Summary
Målet med denne studien var å utvikle en murin modell av brenne sårheling. En termisk brenning ble indusert på dorsalhuden til mus ved hjelp av en forvarmet messingmal. Brent vev ble debrided og overlaid med en hud graft høstet fra halen av en genetisk lignende donor mus.
Abstract
Trivielle overfladiske sår helbreder uten komplikasjoner ved primær intensjon. Dype sår, som full tykkelse brenner, helbrede etter sekundær intensjon og krever kirurgisk debridement og hud pode. Vellykket integrering av donortransplantatet i en mottaker sårseng avhenger av rettidig rekruttering av immunceller, robust angiogen respons og ny ekstracellulær matrisedannelse. Utviklingen av nye terapeutiske midler, som retter seg mot noen viktige prosesser som er involvert i sårheling, hindres av mangelen på pålitelige prekliniske modeller med optimalisert objektiv vurdering av sårlukking. Her beskriver vi en billig og reproduserbar modell av eksperimentell full tykkelse brenne sår rekonstruert med en allogen hud graft. Såret er indusert på dorsumoverflaten av bedøvede innavlede villtypemus fra BALB/C- og SKH1-Hrhr-bakgrunnen. Brenningen produseres ved hjelp av en messingmal som måler 10 mm i diameter, som er forvarmet til 80 °C og leveres ved et konstant trykk i 20 s. Brenn eschar utskilles 24 timer etter skaden og erstattes med en full tykkelse pode høstet fra halen av en genetisk lignende donormus. Ingen spesialisert utstyr er nødvendig for prosedyren og kirurgiske teknikker er enkle å følge. Metoden kan enkelt implementeres og reproduseres i de fleste forskningsinnstillinger. Visse begrensninger er knyttet til modellen. På grunn av tekniske problemer er innhøstingen av tynnere hudtransplantater med delt tykkelse ikke mulig. Den kirurgiske metoden vi beskriver her gjør det mulig å rekonstruksjon av brannsår ved hjelp av full tykkelse hudtransplantater. Det kan brukes til å utføre preklinisk terapeutisk testing.
Introduction
Kirurgisk debridement og hud pode er vanlig klinisk praksis som brukes i forvaltningen av kroniske sår1, brenne sår2, og akutte sår som traumatiske sår3. Hudtransplantasjon refererer til den kirurgiske prosedyren, som innebærer fjerning av sunn hud fra en del av kroppen og overføre den til en annen. Donortransplantater erstatter det tapte vevet og gir et strukturelt stillas for mobilmigrasjon og vekst. Etter integrering i mottakerstedet erstatter hudtransplantater den tapte hudbarrieren ved å gi beskyttelse mot mikrobiell invasjon, skadelige effekter av det ytre miljøet og overdreven tap av fuktighet4. Vellykket integrering av hudtransplantat avhenger av flere faktorer. Disse inkluderer tilstrekkelige immunresponser i nærvær av mikrobielle infeksjoner og rettidig oppløsning av betennelse, robust angiogenese på sårstedet og etablering av vaskulære anastomoser mellom mottakersengen og donortransplantatet5. Etter hvert som transplantatet begynner å forringes, må resident dermal celler erstattes av celler som er i stand til å produsere ny ekstracellulær matrise. Samtidig må epidermale keratinocytter krype over den nyproduserte matrisen for å danne neo-epidermis og re-epitelialisere såret. Det er derfor tydelig at effektiv migrering av celler fra mottakersengen til donortransplantatet er en annen avgjørende faktor som påvirker vellykket podeinnarbeidelse. Gitt det store antallet faktorer som er involvert i sårheling6, som kan være umulig å kontrollere i de menneskelige studiene på grunn av etiske begrensninger, er modeller av preklinisk eksperimentell hudpoding nødvendig. Utvikling av prekliniske modeller for brennårsheling og tilhørende hudtransplantering vil være viktig for forståelse av komplekse mekanismer involvert i kutan vevreparasjon og avgjørende for testing av nye terapeutiske midler. In vitro-modellene for sårheling er ikke i stand til å nøyaktig etterligne kompleksiteten i kutan vev. In vivo dyremodeller er et uunnværlig undersøkende verktøy for å forstå mekanismene som er involvert i vevsreparasjon.
