Summary
Syftet med denna studie var att utveckla en murine modell av bränna sårläkning. En termisk brännskada inducerads på dorsala huden på möss med hjälp av en förvärmd mässing mall. Brända vävnad var debrided och överlagrad med en hud ympkvisten skördas från svansen av en genetiskt liknande givare mus.
Abstract
Triviala ytliga sår läker utan komplikationer genom primära avsikt. Djupa sår, såsom full tjocklek brännskador, läka genom sekundär avsikt och kräver kirurgiska debridement och hud ympning. Framgångsrik integration av givaren moderplantor i en mottagare sår säng beror på snabb rekrytering av immunceller, robust angiogenic svar och nya extracellulära matris bildning. Utvecklingen av nya terapeutiska medel, som riktar sig till några viktiga processer som är involverade i sårläkning, hindras av bristen på tillförlitliga prekliniska modeller med optimerad objektiv bedömning av sårstängning. Här beskriver vi en billig och reproducerbar modell av experimentell full tjocklek bränna sår rekonstrueras med en allogen hud moderplantor. Såret induceras på dorsumytan av sövda inavlade vilda möss av vilda typer från BALB/C- och SKH1-Hrhr-bakgrunderna. Brännningen produceras med hjälp av en mässingsmall som mäter 10 mm i diameter, som är förvärmd till 80 °C och levereras vid ett konstant tryck i 20 s. Bränneschar strukits 24 timmar efter skadan och ersätts med en full tjocklekstransplantat som skördats från svansen på en genetiskt liknande givarmus. Ingen specialiserad utrustning krävs för ingreppet och kirurgiska tekniker är enkla att följa. Metoden kan enkelt implementeras och reproduceras i de flesta forskningsmiljöer. Vissa begränsningar är associerade med modellen. På grund av tekniska svårigheter är skörden av tunnare hudtransplantat med delad tjocklek inte möjlig. Den kirurgiska metod vi beskriver här möjliggör återuppbyggnad av bränna sår med full tjocklek huden ympkvistar. Det kan användas för att utföra prekliniska terapeutiska tester.
Introduction
Kirurgisk debridement och hudympning är vanliga kliniska metoder som används vid hantering av kroniska sår1,brännskador2, och akuta sår såsom traumatiska sår3. Hudtransplantation hänvisar till det kirurgiska ingreppet, vilket innebär avlägsnande av frisk hud från en del av kroppen och överföra den till en annan. Givaren ympkvistar ersätta den förlorade vävnaden och ger en strukturell byggnadsställning för cellulärmigration och tillväxt. Efter integrering i mottagarplatsen ersätter hudtransplantat den förlorade hudbarriären genom att ge skydd mot mikrobiell invasion, skadliga effekter av den yttre miljön och överdriven förlust av fukt4. Framgångsrik hudtransplantat integration beror på flera faktorer. Dessa inkluderar adekvata immunsvar i närvaro av mikrobiella infektioner och snabb upplösning av inflammation, robust angiogenes vid sårplatsen och etablering av vaskulär anastomoser mellan mottagarbädden och donatortransplantatet5. När transplantatet börjar försämras måste inhemska dermalceller ersättas med celler som kan producera ny extracellulär matris. Samtidigt måste epidermal keratinocyterna krypa över den nyproducerade matrisen för att bilda neo-epidermis och åter epitelialisera såret. Det är därför uppenbart att effektiv migration av celler från mottagarbädden i donatortransplantatet är en annan avgörande faktor som påverkar framgångsrik graft incorporation. Med tanke på det stora antalet faktorer som är inblandade i sårläkning6, som kan vara omöjligt att kontrollera i de mänskliga prövningarna på grund av etiska begränsningar, modeller av prekliniska experimentella huden ympning är nödvändiga. Utveckling av prekliniska modeller av bränna sårläkning och tillhörande huden ympning kommer att vara viktigt för förståelsen av komplexa mekanismer som deltar i testning vävnad reparation och viktigt för testning av nya terapeutiska medel. In vitro-modellerna av sårläkning kan inte exakt efterlikna komplexiteten i den kutana vävnaden. Djurmodellerna in vivo är ett oumbärligt utredningsverktyg för att förstå de mekanismer som är involverade i vävnadsreparation.
