Summary
להלן, אנו מתארים הליך לניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול. ההליך רלוונטי למחקרים החוקרים קשרים בין דפוסי מתילציה של גנים וגורמים התורמים מסרטן בסרטן מערכת העיכול.
Abstract
מתילציה של דנ"א היא שינוי אפיגנטי חשוב בעל משמעות ביולוגית והתמקדות תכופה בחקר הסרטן. מתילציה DNA גנום רחב הוא אמצעי שימושי כדי לספק ניתוח מדויק של מצב מתילציה של ממאירות במערכת העיכול (GI). בהתחשב השימושים התרגומיים הפוטנציאליים מרובים של ניתוח מתילציה DNA, תרגול קלינאים ואחרים חדשים מחקרים מתילציה DNA צריך להיות מסוגל להבין צעד אחר צעד איך אלה ניתוחים הגנום כולו מבוצעים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק תיאור מפורט של האופן שבו שיטה זו משמשת לזיהוי סמן ביולוגי ממאירות GI. חשוב לציין, אנו מתארים שלושה שלבים קריטיים הדרושים כדי להשיג תוצאות מדויקות במהלך ניתוח גנום רחב. ברור ותמציתי כתוב, שלוש שיטות אלה חסרים לעתים קרובות ולא מורגש אלה חדשים מחקרים אפיגנטיים. השתמשנו 48 דגימות של ממאירות GI (סרטן קיבה) כדי להדגיש כמעט איך ניתוח מתילציה DNA רחב הגנום יכול להתבצע עבור ממאירות GI.
Introduction
אפיגנטיקה מתייחסת לשינויים תורשתיים בתפקוד הגנים ללא שינוי ברצף הדנ"א1. שינויים כאלה עשויים להיות בגלל מתילציה DNA, שבו קבוצות מתיל על בסיס DNA עשוי לשנות את ביטוי הגן באמצעות שינויים באריזת כרומטין. התפתחות סרטן והתקדמות עלולה להתרחש אם השפעה זו גורמת לביטוי שונה של גנים מדכאיגידולים 2. הזדקנות ודלקת כרונית הן הגורמים לסרטן ואת הסיבות העיקריות לשינויים מתילציה DNA בבניאדם 3,4,5. כתוצאה מכך, זה מאפשר ניצול של מתילציה DNA כסמן ביולוגי באבחון סרטן, וכמטרה לטיפול ומניעה. לגילוי מוקדם ופרוגנוזה של סרטן, מתילציה DNA נמדדים בדגימות גידול,דם, שתן וצואה 6, בעוד סוכני demethylating משמשים כעת לטיפול בלוקמיה כגון תסמונת myelodysplastic7.
ניתוח מתילציה DNA רחב גנום באמצעות פלטפורמת מערך להערכה מורכבת של מתילציה DNA על לוקוס CpG בודד בגנום האנושי יכול להיות מנוצל כדי לבחון את מצב מתילציה של יותר מ 450,000 אתרי CpG ב- DNA גנומי8,9, אשר מאפשר חקר של אפיגנטיקה סרטן (ראה טבלה של חומרים). טכנולוגיות ריצוף ביסולפיט גנום שלם (WGBS) שינו את הגישות שלנו בתחוםהאפיגנטיקה 10,11. עם זאת, ישנם כמה חסרונות לטכנולוגיות במונחים של עלות משמעותית ותנאי עיבוד לניתוח אפיגנטי של מספר גדול שלדגימות 10,11. לכן, פלטפורמת המערך אפשרית יותר להערכה מורכבת של מתילציה DNA בגנום האנושי. הזמינות של גישות לניתוחי מתילציה ברחבי הגנום השתפרה בשנים האחרונות ומאפשרת לנו להרחיב את הידע שלנו כיצד מתילציה של DNA תורמת להתפתחות סרטןוהתקדמות 12. ההתקדמות האחרונה בגישות פלטפורמת microarray לספק לנו את הרציונל לניתוח מתילציה הגנום רחב לזהות חתימה אפיגנטית רומן בסרטןמערכת העיכול 13. מטרת פרוטוקול זה היא לספק תיאור מפורט של האופן שבו שיטה זו משמשת לזיהוי סמן ביולוגי ממאירות GI.