Flere metoder for hudtransplanteringsteknikk ble utviklet hos gnagere for å etterligne kirurgisk eksisjon og brenne sårrekonstruksjon7,,8,9. Imidlertid klarte de fleste av de tidligere beskrevne prosedyrene ikke å indusere en termisk brannskade før hudtransplantasjon. I stedet for brennsåret ble et fulltykkelsesutsår indusert, som deretter ble rekonstruert med en full tykkelse hud allograft7. Ulike anatomiske landemerker som øre, hale og rygg har blitt brukt til høsting av donorhuden hos gnagere7,8. Ulike graft fiksering og stabilisering teknikker ble rapportert, inkludert en "ingen sutur teknikk"9,suturer7 og kirurgisk lim10,,11,,12.
Formålet med denne studien var å utvikle en murine modell av en full tykkelse brenne sår som ville rekapitulere dagens gull standard tilnærming i brenne behandling, som innebærer ikke levedyktig vev excision og hud pode. En termisk brenning ble indusert på hele overflaten av en mus ved hjelp av en forvarmet messingmal. Brenn eschar ble utskåret og erstattet med en full tykkelse pode høstet fra halen av en donor mus. Det er tre viktige fordeler med denne eksperimentelle modellen. For det første kan mer enn ett brannsår induseres på baksiden av mottakermusen, og fire donorhudtransplantater kan høstes fra en enkelt hale av donormusen. Dette betyr at flere eksperimentelle og kontrollbehandlinger potensielt kan sammenlignes med samme mottaker og donordyr. Avhengig av ønsket administrasjonsmåte kan kontrollbehandlingen omfatte lokal eller systemisk administrering av kjøretøyet eller placebokontrollen (f.eks. aktuell bruk av salve, subkutan, intraperitoneal eller intravenøs injeksjon av oppløsning). For det andre kan tidspunktet for behandlingen og endepunktet for eksperimentet kontrolleres. For det tredje avhenger denne modellen av rekonstruksjon av sår ved hjelp av full tykkelse grafts høstet fra halen, som er kjent for å ha en høyere sannsynlighet for vellykket inkorporering i donorområdet sammenlignet med huden høstet fra baksiden13. Dette kan skyldes det lavere antallet epidermale Langerhans-celler, som spiller en nøkkelrolle i kutan immunbiologi, og er forbundet med hudtransplantatavstøting14.
Den foreslåtte modellen for sårheling og graftintegrasjon kan godt brukes på transgene og knockout mus. Bruken av genmodifiserte mus vil bidra til å belyse rollene som visse gener kan spille under sårreparasjon. Eksogen bruk av aktuelle sårpreparater eller subkutan administrering av terapeutiske antistoffer på skadestedet kan også vurderes.
På grunn av tekniske problemer er hudtransplantater i delt tykkelse bestående av epidermis og en del av dermis vanskelig å oppnå hos mus. Full tykkelse hud grafts bestående av epidermis og full tykkelse dermis er kjent for å kreve en godt vaskularisert sår seng for vellykket integrering. Manglende evne til å høste hudtransplantater i glass i glass i glasset kan betraktes som en begrensning av denne modellen. Fiksering av hudtransplantatet til mottakerens sårseng ble oppnådd ved påføring av det kirurgiske klebelimet, som er forbundet med mindre traumer og rask nedbrytning sammenlignet med andre former for vevsfiksering15. Tidligere studier har vist at suturering er forbundet med sterkere vevsfiksering enn det kirurgiske limet ved 24 timer etter kirurgisk prosedyre15, som kan betraktes som en ulempe med prosedyren. Men på senere tidspunkter blir den biomekaniske styrken av sår behandlet med et kirurgisk lim sammenlignbar med suturer15 og bedre enn stiftfiksering16. Etter vevsfiksering med kirurgisk lim, må sår dekkes med en sårdressing. Selv om sår på den dorsale overflaten av musen er vanskelig for dyret å nå, er sårdressingen derimot lett for dyret å manipulere og fjerne. Hyppige endringer i sårdressing kan være berettiget.
