Summary
이 프로토콜은 연골에서 양이온 펩티드 캐리어에 대한 평형 섭취량, 침투 깊이 및 비 평형 확산 속도를 결정합니다. 운송 특성의 특성화는 효과적인 생물학적 반응을 보장하는 데 중요합니다. 이러한 방법은 음전하 조직을 대상으로 최적의 충전 약물 운반사업자를 설계하는 데 적용될 수 있다.
Abstract
연골과 같은 신체의 여러 부정적 충전 조직은 음전하 아그레칸의 고밀도로 인해 표적 약물 전달에 장벽을 제시하고, 따라서 치료 반응을 높이기 위해 향상된 표적 타겟팅 방법이 필요합니다. 연골은 높은 음의 고정 전하 밀도를 가지고 있기 때문에, 약물은 정전기 상호 작용을 활용하기 위해 양전하 약물 캐리어로 수정 할 수 있습니다, 향상된 연골 약물 수송을 허용. 따라서 약물 운반선의 수송을 연구하는 것은 생물학적 반응을 유도하는 약물의 효능을 예측하는 데 중요합니다. 연골 연동에서 양양 펩티드 운반선의 평형 섭취량, 침투 깊이 및 비평형 확산 속도를 정량화할 수 있는 세 가지 실험의 설계를 보여줍니다. 평형 섭취 실험은 주변 목욕에 비해 연골 내의 용성 농도의 척도를 제공하며, 이는 연골에서 약물의 치료 농도를 향상시키는 데 약물 운반체의 잠재력을 예측하는 데 유용합니다. 공초점 현미경을 이용한 침투 연구의 깊이는 solutes가 그들의 매트릭스 및 세포 표적 사이트에 도달하는지 여부를 평가하는 데 중요한 연골의 깊은 영역에 피상에서 1D solute 확산의 시각적 표현을 허용합니다. 맞춤형 수송 챔버를 이용한 비평형 확산 속도 연구는 조직 전반에 걸쳐 형광으로 표지된 솔루트의 확산 속도를 특성화함으로써 조직 매트릭스와의 결합 상호 작용강도의 측정을 가능하게 한다. 이것은 연골과 최적의 결합 강도의 캐리어를 설계하는 데 도움이됩니다. 함께, 3개의 수송 실험에서 얻은 결과는 약물 전달 애플리케이션을 위한 약하고 가역적인 충전 상호작용을 활용하는 최적으로 충전된 약운반사업자를 설계하기 위한 가이드라인을 제공한다. 이러한 실험적 방법은 또한 약물 및 약물-약물 운반체 컨쥬게이트의 수송을 평가하기 위해 적용될 수 있다. 또한, 이러한 방법은 반월 상 연골, 각막 및 유리체 유머와 같은 다른 부정적인 충전 조직을 대상으로 하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
본문에 부정적인 충전된 조직에 약물 전달은 세포 및 매트릭스 표적 부위1에도달하기 위해 조직 깊숙이 침투하는 약물의 무능력으로 인해 어려움을 유지하고 있다. 이들 조직 중 일부는 조직 내에서 높은 음전하 고정 전하 밀도(FCD)2를 생성하고 대부분의 거대 분자3,,4의전달을 위한 장벽역할을 하는 조밀하게 포장된 음전하 아그레칸으로 구성된다. 그러나, 양전하 약물 운반선의 도움으로, 이러한 음전하 조직 장벽은 실제로 지속적인 약물전달을위한 정전기 전하 상호작용을 통해 약물 창고로 변환될 수 있다1,5,,6,,7(도 1).
그림 1: CPC의 충전 기반 연골 전달. 무릎 관절 공간에 CPC의 관절 내 주입. 양전하 CPC와 음전하 아그레칸 그룹 간의 정전기 상호 작용은 연골을 통해 신속하고 완전한 깊이 침투를 가능하게 합니다. 이 그림은 Vedadghavami 외4에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
최근에는 단길이 의 양이온 펩티드 캐리어(CC)가 음전하 연골4로전달하기 위해 더 큰 크기의 치료제를 운반할 수 있는 작은 양이온 영역을 만드는 것을 목표로 설계되었다. 골관절염(OA)10과같은만연성8,9 및 퇴행성 질환을 치료하기 위한 연골에 효과적인 약물 전달을 위해서는, 약물의 치료 농도가 조직 내 깊숙이 침투하는 것이 중요하며, 여기서 대부분의 연골세포(chondrocytes)가 놓여 있다.11 몇몇 잠재적인 질병 수정 약유효하더라도, 이들이 효과적으로 연골을 표적으로 할 수 없기 때문에 아무도 FDA 승인을 얻지 못했습니다12,,13. 따라서, 치료 반응을 유도하는 약물의 효과를 예측하기 위해서는 약물 운반선의 수송 성질에 대한 평가가 필요하다. 여기서, 우리는 CPC4의평형 섭취량, 침투 깊이 및 비 평형 확산 속도를 평가하기 위해 활용할 수있는 세 가지 별도의 실험을 설계했습니다.
최적의 치료 반응을 제공할 수 있는 연골 내에 충분한 약물 농도가 있는지 확인하기 위해, 섭취 실험은 연골4에서평형 CPC 농도를 정량화하도록 설계되었다. 이 설계에서는 연골과 주변 목욕 사이의 평형에 따라 연골 내부의 총 솔직량(매트릭스에 결합되거나 프리)을 사용하여 결정할 수 있다. 이 비율은 연골 내부의 솔틸테 농도를 평형 욕조의 농도로 정상화하여 계산됩니다. 원칙적으로 연골을 통한 확산이 전하 상호 작용에 의해 지원되지 않는 중성 솔루트는 1 미만의 섭취 비율을 가질 것입니다. 반대로, 정전기 상호 작용을 통해 운송이 향상된 양이온 솔루트는 1보다 큰 섭취 비율을 보여줍니다. 그러나 CPC와 마찬가지로 최적의 양전하를 사용하면 훨씬 더 높은 흡기 비율(300보다 큰)4를초래할 수 있습니다.