Flera metoder för hud ympning teknik har utvecklats hos gnagare för att efterlikna kirurgiska excision och bränna sår återuppbyggnad7,8,9. De flesta av de tidigare beskrivna förfarandena misslyckades dock inte att framkalla en termisk bränna skada före huden ympning. Istället för bränna såret, en full tjocklek excisional sår inducerades, som sedan rekonstruerades med en full tjocklek hud allograft7. Olika anatomiska landmärken som öra, svans och rygg har använts för skörd av donatorhuden hos gnagare7,8. Olika graft fixering och stabilisering tekniker rapporterades, inklusive en "ingen sutur teknik"9, suturer7 och kirurgiskt lim10,11,12.
Syftet med denna studie var att utveckla en murine modell av en full tjocklek bränna sår som skulle rekapitulera den nuvarande guldstandard strategi i bränna behandling, vilket innebär nonviable vävnad excision och huden ympning. En termisk brännskada inducerads på dorsum ytan av en mus med hjälp av en förvärmd mässing mall. Bränneschar var strukits och ersättas med en full tjocklek ympkvist skördas från svansen på en givare mus. Det finns tre viktiga fördelar med denna experimentella modell. För det första kan mer än ett brännsår induceras på baksidan av mottagarmusen, och fyra donatorhudstransplantat kan skördas från en enda svans av givarmusen. Detta innebär att flera experimentella behandlingar och kontrollbehandlingar potentiellt kan jämföras med samma mottagare och donatordjur. Beroende på önskad administreringsväg kan kontrollbehandlingen omfatta lokal eller systemisk administrering av fordonet eller placebokontroll (t.ex. topikal applicering av salva, subkutan, intraperitoneal eller intravenös injektion av lösningen). För det andra kan tidpunkten för behandlingen och effektmåttet för experimentet kontrolleras. För det tredje, denna modell beror på återuppbyggnaden av sår med full tjocklek ympkvistar skördas från svansen, som är kända för att ha en högre sannolikhet för framgångsrik införlivande i givaren webbplats jämfört med huden skördas från baksidan13. Detta kan bero på det lägre antalet epidermal Langerhans celler, som spelar en nyckelroll i testning immunbiologi, och är associerade med huden transplantat avstötning14.
Den föreslagna modellen för sårläkning och transplantat integration kan mycket väl tillämpas på transgena och knockout möss. Användningen av genetiskt modifierade möss kommer att bidra till att belysa de roller som vissa gener kan spela under sårreparationer. Exogen tillämpning av aktuella sårpreparat eller subkutan administrering av terapeutiska antikroppar på skadeplatsen kan också övervägas.
På grund av tekniska svårigheter är split thickness hudtransplantat bestående av epidermis och en del av dermis svåra att få hos möss. Full tjocklek huden ympkvistar bestående av epidermis och full tjocklek dermis är kända för att kräva en väl vascularized sår säng för framgångsrik integration. Oförmågan att skörda hudtransplantat med delad tjocklek hos möss kan betraktas som en begränsning av denna modell. Fixering av hudtransplantatet till mottagarsåret sängen uppnåddes via tillämpning av det kirurgiska limmet, vilket är förknippat med mindre trauma och snabb nedbrytning jämfört med andra sätt att vävnad fixering15. Tidigare studier har visat att suturering är associerad med starkare vävnadfixering än det kirurgiska limmet vid 24 timmar efter det kirurgiska ingreppet15, vilket kan betraktas som en nackdel för förfarandet. Vid senare tidpunkter blir dock den biomekaniska styrkan hos sår som behandlats med ett kirurgiskt lim jämförbar med suturer15 och bättre än häftfixering16. Efter vävnadfixering med det kirurgiska limmet måste såren täckas med ett sårförband. Även sår på den dorsala ytan av musen är svåra för djuret att nå, såret dressing, å andra sidan, är lätt för djuret att manipulera och ta bort. Frekventa sårförbandsbyten kan vara motiverade.