Anestesi-indusert hypotermi hos små gnagere er et godt dokumentert fenomen17. Hypotermi er en bivirkning av denne prosedyren, noe som forårsaker komplikasjoner, og potensielt kompromitterer både dyrehelse og datakvalitet. Derfor garanterer denne metoden gjennomføringen av temperaturstyringsstrategier, spesielt hvis hårløse SKH1-Hrhr brukes.
Den viktigste begrensningen ved å bruke mus for å etterligne menneskelig sårlukking er forskjellen mellom hudens anatomi og fysiologi. Mus sår helbreder hovedsakelig via sammentrekning, mens menneskelige sår helbreder gjennom granulering vevdannelse og re-epitelialisering18. For å ta høyde for dette avviket, kan den nåværende modellen endres og brukes i kombinasjon med en skinnende ring tett festet rundt såret for å hindre hudkontraksjon19. Gitt noen fordeler og ulemper ved denne in vivo-protokollen, kan denne modellen tjene som et verktøy for å studere visse prosesser som er involvert i sårheling som er umulig å studere in vitro.
Protocol
Alle eksperimenter ble godkjent av det franske institutt for høyere utdanning og forskning (studienummer: 122162017111616517670v2 og DAP180012). Alle musene var enhus ved ankomst i plastbur og fikk en 7-dagers akklimatiseringsperiode før studien. Dyrerommet ble opprettholdt på en 12/12 t lys / mørk syklus (lys på kl 07:00). Mat og vann fra springen ble gitt ad libitum. BALB/c og SKH1-Hrhr-mus ble matet tradisjonelt hvete/soyabasert kosthold. Sagflis sengetøy ble utstyrt sammen med hekkende materiale.
1. Utstyr forberedelse
- Klargjør en brennende enhet for prosedyren og sett den til 80 °C ved hjelp av temperaturregulatoren (Figur 1A). Kontroller temperaturen på messingmalen (Figur 1B,C) ved hjelp av det infrarøde termiske bildekameraet.
- Kontroller at det digitale manometeret fungerer som det skal.
- Dekk scenen med en kirurgisk drapering og juster høyden på bordet (Figur 1A).
2. Preoperativ og intraoperativ dyrepleie
- Erverve BALB/c og SKH1-Hrhr mus, 6-8 uker.
- Tilsett paracetamol suspensjon ved 3 mg / ml til drikkevann og tilsett 12 timer før og opptil 72 timer etter prosedyren.
- Bruk en 1 ml sprøyte og en 26 G kanyle, administrere buprenorfin subkutansalt ved 0,05 μg/g 30 min før prosedyren og hver 6.
- Bruk en 1 ml sprøyte og en 26 G kanyle, administrer lidokain til musens dorsum og 2-3 mm distal til brennsåret. Injiser lidokain ved 0,05 μg/g subkutøst 15 min før induksjon av brennsåret.
- Bedøve mus ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av xylazin ved 10 mg/kg og ketamin 100 mg/kg. Bruk en 1 ml sprøyte og en 26 G kanyle til å administrere injeksjonen.
- Kritisk trinn: Plasser bedøvet mus på en oppvarmet pute og hold musen varm for å forhindre hypotermi de første 30 minuttene etter induksjon av anestesi og i minst 15 minutter etter utvinning fra anestesi. I tillegg til den oppvarmede puten kan andre modaliteter, inkludert varmelamper,sirkulerende varme væsker eller luft, og forvarmede varmereservoarer brukes til å regulere kroppstemperaturen. heat
- Påfør smøregel på musens øyne for å forhindre dehydrering av hornhinnen.