Protocol
כל ההליכים הבאים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסדות. המחקר אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית בבית החולים Shizuoka של אוניברסיטת ג'ונטנדו, והסכמה מדעת בכתב נדחתה בגלל העיצוב הרטרוספקטיבי.
1. שטיפת השקופיות
- הכן 10 מיקרומטר של מקטעי פרפין-מוטבעים (FFPE) לא נגועים בפרלין קבוע.
- מקם שקופיות במחזיק שקופיות מזכוכית: השתמש בכ- 3-5 השקופיות חתונות הגדולות ביותר אלא אם כן הרקמה מינימלית ויש צורך בשקופיות נוספות.
- מלא את מחזיק השקופיות ב- xylene וודא שכל הרקמה בשקופית שקועה. אפשר לשבת במשך 15 דקות.
- לאחר 15 דקות, יוצקים את הקסילן עם השקופיות מוחזקות עם קצה פיפטה, כך השקופיות לא לנשור.
- יוצקים עוד קסילן לאותה רמה כמו קודם. אפשר לשבת עוד 15 דקות.
- לאחר 15 דקות, לשפוך את הקסילן שוב.
- מלא את מחזיק השקופית באתנול 100% (EtOH), וודא שכל הרקמה בשקופית שקועה לחלוטין. אפשר לשבת במשך 3 דקות.
- יוצקים את EtOH תוך החזקת השקופיות בזהירות. מילוי מחדש לאותה רמה עם יותר EtOH. אפשר לשבת במשך 2 דקות.
- שפוך שוב את ה- EtOH והסר את השקופית. בזהירות מניחים אותם עם הפנים כלפי מעלה על מגבת נייר נקייה לייבוש. אפשר לשבת במשך 10 דקות.
2. גירוד השקופיות
- הכן חיץ עיכול/תיזה עם 650 מ"ל של מים מטופלים diethylpyrocarbonate (DEPC), 100 מ"ל של חומצה אתילנדיאמינטית טראצטית (EDTA), 50 מ"ל של טריס הידרוכלוריד (טריס-HCL) 2 m pH 8.8, ו 200 מ"ל של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) (ראה טבלת חומרים).
- מלא צינור פוליפרופילן חד-שלבי של 1.5 מ"ל עם חיץ 80 μL של עיכול/תזה (ראה רשימת חומרים).
- שים טיפ פיפטה נקי לתוך המאגר.
- זהה רקמות סרטן של אזור הגידול המתאים ביותר עבור macrodissection על פי החלק המוכתם H&E המתאים.
הערה: אזור הגידול עבור macrodissection צריך להיות מזוהה על ידי רצוי שני פתולוגים מוסמכים. - רקמת סרטן Macrodissect מבוסס על סעיף מוכתם H&E מסומן.
- קח סכין גילוח נקי בעדינות לגרד את רקמת הסרטן את השקופית, מנסה לשמור אותו בחתיכה אחת, כך קל יותר לעבוד עם.
- קח את קצה פיפטה מתוך צינור פוליפרופילן חד-שימוש המכיל חיץ ולהשתמש בו כדי להעביר את הרקמה גרוטאות לתוך בקבוקון החיץ (ראה רשימת חומרים).
הערה: הקצה הרטוב צריך למשוך את הרקמה, מה שהופך את ההעברה לקלה יותר.
- חזור על שלב 2.5 עם שאר השקופיות.
- אחרי כל הרקמה היא בצינור פוליפרופילן חד שימוש, להשתמש בקצה כדי לוודא את הרקמה שקועה לחלוטין והוא לא דבוק לקיר של הצינור.
- הוסף 20 μL של פרוטאז סרין הקשורות subtilisin לבקבוקון בעדינות תנועה לערבב (ראה רשימת חומרים).