Anestesi-inducerad hypotermi hos små gnagare är ett väldokumenterat fenomen17. Hypotermi är en bieffekt av detta förfarande, som orsakar komplikationer, och potentiellt äventyrar både djurhälsa och datakvalitet. Därför motiverar denna metod genomförandet av temperaturhanteringsstrategier, särskilt om hårlösa SKH1-Hrhr används.
Den viktigaste begränsningen av att använda möss för att efterlikna mänskliga sår stängning är skillnaden mellan hudens anatomi och fysiologi. Mussåren läker mestadels via kontraktion, medan mänskliga sår läker genom granulering vävnadsbildning och åter epitelialisering18. För att ta hänsyn till denna diskrepans kan den aktuella modellen modifieras och användas i kombination med en splintingring tätt faststämd runt såret för att förhindra hudkontraktion19. Med tanke på vissa fördelar och nackdelar med detta in vivo-protokoll, denna modell skulle kunna fungera som ett verktyg för att studera vissa processer som deltar i sårläkning som är omöjliga att studera in vitro.
Protocol
Alla experiment godkändes av det franska ministeriet för högre utbildning och forskning (studienummer: 122162017111616517670v2 och DAP180012). Alla möss var single-housed vid ankomsten i plast burar och fick en 7-dagars acklimatiseringsperiod före studien. Djurrummet hölls vid en 12/12 h ljus / mörk cykel (lampor på vid 07:00). Mat och kranvatten tillhandahölls ad libitum. BALB/c och SKH1-Hrhr möss matades traditionella vete /soja-baserad kost. Sågspån sängkläder var försedd tillsammans med häckande material.
1. Förberedelse av utrustning
- Förbered en förbränningsanordning för proceduren och ställ in den på 80 °C med hjälp av temperaturregulatorn (bild 1A). Kontrollera temperaturen på mässingsmallen (figur 1B,C) med hjälp av den infraröda värmekameran.
- Se till att den digitala manometern fungerar som den ska.
- Täck scenen med en kirurgisk draperi och justera tabellens höjd (bild 1A).
2. Preoperativ och intraoperativ djurvård
- Förvärva BALB/c och SKH1-Hrhr möss, 6-8 veckors ålder.
- Tillsätt paracetamol suspension vid 3 mg/ml till dricksvatten och leverera 12 timmar före och upp till 72 timmar efter ingreppet.
- Med hjälp av en 1 ml-spruta och en 26 G nål, administrera buprenorfin subkutant vid 0,05 μg/g 30 min före ingreppet och var 6:e timme under de första 72 timmarna efter ingreppet.
- Med hjälp av en 1 ml spruta och en 26 G nål, administrera lidokain till dorsum av musen och 2-3 mm distala till området för bränna såret. Injicera lidokain vid 0,05 μg/g subkutant 15 minuter före induktion av bränna såret.
- Bedöva möss med en intraperitoneal injektion av xyazine vid 10 mg/kg och ketamin 100 mg/kg. Använd en 1 ml-spruta och en 26 G-nål för att administrera injektionen.
- Kritiskt steg: Placera den sövda musen på en uppvärmd pad och håll musen varm för att förhindra hypotermi under de första 30 minuterna efter induktion av anestesi och i minst 15 minuter efter återhämtningen från anestesi. Förutom den uppvärmda dynan kan andra former, inklusive värmelampor,cirkulerande varma vätskor eller luft, och förvärmda värmereservoarer användas för att reglera kroppstemperaturen. heat
- Applicera smörjgel på ögonen på musen för att förhindra uttorkning av hornhinnan.