- Bruk tåklemmetinstinensrefleksen for å vurdere dybden av anestesi.
- Ved hjelp av en 1 ml sprøyte og en 26 G kanyle administrere 200 μL av Lactated Ringer's Solution supplert med 5% dekstrose. Administrer væskeerstatning subkutært umiddelbart etter induksjon av anestesi og 6 timer etter prosedyren for å forhindre dehydrering.
3. Full tykkelse brenne sår induksjon
- Barber den bedøvede musen med hårklippere.
- Påfør hårtørr på den dorsum overflaten av musen i 1 minutt. Tørk av kremen med litt steril gasbind og rengjør området med et stykke fuktig gasbind. Blot huden med litt gasbind til den er tørr.
- Plasser musen på scenen dekket med en kirurgisk drapering og flytt scenen oppover nærmere den forvarmede messingmalen.
- Påfør den sirkulære messingmalen på baksiden av musen (80 °C i 20 s) med konstant trykk på 0,15 N (figur 2).
- Kritisk trinn: Umiddelbart etter brenninduksjon, plasser det bedøvede dyret på den oppvarmede puten for å forhindre hypotermi og hold musen varm under og etter prosedyren. Når gjenopprettet fra anestesi, returnere musen tilbake til buret.
- Kritisk trinn: Gi en mashed diett på burgulvet de første 72 timene etter den kirurgiske prosedyren. Mus er noen ganger motvillige til å nå opp til et sipperrør for å drikke vann etter en brannskadskade.
4. Høsting av donortransplantatet
- Lag et langsgående snitt med en skalpell i den øvre delen av hale av donormusen og fjern forsiktig huden ved hjelp av kirurgiske tang.
- Legg halehuden i en steril petriskål fylt med 10 ml steril 0,9% saltoppløsning. Bruk en linjal til å måle ut individuelle grafts og kutte halehuden i stykker, hver måler 15 mm, ved hjelp av en skalpell.
- Når du er klar, hold hudtransplantatene i 0,9 % saltvannsløsning ved 4 °C i opptil 2 timer.
5. Kirurgisk eksisjon og hudtransplantasjon
- Tjuefire timer etter brennduksjon, forberede musen for anestesi ved innånding av isofluran. Plasser musen i induksjonskammeret og induser anestesi ved hjelp av 5% isofluran i 100% oksygen med en strømningshastighet på 4 l / min. For å opprettholde anestesi under operasjonen, bruk 2% isofluran ved 2 l / min.
- Plasser en kirurgisk drapere på musen og klipp ut et vindu for å eksponere det kirurgiske feltet. Bruk aseptisk teknikk, vattpinne såret først med povidon-jod og deretter med 70% alkohol.
- Plukk forsiktig opp det brente vevet med et par kirurgiske pinsett og avgiftsdirektoratet alt nekrotisk og ikke-levedyktig vev med steril kirurgisk saks og pinsett. Fjern panniculus carnosus laget av hypodermis for å lage en stabil mottaker seng.
- Plasser hudtransplantatet på den nylagde sårsengen. Trekk forsiktig den omkringliggende huden mot hudtransplantatet ved hjelp av kirurgiske pinsett. Påfør litt kirurgisk lim for å feste transplantatet til sårsengen og trykk forsiktig for å justere hudkantene. Kritisk trinn: Størrelsen på sårsengen må være litt større enn størrelsen på hudtransplantatet for å sikre vellykket engraftment.
- La musen gjenopprette fra anestesi. Kritisk trinn:Plasser musen på en oppvarmet pute. Hold musen varm under og etter prosedyren for å forhindre hypotermi.
- Påfør inert parafin gasbind dressing og klebende sekundær dressing over podet såret.
- Plasser musen i et individuelt bur. Kritisk trinn: Gi litt mashed diett på burgulvet de første 72 timene etter kirurgisk prosedyre og overvåke daglig.