- מניחים את הבקבוקון בבלוק חום של 55 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות או לילה. הקפד מעט מערבולת לאחר 2 שעות.
3. טיפול ביסולפי
- השתמש 45 μL של פתרון רקמה מתעכל כמו המדגם.
- בצע את הטיפול הביסולפי באמצעות רייגנטים בערכת המרה ביסולפית בהתאם להוראות היצרן (ראה רשימת חומרים).
- הוסף 5 μL של מאגר דילול לדגימה DNA דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 15 דקות (ראה רשימת חומרים).
- בעוד הדגימות דגירה, להכין את reagent המרה bisulfite על ידי הוספת 750 μL של dH2O ו 210 μL של מאגר דילול לצינור אחד של REAGENT המרת CT (ראה רשימת חומרים). מערבבים את הצינורות על ידי מערבולת במשך 10 דקות.
- לאחר הדגירה של 15 דקות, להוסיף 100 μL של reagent המרת CT מוכן לכל מדגם ומערבבים על ידי היפוך.
- הדגירה את הדגימות בחושך ב 50 °C (60 °F) במשך 12 עד 16 שעות.
- לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות ואת המקום על הקרח במשך 10 דקות.
- הוסף 400 μL של מאגר איגוד ומערבבים כל מדגם על ידי צינור למעלה ולמטה (ראה רשימת חומרים). טען כל דגימה לתוך עמודת ספין והצב את העמודה בצינור איסוף של 2 מ"ל (ראה רשימת חומרים).
- צנטריפוגה כל מדגם במלוא המהירות (10,000 x g)במשך דקה אחת ולזרוק את הזרימה דרך.
- הוסף 200 μL של מאגר לשטוף לכל עמודה ולסובב במלוא המהירות במשך 1 דקות, השלכת זרימה דרך (ראה רשימת חומרים).
- הוסף 200 μL של מאגר desulfonation לכל עמודה ולאפשר לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות (ראה רשימת חומרים). לאחר הדגירה, לסובב את העמודים במלוא המהירות במשך 1 דקה ולהשליך את הזרימה דרך.
- הוסף 200 μL של מאגר לשטוף לכל עמודה ולסובב במלוא המהירות במשך 1 דקות (ראה רשימת חומרים).
- חזור על שלב זה פעם נוספת.
- הוסף 46 μL של dH2O לכל עמודה והצב כל עמודה בצינור פוליפרופילן סטרילי חדש של 1.5 מ"ל לשימוש יחיד (ראה רשימת חומרים). סובב כל צינור במשך 2 דקות כדי לחמק מהדנ"א.
- הסר כל עמוד ספין מצינור פוליפרופילן חד-שימושי והשליך (ראה רשימת חומרים). הדנ"א מוכן כעת לניתוח.
4. פלטפורמת מערך להערכת מתילציה של DNA בלוקוס CpG בגנום האנושי
- להעריך את איכות ה-DNA (בדיקת איכות: QC) באמצעות FFPE QC בדיקה על מכשיר הגברה וזיהוי PCR בזמן אמת, עם ניתוח נתונים הבאים שבוצעו על פי הוראות היצרנים (ראה רשימת חומרים).
הערה: דגימות עם ∆Cq פחות מה- 5.0 המומלץ מעובדותעוד יותר 14. - לנתח דגימות עם פלטפורמת מערך להערכה מורכבת של מתילציה DNA כדי להעריך את מצב מתילציה של >450,000 אתרי CpG בגנום (ראה רשימת חומרים). גיליון פרטי מוצר, גליון נתונים וקבצי מוצר עבור פלטפורמת המערך זמינים15.
הערה: ההתבצעות מתבצעת בהתאם להוראות היצרן עבור חומר FFPE14. - חשב מתילציה גבוהה ונמוכה של לוקוס בכלי ניתוח נתונים עבור פלטפורמת מערך כערך β, עם טווח שאורכו בין 0 ל- 1, בהתאמה (ראה רשימת חומרים). השתמש בתוכנה מסחרית זמינה (ראה רשימת חומרים)כדי לחשב β ערך מסחרי.