- Använd tå nypa tillbakadragande reflex för att bedöma djupet av anestesi.
- Med hjälp av en 1 ml-spruta och en 26 G nål administreras 200 μL lakterad ringsignallösning kompletterad med 5% dextros. Administrera vätskeersättning subkutant omedelbart efter induktion av anestesi och 6 timmar efter ingreppet för att förhindra uttorkning.
3. Full tjocklek bränna sår induktion
- Raka den sövda musen med hårklippningsmaskinerna.
- Applicera hårborttagningskräm på musytan i 1 minut. Torka av krämen med hjälp av lite steril gasväv och rengör området med en bit fuktig gasväv. Blot huden med lite gasväv tills torr.
- Placera musen på scenen täckt med en kirurgisk drapering och flytta scenen uppåt närmare den förvärmda mässing mallen.
- Applicera den cirkulära mässingsmallen på baksidan av musen (80 °C för 20 s) med konstant tryck på 0,15 N (bild 2).
- Kritiskt steg: Omedelbart efter bränna induktion, placera den sövda djuret på den uppvärmda dynan för att förhindra hypotermi och hålla musen varm under och efter ingreppet. När återhämtat sig från anestesi, tillbaka musen tillbaka till buren.
- Kritiskt steg: Ge en mosad kost på burgolvet under de första 72 timmarna efter det kirurgiska ingreppet. Möss är ibland ovilliga att nå upp till en sipper röret att dricka vatten efter en skada på brännskada.
4. Skörd av donatortransplantat
- Gör ett längsgående snitt med en skalpell i den övre delen av svansen på givarmusen och ta försiktigt bort huden med hjälp av kirurgiska pincett.
- Placera svanshuden i en steril petriskål fylld med 10 ml steril 0,9% saltlösning. Använd en linjal för att mäta ut enskilda transplantat och skär svansen huden i bitar, var och en mäter 15 mm, med hjälp av en skalpell.
- När den har förberetts, håll hudtransplantaten i 0,9% saltlösning vid 4 °C i upp till 2 timmar.
5. Kirurgisk excision och hudtransplantation
- Tjugofyra timmar efter bränninduktionen, förbered musen för anestesi genom inandning av isofluran. Placera musen i induktionskammaren och inducera anestesi med 5% isofluran i 100% syre med en flödeshastighet på 4 L/min. För att bibehålla anestesi under operation, använd 2% isofluran vid 2 L/min.
- Placera en kirurgisk draperi på musen och skär ut ett fönster för att exponera operationsfältet. Med hjälp av aseptisk teknik, svabb såret först med povidone-jod och sedan med 70% alkohol.
- Plocka försiktigt upp den brända vävnaden med ett par kirurgiska pincett och punktskatt alla nekrotiska och nonviable vävnad med steril kirurgisk sax och pincett. Ta bort panniculus carnosus lagret av hypodermis för att skapa en stabil mottagarbädd.
- Placera hudtransplantatet på den nylagade sårbädden. Dra försiktigt den omgivande huden mot hudtransplantatet med kirurgisk pincett. Applicera lite kirurgiskt lim för att fästa transplantatet på sårbädden och tryck försiktigt för att anpassa hudkanterna. Kritiskt steg: Sårbäddens storlek måste vara lätt större än storleken på hudtransplantatet för att säkerställa en lyckad engraftment.
- Låt musen återhämta sig från anestesi. Kritiskt steg:Placera musen på en uppvärmd pad. Håll musen varm under och efter ingreppet för att förhindra hypotermi.
- Applicera inert paraffin gasväv dressing och självhäftande sekundär dressing över det ympade såret.
- Placera musen i en enskild bur. Kritiskt steg: Ge några mosade kost på burgolvet för de första 72 timmarna efter det kirurgiska ingreppet och övervaka dagligen.