- Gi leker og berike miljøet.
6. Digital bildebehandling og post-mortem sårsamling
- Fotografer sår med et digitalt kamera ved å plassere en linjal ved siden av såret (Figur 3).
- På slutten av forsøket, euthanize dyr ved eksponering for karbondioksid og cervical dislokasjon. Kritisk trinn: Overdreven trekkvirkning av huden under cervical dislokasjon kan skade transplantatet.
- Ved post-mortem, kirurgisk avgiftsdirektoratet dorsal brenne sår til fascia ved hjelp av saks. Bisect sår. Fiks halvparten i 10% bufret formalin og prosess for histologi og immunohistochemistry. Frys den andre halvdelen i flytende nitrogen for RNA-ekstraksjon og proteinmengde og hold deg ved -80 °C.
7. Hudhistologi, immunohistokjemi og kollagenvisualisering
- Bygg inn hudprøver i parafin, kutt til 4 μm seksjoner og plasser på positivt ladede lysbilder.
- Bruk lysbilder farget med hematoxylin og eosin for å evaluere frekvensen av re-epitelialisering (% av det opprinnelige såret). Såret som er dekket med neo-epidermis kan uttrykkes som en prosentandel av hele såret (figur 4). Bruk et digitalt mikroskopprogram og ImageJ-programvare til å utføre den mikroskopiske analysen av seksjonene.
- Bruk histologiske seksjoner (4 μm tykkelse) utarbeidet fra formalin-fast og parafin-innebygd vev og utsette dem for immunohistokjemi.
- For å vurdere kollagen I og fibronekt uttrykk i sår, bruke primære antistoffer og inkubere i 1 h. Deteksjon kan utføres av arter-spesifikke pepperrot peroxidase (HRP) eller alkaliske fosfatase (AP)-konjugert sekundære antistoffer.
- Reagere seksjoner med enten: (i) HRP,3,3'-diaminobenzidin (DAB) eller (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Table of Materials), som gir en lys rød farge (Figur 5). Skann delene ved hjelp av et instrument og analyser med det digitale mikroskopprogrammet og ImageJ.
- For å muliggjøre histologisk vurdering av kollagendeponering, utfør trichrome farging på histologiske seksjoner ved hjelp av et kommersielt sett.
- For kollagenfibervisualisering, bruk multiphoton mikroskopi og andre harmonisk generasjon teknikk (Figur 5). Bruk et mikroskop med flere bilder for vevsavbildning som tidligere beskrevet20. Bruk en Ti:Sapphire laser med en midtbølgelengde på 810 nm som laserkilde for å generere andre harmoniske og to-foton spent fluorescens signaler (TPEF).
- Bruk en laserstråle utstyrt med et 25x/0,95 W mål for å samle og opphisse andre harmonisk generasjon (SHG) og TPEF. Oppdag signaler som beskrevet tidligere21 av NDD PMT-detektorer. Bruk programvare for laserskanningskontroll og bildeanskaffelse.
