggtykkelsesforholdet beregnet for hver farget arterie. Jo lavere er forholdet, jo mer alvorlig er CVS. Dermed oppstod en CVS i BA i SAH-hjerner sammenlignet med sham mouse brains (Figur 2B), men også i andre store cerebrale arterier (MCA, ACA, data som ikke vises22).

Følsomomotoriske dysfunksjoner etter SAH
Målingen av spesifikke motorunderskudd, godt beskrevet i denne SAH-modellen av El Amki et al.22 og Clavier et al.23, kan betraktes som et hovedevalueringskriterium for utfall for å teste spesifikke terapeutiske mål som regulerer disse SAH-tilknyttede langsiktige effektene. Kort (Figur 3A), ved D6 etter operasjonen, ble hver mus evaluert i åpen felttest i 10 minutter. Ved hjelp av ANY-maze programvareversjon 4.99 ble avstanden dekket og antall oppdrett og lening registrert. Tjuefire timer etter åpen felttest deltok hver mus i tre påfølgende økter av strålevandringstesten som involverte, etter en enhets habituation periode, måling av total gangtid, tid til å nå plattformen og antall turer. Resultatene ble uttrykt som et gjennomsnitt på tre økter. Som vist av El Amki et al.22, ble følsomme dysfunksjoner evaluert av strålen walking test ved D10 etter operasjonen vist seg å være til stede i SAH-modellen (Figur 3B). Ved D9 ble spontan aktivitet av mus evaluert av åpen felttest i løpet av 10 minutter også signifikant påvirket av SAH som oppdaget av avstanden krysset og den vertikale aktiviteten sammenlignet med sham-tilstanden (figur 3C).

Figure 1
Figur 1. Eksperimentell design, kirurgisk prosedyre, blodfordeling, makroskopisk vasospasme, kroppsvekt og dødelighet etter SAH. (A) Skjematisk diagram som viser eksperimentell design av denne protokollen. D-1 og D0 representerer operasjonsdagene med en dobbel injeksjon på henholdsvis 60 og 30 μL aCSF (Sham) eller blod (SAH) i sisternamagnaten. Fra D1 til D8 ble mus daglig observert og veid. Ved D1 ble hjernen høstet for å observere blodfordelingen til paravaskulære rom (C). D6 og D7 ble valgt som optimalisert tidsvindu for atferdsanalyser, inkludert åpne felt- og strålevandringstester. Ved D8 ble hjernen samplet for å evaluere CVS, som vist makrooskopisk i (C). (B)Kirurgisk prosedyre for blodinjeksjon i cisterna magna. Blod ble samlet inn fra halspulsåren av en homolog mus. Etter dyreforberedelse og installasjon på stereotaktisk ramme ble det utført et nakkesnitt i bakre nakke, de bakre musklene ble separert, og deretter ble de underliggende musklene spredt for å åpne en tilgang til den vaskulariserte membranen som avgrenset cisternamagnaten. Pipetten ble satt inn i cisternamagnaten før blodinjeksjon. (C) Illustrasjon av blodfordelingen til paravaskulære rom tjuefire timer etter operasjonen og makroskopisk CVS etter transcardial perfusjon av indisk blekk fem dager etter operasjonen i SAH sammenlignet med Sham tilstand. (D)Vektutvikling fra D-1 til D8 etter operasjonen i Sham (n = 10) og SAH C57Bl / 6J (n = 15) mus. SAH-mus viste en reduksjon i prosentandelen av kroppsvektøkning fra D1 til D8 sammenlignet med shammus (p<0,01). ANOVA med Bonferronis post hoc test for flere sammenligningstester. Overlevelseskurve etter kirurgi i sham (n=10) og SAH C57Bl/6J (n=15) mus. Data ble uttrykt som Kaplan Meier kurver. SAH-mus viste en viktigere dødelighet ved D7 etter operasjonen sammenlignet med sham mus (p<0.05). Mantel-Cox test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Eksperimentell design for cerebral vasospasmeanalyse og tidsforløpet av cerebral vasospasme i basilær arterie etter SAH. (A) Skjematisk diagram som viser