- Ge leksaker och berika miljön.
6. Digital bildframställning och insamling av sår efter slakt
- Fotografera sår med en digitalkamera genom att placera en linjal bredvid såret (figur 3).
- Vid slutet av experimentet, avliva djur genom exponering för koldioxid och livmoderhalscancer störning. Kritiskt steg: Överdriven dragkraft i huden under livmoderhalsen störningen kan skada transplantatet.
- Vid obduktion, kirurgiskt punktskatt dorsala bränna sår till fascia med sax. Bisect sår. Fix hälften i 10% buffrad formalin och process för histologi och immunohistochemistry. Snabbt frysa den andra halvan i flytande kväve för RNA utvinning och protein kvantation och hålla på -80 °C.
7. Hudhologi, immunhistokemi och kollagenvisualisering
- Bädda in hudprover i paraffin, skär till 4 μm sektioner och placera på positivt laddade diabilder.
- Använd diabilder färgade med hematoxylin och eosin för att utvärdera graden av åter epitelialisering (% av det ursprungliga såret). Det område av såret som är täckt med neo-epidermis kan uttryckas i procent av hela såret (figur 4). Använd ett digitalt mikroskopprogram och ImageJ-programvara för att utföra mikroskopisk analys av sektionerna.
- Använd histologiska sektioner (4 μm tjocklek) beredda från formalin-fast och paraffin-inbäddad vävnad och utsätta dem för immunohistochemistry.
- För att bedöma kollagen I och fibronectin uttryck i sår, tillämpa primära antikroppar och inkubera för 1 h. Detektion kan utföras av artspecifika pepparrot peroxidas (HRP) eller alkalisk fosfatas (AP)-konjugerade sekundära antikroppar.
- Reagera sektioner med antingen: i) HRP,3,3'-diaminobenzidine (DAB) eller (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabell över material), som ger en klarröd färg (Figur 5). Skanna avsnitten med hjälp av ett instrument och analysera med den digitala mikroskopapplikationen och ImageJ.
- För att möjliggöra histologiska bedömning av kollagendeposition, utför trichrome färgning på histologiska sektioner med hjälp av en kommersiell sats.
- För kollagenfibervisualisering, använd multifotonmikroskopi och andra harmoniska generationens teknik (figur 5). Använd ett multifotonmikroskop för vävnadsavbildning enligt tidigare beskrivna20. Använd en Ti:Sapphire laser med en centrum våglängd på 810 nm som laserkälla för att generera andra harmoniska och två foton upphetsad fluorescens signaler (TPEF).
- Använd en laserstråle utrustad med ett 25x/0.95 W-mål för att samla in och excitera andra harmoniska generationen (SHG) och TPEF. Identifiera signaler som beskrivits tidigare21 av NDD PMT detektorer. Använd programvara för laserscanningskontroll och bildförvärv.
Representative Results
Resultaten visar att det utvecklade protokollet är en enkel metod, som tillåter induktion av ett full tjockleksbrännsår hos möss. Brännskador induceras med hjälp av en förvärmd mässingsmall (figur 1A-C). Det brända området visas som ett cirkulärt sår med en vit eschar och en hyperemisk zon. Storleken på bränna såret är något större vid 24 timmar efter brännskadan som ett resultat av den välbeskrivna fenomen som kallas bränna skada progression, vilket möjligen beror på akut inflammation22. Efter excision rekonstrueras brännsår med hjälp av allogen hudtransplantat (figur 3). Dag 7 efter brännskadan blir sår vaskulariserade5, vilket är en indikation på framgångsrik engraftment. Epidermal keratinocyter migrera från intilliggande mottagaren huden i arbetet med att stänga såret och överbrygga klyftan mellan de två kanterna på såren. Mikroskopisk analys av H och E färgade delen av sår visade att längden på neo-epidermis blir betydligt längre på dag 7 efter brännskada jämfört med dag 3 efter brännskada (Figur 4B). Innan en stor studie utförs rekommenderas starkt att forskare slutför en pilotstudie, som möjliggör utforskning av en ny intervention, bedömning av genomförbarheten, identifiering av ändringar av metoden för att säkerställa reproducerbarhet. Statistiskt signifikanta effekter är svåra att upptäcka i mindre prover, medan en ökning av provstorleken är ett sätt att öka den statistiska effekten av ett test. För att till exempel upptäcka en statistiskt signifikant skillnad (p < 0,05) i sårrepiteliseringen (figur 4) mellan grupper, bör provstorleken vara mellan sex och åtta möss per grupp. Alla experiment bör upprepas minst två gånger. Som matrisproducerande celler, såsom fibroblaster, migrera från mottagarvävnaden till transplantatet, viktiga komponenter i den extracellulära matrisen, inklusive kollagen I och fibronectin blir starkt uttryckt i den nybildade matrisen (Figur 5).
