Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dobbelt direkte injektion af blod i Cisterna Magna som en model af Subarachnoid Blødning

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Vi beskrev i denne protokol en standardiseret subaraknoid blødning (SAH) mus model ved en dobbelt injektion af autologt fuldblod i cisterna magna. Den høje grad af standardisering af dobbelt-injektion procedure repræsenterer en midt-til-akut model af SAH med relativ sikkerhed med hensyn til dødelighed.

Abstract

Blandt slagtilfælde, subaraknoid blødning (SAH) i træk til brud på en cerebral arteriel aneurisme udgør 5-9%, men er ansvarlig for omkring 30% af den samlede slagtilfælde-relaterede dødelighed med en vigtig sygelighed i form af neurologiske resultat. En forsinket cerebral vasospasme (CVS) kan forekomme oftest i forbindelse med en forsinket cerebral iskæmi. Forskellige dyremodeller af SAH anvendes nu, herunder endovaskulær perforering og direkte injektion af blod i cisterna magna eller endda den præchiasmatiske cisterne, der hver udviser forskellige fordele og ulemper. I denne artikel præsenteres en standardiseret musemodel af SAH ved dobbelt direkte injektion af bestemte mængder autologt fuldblod i cisterna magna. Kort, mus blev vejet og derefter bedøvet ved isofluran indånding. Derefter blev dyret placeret i en tilbagelænet position på et opvarmet tæppe, der fastholdt en rektal temperatur på 37 °C og placeret i en stereotaktisk ramme med en livmoderhalslig bøjning på ca. 30°. Når den var på plads, blev spidsen af en aflang glasmikropipette fyldt med det homologe arteriel blod taget fra halspulsåren af en anden mus af samme alder og køn (C57Bl/6J) placeret i en ret vinkel i kontakt med atlanto-occipitalmembranen ved hjælp af en mikropulmaniator. Derefter blev der injiceret 60 μL blod i cisternamagen efterfulgt af en 30° nedadgående hældning af dyret i 2 minutter. Den anden infusion af 30 μL blod i cisterna magna blev udført 24 timer efter den første. Den individuelle opfølgning af hvert dyr udføres dagligt (omhyggelig vurdering af vægt og velvære). Denne procedure giver mulighed for en forudsigelig og meget reproducerbar fordeling af blod, sandsynligvis ledsaget af intrakraniel trykhøjde, der kan efterlignes ved en tilsvarende injektion af en kunstig cerebral spinalvæske (CSF), og repræsenterer en akut til mild model af SAH inducerende lav dødelighed.

Introduction

Subaraknoid blødning (SAH) tegner sig for op til 5% af alle slagtilfælde tilfælde og udgør en forholdsvis almindelig patologi med en forekomst af 7,2 til 9 patienter pr 100.000 om året, med en dødelighed på 20% -60% afhængigt af undersøgelsen1,2,3. I den akutte fase skyldes dødeligheden sværhedsgraden af blødning, rebleeding, cerebral vasospasme (CVS) og/eller medicinske komplikationer4. Hos overlevende, tidlig hjerneskade (EBI) er forbundet med parenkymal forlængelse af blødning og brat stigning i intrakranielt tryk, hvilket kan resultere i primær cerebral iskæmi5 og øjeblikkelig død i omkring 10% -15% aftilfældene 6. Efter den indledende "akutte" fase af SAH afhænger prognosen af forekomsten af "sekundær" eller forsinket cerebral iskæmi (DCI), påvist hos næsten 40% af patienterne ved cerebral computertomografi, og hos op til 80% af patienterne efter magnetisk resonansscanning (MRI)7,8. Ud over CVS forekommer mellem 4 til 21 dage efter aneurisme brud i et flertal af SAH patienter, DCI9 kan skyldes multifaktorielle diffuse hjernelæsioner sekundære til mikrothrombose dannelse, reduceret cerebral perfusion, neuroinflammation, og kortikal spredning depression (CSD)10,11,12,13. Dette påvirker 30% af SAH overlevende og påvirker kognitive funktioner, herunder visuel hukommelse, verbal hukommelse, reaktionstid, og udøvende, visuospatial og sprogfunktioner14 forringer dagligdagen15. Nuværende standard behandlinger for at forhindre CVS og / eller de dårlige kognitive resultater hos SAH patienter er baseret på blokering af Ca2 + signalering og vasokonstriktion ved hjælp af Ca2 + kanal hæmmere som Nimodipin. Men, nyere kliniske forsøg rettet mod vasokonstriktion afslørede dissociation mellem patientens neurologiske resultat og forebyggelse af CVS16, hvilket tyder på mere komplekse patofysiologiske mekanismer, der er involveret i SAH-langsigtede konsekvenser. Derfor er der et medicinsk behov for større forståelse af antallet af patologiske hændelser, der ledsager SAH og udviklingen af gyldige og standardiserede dyremodeller for at teste originale terapeutiske indgreb.