eksperimentell utforming av protokollen for CVS kvantifisering. Etter fiksering av 4% PFA ble frosne hjerner serielt skåret ved hjelp av en kryostat i 20 μm tverrgående skiver på gelatinbelagte glasssklier. Hematoksylin og Eosin (H&E) farging ble utført fra hjerneskiver med ACA, MCA og BA. Mikrofotografier ble kjøpt opp ved hjelp av et mikroskopmontert kamera ved en 200x forstørrelse. Lumen-området og karveggtykkelsen ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ ved hjelp av en enkel blindmetode. (B) Tidskurs av CVS i BA etter SAH. Representative mikrofotografier av H&E-farging som viser BA morfologi (lumenområde og veggtykkelse) i sham- og SAH-hjerneskiver ved D7 etter SAH. Kvantifisering histogrammer av lumen område / vegg tykkelse ratio viser CVS i BA fra D3 til D10 etter operasjonen (*, p<0.05). Data ble uttrykt som gjennomsnittet ± SEM. n=6/tilstand. ANOVA med Bonferronis post hoc test for flere sammenligninger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Eksperimentell design for atferdsanalyse av langsiktige sensitivomotoriske underskudd etter SAH. (A) Skjematisk diagram som viser eksperimentell utforming av atferdsanalyseprotokollen etter SAH. Kort sagt, ved D6 etter operasjonen, ble motoraktivitetsatferd av mus evaluert av en åpen felttest i 10 minutter, hvor dekket avstand og antall oppdrett og skjevhet ble registrert. Etter en 24 h hvileperiode ble den følsomomotoriske oppførselen til mus evaluert av strålegangstesten, hvor gangtiden, tiden for å nå plattformen og antall turer ble registrert. (B) Fra El Amki et al.22: I strålen walking test, SAH mus viste økt antall turer sammenlignet med kontroller ved D7 (**, p<0,01), D10 (***, p<0.001) og D14 (*, p<0.05) og med sham mus på D10 (*, p<0.05). (C) Fra El Amki et al.22: SAH-mus viste redusert avstand krysset (*, p < 0,05) og vertikal aktivitet sammenlignet med Sham-mus ved D9 (*, p< 0,01). ANOVA etterfulgt av Sidaks flere sammenligningstest. Data ble uttrykt som gjennomsnittet ± SEM. n=10-12/tilstand. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Til tross for intensiteten av forskningen innen SAH og utviklingen av terapeutiske strategier som endovaskulære og farmakologiske behandlingstilbud øker i løpet av de siste tjue årene, er dødeligheten fortsatt høy i løpet av den første uken av sykehusinnleggelse og når ca 50% i løpet av de følgende 6månedene 24,25. Denne nåværende prekliniske modellen ved daglig dobbel injeksjon av homologt arterielt blod inn i cisterna magna har blitt anerkjent for sin gyldighet og dens tilknytning til en lav dødelighet. Faktisk, blant SAH gnagermodeller, et bredt spekter av dødelighet er rapportert: 0-16% dødelighet med enkelt blodinjeksjon i cisterna magn26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, 10-33% dødelighet med blodinjeksjon i prechiasmatic sister20,27,36,37, 16-66% dødelighet i modellen ved endovaskulær perforering38,39,40,41,42,43,44,45 og 0-43% med modellen ved dobbel blodinjeksjon i cisterna magna34,35,46,47,48. Den lave dødeligheten i modellen (9% eller 27%, avhengig av musenes alder) kan skyldes den svake mengden blod injisert, den langsomme varigheten av injeksjonen og tilting av dyret som unngår lokalisert trykk på hjernestammen, sammenlignet med andre doble injeksjonsmodeller. Hos SAH-pasienter oppdages vinduet for CVS-forekomst klassisk ved D4-D10 etter blødning. Men hos dyr er tiden for å sette opp og varigheten av CVS mindre studert og kan variere mellom HSA-modeller, sannsynligvis avhengig av eksperimentelle protokoller og dyrearter21.