Bild 1: Installation av en brännanordning. (A)Placering och inställning av den brinnande enheten. Den brinnande enheten är ansluten till temperaturkontrollen och är ansluten till den digitala monometern för att möjliggöra övervakning av trycket. Den brinnande enheten är upphängd ovanför ett justerbart stadium – plan yta på vilken möss placeras för induktion av brännskada. (B-C) En närbild av mässingsmallen som används för att framkalla sårbrännskador. (C)Mässingsmallens diameter är 1 cm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk illustration av de olika steg som krävs för att reproducera den experimentella modell som beskrivs i den här artikeln. Det finns tre huvudsteg till proceduren: (i) induktion av bränna såret med hjälp av en förvärmd mässing mall; ii) Kirurgisk excision av den icke-viabla nekrotiska vävnaden 24 timmar efter brännskadan. iii) Kirurgisk sårrekonstruktion med hjälp av en allogen hudtransplantat med full tjocklek som skördats från en donatormus. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Den makroskopiska vyn av rekonstruerade musbrännskador. Representativa digitala bilder av brännskador rekonstrueras med allogena huden ympkvistar på dag 0, 1, 3 och 7 efter brännskada. Linjalen på bilder är i millimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mikroskopiskt utseende av sår vid 3 och 7 dagar efter brännskada. H&E-färgade delar av sår 3 och 7 dagar efter brännskador. Längden på neo-epidermis (prickad linje) ökas signifikant i (A) dag 3 sår jämfört med (B) dag 7 sår. Iaoch(B)är skalstången 100 μm.(C)Grafisk representation av andelen sårrepitelialisering. Detta utvärderades genom att mäta längden på neo-epidermis på dag 3 och 7 post-burn skada och uttryckt i procent av hela sårlängd. Resultaten representerar medelvärdet ± S.E.M. (n = 6 möss i dag 3 grupp; n = 6 möss i dag 7 grupp, *p < 0,05; Studentens t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bedömning av den extracellulära matrisen och kollagen I-visualiseringen. Representativa bilder av immunohistochemistry analys på dag 7 mus sår färgas för (A) kollagen och (B) fibronectin. Notera intensiv röd färgning i långsträckta spindelformade kollagen I-positiva celler. Notera brun färgning i fibronectin-positiva celler i dermis av dag 7 sår. Skala bar = 50 μm i alla bilder. I(A)och( B), e betecknar epidermis och d betecknar dermis. (C)Visualisering av kollagenfibrer och histologiska bedömning av kollagen nedfall. D)Representativ TPEF/SHG kollagenbild av dag 7 mus sår. Samtidig TPEF/SHG förvärv med cirkulär polarisering och SHG signaler behandlades selektivt för att få en binär fördelning av SHG efter tillämpning av ett tröskelvärde. TPEF bilder (grön) och SHG bilder (vit) var pseudo-färgade och överlagrad. Skalbar = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Enligt tjockleken klassificering av bränna skada23, full tjocklek brännskador kännetecknas av uppenbara inblandning av hela tjockleken på huden och viss del av den subkutana vävnaden. Denna typ av sår kan läka endast genom kontraktion eller med hud ympning2. En inneboende begränsning av den metod som beskrivs i denna artikel är att endast full tjocklek ympkvistar, i motsats till delad tjocklek ympkvistar, som ofta används i den kliniska inställningen, skördades från svansen på en mus. Detta berodde på den tekniska svårigheten, eftersom musen huden är för tunn för att få delad tjocklek ympkvistar. Det måste påpekas att full tjocklek ympkvistar kräver en väl vascularized sår säng, medan delad tjocklek hudtransplantat kan överleva på givaren platser med mindre vaskularitet24. Tidigare studier visade att ett brännsår som inducerats på baksidan av musen var förknippat med en robust bildning av ny vaskulatur5. Detta tyder på att en väl vascularized område, såsom dorsum av musen, kan betraktas som den anatomiska landmärke för induktion av brännskador.