Bruddet af en intrakraniel aneurisme mest ansvarlig for SAH hos mennesker er sandsynligvis vanskeligt at efterligne i prækliniske dyremodeller. I øjeblikket aneurisme brud og SAH situation kan forsøgsvis testes ved perforering af den midterste cerebral arterie (endovaskulær punktering model) ansvarlig for CVS og sensitivomotoriske dysfunktioner i mus17,18. På grund af den manglende mulige kontrol over blødningsdebut og udbredelsen af blod i denne model er der udviklet andre metoder hos gnavere til at generere SAH-modeller uden endovaskulære brud. Mere præcist, de består af direkte administration af arteriel blod i subaraknoid rummet gennem en enkelt eller en dobbelt injektion i magna cisterna19 eller en enkelt injektion i prechiasmatic cisterne20. Den største fordel ved disse musemodeller uden endovaskulære brud er muligheden for reproducerbart at mestre den kirurgiske procedure og kvaliteten og kvantiteten af den injicerede blodprøve. En anden fordel ved denne model i forhold til modellen ved endovaskulær perforering i særdeleshed er bevarelsen af dyrets generelle velfærd. Som en kendsgerning, denne operation er mindre invasive og teknisk mindre udfordrende end det, der kræves for at generere en carotis væg brud. I denne sidste model skal dyret intuberet og mekanisk ventileres, mens en monofilament indsættes i den eksterne halspulsåre og rykkes ind i den interne halspulsåre. Dette fører sandsynligvis til forbigående iskæmi på grund af fartøj obstruktion af tråden sti. Derfor er den co-morbiditet (døende tilstand, vigtig smerte og død) forbundet med kirurgi mindre vigtigt i dobbelt injektion model sammenlignet med endovaskulær perforering model. Ud over at være en mere konsekvent SAH er metoden med direkte indsprøjtning i overensstemmelse med dyrevelfærden inden for forskning og testning (nedsat tid under anæstesi, smerter fra vævsforstyrrelser i kirurgi og angst) og fører til et samlet minimum af dyr, der anvendes til protokolundersøgelsen og personaleuddannelsen.

Desuden giver dette mulighed for gennemførelse af den samme protokol til transgene mus, hvilket fører til en optimeret patologisk forståelse af SAH og muligheden for sammenlignende test af potentielle terapeutiske forbindelser. Her præsenterer vi en standardiseret musemodel af subaraknoid blødning (SAH) ved en dobbelt daglig injektion i træk af autolog arterielt blod i cisterna magna i 6-8 uger gamle mandlige C57Bl/6J mus. Den største fordel ved denne model er kontrol af blødningsvolumen sammenlignet med endovaskulær perforering model, og styrkelsen af blødningen begivenhed uden en drastisk stigning i intrakranielt tryk21. For nylig er den dobbelte direkte injektion af blod i cisterna magna blevet godt beskrevet på de eksperimentelle og fysiopatologiske spørgsmål i mus. Faktisk har vi for nylig vist CVS af store cerebrale arterier (basilar (BA), midten (MCA) og forreste (ACA) cerebrale arterier), cerebrovaskulær fibrin deposition og celle apoptose fra dag 3 (D3) til 10 (D10), cirkulation defekter af paravascular cerebrospinalvæske ledsaget af ændret sensitivomotor og kognitive funktioner i mus, 10 dage efter SAH i denne model22. Således gør det denne model mestret, valideret og karakteriseret for kortsigtede og langvarige begivenheder post-SAH. Det bør være ideelt egnet til fremadrettet identifikation af nye mål og til undersøgelser af potente og effektive terapeutiske strategier mod SAH-associerede komplikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer blev udført under H. Castels tilsyn i overensstemmelse med det franske etiske udvalg og retningslinjerne i Europa-Parlamentets direktiv 2010/63/EU og Rådet for Beskyttelse af Dyr, der anvendes til videnskabelige formål. Dette projekt blev godkendt af det lokale CENOMEXA og de nationale etiske komitéer for dyreforskning og -afprøvning. Mandlige C57Bl/6J Rj mus (Janvier), i alderen 8-12 uger, blev anbragt under kontrollerede standard miljøforhold: 22 °C ± 1 °C, 12 timer/12 timer lys / mørk cyklus, og vand og fødevarer til rådighed ad libitum.

1. Opsætning af SAH kirurgi og forberedelse til injektion

  1. Før begyndelsen af operationen, trække et tilstrækkeligt antal glas kapillærer ved hjælp af en mikropipette puller. Indsprøjtningspipetten skal udvise en indvendig diameter på 0,86 mm og en udvendig diameter på 1,5 mm.
  2. Forbered den kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) til den falske tilstand.
    1. Der klargør en opløsning med 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4,1,3 mM MgCl2,10 mM glukose, 26,2 mM NaHCO3 i H2O, pH 7,4.
    2. Gas aCSF med 95% O2 og 5% CO2 i 15 min, og derefter tilføje 2,5 mM CaCl2.
    3. Steriliser den iltede aCSF med et filterapparat på 0,22 μm. ACSF-opløsningen kan være stabil i 3-4 uger ved 4 °C. Hvis forurening (opløsning bliver uklar) eller en aflejringsdannelse er dukket op, skal du kassere og lave frisk aCSF.
  3. Indsamling af blod fra en homolog mus donor
    1. Isoleret halspulsåren langs luftrøret og opsaml den maksimale mængde blod ved at punktere halspulsåren.
    2. I praksis skal du placere musen i et anæstesikammer og indlæse kammeret med 5% isofluran, indtil dyret mister bevidstheden.
    3. Kontroller manglen på reflekser ved at fastspænde en af to bagben for at tillade indstillingen af den kirurgiske eksperimentelle procedure.
    4. Coat en 1 ml sprøjte med en heparinopløsning ved hjælp af en 26 G nål (heparinnatrium). Dette vil forhindre blodkoagulation i løbet af de næste skridt.
    5. Monter dyret placeret i dorsale decubitus med ben fra hinanden, og næsen i en anæstesi maske (anæstesi vedligeholdelse med 2 til 2,5% isofluran).
    6. Isoler halspulsåren langs luftrøret ved at dissekere omohyoid musklen i længderetningen. Når arterien er isoleret, skal nålen indsættes mod hjertet ved hjælp af den mikroskærende krog og scefekter og opsaml det maksimale blod via punktering af halspulsåren (60 μL er nødvendig pr. SAH-mus).
    7. Ofre den bedøvede donormus umiddelbart efter blodtapningen ved hjælp af cervikal dislokation.