I denne sammenheng ligner modellen her klinisk SAH-fysipatologi når det gjelder SAH-assosiert CVS. Generelt, i endovaskulær perforeringsmodell, forekommer CVS i MCA og BA etter 1 time hos rotter40 og etter 3 dager hos mus17. I modellen ved blodinjeksjon i prechiasmatisk sisterne ble CVS-forekomsten vist mellom to49 og åtte dager37 hos rotter. I modellen av dobbel injeksjon i cisterna magna hos rotter utvikler CVS mellom 10 minutter29 og 3 dager31. Vi er de første til å beskrive kinetisk utseende av CVS i en musemodell av SAH ved dobbel injeksjon, etablere CVS i de viktigste cerebrale arteriene (ACA, MCA og BA) siden 3 dager og blir opprettholdt til 10th dag post-SAH22, nær det som observeres hos SAH-pasienter. Denne siste modellen kan defineres som en dyktig modell av SAH, alvorlig nok uten dødelighet, slik at undersøkelse av mekanismer og terapeutiske rettet mot CVS.

Denne sah-modellen for musen kan imidlertid også presentere noen grenser. Det første punktet er mangelen på karveggbrudd, som muligens gjengitt i collagenase-indusert SAH-modellen, gjennom ødeleggelse / fordøyelse av blodkarbasal lamina50. Når det gjelder forekomsten av makroskopisk CVS, reduseres cerebral blodstrøm (CBF) i noen hjerneområder ikke systematisk korrelert med nevrologisk utfall, og CBF bør derfor evalueres i denne foreslåtte modellen av SAH. Tidligere rottestudier ved bruk av Laser Doppler Flowmetry i en SAH-modell for dobbel injeksjon viste cbf akutt reduksjon til 30–52 % fra baseline etter første injeksjon, med en retur til baseline etter 2 til 3 dager etter injeksjon51,52,53. I enighet har det vist seg ved MR en reduksjon av CBF på 33-50% ved D3 og 27-44% ved D5 etter SAH induksjon i rotte dobbel injeksjon modeller54,55. Den doble injeksjonen i cisterna magna gir en forutsigbar fordeling av blod langs subaraknoidrommet, noe som resulterer spesielt i blodpropper rundt bakre sirkulasjon, men kan introdusere variasjoner i fysiologiske parametere. For å unngå intrakranielt trykk (ICP) fra å stige med volumet av injisert blod inn i spinalkanalen, som begge fører til forvirrende funksjonsnedsettelse56, kan valget om å fjerne et tilsvarende volum av cerebrospinalvæske gjøres, som tidligere gjort i andremodeller 30,51. I modellen her fikk sham mus et tilsvarende volum av aCSF eller fysiologisk 0,9% NaCl, avhengig av eksperimentet, noe som åpenbart førte til en økning av ICP. Dermed resulterer en akutt økning av ICP i en økning fra 18 mmHg til 120 mmHg27,48,53 i enkeltinjeksjon av blod i cisterna magna-modellen, fra 46 til 107 mmHg27,37,49 i prechiasmatic sistern blodinjeksjon modell, og fra 27 til 110 mmHg 39,40,53,57,58 i endovaskulær perforering modell. I motsetning var den doble blodinjeksjonen i cisterna magna forbundet med en mindre ICP-økning fra 60 til 67 mmHg48,,53. Videre vil handlingen med å fjerne CSF også endre ICP og endre CSF. I SAH-modellen her var beslutningen å ikke fjerne CSF før blodinjeksjon, men å følge kirurgi ved en prosedyre som består i å hilting dyret hodet fra 30°. Målet er å dempe ICP ved å tillate blodfordelingen i fremre sirkulasjon, et viktig og nødvendig skritt for å etterligne menneskelig SAH fysipatologi. Hos SAH-pasienter oppdages en kraftig økning i ICP og er forbundet med et forbigående globalt cerebraliskemi 59, noe som sannsynligvis bidrar til en vedvarende svekkelse av autoregulering og tidlig nevronalt celletap60. Men etter den første hendelsen etter SAH, en tidlig ekstern ventrikulær drenering er ofte vedtatt for bekymrede SAH-pasienter, for å unngå hevelse i hjernen og hydrocephalus61. Her kan det hende at den doble injeksjons-SAH-modellen ikke er alvorlig ved første blødningshendelse for å provosere de ICP-avhengige konsekvensene som observeres hos pasienter, men sannsynligvis reprodusere en vedvarende og mild forbedret ICP i flere dager etter SAH.