연골 내의 높은 약물 농도는 치료 적 이점을 달성하는 데 중요하지만, 연골의 전체 두께를 통해 약물확산도 중요합니다. 따라서, 단백질과 세포 표적 부위에 도달할 수 있도록 약물이 연골 깊숙이 도달하도록 침투깊이를 보여주는 연구가 요구되어 보다 효과적인 치료법을 제공한다. 이 실험은 연골을 통해 솔틸테의 단방향 확산을 평가하도록 설계되었으며, 생체 내에서 관절 내 주입에 이어 연골으로 약물의 확산을 시뮬레이션합니다. 공초점 현미경 검사를 이용한 형광 화상 진찰은 연골으로 침투의 깊이의 평가를 허용합니다. 순 입자 충전은 심층 약물이 매트릭스를 통해 확산될 수 있는 방법을 조정하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 조직 FCD에 기초한 최적의 순 전하는 양이온 입자와 음이온 조직 매트릭스 사이의 약한 가역적 결합 상호 작용을 허용하기 위해 요구된다. 이는 입자가 매트릭스에서 분리할 수 있지만 조직에서 다른 매트릭스 결합 부위에 더 깊이 결합할 수 있도록 모든 상호 작용이 충분히 약하다는 것을의미한다. 반대로, 너무 강한 매트릭스 결합으로 인해 연골의 피상 영역에서 초기 결합 부위에서 입자의 분리를 방지하므로 입자의 과도한 양성 순 전하가 확산쪽으로 해로울 수 있습니다. 이것은 표적 사이트의 대다수가 조직11내 깊은 거짓말로 불충분 한 생물학적 반응을 초래할 것이다.
결합 상호 작용의 강도를 더욱 정량화하기 위해 연골을 통한 약물 확산 률 분석이 유리하다. 비 평형 확산 연구는 다른 솔루트 사이의 실시간 확산 속도의 비교를 허용합니다. 약물이 연골의 피상적, 중간 및 깊은 영역을 통해 확산됨에 따라 결합 상호 작용의 존재는 확산 속도를 크게 변경할 수 있습니다. 결합 상호 작용이 약물과 연골 매트릭스 사이에 존재하는 경우, 효과적인 확산성 (DEFF)로정의됩니다. 이 경우, 일단 모든 결합 부위가 점유되면 약물의 확산 속도는 정상 상태 확산 (DSS)에의해 지배됩니다. 다른 솔루트의 DEFF 간의 비교는 매트릭스와 솔루트의 상대적 결합 강도를 결정합니다. 주어진 솔루트의 경우, DEFF와 DSS가 동일한 크기의 순서 내에 있는 경우 확산 시 약물과 매트릭스 사이에 최소한의 결합이 존재한다는 것을 의미한다. 그러나 DEFF가 DSS보다큰 경우 행렬에 대한 입자의 실질적인 결합이 존재합니다.
설계된 실험은 연골을 통한 용성 수송의 특성화를 개별적으로 허용하지만, 최적으로 충전된 약물 운반체를 설계하기 위해서는 모든 결과를 포함하는 전체적인 분석이 필요하다. 전하 상호 작용의 약하고 가역적 특성은 입자 확산 속도를 제어하고 연골을 통해 높은 평형 섭취와 빠른 전체 깊이 침투를 허용합니다. 평형 섭정 섭취 실험을 통해 비평형 확산 률 연구를 사용하여 확인할 수 있는 전하 상호 작용의 결과로 높은 섭취량을 보이는 운반체를 찾아야 합니다. 그러나 이러한 결합 상호 작용은 연골을 통해 솔ute의 전체 두께 침투를 허용하기 위해 자연에서 약하고 뒤집을 수 있어야합니다. 이상적인 약물 운반대는 섭취와 높은 연골 약물 농도에 충분한 결합을 가능하게 하는 최적의 전하를 가지고 있지만, 전체 두께 확산을 방해하기에는 너무 강하지않다 4. 제시된 실험은 약물 운반체를 표적으로 하는 충전 기지를 둔 조직을 위한 디자인 특성에 도움이 될 것입니다. 이러한 프로토콜은 연골4를통한 CPC 수송을 특성화하는 데 사용되었지만, 이들은 연골 및 기타 음전하 조직을 통해 다양한 약물 및 약물 운반기에적용될 수 있다.
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Protocol
대학 승인은 죽은 조직으로 실험을 수행하기위한 얻어졌다. 소 관절은 도살장에서 상업적으로 얻어졌다.
1. 연골 절제 추출
- 메스 (#10 블레이드)를 사용하여 지방, 근육, 인대, 힘줄 및 기타 모든 결합 조직을 제거하여 소 무릎 관절의 여성나무 손아 귀리 홈에서 연골을 노출시하십시오.
- 3mm 와 6mm 진피 펀치를 사용하여 연골에 수직 펀치를 만들어 원통형 플러그를 추출합니다. 즉시 1% v/v 항생제 항마이코틱으로 보충된 1x 인산완충식염(PBS)의 500 μL을 포함하는 48웰 플레이트의 개별 우물에 플러그를 즉시 놓습니다.
- 연골 플러그의 피상적 측면을 슬라이스기구(도 2)에서우물에 아래로 향하게 놓습니다. 면도날을 사용하여 슬라이스 기구의 표면을 따라 플러그를 슬라이스하여 피상 영역을 포함하는 1mm 두께의 연골 엑스플랜트를 얻습니다. 각 연골 플러그에 대해 반복합니다.
- -20°C에서 프로테아제 억제제(PBS-PI, 50mL 1x PBS당 1PI 미니 태블릿)로 보충된 1x PBS의 500 μL을 포함하는 폴리프로필렌 튜브에 개별적으로 저장합니다.