2. Dyr (8-10-uger gamle C57BL/6J mandlige mus) forberedelse

  1. Vej hver mus præcist ved hjælp af en elektronisk balance. I den nuværende undersøgelse, mus ville have kropsvægt inden for intervallet 20 til 25 gram lige før operationen.
  2. Som tidligere forklaret (se trin 1.3.2 og 1.3.3) fremkaldes anæstesi af mus.
  3. Barber halsen og rummet mellem ørerne med en passende elektrisk klipper.
  4. Monter dyret placeret i ventral decubitus med ben fra hinanden og næsen i en anæstesimaske (anæstesivedligeholdelse med 2 og 2,5% isofluran) på en stereotactic ramme.
  5. Kontroller, at musen sover, og at hans hoved er korrekt blokeret.
  6. Subkutanet injicere 100 μL buprenorphin (0,1 mg/kg) med en 26 G nål i lændet, for at undgå smerter efter opvågnen.
  7. Undgå tørre øjne ved hjælp af beskyttende flydende gel og opretholde en intrarectal temperatur på 37 °C ved hjælp af en auto-reguleret elektrisk tæppe.
  8. Behandl det bageste halsbarberet område med en antiseptisk opløsning (povidone-jod eller chlorhexidin ved hjælp af en steril bomuldsvej).
  9. Forsterilialisere alle instrumenter, der rører den forberedte hud/subkutane væv (opvarmning til 200 °C i 2 timer) og håndteres aseptisk.

3. SAH induktion

  1. Den første dag (D-1)
    1. Skær en 1 cm snit med tynd saks i den bageste hals, efterfulgt af adskillelse af muskler langs midterlinjen for at få adgang til cisterna magna.
    2. Skær spidsen af den tomme glaspipette med tynd saks. Derefter tilpasse sig en sprøjte forbundet til en fleksibel silikone stik.
    3. Overfør 60 μL blod eller aCSF (for henholdsvis SAH- eller sham-tilstand) i et 0,5 ml rør ved hjælp af en præcisionsmikropipette.
    4. Suges ind i glaspipettet 60 μL blod for SAH tilstand eller 60 μL af aCSF for fingeret tilstand.
    5. Til injektion skal pipetten installeres på den stereotaktiske ramme ved hjælp af en ring eller blå-tack og langsomt bringe pipette spidsen til membranen på grænsefladen med cisterna magna.
    6. Langsomt indsætte pipette spidsen gennem atlanto-occipital membran i cisterna magna, ved hjælp af en mikro-manipulator af stereotaktiske ramme.
    7. Tilslut pipetten, der tidligere var fyldt med blod eller aCSF, til sprøjten, der er klar til tryktiluktion.
    8. Injicer ved at trykke på stemplet med en lav hastighed på ca. 10 μL/min. for at undgå akut intrakranielt tryk.
    9. Under injektionen skal respirationshastigheden og rektaltemperaturen overvåges nøje.
    10. Ved injektionens afslutning skal pipetten forsigtigt tage pipetten af via mikromanipulatoren og visuelt sikre, at der ikke er lækage under tilbagetrækningen.
    11. Opnå hæmostasis ved hjælp af en absorberbar hæmostat og køre to suturer med flettet ikke-absorberbare suturing tråd.
    12. Umiddelbart efter operationen, isolere og placere musen i tilbagegang decubitus og dække det med en overlevelse tæppe i en åben kasse for varigheden af inddrivelse.
  2. Anden induktionsdag (D0)
    1. Efter 24 timer fremkaldes anæstesi (se trin 1.3.2 og 1.3.3). Subkutanet injicere 100 μL buprenorphin igen (0,1 mg/kg) og forhindre tørre øjne ved hjælp af beskyttende flydende gel (se trin 2.7 og 2.8).
    2. Installer dyret på den stereotaktiske ramme som dagen før.
    3. Fjern forsigtigt suturerne med mikroscissorer.
    4. Forbered atlanto-occipital membran som før og anvende antiseptisk forberedelse på barberet område af halsen med en steril bomuldsstang.
    5. 30 μL blod eller aCSF injiceres med lav hastighed (se trin 3.1.2 til 3.1.8). Overvåg respirationshastigheden og rektaltemperaturen.
    6. Ved slutningen af injektionen, omhyggeligt tage pipetten og kontrollere fraværet af blod lækage under tilbagetrækning.
    7. Opnå hæmostase og køre to suturer med flettet absorberbar suturing tråd.