I tillegg var en annen ukontrollert parameter i SAH-modellen her de potensielle variasjonene av gjennomsnittlig arterielt blodtrykk (MABP) indusert av for rask injeksjonsprosedyre27. Faktisk stiger MABP vanligvis akutt etter eksperimentell SAH for å bevare cerebralt perfusjonstrykk og deretter faller til baseline. I SAH-modellen her injiserte vi blod eller aCSF (~ 10 μL/min) med lav hastighet for å unngå disse MABP-variasjonene. Når det gjelder de nevrobiologiske hendelsene i denne modellen som etterligner de som er observert hos mennesker, har vi tidligere vist at den doble blodinjeksjonsmodellen av SAH induserer langvarig CVS, mikrotrombosedannelse og hjerneskade, inkludert defekt i potensiell paravaskulær diffusjon fra dag 3 til dag 10 post-SAH22. Nyere data som beskriver at CSD er involvert i SAH-tilknyttede DCI13 støtter imidlertid sterkt jakten på denne typen undersøkelser i musemodellen for dobbel injeksjon. Dette bør muliggjøre vitenskapelige gjennombrudd på den gunstige virkningen av nye terapier rettet mot CSD.

For å konkludere, modellen av dobbel injeksjon av hele arterielt blod inn i cisterna magna er en mestret modell som gjør det mulig å etterligne den menneskelige SAH fysipatologi inkludert CVS, mikrotrombose, vaskulær betennelse, nevrologiske underskudd og dødelighet. Det representerer en validert modell for testing av nye terapeutiske tilnærminger for å behandle SAH-assosiert morbidødelighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker PRIMACEN-plattformen (Normandie Rouen University, Frankrike) for bildeutstyr og Mr. Arnaud Arabo, Fru Julie Maucotel og Fru Martine Dubois, for dyreboliger og omsorg. Vi takker Mrs. Celeste Nicola for å ha lånt stemmen sin til videoopptaket av protokollen. Dette arbeidet ble støttet av Seinari Normandie modningsprogram, Fondation AVC under aegis av FRM, Normandie Rouen University og Inserm. Normandie-regionen og EU (3R-prosjektet). Europa blir involvert i Normandie med European Regional Development Fund (ERDF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rincon, F., Rossenwasser, R. H., Dumont, A. The epidemiology of admissions of nontraumatic subarachnoid hemorrhage in the United States. Neurosurgery. 73 (2), 212-222 (2013).
  2. Sandvei, M. S., et al. Incidence and mortality of aneurysmal subarachnoid hemorrhage in two Norwegian cohorts, 1984-2007. Neurology. 77 (20), 1833-1839 (2011).
  3. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  4. Solenski, N. J., et al. Medical complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a report of the multicenter, cooperative aneurysm study. Participants of the Multicenter Cooperative Aneurysm Study. Critical Care Medicine. 23 (6), 1007-1017 (1995).
  5. Cahill, J., Calvert, J. W., Zhang, J. H. Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (11), 1341-1353 (2006).
  6. Huang, J., van Gelder, J. M. The probability of sudden death from rupture of intracranial aneurysms: a meta-analysis. Neurosurgery. 51 (5), 1101-1107 (2002).