- 다음 의 각 수송 실험을 수행하기 전에, 37°C 수조에서 30분 동안 익스플랜트 함유 바이알을 해동한다.
그림 2: 사용자 정의 된 슬라이싱 기구. 직경 3mm 및 6mm의 연골 연골을 슬라이스하는 데 사용되는 스테인레스 스틸 슬라이스 기구의 설계 파라미터. 다양한 두께의 플라스틱 인서트가 슬라이스 된 각종의 두께를 조정하기 위해 우물 내부에 배치되었습니다. 스테인레스 스틸 원통형 핀 & 1mm 직경은 설비에서 해장을 밀어내는 데 사용되었습니다. 모든 숫자 값은 mm.에 표시됩니다.
2. 연골에서 CPC의 평형 섭취
- 부드럽게 연골 이출 (3mm 다이아 X 1mm 두께.) 섬세한 작업 닦아 와 함께 여분의 1x PBS를 제거 합니다. 균형을 사용하여 각 축출물의 젖은 무게를 빠르게 기록한 다음 즉시 1x PBS 욕조에 배치하여 탈수를 방지합니다.
- 1x PBS-PI로 형광 라벨이 부착된 CPC30 μM 솔루션(축출당 300μL)을 준비합니다. RNase 가 없는 폴리프로필렌 튜브를 사용하여 재구성하십시오.
- 96웰 플레이트에서 각 30 μM CPC 용액의 파이펫 300 μL을 별도의 우물로 넣습니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트 가장자리 근처의 우물을 사용하지 마십시오. Using a spatula, transfer each explant to the solution containing wells.
- 주변 우물을 1x PBS 300 μL로 채우고 우물판을 뚜껑으로 덮습니다. 증발을 최소화하기 위해 유연한 필름으로 플레이트의 가장자리를 밀봉합니다.
- 37°C 인큐베이터 내부에 플레이트 셰이커를 놓아 입자 침전을 제한합니다. 연골에서 CC의 평형 upup을 허용하기 위해 부드러운 회전 (15mm 궤도와 50 rpm) 아래 24 시간 동안 배양(그림 3).
- CPC 농도에 형광의 상관 관계에 대한 표준 곡선 생성
- 폴리프로필렌 튜브의 PBS-PI 1x에서 30 μM - 0 μM(10 2배 희석)에서 CPC 솔루션의 직렬 희석을 준비합니다. 각 희석의 최소 500 μL이 있는지 확인합니다.
- 검은 색 96 웰 플레이트에 연속 우물에 각 희석200 μL을 추가합니다. 샘플 크기를 늘리기 위해 다른 행에서 복제합니다.
- 플레이트 판독기를 사용하여 형광 라벨의 내분 및 방출 파장에서 플레이트 판독기를 사용하여 각 시료의 형광 판독값을 얻을 수 있습니다.
- 형광 판독값 과 CPC 농도를 플롯하고 곡선의 선형 부분에 대한 방정식을 도출한다.
참고: 형광 판독값의 가변성을 제한하려면 표준 곡선을 생성하기 전에 샘플 플레이트와 동일한 조건하에서 CPC 스톡 솔루션을 배양합니다.
- 24 시간 의 인큐베이션 후, 별도의 폴리 프로필렌 튜브에서 각 우물에서 평형 목욕을 수집합니다.
- 각 용액의 200 μL을 검은 색 96웰 플레이트의 별도의 우물로 옮기습니다. 표준 곡선과 동일한 형광 설정 하에서 각 샘플의 형광 판독값을 가져옵니다. 필요한 경우 샘플을 1x PBS-PI로 희석하여 판독값이 표준 곡선의 선형 부분 내에 속하는지 확인합니다.
그림 3: 평형 섭정 주의 실험의 회로도. 연골 이질(3mm dia. x 1mm 두께)은 형광 태그CPC 용액을 함유한 96웰 플레이트에 개인 우물에 배치하였다. 24시간 후 CPC는 연골에 의해 추월되어 주변 목욕의 형광을 줄였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 연골에서 CPC의 침투 깊이
- 1x PBS-PI로 형광 라벨이 부착된 CPC30 μM 솔루션(축출당 300μL)을 준비합니다. RNase 가 없는 폴리프로필렌 튜브를 사용하여 재구성하십시오.
- 메스를 사용하여 연골 이출(직경 6mm x 1mm 두께)을 반디스크로 절단합니다. 절단하는 동안 1 x PBS-PI의 층으로 소비 를 수분을 유지합니다.
- 에폭시(도4, 도 5)를사용하여 맞춤형 1차원 수송챔버의 한 웰의 중간에 반 디스크를 붙이게 한다. 에폭시가 해의 둘레(곡선) 측에 적용되도록 한다. 연골의 확산 표면적과의 접촉을 방지하고 절제의 피상적 측면의 메모를 만들기 위해 우물에서 과도한 접착제를 제거합니다.
- 1x PBS-PI의 80 μL을 각축의 양쪽에 추가합니다. 액체를 각성의 한쪽에서 위아래로 피펫하여 다른 쪽으로 누출을 확인합니다. 누출이 발생하면 필요에 따라 에폭시를 절제하고 적용하십시오.
- 연골(업스트림)의 표면을 마주보고 있는 측면에서 1x PBS-PI를 30 μM CPC 용액의 80 μL로 교체한다. 연골(다운스트림)의 깊은 영역을 마주보고 측면에 1x PBS-PI의 80 μL을 유지합니다.
- 조심스럽게 커버 가능한 컨테이너에 수송 챔버를 배치합니다. 용기의 증발을 피하기 위해 1층 PBS로 용기의 베이스를 덮습니다. 업스트림 챔버와 다운스트림 챔버의 솔루션 간에 직접 접촉이 없는지 확인합니다.