- יבא נתונים שנוצרו בפלטפורמת המערך להערכה מורכבת של פלטפורמת מתילציה של DNA לסביבת התוכנה R (R v.2.15.1) ועבד אותם באמצעות כלי לניתוח מערכימתילציה 16,17.
הערה: במפת החום, הנוצרת באמצעות כלי לניתוח נתונים, עמודות מסודרות על-ידי קיבוץ באשכולות ללא השגחה, בעוד שסדר השורות מבוסס על המשמעות ההולכת ופוחתת של סטטיסטיקת t עבור מתילציה דיפרנציאלית מלמעלה למטה. - חלק את מפת החום לקבוצות מתילציה גבוהות ונמוכה באמצעות המפריד הראשון באשכולות ללא השגחה.
הערה: עבור אימות עם PCR (qMSP) ספציפי מתילציה כמותית, בחר גנים המבוססים על ערך β גדול יותר ביחס לאיי CpG באזור האמרגן, ובשל התאמתם לעיצוב פריימר ובדיקה עבור qMSP.
5. PCR כמותי ספציפי לתיעוב (qMSP)
- השתמש בדנ"א שעבר שינוי ביסולפית מהשלב 3.3 כתבנית עבור PCR מבוסס פלואורסצנטיות בזמן אמת ב- qMSP כדי להעריך מתילציה של אזור האמרגן בכל ניתוח גנים.
- בצע qMSP באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת 96 היטב (ראה רשימת חומרים).
- בדוק את מצב מתילציה האמרגן של גן היעד על ה-DNA שונה ביסולפיט באמצעות פריימר קדימה 200 ננומטר, 200 nM פריימר הפוך, ו 80 nM בדיקות. הכן את תערובת האב עם 16.6 מ"מ (NH4)2SO4, 67 mM טריס pH 8.8, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10 nM פלואורסצין, 0.166 מ"מ של כל דלוקסינוקלאוטיד טריפוספט, ו 0.04 U/ μl של פולימראז DNA (ראה רשימת חומרים). נפח התגובה הסופי בכל באר לכל הראיה הוא 25 μL.
- בצע רכיבה על אופניים של qMSP כדלקמן: 95 °C (60 °F) במשך 5 דקות, ואחריו 55 מחזורים של 95 °C (60 °F) עבור 15 s, 60 °C (60 °F) במשך 1 דקות, ו 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות.
הערה: יש לבחור גן יעד על סמך הקריטריונים של ערכי בטא גדולים יותר, להיות קשור לאיי CpG באזור האמרגן, ולהיות מתאים לעיצוב פריימר ובדיקה עבור qMSP.
- השתמש בגנים אנושיים שטופלו במתילאז CpG (M.SssI) כבקרת מתילציה חיובית (ראה רשימת חומרים).
הערה: הכימות הסופי של מתילציה מוגדר כערך המתילציה היחסי (RMV), ומחושב כ- 2-ΔΔCt עבור כל שכפול זיהוי מתילציה בהשוואה ל- Ct הממוצע עבור β-Actin (ACTB)18. רצפי פריימר ובדיקה מוצגים בטבלה 1. Ct של 100 משמש עבור שכפולים שלא זוהו, המעניקים ערך של 2–ΔΔCt קרוב לאפס. הנוסחה הבאה משמשת: ממוצע 2–ΔΔCt (RMV) = (2–2 Ct_replicate_1 +2 –2 Ct_replicate_2 + 2–Ct_replicate_3)/318.
