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Bioengineering

Cationic पेप्टाइड वाहकों के अंतर-उपास्थि परिवहन गुणों का लक्षण वर्णन

Published: August 10, 2020 doi: 10.3791/61340
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Bioengineering, Northeastern University, 2Department of Mechanical & Industrial Engineering, Northeastern University

Summary

यह प्रोटोकॉल उपास्थि में cationic पेप्टाइड वाहकों के लिए संतुलन तेज, प्रवेश की गहराई और गैर-संतुलन प्रसार दर निर्धारित करता है। एक प्रभावी जैविक प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए परिवहन गुणों का लक्षण वर्णन महत्वपूर्ण है। इन तरीकों को नकारात्मक आवेशित ऊतकों को लक्षित करने के लिए एक इष्टतम आवेशित दवा वाहक डिजाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

उपास्थि की तरह शरीर में कई नकारात्मक आवेशित ऊतक, जो नकारात्मक रूप से आवेशित एग्रीजन के उच्च घनत्व के कारण लक्षित दवा वितरण में बाधा पेश करते हैं और इसलिए, उनकी चिकित्सीय प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए बेहतर लक्ष्यीकरण विधियों की आवश्यकता होती है। क्योंकि उपास्थि एक उच्च नकारात्मक फिक्स्ड चार्ज घनत्व है, दवाओं सकारात्मक चार्ज दवा वाहक के साथ संशोधित किया जा सकता है इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत का लाभ लेने के लिए, बढ़ाया अंतर उपास्थि दवा परिवहन के लिए अनुमति देता है । इसलिए दवा वाहकों के परिवहन का अध्ययन करना जैविक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने में दवाओं की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने की दिशा में महत्वपूर्ण है । हम तीन प्रयोगों के डिजाइन को दिखाते हैं जो उपास्थि एक्सप्लांट में cationic पेप्टाइड वाहकों की संतुलन तेज, प्रवेश की गहराई और गैर-संतुलन प्रसार दर को निर्धारित कर सकते हैं। संतुलन तेज प्रयोग अपने आसपास के स्नान की तुलना में उपास्थि के भीतर घुलनशील एकाग्रता का एक उपाय प्रदान करते हैं, जो उपास्थि में दवाओं की चिकित्सीय एकाग्रता को बढ़ाने में एक दवा वाहक की क्षमता की भविष्यवाणी के लिए उपयोगी है । कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रवेश अध्ययनों की गहराई सतही से उपास्थि के गहरे क्षेत्र तक 1D सॉल्यूट प्रसार के दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देती है, जो यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या सोल्यूट्स अपने मैट्रिक्स और सेलुलर लक्ष्य साइटों तक पहुंचते हैं या नहीं। कस्टम-डिज़ाइन किए गए परिवहन कक्ष का उपयोग करके गैर-संतुलन प्रसार दर अध्ययन ऊतक मैट्रिक्स के साथ बाध्यकारी बातचीत की ताकत के माप को ऊतक में फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सोल्यूट्स की प्रसार दरों को चित्रित करके सक्षम बनाता है; यह उपास्थि के साथ इष्टतम बाध्यकारी शक्ति के वाहकों को डिजाइन करने के लिए फायदेमंद है। एक साथ, तीन परिवहन प्रयोगों से प्राप्त परिणाम बेहतर आवेशित दवा वाहकों को डिजाइन करने के लिए एक दिशानिर्देश प्रदान करते हैं जो दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए कमजोर और रिवर्सिबल चार्ज इंटरैक्शन का लाभ उठाते हैं । इन प्रायोगिक तरीकों को दवाओं और दवा-दवा वाहक संघ के परिवहन का मूल्यांकन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, इन तरीकों को अन्य नकारात्मक आवेशित ऊतकों जैसे मेनिस्कस, कॉर्निया और विट्रियस हास्य को लक्षित करने में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

शरीर में नकारात्मक आवेशित ऊतकों को दवा वितरण कोशिका और मैट्रिक्स लक्ष्य साइटों तक पहुंचने के लिए ऊतक में गहरी पैठ बनाने में दवाओं की असमर्थता के कारण एक चुनौती बनी हुई है1। इनमें से कई ऊतकों में घनी-पैक, नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एग्रीकोन शामिल हैं जो ऊतक के भीतर एक उच्च नकारात्मक फिक्स्ड चार्ज घनत्व (एफसीडी)2 बनाते हैं और सबसे मैक्रोमॉलिक्यूल्स3,,4के वितरण के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, सकारात्मक आवेशित दवा वाहकों की सहायता से, इस नकारात्मक आवेशित ऊतक बाधा को वास्तव में निरंतर दवा वितरण,,1,5,6,7(चित्रा 1) के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक चार्ज इंटरैक्शन के माध्यम से एक दवा डिपो में परिवर्तित किया जासकता है।,

Figure 1
चित्रा 1: सीपीसी की चार्ज आधारित इंट्रा-कार्टिलेज डिलीवरी। घुटने के संयुक्त अंतरिक्ष में सीपीसी का इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन। सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सीपीसी और नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एग्रीकन समूहों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन उपास्थि के माध्यम से तेजी से और पूर्ण गहराई से प्रवेश को सक्षम करते हैं। इस आंकड़े को वेदगवामी एट अल4से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

हाल ही में, लघु लंबाई वाले cationic पेप्टाइड वाहक (सीपीसी) को नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए उपास्थि4को वितरण के लिए बड़े आकार के चिकित्सीय ले जाने में सक्षम छोटे cationic डोमेन बनाने के लक्ष्य के साथ डिजाइन किया गया था। ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए)10जैसेप्रचलित 8,,9 और अपक्षयी रोगों के इलाज के लिए उपास्थि को प्रभावी दवा वितरण के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि दवाओं की चिकित्सीय सांद्रता ऊतक के भीतर गहरी प्रवेश करती है, जहां अधिकांश उपास्थि कोशिकाएं (chondrocytes)झूठ 11झूठ बोलती हैं । यद्यपि कई संभावित रोग संशोधित करने वाली दवाएं उपलब्ध हैं, लेकिन किसी ने भी एफडीए की मंजूरी प्राप्त नहीं की है क्योंकि ये उपास्थि12, 13,13को प्रभावी ढंग से लक्षित करने में असमर्थ हैं। इसलिए, एक चिकित्सीय प्रतिक्रिया को प्रेरित करने में दवाओं की प्रभावशीलता की भविष्यवाणी करने के लिए दवा वाहकों के परिवहन गुणों का मूल्यांकन आवश्यक है। यहां, हमने तीन अलग-अलग प्रयोग तैयार किए हैं जिनका उपयोग संतुलन तेज, प्रवेश की गहराई और सीपीसीएस4की गैर-संतुलन प्रसार दर का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

यह सुनिश्चित करने के लिए कि उपास्थि के भीतर पर्याप्त दवा एकाग्रता है जो एक इष्टतम चिकित्सीय प्रतिक्रिया प्रदान कर सकती है, उपास्थि4में संतुलन सीपीसी एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए तेज प्रयोगों को डिजाइन किया गया था। इस डिजाइन में, उपास्थि और उसके आसपास के स्नान के बीच एक संतुलन के बाद, उपास्थि के अंदर solute की कुल राशि (या तो मैट्रिक्स या मुक्त करने के लिए बाध्य) एक तेज अनुपात का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । इस अनुपात की गणना उपास्थि के अंदर सोल्यूट्स की एकाग्रता को संतुलन स्नान के लिए सामान्य करके की जाती है। सैद्धांतिक रूप से, तटस्थ solutes, जिसका उपास्थि के माध्यम से प्रसार चार्ज बातचीत द्वारा सहायता नहीं है, 1 से कम का एक तेज अनुपात होगा । इसके विपरीत, cationic solutes, जिसका परिवहन इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से बढ़ाया जाता है, 1 से अधिक तेज अनुपात दिखाता है। हालांकि, जैसा कि सीपीसी के साथ दिखाया गया है, इष्टतम सकारात्मक आवेश का उपयोग करने से बहुत अधिक तेज अनुपात (300 से अधिक)4हो सकता है।