Representative Results
Resultatene viser at protokollen som er utviklet er en enkel metode, som tillater induksjon av en full tykkelse brenne sår i mus. Brannskader induseres ved hjelp av en forvarmet messingmal (figur 1A-C). Det brente området fremstår som et sirkulært sår med en hvit eschar og en hyperemisk sone. Størrelsen på brennsåret er litt større ved 24 timer etter brannskadet som følge av det godt beskrevne fenomenet kjent som brannskader, som muligens skyldes akutt betennelse22. Etter eksisjon rekonstrueres brennsår ved hjelp av allogen hudtransplantat (figur 3). På dag 7 etter brannskader blir sår vaskularisert5, noe som er en indikasjon på vellykket engraftment. Epidermale keratinocytter migrerer fra den tilstøtende mottakerhuden i forsøket på å lukke såret og bygge bro mellom de to kantene av sårene. Mikroskopisk analyse av H og E farget del av sår viste at lengden på neo-epidermis blir betydelig lenger på dag 7 etter brannskader sammenlignet med dag 3 etter brannskade (Figur 4B). Før de utfører en stor studie, anbefales det sterkt at forskere fullfører en pilotstudie, som muliggjør utforskning av en ny intervensjon, vurdering av gjennomførbarhet, identifisering av modifikasjoner på metoden for å sikre reproduserbarhet. Statistisk signifikante effekter er vanskelige å oppdage i mindre prøver, mens det å øke utvalgsstørrelsen er en måte å øke den statistiske kraften i en test på. Hvis du for eksempel vil oppdage en statistisk signifikant forskjell (p < 0,05) i sårets reepiteliseringshastighet(figur 4)mellom gruppene, bør prøvestørrelsen være mellom seks og åtte mus per gruppe. Alle eksperimenter bør gjentas minst to ganger. Som matriseproduserende celler, som fibroblaster, migrerer fra mottakervevet inn i transplantatet, blir viktige komponenter i den ekstracellulære matrisen, inkludert kollagen I og fibronectin sterkt uttrykt i den nyopprettede matrisen (Figur 5).
Figur 1: Oppsett av brenneenhet. (A)Plassering og oppsett av den brennende enheten. Den brennende enheten er koblet til temperaturregulatoren og er festet til det digitale monometeret for å muliggjøre overvåking av trykk. Den brennende enheten er suspendert over et justerbart stadium - flat overflate som mus er plassert på for induksjon av brenning. - Jeg harikke noe valg. Et nærbilde av messingmalen som brukes til å indusere sårforbrenninger. (C)Diameteren på messingmalen er 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av de ulike trinnene som kreves for å reprodusere den eksperimentelle modellen som er beskrevet i denne artikkelen. Det er tre hovedtrinn til prosedyren: (i) induksjon av brennsåret ved hjelp av en forvarmet messingmal; (ii) kirurgisk eksisjon av det ikke-levedyktige nekrotiske vevet ved 24 timer etter brannskadet; (iii) kirurgisk sårrekonstruksjon ved hjelp av en full tykkelse allogen hud graft høstet fra en donor mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Det makroskopiske synet på rekonstruerte museforbrenningssår. Representative digitale bilder av brannsår rekonstruert med allogen hudtransplantater på dag 0, 1, 3 og 7 etter brannskader. Linjalen på bilder er i millimeter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Mikroskopisk utseende av sår ved 3 og 7 dager etter brannskade. H&E-farget deler av sår 3 og 7 dager etter brannskade. Lengden på neo-epidermis (stiplet linje) økes betydelig i (A) dag 3 sår sammenlignet med (B) dag 7 sår. I (A) og (B)er vektstangen 100 μm. (C) Grafisk representasjon av prosentandelen av sår re-epitelisering. Dette ble evaluert ved å måle lengden på neo-epidermis på dag 3 og 7 etterforbrenningsskade og uttrykt som en prosentandel av hele sårlengden. Resultatene representerer gjennomsnitt ± S.E.M. (n = 6 mus i dag 3-gruppen; n = 6 mus i dag 7-gruppen, *p < 0,05; Studentens t-test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Vurdering av den ekstracellulære matrisen og kollagen I visualisering. Representative bilder av immunohistochemistry analyse på dag 7 mus sår farget for (A) kollagen og (B) fibronectin. Legg merke til intens rød farging i langstrakte spindelformede kollagen I-positive celler. Legg merke til brun farging i fibronectin-positive celler i dermis av dag 7 sår. Skalalinje = 50 μm i alle bilder. I (A) og (B) betegner e epidermis og d betegner dermis. (C) Visualisering av kollagenfibre og histologisk vurdering av kollagendeponering. (D) Representant TPEF / SHG kollagen bilde av dag 7 mus sår. Samtidig TPEF/SHG-oppkjøp ved hjelp av sirkulær polarisering og SHG-signaler ble selektivt behandlet for å oppnå en binær fordeling av SHG etter å ha brukt en terskel. TPEF-bilder (grønne) og SHG-bilder (hvit) var pseudofargede og overlaide. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Discussion
Ifølge tykkelseklassifiseringen av brannskader23er full tykkelsesforbrenninger preget av tydelig involvering av hele tykkelsen på huden og en viss del av det subkutane vevet. Denne typen sår kan bare helbrede ved sammentrekning eller med hud pode2. En iboende begrensning av metoden som er beskrevet i denne artikkelen er at bare full tykkelse grafts, i motsetning til split tykkelse grafts, som ofte brukes i klinisk setting, ble høstet fra halen av en mus. Dette var på grunn av de tekniske vanskelighetene, da musehuden er for tynn til å oppnå splittykkelse grafts. Det må påpekes at full tykkelse grafts krever en godt vaskularisert sår seng, mens split tykkelse hud grafts er i stand til å overleve på donor steder med mindre vascularity24. Tidligere studier viste at et brannsår indusert på baksiden av musen var forbundet med en robust dannelse av ny vaskulatur5. Dette tyder på at et godt vaskularisert område, som musens dorsum, kan betraktes som det anatomiske landemerket for induksjon av brannsår.