4. Postoperativ opfølgning og afslutning af forsøget

  1. Umiddelbart efter operationen isoleres og placeres musen i tilbagegang decubitus med et overlevelsestæppe på ryggen i en åben kasse under restitution.
  2. Overvej og overhold omhyggeligt hver muss adfærd dagligt, indtil der ofres (f.eks.
  3. Blandt humane endepunkter, et betydeligt vægttab (> 15% af vægten) er klassisk bemærket. En "pukkelrygget tilbage" kropsholdning, langsomme bevægelser, prostration, unormale vokaliseringer af ondt og / eller betydelig aggressiv adfærd er også vigtige tegn på dyrs lidelser. Hvis nogen af disse tegn eller en kombination af tegn vises, er overvågningen af dyret forstærket inden for få timer efter deres udseende. Hvis dyrets velfærd forværres eller ikke forbedres inden for 48 timer, vil det blive vurderet, at et niveau af utålelige lidelser er nået, og aktiv dødshjælp udføres.
  4. På tidspunktet for valg, ofre bedøvet mus ved halshugning, og høst hjerner til yderligere analyser.
  5. Udfør dødshjælp (halshugning) efter isofluran anæstesi (5%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eksperimentel tidsplan, procedure, opfølgning og dødelighed
Figur 1A og figur 1B opsummerer SAH-modelprotokollen ved dobbelt intrakisternal blodinjektion. Kort sagt, på den første dag i SAH induktion (D-1), 60 μL blod trukket fra en homolog mus eller 60 μL kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) blev injiceret i cisterna magna i SAH eller fingeret betingelser, henholdsvis. Den næste dag (D0), blev der injiceret 30 μL blod, der blev trukket ud af en homolog mus, eller 30 μL aCSF i cisterna magna i henholdsvis SAH- eller Sham-forhold. Fireogtyve timer efter operationen, mus drab og hjerneanalyse lov til at observere blodfordelingen i paravascular rum som vist i figur 1C. Som en følsom indikator for den generelle velfærd fra D1 til ofre blev kropsvægten dagligt vurderet fra D1 til D8 og viste en betydelig reduceret vægtøgning i SAH sammenlignet med sham dyr fra D1 til D8 (Figur 1D), hvilket tyder på en langvarig genopretningsproces og langvarige patologiske hændelser efter SAH. Den postoperative dødelighed var 26,7 % ved D7, og de fleste dyr døde på D1 eller D4 efter operation (Figur 1D). Transkardieperfusion af indisk blæk ved D5 gjorde det muligt at observations makroskopiske CVS som vist i figur 1C.

Cerebral vasospasme efter SAH
Som det fremgår af El Amki et al.22, CVS af basilararterien (BA), mellem cerebral arterie (MCA) og forreste cerebral arterie (ACA) var til stede i SAH model ved dobbelt intracisternal injektion af blod i enten ACA, MCA eller BA fra D3 til D10 efter operationen. Kort(figur 2A)efter museoffer og halshugning blev hjerner høstet og postfast i 4 % paraformaldehyd (PFA) og derefter frosset ved -80 °C, før de blev skåret i 20 μm tværgående skiver ved hjælp af en kryostat. Hæmatoxylin og eosin farvning blev udført for BA (interaural 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) og ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) for at tillade CVS-identifikation via systematisk billedopkøb af farvede skiver ved hjælp af et mikroskopmonteret kamera. For at vurdere fraværet eller tilstedeværelsen af makroskopisk CVS blev lumen-forholdet mellem lumen og vægtykkelse beregnet for hver farves arterie. Jo lavere er forholdet, jo mere alvorlig er CVS. Således forekom en CVS i BA i SAH hjerner sammenlignet med fingeret mus hjerner (Figur 2B), men også i andre store cerebrale arterier (MCA, ACA, data ikke vist22).

Sensitivomotoriske dysfunktioner efter SAH
Måling af specifikke motoriske underskud, som el Amki et al. og Clavier et23al.23 er velbeskrevet i denne SAH-model, kan betragtes som et hovedkriterium for resultatet for at teste specifikke terapeutiske mål, der regulerer disse SAH-tilknyttede langsigtede virkninger. Kort(Figur 3A)ved D6 efter operationen blev hver mus evalueret i open-field-testen i 10 minutter. Ved hjælp af ANY-labyrint software version 4,99, den dækkede afstand og antallet af opdræt og hælder blev registreret. 24 timer efter open-field-testen deltog hver mus i tre på hinanden følgende sessioner af strålevandringstesten, der efter en anordningsvænningsperiode omfattede måling af den samlede gangtid, tiden til at nå platformen og antallet af ture. Resultaterne blev udtrykt som et gennemsnit af tre sessioner. Som det fremgår af El Amki et al.22, viste sensitivomotoriske dysfunktioner, der blev evalueret ved strålegangstesten ved D10 efter operationen, at være til stede i SAH-modellen (Figur 3B). Ved D9 blev spontan aktivitet af mus, der blev evalueret ved open field-testen i løbet af 10 minutter, også væsentligt påvirket af SAH som detekteret af den krydsede afstand og den lodrette aktivitet sammenlignet med fingeret tilstand (Figur 3C).