हालांकि उपास्थि के भीतर उच्च दवा एकाग्रता चिकित्सीय लाभ प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी महत्वपूर्ण है कि दवाओं उपास्थि की पूरी मोटाई के माध्यम से फैलाना है । इसलिए, प्रवेश की गहराई दिखाने वाले अध्ययनों के लिए यह सुनिश्चित करने की आवश्यकता है कि दवाएं उपास्थि के भीतर गहरी तक पहुंचें ताकि मैट्रिक्स और सेलुलर लक्ष्य साइटों तक पहुंचा जा सके, जिससे अधिक प्रभावी चिकित्सा प्रदान की जा सके। यह प्रयोग उपास्थि के माध्यम से सोल्यूट्स के एक तरफा प्रसार का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जो वीवो में अंतर-आर्टिकुलर इंजेक्शन के बाद उपास्थि में दवाओं के प्रसार का अनुकरण करता था। कॉन्फोसल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके फ्लोरेसेंस इमेजिंग उपास्थि में प्रवेश की गहराई के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। नेट पार्टिकल चार्ज मैट्रिक्स के माध्यम से गहरी दवाओं को कैसे फैलाना कर सकता है, इसे कम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक ऊतक एफसीडी पर आधारित एक इष्टतम नेट चार्ज के लिए cationic कणों और एनियोनिक ऊतक मैट्रिक्स के बीच कमजोर-रिवर्सिबल बाध्यकारी बातचीत के लिए अनुमति देने की आवश्यकता है । इसका तात्पर्य यह है कि कोई भी बातचीत काफी कमजोर है ताकि कण मैट्रिक्स से असंबद्ध हो सकें लेकिन प्रकृति में प्रतिवर्ती हो सकते हैं ताकि यह ऊतक4के भीतर गहरे किसी अन्य मैट्रिक्स बाध्यकारी स्थल से बांध सके । इसके विपरीत, एक कण का अत्यधिक सकारात्मक शुद्ध आवेश प्रसार की दिशा में हानिकारक हो सकता है, क्योंकि बहुत मजबूत मैट्रिक्स बाध्यकारी उपास्थि के सतही क्षेत्र में प्रारंभिक बाध्यकारी साइट से कणों की टुकड़ी को रोकता है। इसके परिणामस्वरूप अपर्याप्त जैविक प्रतिक्रिया होगी क्योंकि अधिकांश लक्षित साइटें ऊतककेभीतर गहरी हैं ।

बाध्यकारी बातचीत की ताकत को और अधिक मात्रा में निर्धारित करने के लिए, उपास्थि के माध्यम से दवा प्रसार दरों का विश्लेषण लाभप्रद है। गैर-संतुलन प्रसार अध्ययन विभिन्न सोल्यूट्स के बीच वास्तविक समय प्रसार दरों की तुलना के लिए अनुमति देते हैं। चूंकि दवाएं उपास्थि के सतही, मध्य और गहरे क्षेत्रों के माध्यम से फैलती हैं, बाध्यकारी बातचीत की उपस्थिति प्रसार दरों को बहुत बदल सकती है। जब दवाओं और उपास्थि मैट्रिक्स के बीच बाध्यकारी बातचीत मौजूद होती है, तो इसे प्रभावी डिफ्यूजिटी (डीEFF)के रूप में परिभाषित किया जाता है। इस मामले में, एक बार सभी बाध्यकारी साइटों पर कब्जा कर लिया गया है, दवाओं की प्रसार दर स्थिर राज्य प्रसार (डी एसएस) द्वारा नियंत्रित कियाजाताहै । विभिन्न सोल्यूट के डीएफईएफ के बीच तुलना मैट्रिक्स के साथ घुल्यूट की सापेक्ष बाध्यकारी ताकत निर्धारित करती है। किसी दिए गए सोल्यूट के लिए, यदि डी एफएफ और डीएसएस परिमाण के एक ही क्रम में हैं, तो इसका तात्पर्य है कि प्रसार केदौरान दवा और मैट्रिक्स के बीच न्यूनतम बाध्यकारी मौजूद है। हालांकि, अगर डीEFF डीएसएससे अधिक है, मैट्रिक्स के लिए कणों की पर्याप्त बाध्यकारी मौजूद है ।

डिजाइन किए गए प्रयोग व्यक्तिगत रूप से उपास्थि के माध्यम से सोल्यूट परिवहन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि, एक इष्टतम आवेशित दवा वाहक डिजाइन करने के लिए सभी परिणामों को शामिल करते हुए एक समग्र विश्लेषण की आवश्यकता होती है। चार्ज इंटरैक्शन की कमजोर और प्रतिवर्ती प्रकृति कण प्रसार दर को नियंत्रित करती है और उपास्थि के माध्यम से उच्च संतुलन तेज और तेजी से पूर्ण गहराई प्रवेश के लिए अनुमति देती है। संतुलन तेज प्रयोगों के माध्यम से, हमें उन वाहकों की तलाश करनी चाहिए जो चार्ज इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप उच्च तेज दिखाते हैं जिन्हें गैर-संतुलन प्रसार दर अध्ययनों का उपयोग करके सत्यापित किया जा सकता है। हालांकि, ये बाध्यकारी बातचीत कमजोर और प्रकृति में प्रतिवर्ती होना चाहिए ताकि उपास्थि के माध्यम से सोल्यूट की पूर्ण मोटाई प्रवेश की अनुमति मिल सके। एक आदर्श दवा वाहक के पास एक इष्टतम शुल्क होगा जो तेज और उच्च अंतर-उपास्थि दवा सांद्रता के लिए मजबूत पर्याप्त बाध्यकारी सक्षम बनाता है, लेकिन पूर्ण मोटाई प्रसार4को बाधित करने के लिए बहुत मजबूत नहीं है। प्रस्तुत प्रयोगों चार्ज आधारित ऊतक दवा वाहक लक्ष्यीकरण के लिए डिजाइन विशेषताओं में सहायता करेगा । इन प्रोटोकॉल का उपयोग उपास्थि4के माध्यम से सीपीसी परिवहन की विशेषता के लिए किया गया था, हालांकि, इन्हें उपास्थि और अन्य नकारात्मक आवेशित ऊतकों के माध्यम से विभिन्न प्रकार की दवाओं और दवा वाहकों पर भी लागू किया जा सकता है।

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Protocol

मृत ऊतकों के साथ प्रयोगों के संचालन के लिए विश्वविद्यालय की मंजूरी प्राप्त की गई थी । गोजातीय जोड़ों को एक कसाईघर से व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था।

1. उपास्थि एक्सप्लांट निष्कर्षण

  1. गोजातीय घुटने के जोड़ों के फीमोरोपेटेलर नाली से उपास्थि का पर्दाफाश करने के लिए वसा, मांसपेशियों, स्नायुबंधन, टेंडन और अन्य सभी कनेक्टिव ऊतकों को काटने और हटाने के लिए एक स्केलपेल (#10 ब्लेड) का उपयोग करना।
  2. 3 मिमी और 6 मिमी डर्मल घूंसे का उपयोग करके, बेलनाकार प्लग निकालने के लिए उपास्थि में लंबवत घूंसे बनाएं। तुरंत 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 500 माइक्रोन युक्त 48-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में प्लग 1% v/v एंटीबायोटिक-एंटीमायकोटिक के साथ पूरक रखें।
  3. टुकड़ा करने की क्रियास्थिरता (चित्रा 2)में एक अच्छी तरह से नीचे का सामना करना पड़ उपास्थि प्लग के सतही पक्ष रखें । एक रेजर ब्लेड का उपयोग करना, सतही क्षेत्र के समावेशी है कि एक 1 मिमी मोटी उपास्थि विस्तारित प्राप्त करने के लिए टुकड़ा करने की क्रिया स्थिरता की सतह के साथ प्लग टुकड़ा । प्रत्येक उपास्थि प्लग के लिए दोहराएं।
  4. -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीज अवरोधकों (पीबीएस-पीआई, 1 पीआई मिनी-टैबलेट प्रति 50 एमएल 1x पीबीएस) के साथ पूरक 1x पीबीएस के 500 माइक्रोएल युक्त पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में व्यक्तिगत रूप से उपास्थि विस्तारित करें।
  5. निम्नलिखित परिवहन प्रयोगों में से प्रत्येक का संचालन करने से पहले, 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 30 मिनट के लिए एक्सप्लांट युक्त शीशियों को पिघलाएं।