Brenn sårdybde er en viktig faktor å vurdere. Dybden av brennsåret må være konsistent mellom individuelle mus. Reproduserbarheten av sårdybden avhenger av temperaturen på messingmalen, trykket og varigheten av varmeeksponeringen. Brennsårsdybden må verifiseres histologisk. Det er viktig å huske på at overdreven trykk eller langvarig eksponering av huden til den forvarmede messingmalen kan skade det underliggende vevet. Vevet rundt vertebralkolonnen, inkludert komponentene i det sentrale og perifere nervesystemet, er følsomme for varme, og hvis skadet kan føre til lammelse i bakbenet.
Selv om ingen postoperativ dødelighet var direkte forbundet med den kirurgiske prosedyren, utviklet et lite antall hårløse SKH1-Hrhr-mus, som er spesielt følsomme for kulde, hypotermi og ikke klarte å gjenopprette etter den generelle anestesi. Derfor må det gis supplerende varme under alle estetiske hendelser, og konstant overvåking er nødvendig mens musen er bedøvet.
Metoden som er beskrevet i denne studien var ikke forbundet med infeksjonen på operasjonsstedet. Aseptisk teknikk må imidlertid brukes til å forhindre overføring av mikroorganismer til det kirurgiske såret i den perioperative perioden. Inokulasjon av såret med bioluminescerende eller fluorescerende mikroorganismer kan innlemmes i prosedyren. Denne teknikken kan være nyttig for å studere smittsomme organismer og deres patogenese25. For eksempel kan eksogen tilsetning eller injeksjon av bioluminescerende bakterier tillate overvåking av mikrobiell byrde ved hjelp av in vivo hele dyr imaging25. Gitt at musehår er kjent for å forstyrre in vivo hele dyr fluorescens og bioluminescence imaging, hårløse SKH1-Hrhr mus er ideelle verter for studier som involverer fluorescerende eller bioluminescence reportere.
Sårvevsprøver kan samles på forskjellige tidspunkter og behandles for histologisk og immunohistokjemisk analyse. Protein og RNA kan isoleres fra hudens biopsi og molekylærbiologiteknikker kan brukes til å vurdere uttrykket av viktige molekyler som er involvert i sårheling.
I den nåværende studien beskrev vi en eksperimentell modell av brennårshelbredelse og allogen hud engraftment. Denne prosedyren kan endres og tjene som en modell for prekliniske studier.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense og École Polytechnique. Vi takker vår kollega Mr Yann Plantier fra École Polytechnique som ga innsikt og kompetanse som i stor tid hjalp produksjonen av videofilen. Forfatterne takker Mr Benoit Peuteman og Ms Charlotte Auriau fra INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif for deres dyrevelvære og omsorgsekspertise gitt i løpet av dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G.
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