Figure 1
Figur 1. Eksperimentelt design, kirurgisk procedure, blodfordeling, makroskopisk vasospasme, kropsvægt og dødelighed efter SAH. aA) Skematisk diagram, der viser denne protokols eksperimentelle udformning. D-1 og D0 repræsenterer dagene for operationen med en dobbelt injektion på henholdsvis 60 og 30 μL aCSF (Sham) eller blod (SAH) i cisterna magna. Fra D1 til D8 blev mus observeret og vejet dagligt. På D1, hjerner blev høstet for at observere blodfordelingen i paravascular rum (C). D6 og D7 blev valgt som optimeret tidsvindue til adfærdsmæssige analyser, herunder åbne felt- og strålevandringstest. På D8 blev der udtaget prøver af hjerner til vurdering af CVS, som vist makroskopisk i (C). (B)Kirurgisk procedure for blodindsprøjtning i cisterna magna. Blod blev indsamlet fra halspulsåren af en homolog mus. Efter dyr forberedelse og installation på stereotaktisk ramme, en nakke snit blev udført i den bageste hals, de bageste muskler blev adskilt, og derefter de underliggende muskler blev dissekeret for at åbne en adgang til den vaskulære membran afgrænse cisterna magna. Pipetten blev indsat i cisterna magna før blodindsprøjtning. c) Illustration af blodfordelingen i paravascularrum 24 timer efter operationen og af makroskopisk CVS efter transkardiisk perfusion af indisk blæk fem dage efter operation i SAH sammenlignet med Sham-tilstand. d)Vægtudvikling fra D-1 til D8 efter operationen i Sham (n=10) og SAH C57Bl/6J (n=15) mus. SAH-mus viste et fald i procentdelen af kropsvægtøgning fra D1 til D8 sammenlignet med sham mus (p<0,01). ANOVA med Bonferronis post hoc test for flere sammenligningstest. Overlevelseskurve efter operation i sham (n=10) og SAH C57Bl/6J (n=15) mus. Data blev udtrykt som Kaplan Meier kurver. SAH-mus viste en vigtigere dødelighed ved D7 efter operationen sammenlignet med sham mus (p<0.05). Mantel-Cox test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Eksperimentelt design til cerebral vasospasme analyse og tidsforløb af cerebral vasospasme i basilar arterie efter SAH. aA) Skematisk diagram, der viser den eksperimentelle udformning af protokol til CVS-kvantificering. Efter post-fiksering af 4% PFA, frosne hjerner blev serielt skåret ved hjælp af en kryostat i 20 μm tværgående skiver på gelatine-belagt glas dias. Hematoxylin og Eosin (H&E) farvning blev udført fra hjerne skiver forsynet med ACA, MCA og BA. Mikrofotografier blev erhvervet ved hjælp af et mikroskop-monteret kamera på en 200x forstørrelse. Lumen område og fartøj vægtykkelse blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ ved en simpel blind metode. BB) Cvs-tiden i BA efter SAH. Repræsentative mikrofotografier af H & E farvning viser BA morfologi (lumen område og vægtykkelse) i fingeret og SAH hjerne skiver på D7 post-SAH. Kvantificering histogrammer af lumenområde/vægtykkelsesforhold, der viser CVS i BA fra D3 til D10 efter operationen (*, p<0,05). Data blev udtrykt som middel ± SEM. n=6/tilstand. ANOVA med Bonferronis post hoc test for flere sammenligninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Eksperimentelt design til adfærdsmæssig analyse af langsigtede sensitivomotor underskud efter SAH. (A) Skematisk diagram, der viser den eksperimentelle udformning af adfærdsmæssige analyse protokol efter SAH. Kort, ved D6 post-kirurgi, motorisk aktivitet adfærd mus blev evalueret ved en open-field test i 10 minutter, hvor overdækket afstand og antallet af opdræt og hælder blev registreret. Efter en hvileperiode på 24 timer blev musenes sensitivomotoriske adfærd evalueret ved strålegangstesten, hvor gangtiden, tiden til at nå platformen og antallet af ture blev registreret. (B) Fra El Amki et al.22: I strålegangstesten viste SAH-mus et øget antal ture sammenlignet med kontrollerne ved D7 (**, p<0,01), D10 (***, p<0,001) og D14 (*, p<0,05) og med sham mus på D10 (*, p<0.05). (C) Fra El Amki et al.22: SAH mus udstillet en nedsat afstand krydsede (*, p < 0,05) og lodret aktivitet sammenlignet med Sham mus på D9 (*, p< 0,01). ANOVA efterfulgt af Sidaks test af flere sammenligninger. Data blev udtrykt som middel ± SEM. n=10-12/tilstand. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På trods af intensiteten af forskningen inden for SAH og udviklingen af terapeutiske strategier såsom endovaskulære og farmakologiske behandlingsmuligheder stigende i løbet af de sidste tyve år, dødeligheden er fortsat høj inden for den første uge af hospitalsindlæggelse og når omkring 50% i løbet af de følgende 6 måneder24,25. Denne nuværende prækliniske model ved daglig dobbelt injektion af homolog arterielt blod i cisterna magna er blevet anerkendt for sin gyldighed og dens tilknytning til en lav dødelighed. Blandt SAH-gnavere modeller, en bred vifte af dødelighed er blevet rapporteret: 0-16% dødelighed med enkelt blodinjektion i cisterna magn26,,27,,28, 29,,30,31,32,33,34,35, 10-33% dødelighed med blodindsprøjtning i præchiasmatisk cister20,27,3 6,37, 16-66% dødelighed i modellen ved endovaskulær perforering38,39,,40,41,42,43,44,45 og 0-43% med modellen ved dobbelt blodindsprøjtning i cisterna magna34,35,46,47,48.29, Den lave dødelighed i modellen (9% eller 27%, afhængigt af alderen på mus) kan skyldes den svage mængde blod injiceret, den langsomme varighed af injektion, og vippe af dyret undgå lokaliseret tryk på hjernestammen, sammenlignet med andre dobbelt injektion modeller. Hos SAH-patienter påvises vinduet med CVS-forekomst klassisk ved D4-D10 efter blødningen. Hos dyr undersøges tid til debut og cvs-varighed dog mindre, og den kan variere mellem HSA-modellerne, sandsynligvis afhængigt af forsøgsprotokoller og dyrearter21.

I denne sammenhæng ligner modellen her klinisk SAH fysiopatologi i form af SAH-associeret CVS. Generelt forekommer CVS i endovaskulær perforeringsmodel i MCA og BA efter 1 time hosrotter 40 og efter 3 dage hos mus17. I modellen ved blodinjektion i præchiasmatisk cisterne blev CVS-forekomst vist mellem to49 og otte dage 37 hos rotter. I modellen af dobbelt injektion i cisterna magna hos rotter, CVS udvikler mellem 10 minutter29 og 3 dage31. Vi er de første til at beskrive kinetisk af udseendet af CVS i en mus model af SAH ved dobbelt injektion, oprettelse CVS i de vigtigste cerebrale arterier (ACA, MCA og BA) siden 3 dage og opretholdes indtil 10th dag post-SAH22, tæt på, hvad der er observeret i SAH patienter. Denne sidste model kunne defineres som en dygtig model af SAH, svær nok uden dødelighed, så undersøgelse af mekanismer og terapeutiske målretning CVS.