Figure 2
चित्रा 2: कस्टम डिजाइन टुकड़ा करने की क्रिया स्थिरता। स्टेनलेस स्टील स्लाइसिंग स्थिरता के डिजाइन पैरामीटर 3 और 6 मिमी व्यास के उपास्थि एक्सप्लांट्स टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उपयोग किए जाते हैं। कटा हुआ explants की मोटाई को समायोजित करने के लिए कुओं के अंदर अलग मोटाई के प्लास्टिक आवेषण रखा गया था । स्टेनलेस स्टील बेलनाकार पिन & 1 मिमी व्यास का उपयोग स्थिरता से बाहर निकलने के लिए किया गया था। सभी संख्यात्मक मूल्यों को मिमी में प्रस्तुत किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. उपास्थि में CPCs के संतुलन तेज

  1. धीरे-धीरे उपास्थि एक्सप्लांट (3 मिमी व्यास. X 1 मिमी मोटी.) को एक नाजुक कार्य के साथ एक्सप्लांट सतह से अतिरिक्त 1x पीबीएस को हटाने के लिए पोंछते हैं। एक संतुलन का उपयोग करना, जल्दी से प्रत्येक एक्सप्लांट के गीले वजन को रिकॉर्ड करें और फिर निर्जलीकरण को रोकने के लिए तुरंत 1x पीबीएस स्नान में रखें।
  2. 1x पीबीएस-पीआई में फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सीपीसी के 30 माइक्रोन समाधान (300 माइक्रोन प्रति एक्सप्लांट) तैयार करें। पुनर्गठन के लिए RNase-मुक्त पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब का उपयोग करें।
  3. एक 96-अच्छी प्लेट में, प्रत्येक 30 माइक्रोन सीपीसी समाधान के 300 माइक्रोन को अलग-अलग कुओं में पिपेट करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट के किनारे के पास कुओं का उपयोग करने से बचें। एक स्पैटुला का उपयोग करके, प्रत्येक एक्सप्लांट को कुओं वाले समाधान में स्थानांतरित करें।
  4. 1x PBS के 300 μL के साथ आसपास के कुओं को भरें और ढक्कन के साथ अच्छी तरह से प्लेट को कवर करें। वाष्पीकरण को कम करने के लिए लचीली फिल्म के साथ प्लेट के किनारों को सील करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर, प्लेट को एक प्लेट शेकर पर रखें ताकि कण तलछट को सीमित किया जा सके। उपास्थि(चित्रा 3)में सीपीसी के संतुलन तेज के लिए अनुमति देने के लिए कोमल रोटेशन (15 मिमी कक्षा के साथ 50 आरपीएम) के तहत 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  6. सीपीसी एकाग्रता के लिए फ्लोरेसेंस के सहसंबंध के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न करें
    1. पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में 1x पीबीएस-पीआई में 30 माइक्रोन - 0 माइक्रोन (10 2-गुना कमजोर पड़ने) से सीपीसी समाधानों के धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कमजोर पड़ने का कम से कम 500 माइक्रोन मौजूद है।
    2. एक काले ९६-अच्छी तरह से थाली में लगातार कुओं के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के २०० μL जोड़ें । नमूना आकार बढ़ाने के लिए दूसरी पंक्ति में डुप्लिकेट।
    3. प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट लेबल के उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक नमूने की फ्लोरेसेंस रीडिंग प्राप्त करें।
    4. प्लॉट फ्लोरेसेंस रीडिंग बनाम सीपीसी एकाग्रता और वक्र के रैखिक भाग के लिए एक समीकरण प्राप्त करते हैं।
      नोट: फ्लोरेसेंस रीडिंग में परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए, मानक वक्र की पीढ़ी से पहले नमूना प्लेट के समान शर्तों के तहत सीपीसी स्टॉक समाधान को इनक्यूबेट करें।
  7. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, अलग पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में प्रत्येक कुएं से संतुलन स्नान इकट्ठा करें।
  8. एक काले 96-अच्छी तरह से प्लेट के अलग कुओं में प्रत्येक समाधान के 200 μL हस्तांतरण। मानक वक्र के लिए एक ही फ्लोरोसेंट सेटिंग्स के तहत प्रत्येक नमूने की फ्लोरेसेंस रीडिंग प्राप्त करें। यदि आवश्यक हो, तो मानक वक्र के रैखिक हिस्से के भीतर रीडिंग सुनिश्चित करने के लिए 1x पीबीएस-पीआई में नमूने को पतला करें।

Figure 3
चित्रा 3: संतुलन तेज प्रयोगों की योजनाबद्ध। उपास्थि विस्तार (3 मिमी व्यास. x 1 मिमी मोटी) को 96-अच्छी तरह से प्लेट में व्यक्तियों के कुओं में रखा गया था जिसमें फ्लोरोसेंटली टैग किए गए सीपीसी समाधान थे। 24 एच सीपीसी के बाद उपास्थि द्वारा ऊपर ले जाया गया, जिससे आसपास के स्नान की फ्लोरेसेंस कम हो गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

3. उपास्थि में सीपीसी के प्रवेश की गहराई

  1. 1x पीबीएस-पीआई में फ्लोरोसेंटी लेबल वाले सीपीसी के 30 माइक्रोन समाधान (300 माइक्रोन प्रति एक्सप्लांट) तैयार करें। पुनर्गठन के लिए RNase-मुक्त पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब का उपयोग करें।
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करके, आधा डिस्क बनाने के लिए उपास्थि एक्सप्लांट (6 मिमी व्यास x 1 मिमी मोटाई) को आधे में काट लें। कटिंग करते समय एक्सप्लांट को 1x पीबीएस-पीआई की एक परत के साथ हाइड्रेटेड रखें।
  3. एक एपॉक्सी(चित्रा 4, चित्रा 5)का उपयोग करके कस्टम-डिज़ाइन किए गए 1-आयामी परिवहन कक्ष के एक कुएं के बीच में आधा डिस्क एक्सप्लांट गोंद करें। सुनिश्चित करें कि एपॉक्सी को एक्सप्लांट के परिवर्ती (घुमावदार) पक्ष पर लागू किया जाता है। उपास्थि के प्रसार सतह क्षेत्र के साथ संपर्क को रोकने के लिए अच्छी तरह से अतिरिक्त गोंद निकालें और एक्सप्लांट के सतही पक्ष का एक नोट बनाएं।
  4. एक्सप्लांट के दोनों तरफ 1x पीबीएस-पीआई के 80 माइक्रोन जोड़ें। दूसरी तरफ रिसाव की जांच करने के लिए एक्सप्लांट के एक तरफ से तरल को ऊपर और नीचे पिपेट करें। यदि रिसाव होता है, तो एक्सप्लांट को समायोजित करें और आवश्यकतानुसार एपॉक्सी लागू करें।
  5. 1x पीबीएस-पीआई को उपास्थि (अपस्ट्रीम) की सतही सतह का सामना करने वाले पक्ष से 30 माइक्रोन सीपीसी समाधान के 80 माइक्रोन के साथ बदलें। उपास्थि (डाउनस्ट्रीम) के गहरे क्षेत्र का सामना कर रहे पक्ष पर 1x पीबीएस-पीआई के 80 माइक्रोल बनाए रखें।
  6. सावधानी से परिवहन कक्ष को एक कवर कंटेनर में रखें। समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए कंटेनर के आधार को एक परत 1x पीबीएस के साथ कवर करें। सुनिश्चित करें कि अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम कक्षों के समाधानों के बीच कोई सीधा संपर्क नहीं है।
  7. कण तलछट को सीमित करने के लिए एक प्लेट शेकर पर कवर कंटेनर रखें। कोमल रोटेशन (15 मिमी कक्षा के साथ 50 आरपीएम) के तहत कमरे के तापमान पर या तो 4 या 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट।।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, चैंबर से एक्सप्लांट निकालें और एक्सप्लांट के केंद्र से ~ 100 माइक्रोन स्लाइस काट लें।
    नोट: यह क्रॉस-सेक्शन उपास्थि के सतही, मध्यम और गहरे क्षेत्रों को शामिल करता है।
  9. एक गिलास स्लाइड और एक कवरलिप के बीच टुकड़ा रखें। 1x पीबीएस-पीआई की एक परत के साथ स्लाइस को हाइड्रेट करें।
  10. 10x आवर्धन पर, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट छवियों के जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए स्लाइस की पूरी मोटाई के माध्यम से छवि।
  11. इमेजजे परियोजना का उपयोग करके उपास्थि में सीपीसी के प्रवेश की गहराई निर्धारित करने के लिए जेड-स्टैक के भीतर छवियों की औसत तीव्रता।
    1. फ़ाइल पर क्लिक करके छवि ढेर खोलें । खुला।
    2. टास्क बार और क्लिक करें इमेज पर'इमेज'पर क्लिक करें । ढेर । ड्रॉपडाउन मेनू से जेड प्रोजेक्ट।
    3. इनपुट स्लाइस संख्या 1 से अंतिम टुकड़ा करने के लिए। प्रोजेक्शन टाइपके तहत'औसत तीव्रता'का चयन करें । क्लिक करें'ओके.'