  7. Rabinstein, A. A. Secondary brain injury after aneurysmal subarachnoid haemorrhage: more than vasospasm. Lancet Neurology. 10 (7), 593-595 (2011).
  8. Kivisaari, R. P., et al. MR Imaging After Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage and Surgery: A Long-term Follow-up Study. American Journal of Neuroradiology. 22 (6), 1143-1148 (2001).
  9. Mayberg, M. R., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 25 (11), 2315-2328 (1994).
  10. Dankbaar, J. W., et al. Relationship between vasospasm, cerebral perfusion, and delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neuroradiology. 51 (12), 813-819 (2009).
  11. Sehba, F. A., Hou, J., Pluta, R. M., Zhang, J. H. The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Progress in Neurobiology. 97 (1), 14-37 (2012).
  12. Miller, B. A., Turan, N., et al. Inflammation, vasospasm, and brain injury after subarachnoid hemorrhage. BioMed Res Int. 2014, 384342 (2014).
  13. Dreier, J. P., et al. Delayed ischaemic neurological deficits after subarachnoid haemorrhage are associated with clusters of spreading depolarizations. Brain. 129, Pt 12 3224-3237 (2006).
  14. Mayer, S., et al. Global and domain-specific cognitive impairment and outcome after subarachnoid hemorrhage. Neurology. 59 (11), 1750-1758 (2002).
  15. Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41 (8), 519-536 (2010).
  16. Macdonald, R. L., et al. Randomized trial of clazosentan in patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhage undergoing endovascular coiling. Stroke. 43 (6), 1463-1469 (2012).
  17. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological Research. 24 (5), 510-516 (2002).
  18. Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
  19. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  20. Sabri, M., et al. Anterior circulation mouse model of subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1295, 179-185 (2009).
  21. Leclerc, J. L., et al. A Comparison of Pathophysiology in Humans and Rodent Models of Subarachnoid Hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. El Amki, M., et al. Long-Lasting Cerebral Vasospasm, Microthrombosis, Apoptosis and Paravascular Alterations Associated with Neurological Deficits in a Mouse Model of Subarachnoid Hemorrhage. Molecular Neurobiology. 55 (4), 2763-2779 (2018).
  23. Clavier, T., et al. Association between vasoactive peptide urotensin II in plasma and cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a potential therapeutic target. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2018).
  24. Kundra, S., Mahendru, V., Gupta, V., Choudhary, A. K. Principles of neuroanesthesia in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology. 30 (3), 328-337 (2014).
  25. Schertz, M., et al. Incidence and Mortality of Spontaneous Subarachnoid Hemorrhage in Martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  26. Lin, C. -L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  27. Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. -A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
  28. Turowski, B., et al. New angiographic measurement tool for analysis of small cerebral vessels: application to a subarachnoid haemorrhage model in the rat. Neuroradiology. 49 (2), 129-137 (2007).
  29. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  30. Muñoz-Sánchez, M. Á, et al. Urotensinergic system genes in experimental subarachnoid hemorrhage. Medicina Intensiva (English Edition). 41 (8), 468-474 (2017).
  31. Delgado, T., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  32. Solomon, R. A., Antunes, J. L., Chen, R., Bland, L., Chien, S. Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage: a new animal model. Stroke. 16 (1), 58-64 (1985).
  33. Ram, Z., Sahar, A., Hadani, M. Vasospasm due to massive subarachnoid haemorrhage-a rat model. Acta Neurochirurgica. 110 (3-4), 181-184 (1991).
  34. Glenn, T. C., et al. Subarachnoid hemorrhage induces dynamic changes in regional cerebral metabolism in rats. Journal of Neurotrauma. 19 (4), 449-466 (2002).
  35. Gules, I., Satoh, M., Clower, B. R., Nanda, A., Zhang, J. H. Comparison of three rat models of cerebral vasospasm. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (6), 2551-2559 (2002).
  36. Sabri, M., et al. Mechanisms of microthrombi formation after experimental subarachnoid hemorrhage. Neuroscience. 224, 26-37 (2012).