Men denne mus SAH model kan også præsentere nogle grænser. Det første punkt er manglen på fartøj væg brud, som eventuelt gengivet i kollagen-induceret SAH model, gennem ødelæggelse / fordøjelse af blodkar basal lamina50. Med hensyn til forekomsten af makroskopisk CVS, reduceret cerebral blodgennemstrømning (CBF) i nogle hjerneområder er ikke systematisk korreleret med neurologiske resultat, således CBF bør evalueres i denne foreslåede model af SAH. Tidligere rotteundersøgelser med Laser Doppler Flowmetri i en SAH-model med dobbelt injektion viste CBF's akutte fald til 30-52 % fra baseline efter den første injektion med en tilbagevenden til baseline efter 2 til 3 dage efterinjektionen 51,52,53. I enighed, Det har vist sig af MR-scanning et fald på CBF på 33-50% på D3 og 27-44% på D5 efter SAH induktion i rotte dobbelt injektion modeller54,55. Den dobbelte injektion i cisterna magna giver mulighed for en forudsigelig fordeling af blod langs subaraknoid rummet, hvilket resulterer især i blodpropper omkring den bageste cirkulation, men kan indføre variationer i fysiologiske parametre. For at undgå intrakranielt tryk (ICP) fra stigende med mængden af injiceret blod ind i rygmarvskanalen, både fører til confounding funktionelle funktionsnedsættelser56, valget om at fjerne en tilsvarende mængde cerebrospinalvæske kunne gøres, som tidligere gjort i andremodeller 30,51. I modellen her, sham mus modtaget en tilsvarende mængde af ACSF eller fysiologiske 0,9% NaCl, afhængigt af forsøget, naturligvis fører til en stigende ICP. En akut stigning i ICP resulterer således i en stigning fra 18 mmHg til 120 mmHg27,48,53 ienkelt injektion af blod i cisterna magna model, fra 46 til 107 mmHg27,37,49 i præchiasmatisk cisterne blodindsprøjtning model, og fra 27 til 110 mmHg 39,40,53,57,58 i endovaskulær perforering model. I modsætning hertil var den dobbelte blodindsprøjtning i cisterna magna forbundet med en mindre ICP stigning fra 60 til 67 mmHg48,53. Desuden vil fjernelsen af EFSR også ændre ICP og ændre EFSR. I SAH-modellen her var det op til beslutningen ikke at fjerne CSF før blodindsprøjtningen, men at ledsage operationen med en procedure, der bestod i at fæste dyrets hoved fra 30°. Målet er at dæmpe ICP ved at lade blodfordelingen i den forreste cirkulation, et vigtigt og nødvendigt skridt til at efterligne human SAH fysiopatologi. Hos SAH-patienter påvises en kraftig stigning i ICP og er forbundet med en forbigående global cerebral iskæmi59, hvilket sandsynligvis bidrager til en vedvarende svækkelse af autoregulering og tidlig neuronal celletab60. Men efter den første begivenhed post-SAH, en tidlig ekstern ventrikel dræning er ofte vedtaget for berørte SAH patienter, for at undgå hjernen hævelse og hydrocephalus61. Her kan den dobbelte injektion SAH model ikke være alvorlig ved den første blødning begivenhed at provokere ICP-afhængige konsekvenser observeret hos patienter, men sandsynligvis reproducere en vedvarende og mild forbedret ICP i dagevis efter SAH.

Desuden var en anden ukontrolleret parameter i SAH-modellen her de potentielle variationer af det gennemsnitlige arterielt blodtryk (MABP), der blev fremkaldt ved overdrevent hurtigblodindsprøjtningsprocedure 27. Faktisk, MABP typisk akut stiger efter eksperimentelle SAH at bevare cerebral perfusion tryk og derefter, falder til baseline. I SAH-modellen her injicerede vi blod eller aCSF (~ 10 μL/min.) med lav hastighed for at undgå disse MABP-variationer. Med hensyn til de neurobiologiske hændelser i denne model efterligne dem observeret hos mennesker, vi tidligere viste, at den dobbelte blodindsprøjtning model af SAH inducerer langvarig CVS, mikrothrombosis dannelse og cerebral hjerneskade, herunder defekt i potentielle paravascular diffusion fra dag 3 til dag 10 post-SAH22. De seneste data, der beskriver, at CSD er involveret i SAH-associeret DCI13, støtter imidlertid kraftigt forfølgelsen af denne type undersøgelser i musemodellen for dobbeltinjektion. Dette skulle muliggøre videnskabelige gennembrud med hensyn til de gavnlige virkninger af nye behandlingsformer, der er rettet mod CSD.