Figure 4
चित्रा 4: कस्टम-डिज़ाइन किया गया 1-डी परिवहन कक्ष। 6 व्यक्तिगत कुओं के साथ पीएमएमए 1डी ट्रांसपोर्ट चैंबर के डिजाइन पैरामीटर। सभी संख्यात्मक मूल्यों को मिमी में प्रस्तुत किया जाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: प्रवेश अध्ययन की गहराई की योजनाबद्ध। उपास्थि एक्सप्लांट (6 मिमी व्यास x 1 मिमी मोटाई) को आधे में काटा गया था और 1-डी डिफ्यूजिव परिवहन कुओं के केंद्र में तय किया गया था। फ्लोरोसेंटली टैग किए गए सीपीसी समाधान को उपास्थि के सतही क्षेत्र (एसजेड) के संपर्क में अच्छी तरह से जोड़ा गया था। उपास्थि के डीप जोन (डीजे) के संपर्क में कुएं के किनारे 1x पीबीएस-पीआई जोड़ा गया था। प्रसार के बाद, कंस्थापना (3 मिमी x 1 मिमी) के एक क्रॉस-सेक्शन को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इस आंकड़े को वेदगवामी एट अल से संशोधित किया गया है ।4 और Bajpayee एट al.3कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. उपास्थि में CPCs की गैर संतुलन प्रसार दर

  1. कस्टम-डिज़ाइन किए गए ट्रांसपोर्ट चैंबर(चित्रा 6)के दो हिस्सों को इकट्ठा करने और कक्ष को बंद करने के लिए एक साथ लाएं। एक रिंच के साथ चैंबर को कसकर बंद करने के लिए वाशर, नट और बोल्ट का उपयोग करें।
    नोट: परिवहन कक्ष को फ्लोरोसेंट रीडिंग में हस्तक्षेप नहीं करने के लिए पारदर्शी होना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल होने वाले ट्रांसपोर्ट चैंबर पॉलीमिथाइलमेथाक्रिलेट (पीएमएमए) से बनाए जाते हैं।
  2. 1x पीबीएस (प्रत्येक कक्ष के लिए 2 मिली) में 0.5% डब्ल्यू/वी गैर वसा गोजातीय दूध समाधान के साथ चैंबर के भीतरी स्थान को 15 मिनट के लिए कोट करें ताकि सीपीसी के चैंबर दीवारों के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोका जा सके। फिर 1x पीबीएस (प्रत्येक कक्ष के लिए 2 एमएल) के साथ कक्ष कुल्ला।
  3. कस्टम-डिज़ाइन किए गए स्लाइसिंगस्थिरता (चित्रा 2)और एक रेजर ब्लेड का उपयोग करके, सतही क्षेत्र सहित 500-800 माइक्रोन की मोटाई के लिए 6 मिमी व्यास उपास्थि एक्सप्लांट (ट्रांसवर्स प्लेन) का टुकड़ा करें। एक्सप्लांट को 1x पीबीएस के साथ हाइड्रेटेड रखें।
  4. हथौड़ा संचालित और डर्मल घूंसे का उपयोग करना, रबर शीट से गैसकेट बनाएं जैसा कि चित्र 7में दिखाया गया है।
  5. प्रत्येक आधे परिवहन कक्ष को इकट्ठा करने के लिए 1 बड़े रबर गैसकेट, 1 पीएमएमए डालने और 1 छोटे रबर गैसकेट प्रत्येक शामिल हैं। ऊपर के कक्ष का सामना कर रहे सतही क्षेत्र के साथ, प्लास्टिक डालने के कुओं में एक्सप्लांट रखें। सैंडविच दो हिस्सों को एक साथ विधानसभा को पूरा करने और कसकर एक रिंच(चित्रा 7)का उपयोग कर पेंच ।
  6. अपस्ट्रीम चैंबर को 1x पीबीएस-पीआई के 2 एमएल से भरें और अपस्ट्रीम चैंबर से तरल पदार्थ के रिसाव के लिए डाउनस्ट्रीम चैंबर का निरीक्षण करें । यदि रिसाव मौजूद है, तो कक्ष को फिर से इकट्ठा करें, गैसकेट स्थिति और शिकंजा की जकड़न को समायोजित करें। यदि कोई रिसाव नहीं है, तो डाउनस्ट्रीम चैंबर को 2 एमएल 1x पीबीएस-पीआई के साथ भी भरें।
  7. दोनों ऊपर और बहाव कक्षों के लिए एक मिनी हलचल बार जोड़ें और एक हलचल थाली पर चैंबर जगह है । कक्ष को संरेखित करें ताकि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से लेजर डाउनस्ट्रीम चैंबर के केंद्र की ओर केंद्रित हो। डाउनस्ट्रीम चैंबर(चित्रा 8)के पीछे स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के सिग्नल रिसीवर भाग को रखें।
    नोट: स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के लेजर और रिसीवर को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन से उत्तेजित, उत्सर्जन और संचारित संकेतों को उत्तेजित करने, उत्सर्जित करने के लिए उपयुक्त फिल्टर से सुसज्जित किया जाना चाहिए। फ्लोरेसेंस सिग्नल में हस्तक्षेप से बचने के लिए प्रयोग के दौरान ब्लैक बॉक्स का उपयोग करके परिवहन कक्ष को प्रकाश से बचाएं। वाष्पीकरण से बचने के लिए लचीला फिल्म के साथ चैंबर के शीर्ष पर उद्घाटन सील करने के लिए सबसे अच्छा अभ्यास है।
  8. वास्तविक समय के डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस उत्सर्जन रीडिंग को इकट्ठा करें और कम से कम 5 मिनट के लिए एक स्थिर संकेत सुनिश्चित करें।
    नोट: डाउनस्ट्रीम चैंबर से अलीकोट को प्लेट रीडर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस के लिए प्राप्त और मूल्यांकन किया जा सकता है यदि एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया स्पेक्ट्रोफोटोमीटर या पारदर्शी परिवहन कक्ष उपलब्ध नहीं है।
  9. पिपेट फ्लोरोसेंटली के स्टॉक समाधान की पूर्व-गणना की गई मात्रा ने अपस्ट्रीम कक्ष में सीपीसी को टैग किया ताकि अपस्ट्रीम कक्ष के अंदर 3 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित की जा सके। डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस सिग्नल का निरीक्षण करें और ढलान में लगातार वृद्धि तक पहुंचने के लिए सोल्यूट परिवहन की अनुमति दें।
    नोट: एक मोटा उपास्थि एक्सप्लांट स्थिर राज्य तक पहुंचने के लिए अब समय की आवश्यकता होगी ।
  10. एक बार स्थिर स्थिति तक पहुंच जाने के बाद, अपस्ट्रीम चैंबर से 20 माइक्रोन लें और डाउनस्ट्रीम चैंबर ("स्पाइक टेस्ट") में जोड़ें।
    नोट: डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस में एक स्पाइक देखा जाएगा। यह फ्लोरेसेंस रीडिंग और सीपीसी एकाग्रता के बीच सहसंबंध के लिए अनुमति देगा ।
  11. वास्तविक समय डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस रीडिंग लीजिए।

Figure 6
चित्रा 6: कस्टम-डिज़ाइन गैर-संतुलन प्रसार परिवहन कक्ष। पीएमएमए गैर संतुलन प्रसार परिवहन कक्ष के डिजाइन मापदंडों। कक्ष को फ्लोरेसेंस रीडिंग में हस्तक्षेप न करने के लिए पारदर्शी होना चाहिए। पूर्ण परिवहन कक्ष में दिखाए गए स्थिरता के दो समान हिस्सों शामिल थे। चैंबर के हिस्सों के संरेखण और पूर्ण बंद करने को सुनिश्चित करने के लिए दो बेलनाकार स्टेनलेस-स्टील पिन (~ 2.94 मिमी व्यास, ~ 18 मिमी लंबे) की आवश्यकता थी। पेंच तंग विधानसभा के लिए चैंबर के प्रत्येक कोने में 6-32 धागे शिकंजा के लिए चार समान स्लॉट किए गए थे। सभी संख्यात्मक मूल्यों को मिलीमीटर में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: गैर संतुलन प्रसार परिवहन कक्ष की विधानसभा। (ए)ब्लैक पीएमएमए आवेषण और(बी)बड़े और छोटे रबर गैसकेट के डिजाइन पैरामीटर। चैंबर के तंग बंद सुनिश्चित करने के लिए रबर गैसकेट की मोटाई समायोजित की गई थी। सभी संख्यात्मक मूल्यों को मिमी में प्रस्तुत किया जाता है।(सी)योजनाबद्ध केंद्र में रखे उपास्थि एक्सप्लांट के साथ परिवहन कक्ष के दो हिस्सों के लिए असेंबली का आदेश दिखाता है। एसजेड उपास्थि के सतही क्षेत्र को इंगित करता है जो अपस्ट्रीम कक्ष का सामना कर रहा था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: गैर संतुलन प्रसार प्रयोगों की योजनाबद्ध। उपास्थि विस्तार (6 मिमी व्यास x 1 मिमी मोटाई) को परिवहन कक्ष के केंद्र में ऊपर के कक्ष का सामना करने वाली सतह के साथ रखा गया था। चैंबर के ऊपर और डाउनस्ट्रीम दोनों तरफ 1x पीबीएस-पीआई से भरे हुए थे और एक मिनी हलचल बार का उपयोग करके मिश्रित थे। फ्लोरोसेंट रीडिंग इकट्ठा करने के लिए डाउनस्ट्रीम चैंबर की ओर इशारा करते हुए लेजर के साथ, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए सीपीसी समाधान को अपस्ट्रीम चैंबर में जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Representative Results

उपास्थि द्वारा CPCs के संतुलन अवशोषण के बाद, स्नान फ्लोरेसेंस कम हो जाता है जब solute ऊतक द्वारा ऊपर ले जाया गया है । हालांकि, यदि अंतिम स्नान का फ्लोरेसेंस मूल्य प्रारंभिक के समान रहता है, तो यह इंगित करता है कि कोई/न्यूनतम घुलनशील तेज नहीं है । solute तेज की एक और पुष्टि है अगर ऊतक दिख गया है फ्लोरोसेंट डाई के रंग के लिए रंग बदल गया है । उपास्थि में सोल्यूट्स का मात्रात्मक तेज मानक वक्र का उपयोग करके फ्लोरेसेंस मूल्यों को एकाग्रता में परिवर्तित होने के बाद तेज अनुपात (आरयू)का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। प्रारंभिक स्नान एकाग्रता (सीबाथ,i)और संतुलन स्नान एकाग्रता (सीबाथ),उपास्थि (सीउपास्थि)के अंदर घुलनशील एकाग्रता का उपयोग इस प्रकार किया गया था जहां वीबाथ= 300 माइक्रोन:

Equation 1

सीउपास्थि और सीबाथका उपयोग करके, नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके तेज अनुपात निर्धारित किया गया था।

Equation 2

मूल्य और ---1 चार्ज इंटरैक्शन के कारण बढ़ी हुई तेजता का संकेत देते हैं, जबकि मूल्य और एलटी;1 कम तेज का संकेत देते हैं। उदाहरण के लिए, न्यूट्राविडिन (60 केडीए, पीआई 7) जैसे बड़े, तटस्थ सॉउट्स ने उपास्थि मैट्रिक्स 1 के साथ स्टेरिक बाधा के कारण आरयूएंडएलटी;1दिखाया है, जबकि छोटे, तटस्थ सोल्यूट्स को आरयू~ 1 दिखाने की उम्मीद है, क्योंकि वे उपास्थि में फैलाना, संतुलन तक पहुंचने में सक्षम हैं। इसके विपरीत, न्यूट्राविडिन के सकारात्मक आवेशित समकक्ष एविडिन (पीआई 10.5) ने उपास्थि 1 में एक आरयू~180दिखाया है। इसके अलावा, छोटे आकार के CPCs (~ 2.5-4 केडीए) ४००४तक एक आरयू दिखाते हैं । जैसा कि चित्रा 9द्वारा दिखाया गया है, तेज अनुपात में आरोप-निर्भर प्रतिक्रिया4दिखाई दी ।

Figure 9
चित्रा 9: उपास्थि में सीपीसी के संतुलन तेज के प्रतिनिधि परिणाम । अलग-अलग नेट चार्ज (+8, +14 और +20) के सीपीसी और उपास्थि में उनके संबंधित तेज अनुपात से पता चला है कि तेज बढ़ते शुल्क के साथ एकरसता में वृद्धि नहीं करता है। इस आंकड़े को वेदगवामी एट अल से संशोधित किया गया है ।4कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यदि संतुलन तक पहुंचने के बाद स्नान की फ्लोरेसेंस बढ़ गई है, तो यह इंगित करेगा कि फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए सॉल्यूट की प्रारंभिक स्नान एकाग्रता बहुत अधिक थी। यह उत्सर्जन प्लेट रीडर के माध्यम से उत्तेजन के बाद समाधान के भीतर फंसने के लिए कारण होगा । इस समस्या को हल करने के लिए, प्रारंभिक स्नान एकाग्रता कम करें।