Bränn sårdjup är en viktig faktor att tänka på. Djupet på bränna såret måste vara konsekvent mellan enskilda möss. Reproducerbarheten av bränna sårdjup beror på temperaturen på mässing mallen, tryck och varaktighet av värmeexponering. Brännsårets djup måste verifieras histologiskt. Det är viktigt att komma ihåg att överdrivet tryck eller långvarig exponering av huden till den förvärmda mässing mallen kan skada den underliggande vävnaden. Vävnaden som omger ryggraden, inklusive komponenterna i det centrala och perifera nervsystemet, är känsliga för värme, och om den skadas kan resultera i bakbenförlamning.
Även om ingen postoperativ dödlighet var direkt förknippad med det kirurgiska ingreppet, ett litet antal hårlösa SKH1-Hrhr möss, som är särskilt känsliga för kyla, utvecklat hypotermi och misslyckades med att återhämta sig efter den allmänna anestesi. Därför måste extra värme tillhandahållas under alla estetiska händelser och konstant övervakning krävs medan musen sövs.
Den metod som beskrivs i denna studie var inte associerad med kirurgiska webbplats infektion. Aseptisk teknik måste dock användas för att förhindra överföring av mikroorganismer till det kirurgiska såret under perioperativa perioden. Inokulering av såret med bioluminescerande eller fluorescerande mikroorganismer kan införlivas i förfarandet. Denna teknik kan vara användbar vid studier av smittsamma organismer och deras patogenes25. Exogen tillsats eller injektion av bioluminescerande bakterier kan till exempel tillåta övervakning av den mikrobiella bördan med hjälp av in vivo hela djur imaging25. Med tanke på att mushår är känt för att störa in vivo hela djur fluorescens och bioluminescens imaging, hårlösa SKH1-Hrhr möss är idealiska värdar för studier med fluorescerande eller bioluminescerande reportrar.
Sårvävnadsprover kan samlas in vid olika tidpunkter och bearbetas för histologiska och immunohistokemiska analyser. Protein och RNA kan isoleras från hudbiopsi och molekylärbiologiska tekniker kan användas för att bedöma uttrycket av viktiga molekyler som är involverade i sårläkning.