Afslutningsvis er modellen med dobbelt injektion af fuld arterielt blod i cisterna magna en mastered model, der giver en nem måde at efterligne den menneskelige SAH fysiopatologi herunder CVS, mikrothrombosis, vaskulær inflammation, neurologiske underskud og dødelighed. Det repræsenterer en valideret model for afprøvning af nye terapeutiske tilgange til behandling af SAH-associeret morbidødelighed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker PRIMACEN-platformen (Normandie Rouen University, Frankrig) for billedbehandlingsudstyr og Hr. Arnaud Arabo, Julie Maucotel og fru Martine Dubois for dyreopbeboering og -pleje. Vi takker fru Celeste Nicola for at give hende sin stemme til videooptagelser af protokollen. Dette arbejde blev støttet af Seinari Normandiet modning program, Fondation AVC under ledelse af FRM, Normandie Rouen University og Inserm. Normandiet og Den Europæiske Union (3R-projektet). Europa bliver involveret i Normandiet med Den Europæiske Fond for Regionaludvikling (EFRU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rincon, F., Rossenwasser, R. H., Dumont, A. The epidemiology of admissions of nontraumatic subarachnoid hemorrhage in the United States. Neurosurgery. 73 (2), 212-222 (2013).
  2. Sandvei, M. S., et al. Incidence and mortality of aneurysmal subarachnoid hemorrhage in two Norwegian cohorts, 1984-2007. Neurology. 77 (20), 1833-1839 (2011).
  3. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
  4. Solenski, N. J., et al. Medical complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a report of the multicenter, cooperative aneurysm study. Participants of the Multicenter Cooperative Aneurysm Study. Critical Care Medicine. 23 (6), 1007-1017 (1995).
  5. Cahill, J., Calvert, J. W., Zhang, J. H. Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 26 (11), 1341-1353 (2006).
  6. Huang, J., van Gelder, J. M. The probability of sudden death from rupture of intracranial aneurysms: a meta-analysis. Neurosurgery. 51 (5), 1101-1107 (2002).
  7. Rabinstein, A. A. Secondary brain injury after aneurysmal subarachnoid haemorrhage: more than vasospasm. Lancet Neurology. 10 (7), 593-595 (2011).
  8. Kivisaari, R. P., et al. MR Imaging After Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage and Surgery: A Long-term Follow-up Study. American Journal of Neuroradiology. 22 (6), 1143-1148 (2001).
  9. Mayberg, M. R., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. A statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 25 (11), 2315-2328 (1994).
  10. Dankbaar, J. W., et al. Relationship between vasospasm, cerebral perfusion, and delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neuroradiology. 51 (12), 813-819 (2009).
  11. Sehba, F. A., Hou, J., Pluta, R. M., Zhang, J. H. The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Progress in Neurobiology. 97 (1), 14-37 (2012).
  12. Miller, B. A., Turan, N., et al. Inflammation, vasospasm, and brain injury after subarachnoid hemorrhage. BioMed Res Int. 2014, 384342 (2014).
  13. Dreier, J. P., et al. Delayed ischaemic neurological deficits after subarachnoid haemorrhage are associated with clusters of spreading depolarizations. Brain. 129, Pt 12 3224-3237 (2006).
  14. Mayer, S., et al. Global and domain-specific cognitive impairment and outcome after subarachnoid hemorrhage. Neurology. 59 (11), 1750-1758 (2002).
  15. Al-Khindi, T., Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Cognitive and functional outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Stroke. 41 (8), 519-536 (2010).
  16. Macdonald, R. L., et al. Randomized trial of clazosentan in patients with aneurysmal subarachnoid hemorrhage undergoing endovascular coiling. Stroke. 43 (6), 1463-1469 (2012).
  17. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurological Research. 24 (5), 510-516 (2002).
  18. Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. A murine model of subarachnoid hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).
  19. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  20. Sabri, M., et al. Anterior circulation mouse model of subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1295, 179-185 (2009).
  21. Leclerc, J. L., et al. A Comparison of Pathophysiology in Humans and Rodent Models of Subarachnoid Hemorrhage. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 71 (2018).
  22. El Amki, M., et al. Long-Lasting Cerebral Vasospasm, Microthrombosis, Apoptosis and Paravascular Alterations Associated with Neurological Deficits in a Mouse Model of Subarachnoid Hemorrhage. Molecular Neurobiology. 55 (4), 2763-2779 (2018).
  23. Clavier, T., et al. Association between vasoactive peptide urotensin II in plasma and cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a potential therapeutic target. Journal of Neurosurgery. , 1-11 (2018).
  24. Kundra, S., Mahendru, V., Gupta, V., Choudhary, A. K. Principles of neuroanesthesia in aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Anaesthesiology Clinical Pharmacology. 30 (3), 328-337 (2014).
  25. Schertz, M., et al. Incidence and Mortality of Spontaneous Subarachnoid Hemorrhage in Martinique. PLOS ONE. 11 (5), 0155945 (2016).
  26. Lin, C. -L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).
  27. Prunell, G. F., Mathiesen, T., Diemer, N. H., Svendgaard, N. -A. Experimental subarachnoid hemorrhage: subarachnoid blood volume, mortality rate, neuronal death, cerebral blood flow, and perfusion pressure in three different rat models. Neurosurgery. 52 (1), 165-176 (2003).
  28. Turowski, B., et al. New angiographic measurement tool for analysis of small cerebral vessels: application to a subarachnoid haemorrhage model in the rat. Neuroradiology. 49 (2), 129-137 (2007).
  29. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  30. Muñoz-Sánchez, M. Á, et al. Urotensinergic system genes in experimental subarachnoid hemorrhage. Medicina Intensiva (English Edition). 41 (8), 468-474 (2017).