कन्मोसिंग इमेजिंग के बाद, प्रत्येक छवि के साथ छवियों का एक ढेर उत्पादित किया गया था जिसमें उपास्थि की विभिन्न परतों पर फ्लोरोसेंटी टैग किए गए सीपीसी के प्रवेश की गहराई दिखाई गई थी। उपास्थि एक्सप्लांट के केंद्र से प्राप्त छवि ने एक्सप्लांट की मोटाई में किसी भी अन्य छवि की तुलना में प्रवेश की सबसे दूर गहराई दिखाई। ImageJ जैसे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, सीपीसी प्रवेश की औसत तीव्रता को प्रदर्शित करने वाली एक छवि का उत्पादन करने के लिए छवियों के ढेर को मढ़ा गया था। इन मढ़ा छवियों विभिन्न आरोप लगाया दवा वाहक के बीच प्रवेश की समग्र गहराई की सबसे अच्छी तुलना प्रदान की है। ऊतक(चित्रा 10)के भीतर CPCs के लिए एक आरोप पर निर्भर प्रतिक्रिया देखी गई थी । बड़े तटस्थ रूप से चार्ज किए गए वाहक (उदाहरण के लिए, न्यूट्राडिन) सतही क्षेत्र की तुलना में बहुत दूर प्रवेश नहीं करेंगे क्योंकि उनके पास मैट्रिक्स1के साथ बाध्यकारी प्रेरित करने के लिए चार्ज इंटरैक्शन का उपयोग करने की क्षमता की कमी है। इसी तरह, बहुत अधिक सकारात्मक आरोप सतही क्षेत्र तक सीमित होगा (जैसा कि सीपीसी + 20 द्वारा 24 एच के बाद भी दिखाया गया है)4,हालांकि, यह वाहक को मैट्रिक्स के लिए बहुत दृढ़ता से बंधे होने का परिणाम है; वे अपने आरंभिक लक्ष्य से अनबन नहीं कर पा रहे हैं । हालांकि, एक इष्टतम आवेशित दवा वाहक उपास्थि के गहरे क्षेत्रों में प्रवेश करने में सक्षम होगा क्योंकि यह इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन (जैसा कि सीपीसी + 14 द्वारा दिखाया गया है)4की कमजोर और प्रतिवर्ती प्रकृति का लाभ उठा सकता है। यह वाहक को अपने प्रारंभिक लक्ष्य से बांधने की अनुमति देता है, मैट्रिक्स के माध्यम से गहराई से आगे बढ़ने के लिए अनबाइंड, और फिर ऊतक के अंदर आगे लक्ष्य के लिए फिर से बांधता है। उदाहरण के लिए, एविडिन (~ 7 एनएम व्यास, 66 केडीए, पीआई 10.5) नकारात्मक आवेशित मैट्रिक्स ग्लाइकोसामिनोग्लिकन (जीएजी) के साथ बाध्यकारी 150 माइक्रोन का एक वियोजन स्थिर (केडी)है, जिसे पूर्ण मोटाई प्रवेश के लिए आवश्यक रिवर्सिबल बाध्यकारी को सक्षम करने के लिए पर्याप्त माना जाता था1। कमजोर बाध्यकारी के बावजूद, एविडिन ने नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए जीएज (बाइंडिंग घनत्वएन टी = 2900 माइक्रोन) 1 की उच्च घनत्व की उपस्थिति के कारण उपास्थि में उच्च प्रतिधारण और तेजदिखाया। इसके अलावा, जैसा कि सीपीसी + 8 द्वारा दिखाया गया है, पूर्ण मोटाई प्रवेश 4 घंटे के भीतर दिखाई दे रहा था, जबकि सीपीसी + 14 को पूर्ण गहराई तक पहुंचने के लिए24घंटे की आवश्यकता थी 4 । इस प्रकार, टिश्यू मोटाई में विभिन्न सॉउट्स की दर की प्रभावी रूप से तुलना करने के लिए कई समय अंक चुने जाने चाहिए। प्रवेश की गहराई की अधिक मात्रात्मक समझ के लिए, इमेजजे का उपयोग करके ऊतक की मोटाई के साथ सॉल्यूट्स की सापेक्ष तीव्रता प्राप्त की जा सकती है।

Figure 10
चित्रा 10: उपास्थि में प्रवेश अध्ययन की गहराई से प्रतिनिधि परिणाम। अलग-अलग नेट चार्ज (+8, +14 और +20) के सीपीसी और उपास्थि के माध्यम से प्रवेश की उनकी संबंधित गहराई से पता चला कि सीपीसी + 8 और सीपीसी + 14 द्वारा देखे गए कमजोर-रिवर्सिबल बाइंडिंग का पता चला है, जो पूर्ण गहराई से प्रवेश के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, सीपीसी + 20 के लिए देखा के रूप में भी मजबूत बाध्यकारी पूर्ण मोटाई प्रवेश बाधित । इस आंकड़े को वेदगवामी एट अल से संशोधित किया गया है ।4कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यदि इमेजिंग के दौरान उपास्थि के अंदर कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं देखा गया है, तो दो मुद्दे मौजूद हो सकते हैं; या तो प्रसार के लिए सतह क्षेत्र एपॉक्सी द्वारा अवरुद्ध किया गया था, या प्रारंभिक स्नान एकाग्रता फ्लोरोसेंट संकेत का उत्पादन करने के लिए बहुत कम थी। इन समस्याओं को ठीक करने के लिए, उपास्थि सतहों से अतिरिक्त एपॉक्सी को हटा दें और घुलनशील एकाग्रता बढ़ाएं।

गैर-संतुलन प्रसार परिवहन प्रयोगों के परिणामस्वरूप एक वक्र हुआ जैसा कि चित्र 11में दिखाया गया है । वक्र का प्रारंभिक भाग उपास्थि के माध्यम से सोल्यूट प्रसार का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि सोल्यूट-मैट्रिक्स बाध्यकारी बातचीत होती है। वाहक के बढ़ते शुल्क के साथ, मजबूत मैट्रिक्स बाध्यकारी हुआ जिसके परिणामस्वरूप नीचे के कक्ष तक पहुंचने के लिए सॉल्यूट्स के लिए लंबा समय होगा। एक बार सोल्यूट्स उपास्थि की गहराई के माध्यम से प्रवेश करते हैं और डाउनस्ट्रीम कक्ष तक पहुंच जाते हैं, वक्र की ढलान में वृद्धि देखी गई क्योंकि समय के साथ फ्लोरेसेंस रीडिंग बढ़ जाती है। वक्र का यह दूसरा हिस्सा स्थिर-राज्य प्रसार का प्रतिनिधित्व करते हुए एक स्थिर ढलान पर पहुंच गया। एक्स-इंटरसेप्ट द्वारा चिह्नित स्थिर-राज्य प्रसार(τ Lag)तक पहुंचने में लगने वाले समय को निर्धारित करने के लिए स्थिर-राज्य ढलान पर एक स्पर्शरेखा रेखा खींची गई थी। प्रभावी प्रसार (डीEFF),CPCs की प्रसार दर जबकि उपास्थि में बाध्यकारी बातचीत मौजूद हैं, इस प्रकार के रूप मेंο Lag और explant मोटाई (एल) का उपयोग करके गणना की गई थी:

Equation 3

अपस्ट्रीम से डाउनस्ट्रीम चैंबर में समाधान के 20 माइक्रोन के हस्तांतरण के बाद, फ्लोरेसेंस में एक स्पाइक देखा गया; परिणामस्वरूप स्थिर फ्लोरेसेंस तीव्रता का उपयोग एकाग्रता के सहसंबंध के लिए किया गया था। डाउनस्ट्रीम (सीडी)में सीपीसी की एकाग्रता को अपस्ट्रीम एकाग्रता (सीयू)में सामान्य किया गया था, फिर समय के खिलाफ साजिश रची गई थी। इस वक्र की ढलान का उपयोग स्थिर-राज्य प्रसार दर का अनुमान लगाने के लिए किया गया था जब उपास्थि में सभी बाध्यकारी साइटों पर कब्जा कर लिया जाता है (डीएसएस)जैसा कि नीचे दिखाया गया है। यह मूल्य विभाजन गुणांक के समावेशी था। यहां, φ, वीडी और ए उपास्थि छिद्र (~ 0.8), डाउनस्ट्रीम चैंबर वॉल्यूम (2 एमएल) और उपास्थि (0.1257 सेमी2)के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र का क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं। सीपीसी के लिए गैर-संतुलन परिवहन प्रयोगों से गणना किए गए प्रतिनिधि डीएफ एफ . और डीएसएस मूल्य तालिका 1में पाए जा सकते हैं।

Equation 4

Figure 11
चित्रा 11: उपास्थि के माध्यम से गैर संतुलन प्रसार अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम । सीपीसी + 8 प्रसार वक्र, डाउनस्ट्रीम एकाग्रता (सीडी)के रूप में प्लॉट किया गया है, जो समय के खिलाफ अपस्ट्रीम एकाग्रता (सीयू)को सामान्यीकृत करता है। स्थिर-राज्य ढलान (नीला) पर खींची गई एक स्पर्शरेखा रेखा एक्स-एक्सिसकोपार करती है, जिसका उपयोग डीएफईफकी गणना करने के लिए किया जाता था। स्पर्शरेखा की ढलान का उपयोग डीएसएसकी गणना करने के लिए किया जाता था। स्पाइक टेस्ट (ग्रे) डाउनस्ट्रीम एकाग्रता को सामान्य बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले अपस्ट्रीम से डाउनस्ट्रीम तक 20 माइक्रोन सीपीसी समाधान के हस्तांतरण के बाद डाउनस्ट्रीम चैंबर में स्थिर एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े को वेदगवामी एट अल से संशोधित किया गया है ।4कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यदि डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस अपस्ट्रीम चैंबर में फ्लोरोसेंटली टैग पेप्टाइड के अलावा से पहले स्थिर करने में विफल रहता है, तो यह संभावना है कि पिछले प्रयोग से दीवारों पर सोल्यूट अवशेष अटके हुए हैं। इस मामले में, कक्ष को अलग करें और साबुन और सोनिकेट से धोएं। यदि अपस्ट्रीम कक्ष में फ्लोरोसेंटली टैग पेप्टाइड के अलावा तुरंत डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस में वृद्धि हुई है, तो इससे यह संकेत मिल सकता है कि रिसाव मौजूद है। इसके लिए परिवहन कक्ष को फिर से इकट्ठा करने और लीक के लिए फिर से परीक्षण करने की आवश्यकता होगी । यदि डाउनस्ट्रीम फ्लोरेसेंस सिग्नल स्थिर-राज्य वृद्धि के विपरीत एक पठार तक पहुंचता है, तो यह अपस्ट्रीम कक्ष में एकाग्रता की संभावित हानि को इंगित करता है, जो कक्ष की दीवारों से चिपके हुए सॉलुट्स के कारण होने की संभावना है। अपस्ट्रीम चैंबर में 0.005% w/v गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के अलावा चिपके हुए को रोकने में मदद कर सकते हैं।

सीपीसी डीEFF (सेमी2/ डीएसएस (सेमी2/s)
सीपीसी+8 1.7 ± 0.4 x 10-7 5.8 ± 0.0 x 10-5
सीपीसी +14 9.8 ± 0.2 x 10-8 2.6 ± 1.2 x 10-5
सीपीसी+20 4.7 ± 0.1 x 10-8 1.4 ± 0.9 x 10-5

तालिका 1: उपास्थि के माध्यम से सीपीसी परिवहन के लिए प्रतिनिधि डीEFF और डीएसएस मूल्यों । इस तालिका को वेडगवामी एट अलसे संशोधित किया गया है।

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Discussion

यहां वर्णित तरीके और प्रोटोकॉल नकारात्मक रूप से आवेशित ऊतकों के लिए लक्षित दवा वितरण के क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन ऊतकों में मौजूद नकारात्मक आवेशित एग्रीकन के उच्च घनत्व के कारण, एक बाधा बनाई जाती है, इस प्रकार दवाओं को उनके सेलुलर लक्ष्य साइटों तक पहुंचने से रोकती है जो मैट्रिक्स के भीतर गहरी झूठ बोलती हैं। इस उत्कृष्ट चुनौती से निपटने के लिए, दवाओं को सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए दवा वाहकों को शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है जो ऊतक,,1, 3, 4,,,14, 15, 16,,163,4,17,19,19के भीतर दवाओं की परिवहन दर, तेज और बाध्यकारी को बढ़ासकते19हैं। जैसा कि विकसित तरीकों के साथ यहां दिखाया गया है, सकारात्मक आवेशित दवा वाहकों के परिवहन को संतुलन तेज, प्रवेश की गहराई और गैर-संतुलन प्रसार दर निर्धारित करने के लिए चिह्नित किया जा सकता है। हमने सफलतापूर्वक तीन अलग-अलग प्रायोगिक सेटअप तैयार किए हैं जिनका उपयोग उपास्थि विस्तार के माध्यम से परिवहन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

परिवहन के सफल लक्षण वर्णन के लिए, प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदमों का पालन करने की आवश्यकता है । सभी समाधानों में प्रोटीज अवरोधकों (पीआई) का उपयोग उपास्थि के माध्यम से सीपीसी के अंतर-उपास्थि परिवहन को सटीक रूप से चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि वे ऊतक20में प्रोटीन के एंजाइमेटिक पाचन को रोकने के लिए कार्य करते हैं। इसलिए, यदि उपयोग नहीं किया जाता है, तो उपास्थि मैट्रिक्स घटक जैसे एग्रीकन और कोलेजन प्रयोग के दौरान आसपास के स्नान में नीचा और स्रावित करना शुरू कर सकते हैं। यह उपास्थि के एफसीडी को बहुत कम कर सकता है, जिससे उपास्थि मैट्रिक्स में चार्ज-आधारित बाध्यकारी साइटों की संख्या कम हो सकती है। परिणामस्वरूप ऊतक अब स्वस्थ उपास्थि का प्रतिनिधि नहीं होगा। इसके विपरीत, प्रस्तुत किए गए प्रयोगों का उपयोग गठिया उपास्थि के माध्यम से सीपीसी के परिवहन का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है जहां ओए20में देखी गई एग्रीकन सामग्री बहुत कम है। उपास्थि के प्रत्यारोपण को पचाने के लिए ट्राइप्सिन या चोंड्रोइटाइनास एबीसी का उपयोग करके, एग्रीकन घनत्व को नियंत्रित किया जा सकता है, जिससे रोगग्रस्त राज्य में परिवहन और दवा वितरण के मूल्यांकन की अनुमति दी जा सके। इस मामले में, चार्ज-आधारित बाध्यकारी से समझौता किया जा सकता है, जबकि अन्य प्रकार की बातचीत जैसे हाइड्रोजन बांड और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन सहक्रियात्मक रूप से अंतर-उपास्थि बाध्यकारी और प्रतिधारण 4 कोबढ़ातेहैं।

नमूना तैयारी और प्रयोग के दौरान उपास्थि एक्सप्लांट के जलयोजन को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। आर्टिकुलर कार्टिलेज21को अपरिवर्तनीय क्षति पहुंचाने के लिए 6 मिनट से अधिक समय तक हवा के संपर्क में आने के माध्यम से निर्जलीकरण दिखाया गया है । नतीजतन, सीपीसी के परिवहन में अप्रत्याशित परिवर्तन हो सकते हैं। इसी तरह, सीपीसी स्नान के वाष्पीकरण के परिणामस्वरूप एक्सप्लांट निर्जलीकरण हो सकता है; इसे एक लचीली फिल्म के साथ सील करके रोका जा सकता है। हालांकि, स्नान वाष्पीकरण न केवल एक्सप्लांट निर्जलीकरण का कारण बन सकता है, बल्कि यह सीपीसी स्नान एकाग्रता में बदलाव का कारण बन सकता है, जिसके परिणामस्वरूप झूठी फ्लोरोसेंट रीडिंग होती है। इसके अलावा यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रवेश अध्ययन की गहराई को इमेजिड होने के लिए उपास्थि के पतले क्रॉस-सेक्शन (~ 100 माइक्रोन) की आवश्यकता होती है। यह एक तकनीक है जिसके लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है ताकि एक समान मोटाई के स्लाइस प्राप्त किए जा सकें। गैर-संतुलन प्रसार प्रयोगों के लिए भी यह महत्वपूर्ण है, कि परिवहन कक्ष पारदर्शी हो ताकि कस्टम-डिज़ाइन किए गए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ वास्तविक समय फ्लोरेसेंस माप प्राप्त किया जा सके। हालांकि, एक विकल्प के रूप में, डाउनस्ट्रीम चैंबर से एलिकोट्स को प्लेट रीडर या अन्य स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रीडर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस के लिए प्राप्त और मूल्यांकन किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों का बहुत महत्व है क्योंकि वे वीवो दवा प्रतिधारण और दीर्घकालिक जैविक प्रभावकारिता में बेहतर भविष्यवाणी करने के लिए उपास्थि के माध्यम से दवा वाहक परिवहन की विशेषता के लिए एक बेंच-स्केल विधि प्रदान करते हैं । हाल ही में, असुरक्षित मीडिया22के माध्यम से सोल्यूट परिवहन को मापने के लिए कम्प्यूटेशनल द्रव गतिशीलता के लिए एक परिमित तत्व ढांचा लागू किया गया था। अरबबी एट अल ने माइक्रो-सीटी इमेजिंग से प्राप्त प्रायोगिक आंकड़ों के संयोजन में परिमित तत्व विश्लेषण का उपयोग किया है ताकि नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए कंट्रास्ट एजेंट की प्रसार दरों को मापने के लिए, उपास्थि23, 24,24में ioxaglate । इसके अलावा, एक बहु-क्षेत्र, बहु-फेसिक मॉडल का उपयोग करके, उपास्थि के विभिन्न क्षेत्रों में ioxaglate के प्रसार गुणांक प्रत्येक क्षेत्र के एफसीडी के साथ मापा गया था। जबकि माइक्रो-सीटी इमेजिंग का उपयोग केवल विपरीत एजेंटों के साथ किया जा सकता है, हमारा प्रयोगात्मक सेटअप सभी दवाओं और दवा वाहकों के परिवहन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है जिन्हें फ्लोरोसेंटली लेबल किया जा सकता है। हालांकि, अरबबी एट अल द्वारा उपयोग की जाने वाली उन्नत गणना मॉडलिंग सोल्यूट परिवहन व्यवहार का अधिक व्यापक विश्लेषण प्रदान करती है और इसे हमारे प्रयोगात्मक तरीकों पर लागू किया जा सकता है13,,24।