- 입자 침전을 제한하기 위해 지붕이 덮인 용기를 플레이트 셰이커에 놓습니다. 부드러운 회전 아래 실온에서 4 또는 24 시간 (15mm 궤도50 rpm)에 대한 배양.
- 인큐베이션 후, 챔버에서 엑아공장을 제거하고 각성의 중심에서 ~100 μm 슬라이스를 잘라냅니다.
참고: 이 단면은 연골의 피상적, 중간 및 깊은 영역을 포함합니다. - 슬라이스를 유리 슬라이드와 커버슬립 사이에 놓습니다. 1x PBS-PI 레이어로 슬라이스를 수분처리합니다.
- 10배율에서, 슬라이스의 전체 두께를 통해 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지의 z 스택을 얻을 수 있습니다.
- ImageJ를 사용하여 z 스택 내의 이미지의 평균 강도를 투영하여 연골에서 CPC의 침투 깊이를 결정합니다.
- 파일을 클릭하여 이미지 스택을 엽니다 | 열립니다.
- 작업 표시줄에서'이미지'를클릭하고 이미지를 클릭 | 스택 | 드롭다운 메뉴에서 Z 프로젝트.
- 1에서 마지막 슬라이스로 슬라이스 숫자를 입력합니다. 투영 유형에서'평균 강도'를 선택합니다. 'OK.'를 클릭합니다.OK
그림 4: 사용자 정의 설계된 1-D 전송 챔버. 6 개의 개별 우물PMMA 1D 수송 챔버의 설계 매개 변수. 모든 숫자 값은 mm.에 표시됩니다.
그림 5: 침투 연구의 깊이의 회로도. 연골 이출(직경 6mm x 1mm 두께)은 반으로 절단되어 1D 확산 수송 우물의 중앙에 고정하였다. 형광 태그 CPC 용액은 연골의 피상 영역 (SZ)과 접촉하여 우물의 측면에 첨가되었다. 1x PBS-PI는 연골의 깊은 영역(DZ)과 접촉하여 우물의 측면에 첨가하였다. 확산 후 연골의 단면(3mm x 1mm)은 공초점 현미경 을 사용하여 이미지화되었다. 이 수치는 Vedadghavami 외4 및 Bajpayee 등에서 수정되었습니다.3이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 연골에서 CC의 비 평형 확산 속도
- 맞춤형 수송챔버(그림6)의두 반쪽을 함께 가져와 챔버를 조립하고 닫습니다. 와셔, 너트 및 볼트를 사용하여 렌치로 챔버를 단단히 닫습니다.
참고: 형광 수치를 방해하지 않도록 운송 챔버는 반투명해야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 수송챔버는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)로 만들어집니다. - 챔버 벽에 CC의 비특이적 결합을 방지하기 위해 1x PBS (각 챔버당 2 mL)에 0.5 % w /v 비지방 소 우유 용액을 15 분 동안 챔버의 내부 공간을 코팅합니다. 그런 다음 챔버를 1x PBS(각 챔버에 대해 2mL)로 헹구는 다.
- 맞춤 설계된 슬라이스 기구(도2)와면도날을 사용하여 6mm 직경의 연골 박리(횡단 평면)를 피상 영역을 포함하는 500-800 μm 두께로 슬라이스합니다. 1배 PBS로 절제된 수분을 유지하십시오.
- 해머 구동 및 진피 펀치를 사용하여 그림 7에표시된 대로 고무 시트에서 개스킷을 만듭니다.
- 각 반 수송 챔버를 조립하여 대형 고무 개스킷 1개, PMMA 인서트 1개, 작은 고무 개스킷 1개를 각각 포함합니다. 상류 챔버를 향한 피상 지대를 가진 플라스틱 인서서의 우물에 익스플을 놓습니다. 두 반쪽을 함께 샌드위치하여 조립을 완료하고 렌치(그림7)를사용하여 단단히 나사를 나사로 고정합니다.
- 상류 챔버를 1x PBS-PI의 2mL로 채우고 상류 챔버에서 유체가 누출되는 다운스트림 챔버를 관찰한다. 누출이 있는 경우 챔버를 다시 조립하여 개스킷 위치와 나사의 압박감을 조정합니다. 누출이 없는 경우 다운스트림 챔버를 2mL 1x PBS-PI로 채우면 됩니다.
- 위류 챔버에 미니 스터드 바를 추가하고 챔버를 교반 판에 놓습니다. 분광계에서 레이저가 다운스트림 챔버의 중심을 향해 초점을 맞출 수 있도록 챔버를 정렬합니다. 다운스트림 챔버 뒤에 분광계의 신호 수신기 부분을 놓습니다(도8).
참고: 분광계의 레이저와 수신기에는 형광으로 표시된 단백질로부터 신호를 흥분, 방출 및 전송하는 적절한 필터가 장착되어 있어야 합니다. 형광 신호의 간섭을 피하기 위해 실험 중에 블랙 박스를 사용하여 광으로부터 운송 챔버를 보호하십시오. 증발을 피하기 위해 유연한 필름으로 챔버 상단의 개구부를 밀봉하는 것이 좋습니다. - 실시간 다운스트림 형광 방출 판독값을 수집하고 최소 5분 동안 안정적인 신호를 보장합니다.
참고: 다운스트림 챔버의 알리쿼트(Aliquots)는 맞춤형 분광광계 또는 반투명 수송챔버를 사용할 수 없는 경우 플레이트 리더기를 사용하여 형광을 획득하고 평가할 수 있다. - 파이펫은 상류 챔버 내부에 3 μM의 최종 농도를 보장하기 위해 상류 챔버에 형광 태그 CPC의 주식 용액의 미리 계산 된 볼륨. 다운스트림 형광 신호를 관찰하고 경유 수송이 경사면에서 꾸준한 증가에 도달 할 수 있습니다.