Representative Results
המאפיינים של 48 חולים עם סרטן קיבה בקבוצת האימונים הם כדלקמן (טבלה 2): הגיל החציוני של חולים היה 74 שנים (52-89 שנים), ואת הקוהורטה כללה 38 גברים (79.2%), ו 10 נקבות (20.8%). היו 35 חולים (72.9%) עם סרטן קיבה ראשוני ב 13 חולים (27.1%) עם סרטן קיבה קרן (סרטן קיבה ראשוני: התרחשות ראשונה של ממאירות לא גרורתית בקיבה; סרטן קיבה קרן: סרטן בבטן 2015 שהתפתח יותר מ 5 שנים לאחר כריתת קיבה דיסטלית, ללא קשר הסיבה כריתההמקורית 19). היו 23 חולים (47.9%) עם גרורות בלוטות הלימפה ו 25 חולים (52.1%) ללא. ראשית, כל 48 הדגימות (קבוצת האימונים) הועמסו לזיהוי חריגים (איור 1A). שתי דגימות העניקו שיאים שהיו גדולים משתי סטיות תקן שנעקרו מהאחרות, ודגימות אלה הוסרו (איור 1B). לכן, 46 דגימות היו מקובצים על ידי היפרמתילציה מקדם DNA. מפת החום שנוצרה חולקה לשתי קבוצות המבוססות על מתילציה גבוהה ונמוכה (איור 2). מפת חום זו מאפשרת הדמיה של 50 הבדיקות המובילות בטווח של 1,500 bp של אתר ההתחלה התמלולי (TSS) בניתוח מתילציה דיפרנציאלית. קבוצות המתילציה הגבוהות והנמוכה היו שונות בגורמים קליאופתולוגיים הקשורים לפנוטיפ ממאיר אגרסיבי. כלומר, סוג הסרטן (סרטן קיבה ראשוני: PGC) (p = 0.01, יחס סיכויים = 9.09 (1.67-50.00)) ונוכחות של גרורות בלוטות הלימפה (חיובי) (p = 0.03, יחס סיכויים = 6.82 (1.16-40.08)) התגלו כגורי חיזוי עצמאיים משמעותיים כאשר הגורמים הקליניאופתולוגיים שימשו כקובאריאטיםבניתוח רב-תכליתי (טבלה 3). לבסוף, זיהינו את הגן EPB41L320,21 (רצפי פריימר ובדיקה המוצגים בטבלה 1) כדי להיות קשור מאוד עם קודיפיקציה של קבוצת האימון לקבוצות מתילציה גבוהות ונמוכה בניתוח microarray. באמצעות qMSP, תוצאות ניתוח microarray עבור EPB41L3 בקבוצה הבדיקה (126 דגימות) אומתו. המאפיינים של החולים בקוהורטת הבדיקה מוצגים בטבלה 4. RMVs של EPB41L3 ברקמות PGC היו גבוהים משמעותית מאלה של סרטן קיבה קרן (RGC) בניתוח univariate (p = 0.01) (איור 3A). באופן דומה, RMVs בדגימות עם גרורות בלוטות הלימפה היו גבוהים באופן משמעותי מאלה ללא גרורות בלוטות הלימפה (p = 0.03) (איור 3B). בדרך זו, ניתוח גנום מתילציה DNA רחב יכול לעזור לנו לזהות גנים ספציפיים כדי לאפיין מצב קליני מסוים בחולים עם ממאירות GI.