I den aktuella studien beskrev vi en experimentell modell av bränna sårläkning och allogen hud engraftment. Detta förfarande kan ändras och fungera som en modell för prekliniska studier.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av La Direction Générale de L'Armement, l'Agence de l'Innovation de Défense och École Polytechnique. Vi tackar vår kollega Yann Plantier från École Polytechnique som gav insikt och expertis som i hög grad hjälpte till med produktionen av videofilen. Författarna tackar Benoit Peuteman och Charlotte Auriau från INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif för deras djurvälbehållning och omsorgsexpertis som tillhandahölls under projektets gång.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringue | Terumo | SS + 01T1 | |
| 26 G needle | Terumo Agani | NN-2613R | 1/2'' - 0,45 X 12mm |
| 96X21 mm Petri Dish | Dutscher | 193199 | |
| Animal Weighing scale | Kern | EMB 5.2K5 | |
| BALB/c mouse | Janvier labs | BALB/cAnNRj | 6-weeks old |
| Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm | Simport | M476-1 | |
| Bond polymer Refine Red | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Brass block | BVG | custom-designed | Circular 10 mm in diameter |
| Buprenorphine (BUPRECARE) | Axience | FR/V/6328396 3/2011 | administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Burning apparatus Kausistar 400 | TraçaMatrix | 34010 | |
| CaseViewer | 3DHISTECH Ltd. | 3Dhistech, Budapest, Hungary | |
| Collagen I antibody | Abcam | ab34710 | Recommanded concentration 1:50; 1:200 |
| D-(+)- glucose (Dextrose) | Sigma Aldrich | G-8769-100 ml | |
| DAB | Leica Biosystems | AR9432 | |
| Digital camera | NIKON | D3400 | objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45 |
| Depilating cream | Veet | ||
| Disposable scalpels | Swann Morton | 6601 | |
| DPBS | PAN biotech | P04-36300 | |
| Ethanol absolute | VWR chemicals | 20821.310 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | ab23750 | Recommanded dilution 1:1000 |
| Filter 0.22um | Sartorius | 16532 | |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14094-11 | |
| Forceps Dumont | F.S.T. | 11295-10 | |
| Hair clippers | AESCULAP | B00VAQ4KUY (ISIS) | |
| Heating pad | Petelevage | 120070 | |
| Isofluorane | Piramal healthcare | FR/V/03248850/2011 | |
| Ketamine | Imalgene | FR/V/0167433 4/1992 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg |
| Lactated Ringers solution | Flee-Flex | 1506443 | |
| Lamina multilabel slide scanner | Perkin Elmer | ||
| LAS software | Leica | version 2.7.3 | |
| Leica Bond III | Leica Biosystem | 1757 | |
| Leukosilk dressing | BSN medical | 72669-01 | |
| Lidocaine | Aguettant | N01BB02 | local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g |
| Manometer | Kern | HDB-5K5 | |
| Masson Trichrome Staining kit | Sigma-Aldrich | HT15-1KT | |
| Micromesh Biopsy cassettes | Simport | M507 | |
| Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope | Leica microsystems | DM500 | Scanner 8000Hz NDD PMT detectors |
| Non adhering dressing Adaptic | Systagenix | A6222 | 12.7cm X 22.9 cm |
| Ocrygel | Tvm France | ### | |
| Paracetamol 300mg | Dolliprane | Liquiz | |
| Paraformaldheyde 4% | VWR chemicals | 1169945 | |
| Povidone-iodine | MEDA pharma | D08AG02 | diluted to 1:2 |
| SKH1-Hrhr mouse | Charles river | 686SKH1-HR | 6-weeks old |
| Slides | Thermoscientific | AGAA000080 | |
| Surgical adhesive | BSN medical | 9927 | |
| Sterile Gauze | Hartmann | 418545/9 | 10 X 10 cm |
| Sterile water | Versylene Fresenius | B230521 | |
| Surgical drape | Hartmann | 2775161 | |
| Ti:Sapphire ChameleonUltra | Coherent | DS 16-02-16 F | 690-1040 nm |
| Thermal imaging Camera | Testo | Testo 868 | |
| Xylazine (Rompum 2%) | Bayer | FR/V/ 8146715 2/1980 | surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg |
References
- Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
- Greenhalgh, D. G.
- Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
- Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. StatPearls. , (2019).
- Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
- Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), New Rochelle. 58-70 (2019).
- Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
- McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , Chapter 4, Unit 4 4 (2009).
- Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
- Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
- Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
- Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
- Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
- Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
- Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
- Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
- Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
- Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
- Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
- Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).