참고: 두꺼운 연골 이절은 정상 상태에 도달하는 데 시간이 더 오래 필요합니다. - 정상 상태에 도달하면 상류 챔버에서 20 μL을 가져 와서 다운스트림 챔버 ("스파이크 테스트")에 추가하십시오.
참고: 하류 형광의 스파이크가 관찰됩니다. 이것은 형광 측정값과 CPC 농도 사이 상관관계를 허용할 것입니다. - 실시간 다운스트림 형광 수치를 수집합니다.
그림 6: 맞춤형 비평형 확산 수송챔버. PMMA 비 평형 확산 수송 챔버의 설계 매개 변수. 형광 수치를 방해하지 않도록 챔버는 반투명해야합니다. 전체 수송 챔버는 표시된 설비의 두 개의 동일한 반으로 구성되었다. 두 원통형 스테인레스 스틸 핀 (~ 2.94 mm 직경, ~ 18mm 길이)은 챔버의 반쪽의 정렬 및 완전한 폐쇄를 보장하기 위해 필요했다. 6-32 스레드 나사에 대한 4개의 동일한 슬롯이 나사 꽉 조립을 위해 챔버의 각 구석에 만들어졌습니다. 모든 수치 값은 밀리미터단위로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 비평형 확산 수송챔버의 조립. (A)블랙 PMMA 인서트와(B)크고 작은 고무 개스킷의 설계 파라미터. 고무 개스킷의 두께는 챔버의 단단한 폐쇄를 보장하기 위해 조정되었다. 모든 수치 값은 mm.(C)혈중으로 표시되어 연골 이외에도 수송 챔버의 두 반쪽에 대한 조립 순서를 중앙에 배치한다. SZ는 상류 챔버를 향하고 있던 연골의 피상 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 비평형 확산 실험의 회로도. 연골 경전(직경 6mm x 1mm 두께)은 상류 챔버를 향한 피상표면을 가진 수송실의 중앙에 배치되었다. 챔버의 상류 측면은 모두 1x PBS-PI로 채워졌고 미니 교반 바를 사용하여 혼합되었습니다. 형광 측정값을 수집하기 위해 다운스트림 챔버를 향해 레이저를 가리키면 형광 태그가 지정된 CPC 용액이 업스트림 챔버에 추가되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Representative Results
연골에 의한 CPC의 평형 흡수에 따라, 조직에 의해 솔루트가 흡수되면 목욕 형광이 감소합니다. 그러나 최종 목욕의 형광 값이 초기와 유사한 상태로 유지되면 최소한의 솔루트 섭취량이 없음을 나타냅니다. 솔루트 섭취량의 또 다른 확인은 조직이 형광염의 색상으로 눈에 띄게 색을 변경한 경우입니다. 연골에서 솔틸의 정량적 섭취는 형광 값이 표준 곡선을 사용하여 농도로 변환된 후 섭취 비(RU)를사용하여 결정되었다. 초기 목욕농도(CBath,i)와평형 목욕 농도(CBath)를사용하여 연골(C연골)내부의 용성 농도는 V배스=300 μL과 같은 것으로 계산하였다.
C연골과 C배스를사용하여, 아래 방정식을 사용하여 섭취 비율을 결정하였다.
값 >>1은 충전 상호 작용으로 인한 향상된 섭취량을 나타내고 값 & 1은 낮은 섭취량을 나타냅니다. 예를 들어, Neutravidin (60 kDa, pI 7)과 같은 더 큰 중성 솔루트는 연골 매트릭스1을가진 비질 방해로 인해 RU<1을 보였으며, 더 작고 중성 솔루트는 연골으로 확산되어 연골으로 확산될 수 있기 때문에 RU~1을 보여줄 것으로 예상됩니다. 반면, 노이트라비딘의 양전하 대응인 아비딘(pI 10.5)은 연골1에서R U~180을 보였다.U 또한 소형 CPC(~2.5~4kDa)는 최대U 4004RU를 표시합니다.4 도 9에도시된 바와 같이, 섭취량 비율은 전하 의존응답4를나타냈다.
그림 9: 연골에서 CPC의 평형 섭취의 대표적인 결과. 다양한 순충전(+8, +14 및 +20)과 연골의 각 섭취량 비율에 따르면 충전이 증가함에 따라 섭취량이 모노톤으로 증가하지 않는 것으로 나타났습니다. 이 그림은 Vedadghavami 등에서 수정되었습니다.4이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
평형에 도달한 후 목욕의 형광이 증가한 경우, 이는 형광태그솔루트의 초기 목욕 농도가 너무 높다는 것을 나타낸다. 이로 인해 배기가스가 플레이트 판독기를 통해 여기를 보낸 후 용액 내에 갇히게 됩니다. 이 문제를 해결하기 위해 초기 목욕 농도를 낮춥춥시다.