איור 1: ערכי ביתא ב-48 דגימות (קבוצת אימונים). כל 48 הדגימות (קבוצת אימונים) נטענו ונבדקו חריגים (א). שתי דגימות היו פסגות שהיו חריגות, ואלה הוסרו (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מפת החום המתקבלת. 46 הדגימות הנותרות היו מקובצות על ידי היפרמתילציה של מקדם הדנ"א. מפת החום חולקה לקבוצות מתילציה גבוהות ונמוכה. מפת חום זו מאפשרת הדמיה של 50 הבדיקות המובילות בטווח של 1,500 bp של אתר ההתחלה התמלולי (TSS) בניתוח מתילציה דיפרנציאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ערכי מתילציה יחסיים (RMVs) עבור EPB41L3 בסרטן קיבה ראשוני (PGC) לעומת סרטן קיבה תריס (RGC), ובמקרי גרורות עם וללא גרורות בלוטות הלימפה. התוצאות של ניתוח microarray עבור EPB41L3 בקבוצה הבדיקה (126 דגימות) אומתו באמצעות qMSP. (A) בניתוח univariate, RMVs של EPB41L3 ברקמות PGC היו גבוהים באופן משמעותי מאלה של RGC (p = 0.01). (B) באופן דומה, RMVs בדגימות עם גרורות בלוטות הלימפה היו גבוהים באופן משמעותי מאשר אלה ללא גרורות בלוטות הלימפה (p = 0.03). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ג'ין | קדימה 5' - 3' | הפוך 5' - 3' | בדיקה |
| בי-אטין | תג GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA קאה טאה קאה אקא קאה אט CAC | \56-FAM\ TGT GGG GTG \זן\ GTG איסור פרסום GTT תג GTT \3IABkFQ\ |
| EPB41L3 | GGG אטה GTG GGG TTG ACG C | אטה AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |
טבלה 1: רצפי פריימר ובדיקה.
| גורמים קליאופתולוגיים | משתנים | |
| גיל | 74 (52 - 89) * | |
| מין | זכר / נקבה | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| סוג | PGC / RGC | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| גרורות בלוטות הלימפה | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: סרטן קיבה ראשוני, RGC: סרטן קיבה קרן | ||
| * חציון (מינימום מקסימום) | ||
טבלה 2: המאפיינים של 48 חולים עם סרטן קיבה בקבוצה אימון.
| ערך P | יחס יחסי זכייה | מרווח בר-סמך של 95% | |
| סוג (PGC) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| גרורות בלוטות הלימפה (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| PGC: סרטן קיבה ראשוני | |||
טבלה 3: גורמי חיזוי עבור קבוצת המתילציה הגבוהה (אשכול B).
| גורמים קליאופתולוגיים | משתנים | |
| גיל | 71 (33 - 86) * | |
| מין | זכר / נקבה | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| סוג | PGC / RGC | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| גרורות בלוטות הלימפה | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: סרטן קיבה ראשוני, RGC: סרטן קיבה קרן | ||
| * חציון (מינימום מקסימום) | ||
טבלה 4: המאפיינים של 126 חולים עם סרטן קיבה בקבוצה הבדיקה.
Discussion
ישנם שלושה שלבים קריטיים בהשגת תוצאות מדויקות מניתוח גנום מתילציה DNA. הראשון הוא macrodissection של אזור הגידול על ידי רצוי שני פתולוגים מוסמכים המבוססים על קטעים מוכתמים H&E נציג. macrodissection לא מדויק יכול לגרום לזיהום עם רקמות לא סרטניות סמוכות, אשר מביא תוצאות לא אמינות; לכן, נדרשת גילוי מאקרו זהיר. השני הוא הערכה של איכות ה-DNA (בדיקת איכות: QC). דגימות אשר להיכשל QC (∆Cq > 5.0) עשוי לתת נתונים באיכות ירודה. לכן, יש להסיר ∆Cq > 5.0 ואחרים בשימוש. השלב השלישי הוא חישוב β-ערך, אשר נקבע על ידי כלי ניתוח נתונים עבור תוכנת פלטפורמת המערך כאות מתילציה / האות הכולל (מתילציה + unmethylated)אות 17. ערך β נע בין 0 ל- 1 (או 0%-100%), דבר שקל לפרש מבחינה ביולוגית17. הבעיה העיקרית עם ערך זה היא תכונות סטטיסטיות ירודות שלה, שכן ההטרוסקסטיות הגבוהה שלה מרמזת כי שונות על פני דגימות בקיצוניות טווח מתילציה (β = 0 או β = 1) מופחתמאוד 17. בנוסף, בשל איכות מדגם ירודה, β-ערכים לא יכול להראות פסגות biphasic לשחזור22, ודגימות ללא פסגות כאלה יש לא לכלול במחקר נוסף. בנוסף, יש לבחור גן יעד על סמך הקריטריונים של ערכי בטא גדולים יותר, להיות קשור לאיי CpG באזור האמרגן, ולהיות מתאים לעיצוב פריימר ובדיקה עבור qMSP.