प्रस्तुत विधि की एक सीमा यह है कि प्रत्येक सोल्यूट परिवहन प्रयोग के लिए प्रायोगिक सेटअप पूरी तरह से वीवो वातावरण में शामिल नहीं है। जैविक प्रतिक्रियाएं और प्राकृतिक संयुक्त के भीतर होने वाली यांत्रिक और गतिशील ताकतें यहां नकली नहीं हैं। इन ताकतों को शामिल करने के लिए, परिवहन कक्ष को चलने और चलने के रूप में गतिविधियों के दौरान होने वाले संवहनी प्रवाह पैटर्न का अनुकरण करने के लिए एक पिस्टन के साथ संशोधित किया जा सकता है। हालांकि, जबकि संवहनी प्रवाह 2 गुना तक तेज बढ़ सकता है, इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के कारण तेज 100-400x बढ़ सकता है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत प्रायोगिक सेटअप प्रभारी आधारित परिवहन औरतेज 25के लिए एक अच्छा अनुमान प्रदान करते हैं । इसके अलावा, चूंकि घुटने के जोड़ में स्वाभाविक रूप से सिनोवियल तरल पदार्थ होता है, इसलिए इसका उपयोग 1x पीबीएस-पीआई के बजाय परिवहन प्रयोगों के लिए स्नान समाधानों में किया जा सकता है। यह अनुमान लगाया गया है कि उपास्थि में cationic वाहकों का तेज 1x पीबीएस की तुलना में सिंओरियल तरल पदार्थ में कम हो जाएगा, क्योंकि सिंओरियल द्रव में नकारात्मक आवेशित कार्बोक्सिल समूहों के साथ हाइलुरोनन चेन की उपस्थिति होगी। यह संभव है कि cationic वाहक प्रतिस्पर्धी उपास्थि के GAGs के अलावा सिनोवियल तरल पदार्थ की हाइलुरोनन श्रृंखलाओं के साथ बांधते हैं। हालांकि, सिंओवियल तरल पदार्थ की तुलना में उपास्थि में नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए समूहों का घनत्व काफी अधिक है, दोनों नकारात्मक आवेशित कार्बोक्सिलेटेड हाइलुरोनन चेन और उपास्थि15में सल्फेटेड जीजीएस की उपस्थिति के कारण। इस प्रकार, हालांकि सिंओरियल तरल पदार्थ की उपस्थिति में उपास्थि में तेज 1x पीबीएस की तुलना में कम होगा, यह अभी भी उच्च अंतर उपास्थि तेज बनाए रखने की उम्मीद है। वीवो में, एविडिन ने सिनोवियल द्रव16, 26,26की उपस्थिति में चूहे और खरगोश उपास्थि दोनों में उच्च अंतर-उपास्थि तेज दिखाया है। इसके अलावा, एविडिन ने खरगोश पूर्वकाल क्रूसिएट स्नायु ट्रांसेक्शन मॉडल 27 में इंट्रा-आर्टिकुलर इंजेक्शन के बाद2सप्ताह तक उपास्थि में उच्च तेज और प्रतिधारण दिखाया है।

इस प्रणाली में गोजातीय उपास्थि का उपयोग मोटाई (~ 1.5-2 मिमी)28, 29,के संदर्भ में मानव उपास्थि में अपनी समानताओं के कारण उपास्थि के माध्यम से दवा प्रवेश का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करने की अनुमतिदेताहै। उपास्थि के माध्यम से सॉल्यूट्स का परिवहन मोटाई के साथ भिन्न हो सकता है; ड्रग कैरियर्स को चूहों या चूहे उपास्थि के माध्यम से पूरी तरह से घुसना करने के लिए कम बाध्यकारी इंटरैक्शन की आवश्यकता हो सकती है जो बहुत पतले हैं, हालांकि मोटा मानव उपास्थि1में गहरे मर्मज्ञ से काफी रुकावट हो सकती है । इसके अलावा, हालांकि इन प्रयोगों को उपास्थि के भीतर सोल्यूट परिवहन की विशेषता के लिए डिज़ाइन किया गया था, इन तरीकों को संशोधित किया जा सकता है और अन्य नकारात्मक आवेशित ऊतकों जैसे मेनिस्कस, कॉर्निया और आंखों के विट्रियस हास्य, और इंटरवर्टेब्रल डिस्क के नाभिक पल्पोसस पर लागू किया जा सकता है। यहां डिजाइन किए गए प्रयोगों के तरीके लाभप्रद हैं क्योंकि फिक्स्चर और परिवहन कक्षों के आयामों को ऊतक के आकार और प्रजातियों के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। इन तरीकों का प्रभाव व्यापक है, न केवल दवा वाहकों तक सीमित है बल्कि दवाओं और दवा-दवा वाहक संघ के परिवहन के मूल्यांकन के लिए भी सीमित है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के अनुबंध W81XWH-17-1-0085 के तहत कांग्रेस निर्देशित चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम (CDMRP) के माध्यम से संयुक्त राज्य अमेरिका के रक्षा विभाग द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और स्वास्थ्य R03 EB025903-1 के राष्ट्रीय संस्थान । एवी को पूर्वोत्तर विश्वविद्यालय में कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग डीन फेलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
316 Stainless Steel SAE Washer McMaster-Carr 91950A044 For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate Fisherbrand 12566620 Black
Acrylic Thick Gauge Sheet Reynolds Polymer N/A For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 100x
Bovine Cartilage Research 87 N/A 2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin Fisher BioReagents BP671-1
CPC+14 LifeTein LT1524 Custom designed peptide
CPC+20 LifeTein LT1525 Custom designed peptide
CPC+8 LifeTein LT1523 Custom designed peptide
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Dermal Punch MedBlades MB5-1 3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides Fisherbrand 12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates Corning Costar 3595 Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film Bemis Parafilm M Laboratory 1337412
Gold Seal Cover Glass Electron Microscopy Sciences 6378701 # 1.5, 18x18 mm
Hammer-Driven Hole Punch McMaster-Carr 3427A15 1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch McMaster-Carr 3427A19 3/4" Diameter
Laser Chroma Technology AT480/30m Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut McMaster-Carr 90480A007 6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope Zeiss LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars Bel-Art Spinbar F37119-0007 7x2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet McMaster-Carr 1370N12 1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk Sigma Aldrich M7409
Petri Dish Chemglass Life Sciences CGN1802145 150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline Corning 21-040-CMR 1x
Plate Shaker VWR 89032-088
Protease Inhibitors Thermo Scientific A32953
Razor Blades Fisherbrand 12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet Reynolds Polymer N/A Black transport chamber inserts
RTV Silicone Loctite 234323 Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel TedPella 549-3 #10, #11 blades
Signal Receiver Chroma Technology ET515lp Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22363204 1.5 mL
Spatula TedPella 13508
Synergy H1 Microplate Reader Biotek H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw McMaster-Carr 90128A153 6-32 Thread size, 1" Long

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 162 इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन एंटिक पेप्टाइड वाहक नकारात्मक आवेशित ऊतक इलेक्ट्रो-डिफ्यूजिव परिवहन फिक्स्ड चार्ज घनत्व लक्षित दवा वितरण
Cationic पेप्टाइड वाहकों के अंतर-उपास्थि परिवहन गुणों का लक्षण वर्णन
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Vedadghavami, A., Mehta, S., Bajpayee, A. G. Characterization of Intra-Cartilage Transport Properties of Cationic Peptide Carriers. J. Vis. Exp. (162), e61340, doi:10.3791/61340 (2020).

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