공초점 이미징에 이어, 각 이미지의 스택은 연골의 다른 층에서 형광 태그 CPC의 침투 깊이를 보여주는 각 이미지와 함께 생성되었다. 연골 절제의 중심에서 얻은 이미지는 각성의 두께 전반에 걸쳐 다른 이미지에 비해 가장 먼 침투 깊이를 나타냈다. ImageJ와 같은 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택이 오버레이되어 CPC 침투의 평균 강도를 표시하는 하나의 이미지를 생성했습니다. 이러한 오버레이 이미지는 다양한 충전 된 약물 운반대 사이의 침투의 전반적인 깊이의 최고의 비교를 제공했다. 조직 내C에 대한 전하 의존반응이관찰되었다(도 10). 대형 중화 운반체(예를 들어, Neutravidin)는 매트릭스1과의결합을 유도하기 위해 전하 상호 작용을 사용할 수 없기 때문에 피상 지대보다 훨씬 더 멀리 침투하지 않습니다. 유사하게, 양전하가 너무 높으면 피상지대(CPC+20에 의해 도시된 바와 같이 24시간 후에도)4,그러나, 이는 캐리어가 매트릭스에 너무 강하게 결합된 결과입니다. 초기 대상에서 바인딩을 해제할 수 없습니다. 최적으로 충전된 약물 운반선은, 그러나, 정전기 상호 작용의 약하고 가역적인 특성을 이용할 수 있기 때문에 연골의 깊은 영역으로 관통할 수 있을 것이다 (CPC+14에 의해 도시된 대로)4. 이를 통해 캐리어가 초기 표적에 결합하고, 결합을 해제하여 매트릭스를 통해 더 깊게 이동한 다음, 조직 내부의 표적에 다시 결합할 수 있습니다. 예를 들어, 아비딘(~7nm 직경, 66kDa, pI 10.5) 결합은 150μM의 해리상수(KD)를 가지며, 이는 전체 두께 침투1에필요한 가역적 결합을 가능하게 하기에 충분히 약한 것으로 여겨졌다.D 약한 결합에도 불구하고, 아비딘은 음전하 GAGs (결합 밀도 NT = 2900 μM)1의고밀도의 존재로 인해 연골에서 높은 유지 및 섭취를 보였다. 또한 CPC+8에 의해 도시된 바와 같이 전체 두께 침투율은 4시간 이내에 표시되었으며 CPC+14는 전체 깊이4에도달하기 위해 24h가 필요했습니다. 따라서, 여러 시간 점은 효과적으로 관통 조직 두께에서 다른 솔출테의 속도를 비교하기 위해 선택되어야한다. 침투 깊이의 보다 정량적 이해를 위해, 조직의 두께를 따라 솔장의 상대적 강도는 ImageJ를 사용하여 얻을 수 있다.
그림 10: 연골 침투 연구의 깊이에서 대표적인 결과. 다양한 순 전하(+8, +14 및 +20)와 연골을 통한 침투 깊이의 CPC는 CPC+8 및 CPC+14가 볼 수 있듯이 약한 가역적 결합을 드러냈습니다. 그러나 CPC +20에 대해 볼 수 있듯이 너무 강한 바인딩은 전체 두께 침투를 방해했습니다. 이 그림은 Vedadghavami 등에서 수정되었습니다.4이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이미징 중 연골 내부에서 형광 신호가 관찰되지 않으면 두 가지 문제가 존재할 수 있습니다. 확산을 위한 표면적 중 하나는 에폭시에 의해 차단되었거나, 초기 목욕 농도가 너무 낮아형 신호를 생성하지 못했다. 이러한 문제를 해결하려면 연골 표면에서 과도한 에폭시를 제거하고 솔직 농도를 증가시면 됩니다.
비평형 확산 수송 실험은 도 11에도시된 바와 같이 곡선을 초래하였다. 곡선의 초기 부분은 솔ute 매트릭스 바인딩 상호 작용이 수행될 때 연골을 통한 용이성 확산을 나타냅니다. 캐리어의 충전이 증가함에 따라 더 강한 매트릭스 바인딩이 발생하여 솔루트가 다운스트림 챔버에 도달하는 데 시간이 더 길어집니다. 연골의 깊이를 관통하고 하류 챔버에 도달하면 시간이 지남에 따라 형광 판독값이 증가함에 따라 곡선의 경사가 증가하는 것을 관찰했습니다. 곡선의 이 두 번째 부분은 꾸준한 경사에 도달하여 안정된 상태 확산을 나타냅니다. 상선선은 정상 상태 경사면에 그려져 x-intercept로 표시된 정상 상태 확산(θLag)에도달하는 데 걸리는 시간을 결정했습니다. 효과적인 확산성(DEFF)은연골에 존재하는 결합 상호 작용이 있는 동안 CPC의 확산 속도는 다음과 같이 θLag 및 절제 두께(L)를 사용하여 계산하였다.
상류에서 하류 챔버로 용액의 20 μL을 전송한 후 형광의 스파이크가 관찰되었습니다. 그 결과 안정화형 형광 강도가 농도와 상관관계를 위해 사용되었다. 다운스트림(CD)의CC 농도는 상류 농도(CU)로정규화된 다음 시간에 대해 플롯되었다. 이 곡선의 경사는 아래와 같이 연골내의 모든 결합 부위가 점유될 때 정상 상태 확산 속도를 추정하는 데 사용되었습니다(DSS). 이 값에는 분할 계수가 포함되었습니다. 여기서, φ, VD 및 A는 연골 다공성을 나타내며(~0.8), 다운스트림 챔버 부피(2mL) 및 연골의 단면 면적(0.1257 cm2)을각각 나타낸다. CPC에 대한 비평형 전송 실험에서 계산된 대표적인 DEFF 및 DSS 값은 표 1에서찾을 수 있다.
그림 11: 연골을 통한 비평형 확산 연구의 대표적인 결과. CPC+8 확산 곡선은, 다운스트림 농도(CD)로플롯되어 시간에 대해 상류 농도(CU)로정규화된다. 상수 상태 경사(파란색)에 그려진 접선선은 DEFF를계산하는 데 사용했던 θLag에서x축을 교차합니다. 접선의 경사는 DSS를계산하는 데 사용되었습니다. 스파이크 테스트(gray)는 다운스트림 농도를 정상화하는 데 사용되는 20μL CPC 용액을 상류에서 다운스트림으로 이송한 후 다운스트림 챔버의 안정화 된 농도를 나타낸다. 이 그림은 Vedadghavami 등에서 수정되었습니다.4이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
상류 챔버에 형광 태그 펩타이드를 첨가하기 전에 하류 형광이 안정화되지 못하면, 이전 실험에서 벽에 붙어 있는 용이성 잔류가 있을 가능성이 높다. 이 경우 챔버를 분해하고 비누로 씻고 초음파 처리하십시오. 상류 챔버에 형광 태그 펩타이드를 첨가한 직후 하류 형광이 증가하는 경우 누출이 존재한다는 것을 나타낼 수 있다. 이를 위해서는 운송 챔버의 재조립과 누출에 대한 재테스트가 필요합니다. 하류 형광 신호가 정상 상태 증가와 는 반대로 고원에 도달하면, 챔버의 벽에 집착하는 솔테에 의해 발생할 가능성이 있는 상류 챔버의 농도 손실이 발생할 수 있음을 나타낸다. 상류 챔버에 0.005 % w /v 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하면 고집을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
| Cpc | DEFF(cm 2/s) | DSS(cm 2/s) |
| CPC+8 | 1.7 ± 0.4 x 10-7 | 5.8 ± 0.0 x 10-5 |
| CPC+14 | 9.8 ± 0.2 x 10-8 | 2.6 ± 1.2 x 10-5 |
| CPC+20 | 4.7 ± 0.1 x 10-8 | 1.4 ± 0.9 x 10-5 |
표 1: 연골을 통한 CPC 전송을 위한 대표 DEFF 및 DSS 값입니다. 이 표는 Vedadghavami 외4에서4 수정되었습니다.
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Discussion
여기에 설명된 방법 및 프로토콜은 부정적으로 충전된 조직에 표적 약물 전달 분야에 중요합니다. 이 조직에 존재하는 부정적인 충전 된 aggrecans의 높은 밀도로 인해 장벽이 생성되므로 약물이 매트릭스 내에서 깊숙이 놓여있는 세포 표적 부위에 도달하지 못하게합니다. 이러한 뛰어난 과제를 해결하기 위해, 약물은 조직 1,3,,4,,14,,15,,,,16,,117,18,,19내에서 약물의 수송 속도, 섭취 및 결합을 향상시킬 수 있는 양전하 약물 운반수단을 통합하도록 수정될 수 있다. 개발된 방법과 함께 도시된 바와 같이, 양전하 약물 운반선의 수송은 평형 섭취량, 침투 깊이 및 비평형 확산 속도를 결정하는 것이 특징일 수 있다. 우리는 성공적으로 연골 경전을 통해 전송을 평가하는 데 사용할 수있는 세 가지 별도의 실험 설정을 설계했다.
운송의 특성화가 성공하려면 절차의 중요한 단계를 따라야 합니다. 모든 솔루션에서 프로테아제 억제제(PI)를 사용하는 것은조직(20)에서단백질의 효소 소화를 방지하는 기능으로 연골을 통해 CPC의 연골 내 수송을 정확하게 특성화하는 데 중요하다. 따라서, 사용하지 않을 경우, 아그레칸 및 콜라겐과 같은 연골 매트릭스 성분은 실험 중에 주변 목욕탕으로 분해되고 분비되기 시작할 수 있다. 이렇게 하면 연골 의 FCD가 크게 낮아지므로 연골 매트릭스의 충전 기반 바인딩 부위 의 수가 줄어듭니다. 결과 조직은 더 이상 건강한 연골을 대표하지 않을 것입니다. 반대로, 제시된 실험은 OA20에서볼 수 있듯이 아그리칸 함량이 훨씬 낮은 관절염 연골을 통해 CPC의 수송을 평가하는 데 사용될 수 있다. 트립신 또는 콘드로이티나아제 ABC를 사용하여 연골 경전을 소화하고, 아그레칸 밀도를 조절하여 병든 상태에서 수송 및 약물 전달의 평가를 가능하게 한다. 이 경우, 충전 기반 결합이 손상될 수 있으며, 수소 결합 및 소수성 상호 작용과 같은 다른 유형의 상호 작용은 시너지 효과적으로 연골 결합 및유지4를향상시킬 수 있다.
연골 절제의 수분을 유지하는 것은 샘플 준비 및 실험 중에 핵심입니다. 6분 이상 공기에 노출을 통한 탈수는 관절연골(21)에돌이킬 수 없는 손상을 유발하는 것으로 나타났다. 따라서 CPC 전송에 예기치 않은 변화가 발생할 수 있습니다. 마찬가지로, CPC 목욕의 증발은 절제 탈수를 초래할 수 있습니다; 이는 유연한 필름으로 밀봉하여 방지할 수 있습니다. 그러나, 목욕 증발은 절제탈을 일으킬 뿐만 아니라 CPC 목욕 농도의 변화를 일으킬 수 있으며, 이로 인해 거짓 형광 수치의 결과. 또한 침투 깊이 연구는 얇은 단면(~100 μM)의 연골을 이미지화해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 이것은 균일 한 두께의 조각을 얻을 수 있도록 연습을 필요로하는 기술이다. 또한 비평형 확산 실험에 중요하며, 운송 챔버는 반투명하여 실시간 형광 측정을 사용자 정의 한 분광광계로 얻을 수 있습니다. 그러나, 대안으로, 다운스트림 챔버에서 알리쿼트는 플레이트 리더 또는 다른 분광표 판독기를 사용하여 형광을 획득하고 평가할 수 있다.
여기에 제시된 방법은 생체 내 약물 보존 및 장기 생물학적 효능을 더 잘 예측하기 위해 연골을 통한 약물 운반체 수송을 특성화하는 벤치 스케일 방법을 제공하기 때문에 큰 의미가 있습니다. 최근에는 다공성미디어(22)를통한 유한원지 프레임워크가 구현되었다. Arbabi 등은 마이크로 CT 이미징에서 얻은 실험 데이터와 함께 유한 원소 분석을 사용하여 음전하 조영제의 확산 률을 측정하고,연골(23,,24)의이옥사질을 측정하였다. 또한, 다중 영역, 다단계 단계 모델을 사용하여, 연골의 다른 영역에서 이옥사질의 확산 계수를 각 영역의 FCD와 함께 측정되었다. 마이크로 CT 이미징은 콘트라스트 에이전트와만 사용할 수 있지만, 당사의 실험 설정은 형광으로 표시될 수 있는 모든 약물 및 약물 운반선의 운송 특성화를 허용합니다. 그러나, Arbabi 등에서 사용하는 고급 계산 모델링은 단정한 수송 거동에 대한 보다 포괄적인 분석을 제공하고 당사의 실험 방법에 적용될 수있다(13,,24).
제시된 방법의 한계는 각 단두수송 실험에 대한 실험용 설정이 생체 내 환경을 완전히 포괄하지 않는다는 것이다. 천연 관절 내에서 발생하는 생물학적 반응과 기계적 및 동적 힘은 여기에서 시뮬레이션되지 않습니다. 이러한 힘을 통합하기 위해, 수송 챔버는 걷기 및 실행으로 활동 중에 발생하는 대류 흐름 패턴을 시뮬레이션하기 위해 피스톤으로 수정할 수 있습니다. 그러나 대류 흐름은 2배 증가할 수 있지만, 정전기 상호 작용으로 인한 섭취량은 100-400배 증가할 수 있습니다. 따라서, 여기에 제시된 실험용 설정은 충전 기반 운송 및 uptake25에대한 좋은 추정치를 제공한다. 또한, 무릎 관절은 자연적으로 활액을 함유하고 있기 때문에, 1x PBS-PI 대신 운송 실험을 위한 목욕 용액에 사용될 수 있다. 연골에서 양양이되는 운반선의 섭취는 활액에 부정적으로 충전된 카복실 그룹을 가진 히알루로난 사슬의 존재로 인해 1배 PBS에 비해 활액이 감소할 것으로 추정됩니다. 양이온 운반선은 연골의 GAGs 이외에 활액의 히알루로난 사슬과 경쟁적으로 결합할 수 있습니다. 그러나, 음전하 군의 밀도는 연골15에서음전하 카박시히알루로난 체인과 황지방 GAGs의 존재로 인해 활액에 비해 연골에서 현저히 높다. 따라서, 활액이 있는 연골의 섭취량은 PBS 1배보다 낮지만, 여전히 높은 연골 섭취를 유지할 것으로 예상된다. 생체 내에서, 아비딘은 활액16, 26의존재에 쥐와 토끼 연골 모두에서 높은 내 연골섭취를26보여 주었다. 또한, 아비딘은 토끼 전방 십자 인대 편부모델(27)에서관절 내 주입 후 최대 2주까지 연골에서 높은 섭취및 유지율을 보이고 있다.
이 시스템에서 소 연골을 사용하면 두께(~1.5-2mm)28,,29의관점에서 인간의 연골과 유사하기 때문에 연골을 통한 약물 침투를 보다 정확하게 나타낼 수 있다. 연골을 통해 솔틸의 수송은 두께에 따라 다를 수 있습니다; 약물 운반대는 훨씬 더 얇은 마우스 또는 쥐 연골을 통해 완전히 침투하기 위해 적은 결합 상호 작용을 요구할 수 있지만, 그러나 두꺼운 인간 연골1에서더 깊은 침투에서 크게 방해될 수 있다. 또한, 이러한 실험은 연골 내의 용성 수송을 특성화하도록 설계되었지만, 이러한 방법은 반월상 연골, 각막 및 눈의 유리체 유머, 및 추간판의 핵 pulposus와 같은 다른 부정적인 충전 된 조직에 수정및 적용 될 수있다. 여기에 설계된 실험의 방법론은 비품 및 수송챔버의 크기와 조직의 종에 따라 조정할 수 있기 때문에 유리하다. 이러한 방법의 영향은 광범위 하며, 마약 운반대뿐만 아니라 약물 및 약물 운반실 공수의 수송 평가를 위해 제한됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 W81XWH-17-1-0085 계약에 따라 의회 지시 의학 연구 프로그램 (CDMRP)과 국립 보건 R03 EB025903-1을 통해 미국 국방부에 의해 지원되었다. AV는 노스이스턴 대학의 공학 학장 펠로우십 대학의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 316 Stainless Steel SAE Washer | McMaster-Carr | 91950A044 | For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | Black |
| Acrylic Thick Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | 100x |
| Bovine Cartilage | Research 87 | N/A | 2-3 weeks old, femoropatellar groove |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP671-1 | |
| CPC+14 | LifeTein | LT1524 | Custom designed peptide |
| CPC+20 | LifeTein | LT1525 | Custom designed peptide |
| CPC+8 | LifeTein | LT1523 | Custom designed peptide |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Dermal Punch | MedBlades | MB5-1 | 3, 4 and 6 mm |
| Economy Plain Glass Microscope Slides | Fisherbrand | 12550A3 | |
| Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning Costar | 3595 | Clear, 96 well |
| Flexible Wrapping Film | Bemis Parafilm M Laboratory | 1337412 | |
| Gold Seal Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 6378701 | # 1.5, 18x18 mm |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2" Diameter |
| Hammer-Driven Hole Punch | McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4" Diameter |
| Laser | Chroma Technology | AT480/30m | Spectrophotometer Laser Light |
| Low-Strength Steel Hex Nut | McMaster-Carr | 90480A007 | 6-32 Thread size |
| LSM 700 Confocal Microscope | Zeiss | LSM 700 | |
| Micro Magnetic Stirring Bars | Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 mm |
| Multipurpose Neoprene Rubber Sheet | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32" Thickness |
| Non-Fat Dried Bovine Milk | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | 150 mm diameter |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| Plate Shaker | VWR | 89032-088 | |
| Protease Inhibitors | Thermo Scientific | A32953 | |
| Razor Blades | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet | Reynolds Polymer | N/A | Black transport chamber inserts |
| RTV Silicone | Loctite | 234323 | Epoxy, Non-corrosive, clear |
| Scalpel | TedPella | 549-3 | #10, #11 blades |
| Signal Receiver | Chroma Technology | ET515lp | Spectrophotometer Laser Signal Receiver |
| Snap-Cap Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22363204 | 1.5 mL |
| Spatula | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 Thread size, 1" Long |
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