הערכה של מתילציה DNA על לוקוס CpG בגנום האנושי מבוצעת באמצעות טכנולוגיה מבוססת microarray עם מספר קבוע של בדיקות כדי לסקר לוקוסים גנומיים ספציפיים. זוהי השיטה הנפוצה ביותר במחקרי עמותה אפיגנום רחב (EWAS) בשל העלות הנמוכה שלה, כמות קטנה של DNA נדרש, זמן עיבוד מדגם קצר משמעותית, המאפשר עיבוד תפוקה גבוהה של דגימות קליניותרבות 23. עם זאת, פלטפורמת מערך להערכה מורכבת של מתילציה DNA על לוקוס CpG בודד מוגבל על ידי מספר וספוטיות של בדיקות עבור loci שינוי אפיגנטי, אשר מונע חקירה של כמה אזורים גנומיים. WGBS נתפס בדרך כלל כשיטה תקן זהב בשל הספקטרום הרחב יותר של כיסוי גנומי10,11. עם זאת, שיטה זו יש עלות משמעותית זמן עיבוד ארוך יחסית לניתוח של מספר גדול שלדגימות 10,11. לכן, זה לא תמיד ריאלי. לשם השוואה, פלטפורמת המערך להערכה מורכבת של מתילציה של DNA בלוקוס CpG בודד בגנום האנושי סבירה לשימוש במונחים של עלות וכיסוי גנומי. לאחרונה, שבבי חרוזים משודרגים האחרונים היכונו להשתמש24. בדיקות אלה יכולות לעזור לנו לנתח אתרי CpG נמדדים כמעט כפולים, אשר יכולים להשיג מחקר אסוציאציה אידיאלי כלל-גנומי (GWAS) עבור אוכלוסיות מדגם גדולות.
לסיכום, ניתוח גנום מתילציה DNA עם פלטפורמת המערך להערכה מורכבת של מתילציה DNA על לוקוס CpG בודד בגנום האנושי יכול לספק מידע חשוב על סמנים ביולוגיים אפיגנטיים בסרטן מערכת העיכול. בהשוואה ל- WGBS, שיטה זו חסכונית ומקצרת את זמן העיבוד לדוגמה. לכן, שיטה זו לגילוי מתילציה DNA על לוקוס CpG צפוי להיות בשימוש נרחב במחקר סמן ביולוגי אפיגנטי.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים במיוחד לכל חברי המחלקה לכירורגיה, מרכז הסרטן המקיף סידני קימל בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס על דיונים שימושיים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם לקריסטן רוג'רס על הדרכה טכנית נדיבה על ההליכים לטיפול ביסולפי ו- qMSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
References
- Qiu, J.
- Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).
- Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).
- Hsieh, C. J., et al. Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).
- Ushijima, T., Okochi-Takada, E. Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from. Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).
- Coppedè, F. Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).
- Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).
- Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. DNA methylation data analysis and its application to cancer research. Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).
- Morris, T. J., Beck, S. Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data. Methods. 72, San Deigo, California. 3-8 (2015).
- Rauluseviciute, I., Drabløs, F., Rye, M. B. DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis. Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).
- Cazaly, E. Making sense of the epigenome using data integration approaches. Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).
- Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection. Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).
- Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas. Epigenomics. 12 (11), (2020).
- Wong, E. M., et al. Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies. BMC Research Notes. 8, 543 (2015).
- Illumina. , Available from: https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html (2020).
- Fackler, M. J., et al. Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence. Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).
- Dedeurwaerder, S., et al. A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing. Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).
- Hulbert, A., et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).
- Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).
- Eijsink, J. J., et al. Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study. Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).
- Sugimoto, K., et al. DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).
- Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. BMC Bioinformatics. 19, Suppl 5 115 (2018).
- Teh, A. L., et al. Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples. Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