  31. Delgado, T., Brismar, J., Svendgaard, N. A. Subarachnoid haemorrhage in the rat: angiography and fluorescence microscopy of the major cerebral arteries. Stroke. 16 (4), 595-602 (1985).
  32. Solomon, R. A., Antunes, J. L., Chen, R., Bland, L., Chien, S. Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage: a new animal model. Stroke. 16 (1), 58-64 (1985).
  33. Ram, Z., Sahar, A., Hadani, M. Vasospasm due to massive subarachnoid haemorrhage-a rat model. Acta Neurochirurgica. 110 (3-4), 181-184 (1991).
  34. Glenn, T. C., et al. Subarachnoid hemorrhage induces dynamic changes in regional cerebral metabolism in rats. Journal of Neurotrauma. 19 (4), 449-466 (2002).
  35. Gules, I., Satoh, M., Clower, B. R., Nanda, A., Zhang, J. H. Comparison of three rat models of cerebral vasospasm. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 283 (6), 2551-2559 (2002).
  36. Sabri, M., et al. Mechanisms of microthrombi formation after experimental subarachnoid hemorrhage. Neuroscience. 224, 26-37 (2012).
  37. Jeon, H., Ai, J., Sabri, M., Tariq, A., Macdonald, R. Learning deficits after experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Neuroscience. 169 (4), 1805-1814 (2010).
  38. Silasi, G., Colbourne, F. Long-term assessment of motor and cognitive behaviours in the intraluminal perforation model of subarachnoid hemorrhage in rats. Behavioural Brain Researchearch. 198 (2), 380-387 (2009).
  39. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26 (6), 1086-1092 (1995).
  40. Bederson, J. B., et al. Acute vasoconstriction after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 42 (2), 352-362 (1998).
  41. Park, I. -S., et al. Subarachnoid hemorrhage model in the rat: modification of the endovascular filament model. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 195-200 (2008).
  42. Vanden Bergh, W., et al. Magnetic resonance imaging in experimental subarachnoid haemorrhage. Acta Neurochirurgica. 147 (9), 977-983 (2005).
  43. Peng, J., et al. LRP1 activation attenuates white matter injury by modulating microglial polarization through Shc1/PI3K/Akt pathway after subarachnoid hemorrhage in rats. Redox Biology. 21, 101121 (2019).
  44. Okada, T., et al. Selective Toll-Like Receptor 4 Antagonists Prevent Acute Blood-Brain Barrier Disruption After Subarachnoid Hemorrhage in Mice. Molecular Neurobiology. 56 (2), 976-985 (2019).
  45. Tiebosch, I. A., et al. Progression of brain lesions in relation to hyperperfusion from subacute to chronic stages after experimental subarachnoid hemorrhage: a multiparametric MRI study. Cerebrovascular Diseases. 36 (3), 167-172 (2013).
  46. Weidauer, S., Vatter, H., Dettmann, E., Seifert, V., Zanella, F. E. Assessment of vasospasm in experimental subarachnoid hemorrhage in rats by selective biplane digital subtraction angiography. Neuroradiology. 48 (3), 176-181 (2006).
  47. Lee, J. Y., Huang, D. L., Keep, R., Sagher, O. Characterization of an improved double hemorrhage rat model for the study of delayed cerebral vasospasm. Journal of Neuroscience Methods. 168 (2), 358-366 (2008).
  48. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PloS one. 7 (3), 33366 (2012).
  49. Piepgras, A., Thome, C., Schmiedek, P. Characterization of an anterior circulation rat subarachnoid hemorrhage model. Stroke. 26 (12), 2347-2352 (1995).
  50. Rosenberg, G. A., Mun-Bryce, S., Wesley, M., Kornfeld, M. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats. Stroke. 21 (5), 801-807 (1990).
  51. Raslan, F., et al. A modified double injection model of cisterna magna for the study of delayed cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage in rats. Experimental & Translational Stroke Medicine. 4 (1), 23 (2012).
  52. Cai, J., et al. A novel intravital method to evaluate cerebral vasospasm in rat models of subarachnoid hemorrhage: a study with synchrotron radiation angiography. PLoS One. 7 (3), 33366 (2012).
  53. Lee, J. Y., Sagher, O., Keep, R., Hua, Y., Xi, G. Comparison of experimental rat models of early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (2), 331-343 (2009).
  54. Guresir, E., et al. The effect of common carotid artery occlusion on delayed brain tissue damage in the rat double subarachnoid hemorrhage model. Acta Neurochir (Wien). 154 (1), 11-19 (2012).
  55. Vatter, H., et al. Time course in the development of cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage: clinical and neuroradiological assessment of the rat double hemorrhage model. Neurosurgery. 58 (6), 1190-1197 (2006).
  56. Leonardo, C. C., Robbins, S., Doré, S. Translating basic science research to clinical application: models and strategies for intracerebral hemorrhage. Frontiers in Neurology. 3, 85 (2012).
  57. Feiler, S., Friedrich, B., Schöller, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).
  58. Westermaier, T., Jauss, A., Eriskat, J., Kunze, E., Roosen, K. Acute vasoconstriction: decrease and recovery of cerebral blood flow after various intensities of experimental subarachnoid hemorrhage in rats. Journal of Neurosurgery. 110 (5), 996-1002 (2009).
  59. van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. 41 (4), 917-930 (2018).
  60. Conzen, C., et al. The Acute Phase of Experimental Subarachnoid Hemorrhage: Intracranial Pressure Dynamics and Their Effect on Cerebral Blood Flow and Autoregulation. Translational Stroke Research. 10 (5), 566-582 (2019).
  61. Connolly, E. S., et al. Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/american Stroke Association. Stroke. 43 (6), 1711-1737 (2012).

Tags

Neurovidenskab Subarachnoid blødning cisterna magna mus vasospasme dyremodel sensitivo-motorisk test blod
Dobbelt direkte injektion af blod i Cisterna Magna som en model af Subarachnoid Blødning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter