Summary
이 연구에서는 특정 세포 표적화를 위한 항체로 자성 나노물질을 생체 기능화하는 프로토콜을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 암세포를 표적으로 삼기 위해 철 나노 와이어를 사용합니다.
Abstract
자성 나노 물질은 다양한 생물 의학 응용 분야에서 큰 주목을 받았습니다. 특정 표적화제로 이러한 나노 물질을 생체 기능화하는 것은 부작용을 최소화하면서 진단 및 치료에서 효능을 향상시키는 데 중요한 측면입니다. 비자성 물질에 비해 자성 나노 물질의 이점은 비접촉식 방식으로 먼 거리에서 자기장에 반응할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 안내하거나 축적할 수 있으며 모니터링도 가능합니다. 최근에는 생물 의학 응용 분야를 위해 고유한 기능을 가진 자기 나노와이어(NW)가 개발되었습니다. 이러한 NW의 큰 자기 모멘트는 자기장에 의한 움직임을 보다 효율적으로 원격 제어할 수 있도록 합니다. 이것은 암 치료, 약물 전달, 세포 추적, 줄기 세포 분화 또는 자기 공명 영상에서 큰 성공을 거두었습니다. 또한 템플릿 보조 전기화학 증착에 의한 NW 제조는 NW 특성을 엄격하게 제어할 수 있는 다양한 방법을 제공합니다. 특히 철 NW 및 산화철(코어 쉘) NW는 높은 자화와 낮은 독성으로 인해 생물 의학 응용 분야에 적합합니다.
이 연구에서 우리는 많은 수의 암세포에서 과발현되는 특정 세포 표면 마커에 대한 특정 항체로 철/산화철 NW를 생체 기능화하는 방법을 제공합니다. 이 방법은 산화철 표면의 특성을 활용하기 때문에 초상자성 산화철 나노 입자에도 적용할 수 있습니다. NW는 먼저 링커 역할을 하는 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane(APTES)으로 코팅되며, 항체는 이 링커에 공유 결합되어 있습니다. APTES 코팅 및 항체 생체 기능화는 전자 에너지 손실 분광법(EELS) 및 제타 전위 측정에 의해 입증되었습니다. 또한, NW에 대한 항체의 항원성은 면역침전 및 웨스턴 블롯을 사용하여 테스트됩니다. 생체 기능성 NW의 특정 표적화와 생체 적합성은 공초점 현미경 및 세포 생존도 분석으로 연구됩니다.
Introduction
자성 나노 물질의 독특한 특성은 자기장1에 반응하는 능력이며, 이는 여러 가지 방법으로 그들을 작동시키는 데 유익하게 활용 될 수 있으며, 예를 들어 자기 공명 영상 (MRI)에 의해 모니터링 될 수도 있습니다. 고주파에서 교류 자기장을 가할 때 열을 발생시켜 온열요법을 유발할 수 있어 치료 옵션1을 제공할 수 있습니다. 또 다른 접근법은 근적외선(NIR) 레이저 2,3으로 실현할 수 있는 광열 처리입니다.
많은 수의 자성 나노 물질 중에서 산화철은 자기 분리, 고열2,4, 세포 유도5, 약물 전달 6,7,8 및 MRI 9,10의 조영제와 같은 생물학적 응용 분야에서 가장 큰 주목을 받았습니다. 이는 높은 생체 적합성 11,12, 큰 자화11,12, 코팅 능력 9,13,14,15, 약물 운반 능력2,16, 약물 2,16 또는 표적 제제12,13,17로 기능화 된 능력 때문입니다,18 및 광학 에너지를 열로 변환하는 기능2. 최근 MagForce는 온열요법 치료를 위해 산화철 나노입자를 사용하여 암 환자를 대상으로 임상 시험을 시작했습니다19.
최근에, 자석 nanowires (NWs)는 생물 의학 응용을 위해 점점 더 이용되고 있다 3,11,16,20,21,22. 이들은 자성 나노 비드와 유사한 특성을 갖지만 이방성 모양과 매우 큰 자기 모멘트를 제공하여 자기장23,24에 의한 매우 효율적인 원격 제어를 가능하게하며, 자기 기계적 효과를 유도하는 저주파 작동을 포함합니다 25,26,27,28,29. 결과적으로, NW는 엑소좀 분리(30) 세포 추적(21), 암 치료(3,11,16), 약물 전달(16,31,32) 및 MRI 조영제(33)와 같은 다양한 생물학적 응용 분야에 구현되었습니다.
특정 세포 표적화 능력을 가진 생체 기능성 자성 나노 물질은 생물 의학 응용 분야 및 정밀 의학 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다34,35. 이러한 표적화를 부착하기 위해서는 나노 물질에 표면 개질이 필요합니다. 일반적으로 처리제의 부착을 용이하게 하는 작용기를 제공하는 코팅이 필요합니다. 문헌에는 자성 나노 물질에 대한 많은 유기 및 무기 코팅이 있습니다. 나노 물질에 고정될 수 있는 작용기를 기반으로 이러한 코팅은 카르복실산기를 기반으로 하는 분자, 고분자, 히스티딘 및 실란기를 기반으로 하는 분자의 네 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다.
카르복실산기를 기반으로 하는 분자는 표면 개질 방법 중 하나입니다. 높은 친화력을 활용
코팅의 음극 카르복실산 그룹과 자성 나노 물질36,37,38의 양전하 사이. 금속 표면에 대한 카르복실산의 결합 공정은 금속-카르복실레이트 염의 생성 또는 카르복실기의 금속에 대한 접착을 포함할 수 있습니다. 그러나, 철/금 또는 니켈/금 NW와 같은 다중 세그먼트 NW의 경우, 바이오 응용 분야에 대한 우수한 특성을 갖는다39,40, 이러한 유형의 코팅은 쉽게 적용될 수 없다. 동시에 두 가지 다른 코팅이 필요합니다: 금 세그먼트를 수정하기 위한 티올기와 자성 세그먼트(철 또는 니켈)를 위한 카르복실기(38). 카르복실기를 기반으로 하는 분자의 몇 가지 예로는 헤마토포르피린, 피멜산, 팔미트산 및 3-[(2-아미노에틸)디티오] 프로피온산(AEDP)38이 있습니다. 고분자를 사용한 자성 나노 물질의 표면 개질은 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 중합체의 분자량이 크기 때문에, 용액(38)에서 자성 나노물질의 안정성을 향상시킨다. 그러나, 나노 물질(38)의 크기를 현저하게 증가시킬 것이다. 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌이민(PEI), 아르기닌-글리신-D 아스파르트산(RGD) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 표면 개질에 가장 일반적으로 사용되는 폴리머의 몇 가지 예입니다. 각각 고유한 기능이 있으며38을 사용합니다. 세 번째 표면 개질 방법은 히스티딘 코팅을 사용하는 것입니다. 히스티딘은 니켈38과 같은 제한된 수의 자성 나노 물질에 높은 친화력을 갖는 히스티딘 아미노산 곁사슬을 가진 단백질입니다. 단백질 정제 공정 38,41,42에 사용할 수 있습니다. 히스티딘 코팅은 또한 니켈/금 NW와 같은 다중-분절된 NWs에 적용될 수 있다38. 나노 물질 표면의 실란화는 잘 확립 된 공정 (38,43,44)입니다. 그것은 3 개의 단일 결합을 통해 임의의 금속 산화물 표면에 연결된 실리콘 원자를 기반으로하며,이 실리콘 원자는 알킬 사슬 (38,43,44)을 통해 말단의 작용기에 결합합니다. 이 코팅의 장점은 유리 아민기를 제공하고 있으며 니켈 및 금과 같은 자성 및 비자성 물질38,45를 각각 코팅할 수 있습니다. 따라서 식염수를 기반으로 하는 분자를 사용하는 것은 다중 세그먼트 NW를 생체 기능화하는 실용적인 경로입니다. 실란기를 기반으로 하는 분자의 몇 가지 예는 (3-아미노프로필) 트리에톡시실란(APTES) 및 (3-아미노프로필) 트리메톡시실란(APTMS)38,45입니다.
코팅에 표적제를 첨가하는 것은 병든 세포의 진단 및 치료 모두에서 중요한 역할을 할 수 있으며, 동시에 건강한 조직에 대한 부작용을 최소화할 수 있다(46,47). 나노 물질의 표면에 표적 물질을 첨가하면 세포 내 세포 내 수용체를 통한 세포 선택적 결합과 내재화가 모두 향상된다7. 이러한 표적화 리간드가 없으면, 나노 물질은 세포막과 비특이적으로 상호 작용하며, 이는 리간드(48)를 갖는 나노 물질에 비해 더 낮은 비율로 결합합니다. 암 조직을 표적으로 삼을 때 어려운 점 중 하나는 건강한 조직과의 특징적인 유사성입니다. 그러므로, 표적화의 성공은 주로 생물학적 표적49,50으로 사용할 적절한 리간드를 결정하는 데 달려 있다. 다양한 표적화제는 나노 물질을 암세포(48,51)로 유도하기 위해 사용되어 왔다(예를 들어, CD44는 건강한 세포(52,53,54,55)에 비해 암세포에서 높은 발현으로 인해).
표적화제는 성분과 복잡성에 따라 압타머 기반 표적화, 리간드 기반 표적화, 항체 기반 표적화의 세 가지 주요 그룹으로 분류할 수 있습니다. 압타머는 화학적으로 합성된 DNA 또는 RNA-올리고뉴클레오티드의 짧은 가닥으로 2차원 및 3차원 구조로 접혀 있어 특정 항원, 대부분 단백질56을 표적으로 삼을 수 있다. 리간드-기반 표적화는 펩티드 및 짧은 아미노산 사슬(57)을 포함한다. 항체-기반 표적화는 전체 항체, 또는 항체 단편, 예컨대 단일-사슬 가변 단편 또는 항원-결합 단편(51)의 사용을 수반한다. 이 방법을 사용하는 것은 특이적 표적 항원에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 2개의 결합 부위를 갖는 장점이 있으며, 이는 매우 높은 선택성(58)을 제공한다. 결합 부위는 자물쇠와 유사하고 항원은 열쇠(58)와 유사하다.
이 작업에서, 사용된 NW는 산화알루미늄 멤브레인 상에 전착에 의해 제조되었으며, 이 방법은 이전 간행물59에서 상세히 기술되었다. 여기서 초점은 이러한 산화철(코어-쉘) NW를 멤브레인에서 방출하고 특정 항체로 생체 기능화하여 표적화 능력을 제공하는 것입니다. 항체는 산화철-철 NW에 직접 결합할 수 없으며 링커가 필요합니다. NW를 APTES로 코팅하면 유리 아민기가 제공되어 항체의 카르복실기를 통한 공유 결합이 가능합니다(그림 1). APTES 코팅의 장점은 철/금 또는 니켈/금 NWs45와 같은 자성21 및 비자성60 재료 모두에 대해 작동할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜에서 설명하는 모든 코팅 및 생체 기능화 단계는 일반적으로 모든 철/산화철 나노 물질과 함께 사용할 수 있습니다. 여기서는 철/산화철 NW를 예로 들었습니다. 결과는 항체 기능화된 NW가 다른 신청을 위해 이용될 수 있는 특정한 세포 표면 수용체에 높은 antigenicity가 있다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 세포 분리, 약물 전달, 광열 및/또는 자기 기계적 처리를 사용한 특정 암세포 치료가 있습니다.
Protocol
주의 : 사용하기 전에 항상 모든 관련 물질안전보건자료(MSDS)를 참조하십시오. 모든 적절한 안전 수칙과 개인 보호 장비(보안경, 장갑, 실험복, 전신 바지, 발가락이 막힌 신발)를 사용하십시오. 생물학적 흄 후드에서 모든 생물학적 반응을 수행합니다.
참고: 이 프로토콜은 밀도가 3 x 10 4 항체/NW인 항-CD44 항체로 코팅된 0.36mg의 철/mL에 해당하는 2 x 1010 생체 기능성 NWs/mL를 생산하기 위한 것입니다. 산화철(코어-쉘) NW는 길이가 2.5μm이고 직경이 41.5nm입니다.
1. 철 나노 와이어의 방출
참고: 철/산화철 NW의 제조 공정은 이전 간행물59에서 자세히 설명되었습니다.
- 커팅 매트에서 단일 모서리 블레이드와 작은 망치를 사용하여 알루미늄(Al) 디스크(그림 2A)를 작은 조각(그림 2B)으로 자릅니다. 핀셋을 사용하여 작은 Al 조각을 튜브로 옮깁니다.
- 작은 Al 조각이 들어 있는 2mL 튜브에 1M 수산화나트륨(NaOH) 1mL를 채웁니다. 모든 Al 조각이 NaOH로 덮여 있는지 확인하십시오.
- 용액을 화학 흄 후드 내부의 실온에서 30분 동안 작동하도록 두십시오.
- 핀셋을 사용하여 Al 조각만 제거하고 방출된 NW(검은색 클러스터, 그림 3A)를 NaOH 용액에 추가로 30분 동안 유지합니다. NaOH 용액을 변경하지 마십시오.
- 2mL 튜브를 마그네틱 랙에 넣어 NW를 수집하고 기존 1M NaOH 용액을 제거하기 전에 2분 동안 기다립니다. 신선한 NaOH 용액으로 교체하십시오.
- NW가 들어있는 2mL 튜브를 30 초 동안 초음파 처리하고 화학 흄 후드 내부에서 1 시간 동안 그대로 두십시오.
- 1.5-1.6단계를 4회 이상 반복합니다.
- 2mL 튜브를 마그네틱 랙에 넣어 NW를 세척하고 2분 동안 기다립니다.
- NaOH 용액을 버리고 1mL의 절대 에탄올로 교체합니다.
- 튜브를 30초 동안 초음파 처리합니다.
- 2mL 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 2분 동안 기다립니다.
- 오래된 절대 에탄올 용액을 버리고 1mL의 신선한 절대 에탄올로 교체하고 30초 동안 초음파 처리합니다.
- 1.11단계와 1.12단계를 4회 이상 반복합니다.
- NW를 1mL의 절대 에탄올에 넣어 필요할 때까지 실온에 보관합니다.
- 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)을 사용하여 철과 NW의 농도를 측정합니다.
참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 그러나 장기간 보관하는 경우 필요할 때까지 Al 템플릿에서 NW를 해제하지 마십시오. 방출 된 NW를 빈번한 초음파 처리없이 오랫동안 에탄올에 침전시키는 것은 분리되는 데 더 오랜 시간의 초음파 처리가 필요한 응집체를 생성합니다.
2. APTES로 나노 와이어 코팅
참고: 이 프로토콜에서 100μL의 APTES 용액(밀도 0.946g/mL61)은 1.6 x 107m 2/g의 NW를 코팅하기에 충분합니다. 나노 물질의 비율이나 질량에 변화가 있는 경우 그에 따라 APTES 부피를 조정해야 합니다.
- 1mL 피펫을 사용하여 1.14단계의 NW를 5mL 유리관으로 옮깁니다.
- 2mL 튜브에 남아 있는 NW를 수집하려면 1mL의 절대 에탄올을 추가하여 빈 2mL 튜브를 두 번 세척하고 1mL 피펫을 사용하여 5mL 유리관으로 옮깁니다.
- 피펫을 사용하여 100μL의 APTES를 NW 용액에 직접 첨가합니다.
- 5mL 유리관을 10초 동안 소용돌이칩니다.
- 실험실 레토르트 스탠드의 클램프에서 5mL 유리관을 조정합니다.
- 5mL 유리관의 절반을 초음파 수조의 물 안에 넣고 1 시간 동안 초음파 처리합니다.
- 초음파 수조에서 5mL 유리관을 꺼내고 400μL의 탈이온수(DI)와 20μL의 1M NaOH(염기성 촉매)를 추가합니다.
주의 : DI 물을 먼저 추가하는 것이 중요합니다. - 2.5-2.6 단계에서 설명한대로 5mL 유리관을 조정하고 1 시간 더 초음파 처리합니다.
- 초음파 수조에서 5mL 유리관을 꺼냅니다.
- 유리관 옆에 자석을 놓고 5분 동안 NW를 수집합니다.
- 상층액을 1mL의 신선한 절대 에탄올로 교체하고 10초 동안 초음파 처리합니다.
- 2.10-2.11단계를 네 번 반복합니다.
- 1mL 피펫을 사용하여 모든 NW 부유 에탄올을 새 5mL 유리관으로 옮깁니다.
알림: APTES 코팅 NW는 필요할 때까지 에탄올이 담긴 유리관에 보관할 수 있습니다. 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
3. 나노와이어의 생체기능화
- 항체 활성화
참고: 약 3 x 104 부의 항체/NW를 달성하려면 철분 0.1mg당 30μL의 항체(1mg/mL)를 사용하십시오.- 2mL 튜브에 3-3-디메틸-아미노프로필 카르보디이미드(EDC) 0.4mg과 설포-N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 1.1mg을 2-N-모르폴리노 에탄술폰산 수화물(MES) 1mL(pH 4.7)에 녹입니다.
알림: EDC/sulfo-NHS 혼합물은 사용하기 전에 신선하고 준비되어야 합니다. - 새로운 2mL 튜브에 30μL의 항-CD44 항체(1mg/mL), 960μL의 0.1M 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7) 및 10μL의 EDC/sulfo-NHS 혼합물(3.1.1단계에서 준비)을 각각 추가합니다.
- 2mL 튜브를 10 x g 의 튜브 셰이커에 넣고 실온에서 15분 동안 굽습니다.
- 2mL 튜브에 3-3-디메틸-아미노프로필 카르보디이미드(EDC) 0.4mg과 설포-N-하이드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS) 1.1mg을 2-N-모르폴리노 에탄술폰산 수화물(MES) 1mL(pH 4.7)에 녹입니다.
- APTES 코팅 나노 와이어의 제조
- 15단계에서 3.1.3분 배양 동안 APTES 코팅된 NW 튜브(2.13단계에서) 옆에 자석을 놓고 2분 동안 NW를 세척하여 NW를 수집합니다.
- 에탄올을 버리고 1mL의 0.1M PBS(pH 7)로 교체한 다음 10초 동안 초음파 처리합니다.
- 3.2.1-3.2.2단계를 네 번 반복합니다.
- 3.2.1단계에서 설명한 대로 NW를 수집하고 0.1M PBS를 삭제합니다. 해결책 없이 NW를 튜브에 보관하십시오.
- 항체의 부착
- 모든 활성화 된 항체 용액 (3.1.3 단계에서 준비)을 NWs 튜브 (3.2.4에서 준비)로 옮기고 10 초 동안 초음파 처리합니다.
- 유리관을 4°C에서 밤새 회전기에 넣습니다.
- 3.2.1단계에서와 같이 자석을 사용하여 NW를 수집하고 상층액을 버립니다.
- 1mL의 2% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 4°C에서 1시간 동안 첨가하여 반응을 차단합니다.
- 예를 들어 면역침전(IP) 및 웨스턴 블롯(WB) 분석을 사용하여 항체 기능성 NW의 항원성을 확인합니다.
참고: 더 나은 결과를 얻으려면 차단 단계 직후 IP, WB 또는 생체 적합성 분석에서 생체 기능성 NW를 사용하십시오.
4. 생체 적합성 분석
참고: NW의 생체 적합성을 연구하기 위해 다양한 세포 생존율 분석과 다양한 세포주를 사용할 수 있습니다. 여기에 사용된 NW의 농도는 이전 간행물16에 기초한다. 세포 파종은 NW 생체 기능화 하루 전에 수행되어야 합니다.
주의 : 아래의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다.
- 96웰 플레이트에서 McCoy의 세포 배양 배지(100μL/웰)에 현탁된 4 x 104 결장암 세포(HCT116 세포주)가 있는 9개의 웰을 파종하고 37°C 및 5% 이산화탄소(CO2)에서 밤새 인큐베이터 내부에 넣습니다.
- 3.2.1 단계에서와 같이 자석을 사용하여 수집하여 NW (3.3.4 단계에서)를 PBS로 세척하고 기존 용액을 1mL의 0.01M PBS (pH 7)로 교체합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 4.2단계에서와 같이 자석을 사용하여 NW를 모아 예열된 McCoy의 배지로 세척(3.2.1단계에서)하고 기존 PBS를 1mL의 예열된 McCoy 배지로 교체합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 단계 3.2.1에서와 같이 자석을 사용하여 NW를 수집하고(단계 4.3에서) 1mL의 데워진 McCoy 배지를 900μL의 데워진 McCoy 배지로 교체합니다. NW 농도는 mL당 0.02mg의 NW여야 합니다.
- 96웰 플레이트(4.1단계)를 인큐베이터에서 생물안전 캐비닛으로 가져옵니다.
- 생물 안전 캐비닛 아래에서 세포에서 오래된 배지를 버리고 100μL의 부유 NW(4.4단계에서 준비)로 교체합니다.
- 플레이트(4.6단계에서 준비)를 손으로 흔든 다음 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터 내부에서 24시간 동안 배양합니다.
- 다음날 인큐베이터에서 96웰 플레이트(4.7단계에서 준비)를 꺼냅니다. 생물 안전 캐비닛 아래에서 다중벽 피펫을 사용하여 각 웰에 11μL의 세포 생존도 시약(재료 표)을 추가합니다.
- 플레이트 셰이커로 10초 동안 10 x g 의 속도로 플레이트를 흔듭니다.
- 인큐베이터에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다.
- 인큐베이터에서 96웰 플레이트(4.10단계에서 준비)를 꺼냅니다. 세포 생존도 시약의 흡광도(여기 540nm, 방출 590nm)를 측정하여 마이크로플레이트 리더(재료 표)에서 플레이트를 판독합니다.
Representative Results
알루미늄(Al) 디스크(그림 2A)를 사용된 튜브에 맞도록 작은 조각(그림 2B)으로 자르는 것이 중요합니다. Al 조각에 1M NaOH를 첨가 한 후 즉시 반응이 시작되어야하며 이는 기포 생성으로 관찰됩니다. 1분 이내에 반응이 일어나지 않거나 반응이 매우 빠르고 용액이 흰 구름으로 완전히 탁해지면 기존 NaOH 용액을 즉시 제거하고 새 용액으로 교체하십시오. NaOH 용액의 pH 값을 확인하십시오. pH>12여야 합니다. NaOH를 사용하여 처음 30분 동안 Al 조각에서 NW가 방출되면 NW(검은색 클러스터, 그림 3A)가 NaOH 용액 내에 떠 있게 됩니다. NW를 해제하는 마지막 단계에서 솔루션은 균질해야 합니다. NW 클러스터가 없어야 합니다(그림 3B). NW를 자석으로 3분 동안 수집한 경우 용액이 투명해야 하고 NW 펠릿이 검은색이어야 합니다(그림 3C). 펠릿이 회색이면 튜브를 버리고 새 Al 샘플로 다시 시작하십시오.
방출 과정에서 NW는 약 5nm 두께의 천연 산화철 층을 얻는데, 이는 이전 보고서11,16,20과 유사합니다. 이 산화물 층은 NW의 생체 적합성 16, 기능화16,18 및 자기 특성20에 중요한 기여를 합니다. 그러나 필요할 때까지 NW를 템플릿에 유지하면(즉, 해제하지 않음) NW에 대한 환경 영향을 방지할 수 있습니다. 방출 공정 후 NW의 평균 직경과 길이는 각각 2.5μm 및 41.5nm였습니다. 단일 NW의 질량은 표 1과 같이 계산할 수 있으며, 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)으로 확인할 수 있다. 여기에서 각 알루미나 디스크에는 약 0.3mg의 철분이 포함되어 있습니다.
방출 후 NW의 응집을 줄이고 추가 기능화를 가능하게 하기 위해 NW를 APTES로 코팅했습니다. 이 코팅은 유리 아민기를 제공하고 자성 및 비자성 재료39,45를 모두 코팅할 수 있는 능력을 가지고 있어 철/금 NW와 같은 다중 세그먼트 NW를 코팅하는 데 적합합니다. 나노 와이어 코팅 중에는 두 가지에 집중하는 것이 중요합니다. 먼저, NW의 표면적과 질량을 기준으로 APTES 분자62에서 필요한 부피를 계산합니다. 이러한 계산은 표 2에 제시되었습니다. 둘째, 나노 와이어가 응집되고 APTES 코팅으로 인해 NW 표면의 일부가 차단되는 것을 방지하기 위해 나노 와이어를 연속적으로 유지하십시오. 예를 들어, 이 프로토콜에서 나노와이어는 APTES 코팅 및 항체 기능화 동안 각각 초음파 수조 및 회전기 아래에서 배양되었습니다. 각 APTES 분자는 실리콘 원자 및 말단 관능성 아민기(21)를 포함한다. 따라서 전자 에너지 손실 분광법(EELS) 맵을 사용하여 NW 표면에 실리콘 원자(분홍색)를 표시하여 APTES 코팅의 존재를 확인할 수 있습니다(그림 4A). 대조적으로, 코팅되지 않은 NW는 철 원자를 나무 껍질 파란색(그림 4B)으로, 철/산소 혼합 원자를 연한 파란색(그림 4B)으로 보여줍니다. 코팅되지 않은 NW의 해당 EELS 매핑(그림 4 C,4D)은 표면(그림 4D)보다 중앙(그림 4C)에서 철 대 산소의 강도가 더 높음을 보여주며, 이는 철-산화철(코어-쉘) 구조를 나타냅니다. EELS 매핑(그림 4C,4D)은 NW의 산화철 층이 Fe2O3보다 Fe3O4 더 많은 것으로 확인되었으며, 이는 이전 간행물20과 유사합니다.
부착된 항체의 항원성은 IP 및 WB 분석을 사용하여 확인할 수 있으며, 여기서 밴드는 양성 샘플에서 관찰될 수 있지만 음성 대조군에서는 관찰되지 않습니다(그림 5). 투명 밴드를 관찰하려면 0.1mg 미만의 NWs/10 x 106 세포를 사용하지 마십시오. 표 3에 제시된 일부 계산과 함께 BCA 분석(Table of Materials)을 사용하여 NW의 항체 수를 정량화했습니다.
또한 제타 전위 측정을 사용하여 표면 기능화를 설명했습니다. APTES의 말단 아민기는 그림 6과 같이 코팅되지 않은 NW의 음전하를 감소시켰습니다. 항체 기능성 NW는 APTES 코팅 NW에 비해 전하를 변화시켰습니다(그림 6). 모든 제타 전위 측정은 pH 7에서 수행되었습니다.
항체 기능성 NW의 특정 세포 표적화는 공초점 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다(그림 7). 새로운 나노 물질의 생체 적합성은 응용 프로그램을 시작하기 전에 테스트해야 합니다. 따라서 세포 생존도 분석을 사용하였고, 비코팅, APTES 코팅 및 항체 코팅 NW가 고농도에서도 생체 적합성을 확인하였다(그림 8).
그림 1: 개략도는 나노와이어의 코팅 및 생체 기능화 방법을 나타냅니다. (A) APTES로 철 NW를 코팅합니다. (B) EDC + Sulfo-NHS를 이용하여 항체를 활성화시키고, 말단에 (C) 항체 기능성 나노와이어를 갖는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 철 증착 알루미늄 디스크. (A) 절단 전의 알루미늄 디스크. (B) 빨간색 선은 디스크를 잘라야 할 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 나노와이어 방출 단계. (A) 나노 와이어 클러스터가 NaOH 용액에 떠 있습니다. 이미지는 NaOH를 첨가한 후 10분 후에 그리고 Al 멤브레인을 제거한 후에 촬영하였다. (B) 에탄올에 현탁된 나노와이어. 사진은 초음파 처리 단계 직후의 마지막 방출 단계에서 촬영되었습니다. (C) 자석에 의해 수집 된 검은 색 나노 와이어 펠릿. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 전자 에너지 손실 분광법(EELS) 맵. (A) APTES 코팅 나노 와이어 (APTES-NW). 파란색과 분홍색은 각각 철과 규소 원자를 나타냅니다. (B) 코팅되지 않은 나노 와이어 (NW). 나무 껍질 파란색과 하늘색은 각각 철과 철/산소 혼합 매핑을 나타냅니다. 코팅되지 않은 NW의 (C) 코어 및 (D) 쉘의 해당 EELS 매핑. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 항체 접합 나노와이어의 기능화 및 활성 확인. CD44-NW의 항원성은 면역침전(IP) 및 웨스턴 블롯(WB)을 사용하여 확인하였다. +Ve: 양성 대조군(전체 세포 용해물)을 나타냅니다. -Ve: 네거티브 컨트롤을 나타냅니다(코팅되지 않은 NW만 해당). – CD44 세포: CD44 항원을 발현하지 않는 세포를 나타냅니다. + CD44 세포 : CD44 항원을 발현하는 대장암 세포를 나타냅니다. 이것은 n = 3개의 독립적인 실험의 대표적인 오점입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: NW, APTES-NW 및 항체에 대한 제타 전위 값. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 컨포칼 현미경 이미지는 특정 표적화를 보여줍니다. CD44-NW는 부착된 것으로 표시되고(A 및 C), Isotype-NW(음성 대조군)는 부착되지 않았습니다(B 및 D). 빨간색, 파란색 및 녹색은 각각 세포막, 핵 및 CD44-NW의 클러스터를 나타냅니다. A와 B는 각각 C와 D의 명시야 영상입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 다양한 제형의 나노와이어로 배양된 대장암 세포(HCT116)의 세포 생존율 연구. 세포를 배양 24시간 후 NW로 처리한 후 NW로 24시간 동안 배양했습니다. 모든 실험은 37°C의 인큐베이터 내부에서 수행되었습니다. 막대는 평균 ± 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 매개 변수 | 값 | 단위 | ||
| Fe NW (h)의 길이 | 2.6 | μm의 | ||
| 반지름 (diameter/2) (r) | 0.01679231 | μm의 | ||
| Fe 밀도 (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW 부피 (V) = π r ^ 2h | 2.30E-15 | 3 센티미터 | ||
| 1 Fe NW 질량 = V x D | AN-80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW 표면적 = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01호 | μm2 미터 | 2.8E+05 | 나노2 |
표 1: 철 NW 질량 계산.
| 매개 변수 | 값 | 단위 |
| APTES/100 μL의 밀도* | 9.50E-01 | g |
| APTES의 분자 와이트(MW) | 2.21E+02 | g / 몰 |
| APTES 몰 수 = 질량/MW | 4.29E-03 | 몰 |
| APTES 분자 수/100μL** | 2.57E+21 | 분자 |
| APTES 크기 *** | 5.00E-01 | nm |
| APTES 표면적 | 2.00E-01호 | 나노2 |
| NW 표면적**** | 2.76E+05 | 나노2 |
| NW 0.3mg의 NW 수 **** | 1.70E+10 | NWs (NWs) |
| NW 주위에 한 층을 생성하는 데 필요한 APTES 분자의 수 | 1.38E+06 | APTES 분자 |
| 0.3 mg의 NW에 필요한 APTES 분자 수 | 2.35E+16 | APTES 분자 |
| *굴절 번호 61 | ||
| ** 분자 수 = mol*avogadro 수 (6E+23) | ||
| 굴절 번호 62 | ||
| 표 1에서 | ||
표 2: NW 코팅에 필요한 APTES 분자 수 계산.
| Y형 IgG 항체 | NW (영어) | |
| 항체 1개당 질량 | 2.3E-13μg | 1.8E-08 μg* |
| 하나의 항체에 대한 표면적 | 재질 보기 23 nm2 | 2.6E+05 nm2 |
| BCA 분석 기준 | 1 mg 당 0.3 mg | |
| NW mg당 항체 0.3 mg 중의 항체 분자 및 NW의 수 | ~1E+15 항체** per ~5.6E+10 NWs | |
| NW당 항체 분자 수 | 1 NW당 ~2E+04 항체*** | |
| *표 1에서 계산 | ||
| **0.3 mg의 항체 수는 BSA 분석에서 받은 항체 수(0.3 mg)를 Y자형 IgG 항체의 평균 분자량(180 kDa = 3E-16 mg)으로 나누어 계산했습니다. | ||
| Y자형 IgG 항체 분자 1개(~23nm2)의 표면적과 NW 1개(~2.6E+05nm2)의 표면적을 기준으로 약 1E+04개의 항체는 NW에 단층을 생성하기에 충분합니다. 우리의 경우 항체 밀도가 예상량보다 2배 더 높았습니다. 이는 항체가 더 많이 부착될 수 있도록 더 많은 암을 제공하는 APTES 코팅과 관련이 있을 수 있습니다. 이 경우 NW가 항체로 완전히 덮여 있고 NW의 방향에 관계없이 항체가 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 기회가 높을 것입니다. 그러나 항체 밀도가 예상 수(항체의 1E+04 분자)보다 낮으면 세포와 NW 사이의 결합 확률이 낮아집니다. | ||
표 3: 나노와이어의 항체 수 계산.
Discussion
모든 나노 물질 제조 및 코팅 방법과 마찬가지로 사용되는 용액의 고품질이 필요합니다. 방출(1M NaOH) 및 기능화(MES) 용액은 여러 번 재사용할 수 있습니다. 그러나 새로운 공정을 시작하기 전에 pH 값을 확인하는 것이 매우 중요합니다. 방출 단계에서, NaOH로 NW를 세척하는 것은 적어도 4 회 수행되어야한다. 세척이 좋을수록 NW의 안정성이 향상되고 응집이 적습니다. 산화물 층은 에탄올 또는 물(63)에 침지할 때 NW의 안정성을 강화한다.
NW의 직경과 길이는 APTES와 항체로 코팅한 후 영향을 받았습니다. 여기서 직경은 41.5 nm에서 70 nm로 증가했으며 NW를 파괴하는 초음파 처리 단계로 인해 길이는 2.5 μm에서 1.6 μm로 감소했습니다. 따라서 생체 기능화 단계 후 NW의 형태를 특성화하는 것이 필수적입니다.
NW에 대한 항체의 부착은 아민기(APTES에서)와 카르복실기(항체에서) 사이의 공유 상호작용에 의존합니다. 따라서 APTES 코팅의 존재를 확인하는 것은 EELS 매핑을 사용한 중요한 단계입니다. 코팅 방법은 안전하고 간단합니다. 고온이나 긴 배양 시간이 필요하지 않습니다. 또한 APTES 코팅은 링커로 작용하여 카르복실기를 가진 다른 항체 또는 단백질의 공유 결합을 가능하게 합니다.
항체로 NW를 생체기능화하는 경우, 생체기능화 과정 후 항체 결합 부위의 항원성에 영향을 미칠 수 있습니다. IP 및 WB 방법을 사용하여 이 문제를 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜에 언급된 생체 기능화 방법을 사용하면 항체가 특정 세포 수용체에 대한 높은 항원성을 갖는 NW에 결합할 수 있습니다. 또한, 항체로 NW를 생체 기능화하면 관심 수용체인 CD44로 세포를 표적으로 삼을 수 있는 능력이 추가되었습니다. 이것은 컨포칼 현미경으로 확인되었습니다. 코팅되지 않은 NW의 생체 적합성은 높았지만(>95%), NW에 APTES 코팅 또는 항체를 첨가하면 생체 적합성이 100% 향상되었습니다.
또한 코팅 및 생체 기능화 프로토콜은 효율적이고 경제적이며 재현 가능합니다. 다른 산화철 나노 물질에 적용 할 수 있어야하며, 코팅과 부착 된 항체의 농도는 나노 물질의 표면적과 질량에 따라 최적화되어야합니다. 이 프로토콜은 일반 실험실의 주변 조건에서 안전하게 수행할 수 있습니다. 생체 기능화는 나노 물질의 생체 적합성과 표적화 능력을 크게 향상시켰습니다. 일반적으로 NW는 나노 의학 응용 분야(다중 모드 또는 조합 처리, 세포 검출 또는 유도, 생물학적 감지 포함)에 매우 유망한 재료입니다. 여기에 설명된 바와 같이 생체 기능화와 결합하여 정밀도와 효능을 높이기 위해 특정 세포 표적화를 달성할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 간행물에 보고된 연구는 King Abdullah University of Science and Technology(KAUST)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
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