  37. Jeon, H., Ai, J., Sabri, M., Tariq, A., Macdonald, R. Learning deficits after experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Neuroscience. 169 (4), 1805-1814 (2010).
  38. Silasi, G., Colbourne, F. Long-term assessment of motor and cognitive behaviours in the intraluminal perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats. Behavioural Brain Researchearch. 198 (2), 380-387 (2009).
  39. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  40. Bederson, J. B., et al. Acute vasoconstriction after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 42 (2), 352-362 (1998).
  41. Park, I. -S., et al. Subarachnoid hemorrhage model in the rat: modification of the endovascular filament model. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 195-200 (2008).
  42. Vanden Bergh, W., et al. Magnetic resonance imaging in experimental subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica. 147 (9), 977-983 (2005).
  43. Peng, J., et al. LRP1 activation attenuates white matter injury by modulating microglial polarization through Shc1/PI3K/Akt pathway after subarachnoid hemorrhage in rats. Redox Biology. 21, 101121 (2019).
  44. Okada, T., et al. Selective Toll-Like Receptor 4 Antagonists Prevent Acute Blood-Brain Barrier Disruption After Subarachnoid Hemorrhage in Mice. Molecular Neurobiology. 56 (2), 976-985 (2019).
  45. Tiebosch, I. A., et al. Progression of brain lesions in relation to hyperperfusion from subacute to chronic stages after experimental subarachnoid hemorrhage: a multiparametric MRI study. Cerebrovascular Diseases. 36 (3), 167-172 (2013).
  46. Weidauer, S., Vatter, H., Dettmann, E., Seifert, V., Zanella, F. E. Assessment of vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage in rats by selective biplane digital subtraction angiography. Neuroradiology. 48 (3), 176-181 (2006).
  47. Lee, J. Y., Huang, D. L., Keep, R., Sagher, O. Characterization of an improved double hemorrhage rat model for the study of delayed cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 168 (2), 358-366 (2008).
  48. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PloS one. 7 (3), 33366 (2012).
  49. Piepgras, A., Thome, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  50. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).
  51. Raslan, F., et al. A modified double injection model of cisterna magna for the study of delayed cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental & Translational Stroke Medicine. 4 (1), 23 (2012).
  52. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PLoS One. 7 (3), 33366 (2012).
  53. Lee, J. Y., Sagher, O., Keep, R., Hua, Y., Xi, G. Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (2), 331-343 (2009).
  54. Guresir, E., et al. The effect of common carotid artery occlusion on delayed brain tissue damage in the rat double subarachnoid hemorrhage model. Acta Neurochir (Wien). 154 (1), 11-19 (2012).
  55. Vatter, H., et al. Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage: clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model. Neurosurgery. 58 (6), 1190-1197 (2006).
  56. Leonardo, C. C., Robbins, S., Doré, S. Translating basic science research to clinical application: models and strategies for intracerebral hemorrhage. Frontiers in Neurology. 3, 85 (2012).
  57. Feiler, S., Friedrich, B., Schöller, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
  58. Westermaier, T., Jauss, A., Eriskat, J., Kunze, E., Roosen, K. Acute vasoconstriction: decrease and recovery of cerebral blood flow after various intensities of experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Journal of Neurosurgery. 110 (5), 996-1002 (2009).
  59. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. 41 (4), 917-930 (2018).
  60. Conzen, C., et al. The Acute Phase of Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Intracranial Pressure Dynamics and Their Effect on Cerebral Blood Flow and Autoregulation. Translational Stroke Research. 10 (5), 566-582 (2019).
  61. Connolly, E. S., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/american Stroke Association. Stroke. 43 (6), 1711-1737 (2012).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 162 Subarachnoid blødning cisterna magna mus vasospasme dyremodell sensitivo-motor test blod
Dobbel direkte injeksjon av blod inn i Cisterna Magna som modell av Subaraknoid blødning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter