Summary
في هذا العمل ، نقدم بروتوكولا للوظائف الحيوية للمواد النانوية المغناطيسية مع الأجسام المضادة لاستهداف خلايا محددة. على سبيل المثال ، نستخدم أسلاك الحديد النانوية لاستهداف الخلايا السرطانية.
Abstract
حظيت المواد النانوية المغناطيسية باهتمام كبير في التطبيقات الطبية الحيوية المختلفة. يعد الأداء الحيوي لهذه المواد النانوية بعوامل استهداف محددة جانبا حاسما لتعزيز فعاليتها في التشخيص والعلاج مع تقليل الآثار الجانبية إلى الحد الأدنى. تتمثل فائدة المواد النانوية المغناطيسية مقارنة بالمواد غير المغناطيسية في قدرتها على الاستجابة للمجالات المغناطيسية بطريقة خالية من الاتصال وعلى مسافات كبيرة. هذا يسمح بتوجيهها أو تجميعها ، بينما يمكن أيضا مراقبتها. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير أسلاك نانوية مغناطيسية (NWs) ذات ميزات فريدة للتطبيقات الطبية الحيوية. تتيح اللحظة المغناطيسية الكبيرة لهذه الأسلحة النووية التحكم عن بعد بشكل أكثر كفاءة في حركتها بواسطة مجال مغناطيسي. وقد تم استخدام هذا بنجاح كبير في علاج السرطان ، وتوصيل الأدوية ، وتتبع الخلايا ، وتمايز الخلايا الجذعية أو التصوير بالرنين المغناطيسي. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر تصنيع NW عن طريق الترسيب الكهروكيميائي بمساعدة القالب طريقة متعددة الاستخدامات مع تحكم صارم في خصائص NW. خاصة الحديد NWs وأكسيد الحديد وأكسيد الحديد (القشرة الأساسية) NWs مناسبة للتطبيقات الطبية الحيوية ، بسبب المغنطة العالية والسمية المنخفضة.
في هذا العمل ، نقدم طريقة للوظائف الحيوية للحديد / أكسيد الحديد NWs بأجسام مضادة محددة موجهة ضد علامة سطح خلية معينة يتم التعبير عنها بشكل مفرط في عدد كبير من الخلايا السرطانية. نظرا لأن الطريقة تستخدم خصائص سطح أكسيد الحديد ، فإنها تنطبق أيضا على جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية. يتم طلاء NWs أولا ب 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) الذي يعمل كرابط ، والذي ترتبط به الأجسام المضادة تساهميا. تم إثبات طلاء APTES والوظيفة الحيوية للأجسام المضادة من خلال التحليل الطيفي لفقدان الطاقة الإلكترونية (EELS) وقياسات جهد زيتا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم اختبار مستضدية الأجسام المضادة على NWs باستخدام الترسيب المناعي واللطخة الغربية. تتم دراسة الاستهداف المحدد لل NWs ذات الوظائف الحيوية وتوافقها الحيوي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ومقايسة صلاحية الخلية.
Introduction
من الخصائص الفريدة للمواد النانوية المغناطيسية قدرتها على الاستجابة للمجالات المغناطيسية1 ، والتي يمكن استخدامها بشكل مفيد لتشغيلها بعدة طرق ، بينما يمكن أيضا مراقبتها ، على سبيل المثال ، عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). عند تطبيق مجال مغناطيسي متناوب بتردد عال ، يمكنهم توليد الحرارة ، والتي يمكن أن تحفز ارتفاع الحرارة ، مما يوفر خيارا علاجيا1. نهج آخر هو المعالجة الحرارية الضوئية ، والتي يمكن تحقيقها باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) 2,3.
من بين العدد الكبير من المواد النانوية المغناطيسية ، تلقى أكسيد الحديد أكبر قدر من الاهتمام في التطبيقات البيولوجية مثل الفصل المغناطيسي ، وارتفاع الحرارة2,4 ، وتوجيه الخلية5 ، وتوصيل الدواء6،7،8 ، وكعامل تباين في التصوير بالرنين المغناطيسي 9,10. ويرجع ذلك إلى توافقها الحيوي العالي 11,12 ، المغنطة الكبيرة 11,12 ، القدرة على التغليف 9,13,14,15 ، القدرة على حمل الأدوية 2,16 ، القدرة على العمل بالأدوية2,16 أو / واستهدافالعوامل 12,13,17، 18 ، والقدرة على تحويل الطاقة الضوئية إلى حرارة2. في الآونة الأخيرة ، بدأت MagForce في التجارب السريرية على مرضى السرطان باستخدام جسيمات أكسيد الحديد النانوية لعلاج ارتفاع الحرارة19.
في الآونة الأخيرة ، تم استغلال الأسلاك النانوية المغناطيسية (NWs) بشكل متزايد للتطبيقات الطبية الحيوية3،11،16،20،21،22. لها خصائص مماثلة للخرزات النانوية المغناطيسية ، ولكنها تقدم شكلا متباينا الخواص ولحظة مغناطيسية كبيرة جدا ، مما يتيح التحكم عن بعد الفعال للغاية بواسطة مجال مغناطيسي23,24 ، بما في ذلك التشغيل منخفض التردد للحث على التأثيرات المغناطيسية الميكانيكية 25,26,27,28,29. نتيجة لذلك ، تم تنفيذ NWs لتطبيقات بيولوجية مختلفة مثل عزل exosomes30 تتبعالخلايا 21 ، علاج السرطان3،11،16 ، توصيل الدواء 16،31،32 ، وكعامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي 33.
المواد النانوية المغناطيسية ذات الوظائف الحيوية ذات القدرة المحددة على استهداف الخلايا لديها إمكانات كبيرة للتطبيقات الطبية الحيوية وفي الطب الدقيق34,35. ولربط عوامل الاستهداف هذه، يلزم إجراء تعديل سطحي على المواد النانوية. عادة ، يحتاجون إلى طلاء يوفر مجموعة وظيفية ، مما يسهل ربط عوامل المعالجة. في الأدب ، هناك عدد كبير من الطلاءات العضوية وغير العضوية للمواد النانوية المغناطيسية. استنادا إلى المجموعة الوظيفية التي يمكن تجميدها للمادة النانوية ، يمكن تصنيف هذه الطلاءات إلى أربع مجموعات رئيسية: الجزيئات القائمة على مجموعات حمض الكربوكسيل ، والبوليمرات ، والهستيدين ، والجزيئات القائمة على مجموعات السيلان.
الجزيئات القائمة على مجموعات حمض الكربوكسيل هي إحدى طرق تعديل السطح. يستخدم التقارب العالي
بين مجموعة حمض الكربوكسيل السالب على الطلاء والشحنة الموجبة على المواد النانوية المغناطيسية36،37،38. قد تتضمن عملية ارتباط حمض كربوكسيلي بسطح فلزي توليد أملاح كربوكسيلات الفلزات أو التصاق مجموعة الكربوكسيل بالفلز. ومع ذلك ، بالنسبة للأسلحة النووية متعددة الأجزاء ، مثل الحديد / الذهب أو النيكل / الذهب NWs ، والتي لها خصائص رائعة للتطبيقات الحيوية39,40 ، لا يمكن تطبيق هذا النوع من الطلاء بسهولة. يتطلب طلاءين مختلفين في نفس الوقت: مجموعات الثيول لتعديل شرائح الذهب ومجموعات الكربوكسيل للقطاعات المغناطيسية (الحديد أو النيكل)38. بعض الأمثلة على الجزيئات القائمة على مجموعات الكربوكسيل هي الهيماتوبورفيرين ، وحمض البيميليك ، وحمض البالمتيك ، و 3- [(2-aminoethyl) dithio] حمض البروبيونيك (AEDP) 38. توفر التعديلات السطحية للمواد النانوية المغناطيسية باستخدام البوليمرات بعض المزايا المميزة. نظرا للوزن الجزيئي الكبير للبوليمرات ، فإنه يعزز استقرار المادة النانوية المغناطيسية في محلول38. ومع ذلك ، فإنه سيزيد بشكل كبير من حجم المادة النانوية38. البولي فينيل بيروليدون (PVP) ، والبولي إيثيلين (PEI) ، وحمض الأسبارتيك أرجينين - جليكاين - D (RGD) ، والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) هي بعض الأمثلة على البوليمرات الأكثر استخداما لتعديلات السطح. كل واحد له ميزاته الخاصة ويستخدم38. طريقة تعديل السطح الثالثة تستخدم طلاء الهستيدين. الهستيدين هو بروتين يحتوي على سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية الهستيدين التي لها تقارب كبير مع عدد محدود من المواد النانوية المغناطيسية مثل النيكل38. يمكن استخدامه لعمليات تنقية البروتين38،41،42. يمكن أيضا تطبيق طلاء الهستيدين على الأسلحة النووية متعددة الأجزاء ، مثل النيكل / الذهب NWs38. إن تكسير سطح المادة النانوية هو عملية راسخة38،43،44. يعتمد على ذرة سيليكون مرتبطة بأي سطح أكسيد معدني من خلال ثلاث روابط مفردة ، وفي نفس الوقت ترتبط ذرة السيليكون هذه بالمجموعة الوظيفية في النهاية من خلال سلسلة ألكيل38،43،44. تتمثل ميزة هذا الطلاء في توفير مجموعات أمين مجانية ، ولديه القدرة على طلاء كل من المواد المغناطيسية وغير المغناطيسية38,45 ، مثل النيكل والذهب ، على التوالي. لذلك ، فإن استخدام الجزيئات القائمة على المجموعة المالحة هو طريق عملي للوظائف الحيوية متعددة NWs. بعض الأمثلة على الجزيئات القائمة على مجموعات السيلان هي (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان (APTES) و (3-أمينوبروبيل) تريميثوكسيسيلان (APTMS) 38,45.
يمكن أن تلعب إضافة عامل استهداف إلى الطلاء دورا مهما في تشخيص وعلاج الخلايا المريضة ، وفي الوقت نفسه ، تقلل من الآثار الجانبية على الأنسجة السليمة46,47. إن إضافة عامل استهداف على سطح المواد النانوية يعزز كلا من الارتباط الانتقائي الخلوي والاستيعاب من خلال مستقبلات البطانةالخلوية 7. بدون هذه الروابط المستهدفة ، تتفاعل المواد النانوية بشكل غير محدد مع أغشية الخلايا ، والتي ترتبط بمعدل أقل مقارنة بالمواد النانوية مع الروابط48. أحد تحديات استهداف الأنسجة السرطانية هو تشابهها المميز مع الأنسجة السليمة. لذلك ، يعتمد نجاح الاستهداف بشكل أساسي على تحديد الربيطة المناسبة لاستخدامها كهدف بيولوجي49,50. تم استخدام عوامل استهداف مختلفة لتوجيه المواد النانوية إلى الخلايا السرطانية48,51 (على سبيل المثال ، CD44 ، بسبب تعبيرها العالي في الخلايا السرطانية مقارنة بالخلايا السليمة52,53,54,55).
يمكن تصنيف عوامل الاستهداف إلى ثلاث مجموعات رئيسية ، بناء على المكونات التي تتكون منها وتعقيدها: الاستهداف القائم على aptamer ، والاستهداف القائم على ligand ، والاستهداف المستند إلى الأجسام المضادة. الأبتامير عبارة عن خيوط قصيرة مركبة كيميائيا من الحمض النووي أو نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي التي يتم طيها في هياكل ثنائية وثلاثية الأبعاد ، مما يجعلها قادرة على استهداف مستضد معين ، وغالبا ما يكون البروتينات56. يشمل الاستهداف القائم على الليجند الببتيدات وسلاسل الأحماض الأمينية القصيرة57. يتضمن الاستهداف القائم على الأجسام المضادة استخدام جسم مضاد كامل ، أو شظايا أجسام مضادة ، مثل شظايا متغيرة أحادية السلسلة أو شظايا مرتبطة بالمستضد51. يتميز استخدام هذه الطريقة بامتلاك موقعي ربط مع تقارب ارتباط عالي مع مستضد مستهدف محدد ، مما يمنحه انتقائية عالية للغاية58. مواقع الربط مماثلة للقفل والمستضد للمفتاح58.
في هذا العمل ، تم تصنيع الأسلحة النووية المستخدمة عن طريق الترسيب الكهربائي على أغشية أكسيد الألومنيوم ، وهي طريقة موصوفة بالتفصيل في منشور سابق59. ينصب التركيز هنا على إطلاق هذه الأسلحة النووية من أكسيد الحديد والحديد (القشرة الأساسية) من الأغشية وتشغيلها بيولوجيا بأجسام مضادة محددة لتوفير قدرة استهداف. لا يمكن للأجسام المضادة أن ترتبط مباشرة بأكسيد الحديد والحديد NWs وتتطلب رابطا. يوفر طلاء NWs باستخدام APTES مجموعات أمينية مجانية ، مما يتيح الارتباط التساهمي عبر مجموعة الكربوكسيل على الأجسام المضادة (الشكل 1). تتمثل ميزة طلاء APTES في قدرته على العمل لكل من الموادالمغناطيسية 21 وغير المغناطيسية60 ، مثل الحديد / الذهب أو النيكل / الذهب NWs45. يمكن استخدام جميع خطوات الطلاء والوظائف الحيوية الموضحة في هذا البروتوكول مع أي مادة نانوية من الحديد / أكسيد الحديد ، بشكل عام. تم استخدام الحديد / أكسيد الحديد NWs هنا كمثال. تظهر النتائج أن NWs التي تعمل بالأجسام المضادة لها مستضد عالي لمستقبلات سطح الخلية المحددة ، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات مختلفة. ومن الأمثلة على ذلك فصل الخلايا ، وتوصيل الأدوية ، وعلاج الخلايا السرطانية المحددة باستخدام العلاجات الحرارية الضوئية و / أو المغناطيسية الميكانيكية.
Protocol
تنبيه: استشر دائما جميع أوراق بيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS) قبل الاستخدام. استخدم جميع ممارسات السلامة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة ، والقفازات ، ومعطف المختبر ، والسراويل الطويلة ، والأحذية المغلقة من الأمام). أداء جميع التفاعلات البيولوجية في غطاء الدخان البيولوجي.
ملاحظة: يهدف هذا البروتوكول إلى إنتاج 2 × 10 10 NWs / مل وظيفية بيولوجيا تعادل 0.36 مجم من الحديد / مل مغلفة بأجسام مضادة ل CD44 بكثافة 3 ×10 4 أجسام مضادة / NW. يبلغ طول أكسيد الحديد والحديد (القشرة الأساسية) NWs 2.5 ميكرومتر وقطرها 41.5 نانومتر.
1. الافراج عن أسلاك الحديد النانوية
ملاحظة: تم شرح عملية تصنيع الحديد / أكسيد الحديد NWs بالتفصيل في منشور سابق59.
- على حصيرة القطع ، قم بقص أقراص الألومنيوم (Al) (الشكل 2A) إلى قطع صغيرة (الشكل 2B) باستخدام شفرة ذات حافة واحدة ومطرقة صغيرة لتناسب أنبوب 2 مل. استخدم الملقط لنقل قطع Al الصغيرة إلى الأنبوب.
- املأ الأنبوب سعة 2 مل ، الذي يحتوي على قطع Al الصغيرة ، ب 1 مل من 1 M هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). تأكد من تغطية جميع قطع Al ب NaOH.
- اترك المحلول يعمل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء دخان كيميائي.
- قم بإزالة قطع Al فقط باستخدام الملقط واحتفظ بالأسلحة النووية التي تم إطلاقها (مجموعات سوداء ، الشكل 3A) في محلول NaOH لمدة 30 دقيقة إضافية. لا تقم بتغيير محلول هيدروكسيد الصوديوم.
- اجمع NWs عن طريق وضع أنبوب 2 مل في رف مغناطيسي وانتظر لمدة دقيقتين قبل إزالة محلول 1 M NaOH القديم. استبدله بمحلول NaOH جديد.
- قم بتنشيط الأنبوب سعة 2 مل الذي يحتوي على NWs لمدة 30 ثانية واتركه لمدة 1 ساعة داخل غطاء دخان كيميائي.
- كرر الخطوات من 1.5 إلى 1.6 أربع مرات على الأقل.
- اغسل NWs عن طريق وضع أنبوب 2 مل في الرف المغناطيسي وانتظر لمدة دقيقتين.
- تخلص من محلول هيدروكسيد الصوديوم واستبدله ب 1 مل من الإيثانول المطلق.
- Sonicate الأنبوب لمدة 30 ثانية.
- ضع أنبوب 2 مل في الرف المغناطيسي وانتظر 2 دقيقة.
- تخلص من محلول الإيثانول المطلق القديم واستبدله ب 1 مل من الإيثانول المطلق الطازج والسونيكات لمدة 30 ثانية.
- كرر الخطوتين 1.11 و 1.12 لأربع مرات على الأقل.
- احتفظ ب NWs في 1 مل من الإيثانول المطلق في درجة حرارة الغرفة حتى تكون هناك حاجة إليها.
- قياس تركيز الحديد وبالتالي NWs باستخدام مطياف كتلة البلازما المقترن بالحث (ICP-MS).
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. ومع ذلك ، بالنسبة للتخزين لفترة طويلة ، لا تقم بتحرير NWs من قالب Al حتى الحاجة إليه. إن الحفاظ على NWs المفرج عنها في الإيثانول لفترة طويلة دون صوتنة متكررة سيخلق تجمعات ستحتاج إلى أوقات أطول من صوتنة ليتم فصلها.
2. طلاء الأسلاك النانوية ب APTES
ملاحظة: في هذا البروتوكول ، 100 ميكرولتر من محلول APTES (كثافة 0.946 جم / مل61) كافية لتغطية 1.6 × 107 م2 / جم من NWs. إذا كان هناك تغيير في نسبة أو كتلة المادة النانوية ، فيجب تعديل حجم APTES وفقا لذلك.
- انقل NWs من الخطوة 1.14 إلى أنبوب زجاجي سعة 5 مل باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- لجمع أي NWs متبقية في أنبوب 2 مل ، اغسل الأنبوب الفارغ 2 مل مرتين بإضافة 1 مل من الإيثانول المطلق وانقله إلى الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- باستخدام الماصة ، خذ 100 ميكرولتر من APTES وأضفها إلى محلول NW مباشرة.
- دوامة أنبوب زجاجي 5 مل لمدة 10 ثوان.
- اضبط الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل على مشبك حامل معوجة المختبر.
- ضع نصف الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل داخل ماء الحمام بالموجات فوق الصوتية و sonicate لمدة 1 ساعة.
- أخرج الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل من الحمام بالموجات فوق الصوتية وأضف 400 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات (DI) متبوعا ب 20 ميكرولتر من 1 M NaOH (الحفز الأساسي).
تنبيه: من المهم إضافة ماء DI أولا. - اضبط الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل ، كما هو موضح في الخطوات 2.5-2.6 ، وصوتنة لمدة 1 ساعة أخرى.
- أخرج الأنبوب الزجاجي سعة 5 مل من الحمام بالموجات فوق الصوتية.
- ضع مغناطيسا بجوار الأنبوب الزجاجي لمدة 5 دقائق لجمع NWs.
- استبدل المادة الطافية ب 1 مل من الإيثانول المطلق الطازج و sonicate لمدة 10 ثوان.
- كرر الخطوات 2.10-2.11 أربع مرات.
- نقل جميع الإيثانول المعلق NWs إلى أنبوب زجاجي جديد سعة 5 مل باستخدام ماصة 1 مل.
ملاحظة: يمكن تخزين NWs المطلية ب APTES في أنبوب زجاجي مع الإيثانول حتى تكون هناك حاجة إليها. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
3. الوظيفة الحيوية للأسلاك النانوية
- تنشيط الأجسام المضادة
ملاحظة: لتحقيق ما يقرب من 3 × 104 أجزاء من الجسم المضاد / NW ، استخدم 30 ميكرولتر من الجسم المضاد (1 مجم / مل) لكل 0.1 مجم من الحديد.- في أنبوب سعة 2 مل ، قم بإذابة 0.4 مجم من 3-3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل كاربوديميد (EDC) و 1.1 مجم من سلفو-N-هيدروكسي سلفوسوكسينيميد (Sulfo-NHS) في 1 مل من هيدرات حمض إيثان سلفونيك 2-N-morpholino (MES) (درجة الحموضة 4.7).
ملاحظة: يجب أن يكون خليط EDC / sulfo-NHS طازجا ومحضرا قبل الاستخدام. - في أنبوب جديد سعة 2 مل ، أضف 30 ميكرولتر من الجسم المضاد ل CD44 (1 مجم / مل) ، و 960 ميكرولتر من 0.1 متر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7) ، و 10 ميكرولتر من خليط EDC / sulfo-NHS (محضر في الخطوة 3.1.1) ، على التوالي.
- ضع أنبوب 2 مل في خفق أنبوبي على حرارة 10 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- في أنبوب سعة 2 مل ، قم بإذابة 0.4 مجم من 3-3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل كاربوديميد (EDC) و 1.1 مجم من سلفو-N-هيدروكسي سلفوسوكسينيميد (Sulfo-NHS) في 1 مل من هيدرات حمض إيثان سلفونيك 2-N-morpholino (MES) (درجة الحموضة 4.7).
- تحضير الأسلاك النانوية المطلية ب APTES
- خلال فترة الحضانة التي تبلغ 15 دقيقة في الخطوة 3.1.3 ، اغسل NWs عن طريق وضع مغناطيس بجوار أنبوب NWs المطلي ب APTES (من الخطوة 2.13) لمدة دقيقتين لجمع NWs.
- تخلص من الإيثانول واستبدله ب 1 مل من 0.1 م PBS (درجة الحموضة 7) ، ثم صوتنة لمدة 10 ثوان.
- كرر الخطوة 3.2.1-3.2.2 أربع مرات.
- اجمع NWs ، كما هو موضح في الخطوة 3.2.1 ، وتجاهل 0.1 M PBS. احتفظ بالأسلحة النووية في الأنبوب دون أي محلول.
- تعلق الأجسام المضادة
- انقل كل محلول الأجسام المضادة المنشط (المحضر في الخطوة 3.1.3) إلى أنبوب NWs (المحضر في 3.2.4) وصوتنة لمدة 10 ثوان.
- ضع الأنبوب الزجاجي في الدوار طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اجمع الأسلحة النووية باستخدام مغناطيس كما في الخطوة 3.2.1 وتخلص من المادة الطافية.
- إضافة 1 مل من محلول ألبومين مصل الأبقار (BSA) بنسبة 2٪ لمدة ساعة عند 4 درجات مئوية لمنع التفاعل.
- تحقق من مستضدية الأجسام المضادة الوظيفية NWs ، على سبيل المثال ، باستخدام مقايسات الترسيب المناعي (IP) واللطخة الغربية (WB).
ملاحظة: للحصول على نتائج أفضل ، استخدم NWs ذات الوظائف الحيوية في اختبار IP أو WB أو التوافق الحيوي مباشرة بعد خطوة الحظر.
4. مقايسة التوافق الحيوي
ملاحظة: لدراسة التوافق الحيوي للأسلحة النووية، يمكن استخدام مقايسات مختلفة لصلاحية الخلايا وخطوط خلايا مختلفة. ويستند تركيز الأسلحة النووية المستخدمة هنا إلى منشور سابق16. يجب أن يتم بذر الخلية قبل يوم واحد من الوظيفة الحيوية NW.
تنبيه: يجب تنفيذ جميع الخطوات التالية تحت خزانة السلامة الأحيائية.
- في صفيحة 96 بئرا ، قم بزرع تسعة آبار مع 4 × 104 من خلايا سرطان القولون (خط خلايا HCT116) معلقة في وسائط زراعة خلايا مكوي (100 ميكرولتر / بئر) ووضعها داخل الحاضنة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
- اغسل NWs (من الخطوة 3.3.4) باستخدام PBS عن طريق جمعها باستخدام مغناطيس كما في الخطوة 3.2.1 واستبدل المحلول القديم ب 1 مل من 0.01 M PBS (الرقم الهيدروجيني 7). كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- اغسل NWs (من الخطوة 4.2) بوسائط McCoy الدافئة عن طريق جمعها باستخدام مغناطيس كما في الخطوة 3.2.1 واستبدل PBS القديم ب 1 مل من وسائط McCoy الدافئة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- جمع NWs (من الخطوة 4.3) باستخدام مغناطيس كما في الخطوة 3.2.1 واستبدال 1 مل من وسائط McCoy الدافئة ب 900 ميكرولتر من وسائط McCoy الدافئة. يجب أن يكون تركيز الأسلحة النووية 0.02 ملغ من الأسلحة النووية لكل مل.
- خذ لوحة 96 بئرا (من الخطوة 4.1) من الحاضنة إلى خزانة السلامة الأحيائية.
- تحت خزانة السلامة الأحيائية، تخلص من الوسائط القديمة من الخلايا واستبدلها ب 100 ميكرولتر من الأسلحة النووية العالقة (أعدت في الخطوة 4-4).
- هز اللوحة (المحضرة في الخطوة 4.6) باليد ثم احتضانها لمدة 24 ساعة داخل الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- في اليوم التالي ، أخرج لوحة 96 بئرا (المحضرة في الخطوة 4.7) من الحاضنة. تحت خزانة السلامة الأحيائية ، أضف 11 ميكرولتر من كاشف صلاحية الخلية (جدول المواد) إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة الجدران.
- هز اللوحة مع شاكر لوحة بسرعة 10 × غرام لمدة 10 ثوان.
- احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في الحاضنة.
- أخرج لوحة 96 بئرا (المحضرة في الخطوة 4.10) من الحاضنة. اقرأ اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة (جدول المواد) عن طريق قياس امتصاص كاشف صلاحية الخلية (الإثارة 540 نانومتر ، الانبعاث 590 نانومتر).
Representative Results
من المهم قطع أقراص الألمنيوم (Al) (الشكل 2A) إلى قطع صغيرة (الشكل 2B) لتناسب الأنبوب المستخدم. بعد إضافة 1 M NaOH إلى قطع Al ، يجب أن يبدأ التفاعل على الفور ، والذي يتم ملاحظته عن طريق إنشاء فقاعات. إذا لم يحدث أي تفاعل في 1 دقيقة أو إذا كان التفاعل سريعا جدا وتحول المحلول إلى عكر تماما مع سحابة بيضاء ، فقم بإزالة محلول NaOH القديم على الفور واستبدله بمحلول جديد. تحقق من قيمة الأس الهيدروجيني لمحلول هيدروكسيد الصوديوم. يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني > 12. عندما يتم إطلاق NWs من قطع Al في أول 30 دقيقة مع NaOH ، فإن NWs (مجموعات سوداء ، الشكل 3A) ستطفو داخل محلول NaOH. في الخطوة الأخيرة من إطلاق الأسلحة النووية ، يجب أن يكون الحل متجانسا. لا ينبغي أن تكون هناك مجموعة من الأسلحة النووية (الشكل 3 ب). إذا تم جمع NWs بمغناطيس لمدة 3 دقائق ، فيجب أن يكون المحلول واضحا ، ويجب أن تكون حبيبات NW سوداء (الشكل 3C). إذا كانت الحبيبات رمادية ، فتخلص من الأنبوب وابدأ مرة أخرى بعينة Al جديدة.
أثناء عملية الإطلاق ، تحصل NWs على طبقة أكسيد الحديد الأصلية بسمك حوالي 5 نانومتر ، وهو مشابه للتقارير السابقة11،16،20. طبقة الأكسيد هذه لها مساهمة مهمة في التوافق الحيوي 16 ، والتشغيل16,18 والخصائص المغناطيسية20 من NWs. ومع ذلك ، فإن الاحتفاظ بالأسلحة النووية في نموذجها (أي عدم إطلاقها) حتى الحاجة سيمنعها من أي آثار بيئية عليها. وكان متوسط قطر وطول الأسلحة النووية بعد عملية الإطلاق 2.5 ميكرومتر و 41.5 نانومتر على التوالي. يمكن حساب كتلة NW واحدة كما هو موضح في الجدول 1 وتم تأكيدها بواسطة التحليل الطيفي لكتلة البلازما المقترنة بالحث (ICP-MS). هنا ، يحتوي كل قرص من الألومينا على حوالي 0.3 ملغ من الحديد.
لتقليل تجميع الأسلحة النووية بعد إطلاقها وتمكين المزيد من الوظائف ، تم طلاء الأسلحة النووية ب APTES. يوفر هذا الطلاء مجموعات أمينية مجانية ولديه القدرة على طلاء كل من المواد المغناطيسية وغير المغناطيسية 39,45 ، مما يجعله مناسبا لطلاء NWs متعددة الأجزاء مثل الحديد / الذهب NWs. أثناء طلاء الأسلاك النانوية ، من المهم التركيز على شيئين. أولا ، احسب الحجم المطلوب من جزيئات APTES62 بناء على مساحة السطح وكتلة NWs. وترد هذه الحسابات في الجدول 2. ثانيا ، حافظ على الأسلاك النانوية في حركة مستمرة لمنع تكتلها وحجب بعض أجزاء أسطح NW من طلاء APTES. على سبيل المثال ، في هذا البروتوكول ، تم تحضين الأسلاك النانوية تحت الحمام بالموجات فوق الصوتية والمدور أثناء طلاء APTES ووظيفة الجسم المضاد ، على التوالي. يحتوي كل جزيء APTES على ذرة سيليكون ومجموعة أمين وظيفية طرفية21. لذلك ، يمكن استخدام خرائط التحليل الطيفي لفقدان طاقة الإلكترون (EELS) لتأكيد وجود طلاء APTES من خلال إظهار ذرات السيليكون (اللون الوردي) على سطح NW (الشكل 4A). في المقابل ، تظهر NWs غير المطلية ذرات الحديد باللون الأزرق اللحاء (الشكل 4B) وذرات مزيج الحديد / الأكسجين باللون الأزرق الفاتح (الشكل 4B). يظهر رسم خرائط EELS المقابل ل NWs غير المطلية (الشكل 4 C ، 4D) كثافة أعلى من الحديد مقابل الأكسجين في المركز (الشكل 4C) مقارنة بالسطح (الشكل 4D) ، مما يشير إلى بنية أكسيد الحديد وأكسيد الحديد (القشرة الأساسية). تم تحديد رسم خرائط EELS (الشكل 4 C ، 4D) أن طبقة أكسيد الحديد على NWs هي Fe 3 O4 أكثر من Fe2O3، وهو مشابه لمنشور سابق20.
يمكن تأكيد مستضدية الأجسام المضادة المرفقة باستخدام مقايسات IP و WB ، حيث يمكن ملاحظة النطاق على العينة الإيجابية ولكن ليس على الضوابط السلبية (الشكل 5). لاحظ أنه لمراقبة نطاق واضح ، لا تستخدم أقل من 0.1 ملغ من NWs / 10 × 106 خلايا. تم استخدام مقايسة BCA (جدول المواد) بالاقتران مع بعض الحسابات الواردة في الجدول 3 لتحديد عدد الأجسام المضادة على NW.
علاوة على ذلك ، تم استخدام قياس جهد زيتا لتوضيح وظائف السطح. خفضت مجموعة الأمين الطرفية على APTES الشحنة السالبة للأسلحة النووية غير المطلية ، كما هو موضح في الشكل 6. كما غيرت NWs التي تعمل بالأجسام المضادة الشحنة مقارنة ب NWs المغلفة ب APTES (الشكل 6). تم إجراء جميع قياسات جهد زيتا عند الرقم الهيدروجيني 7.
يمكن تأكيد استهداف الخلايا المحددة لل NWs الوظيفية للأجسام المضادة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل 7). يجب اختبار التوافق الحيوي لأي مادة نانوية جديدة قبل البدء في أي تطبيق. لذلك ، تم استخدام مقايسة صلاحية الخلية ، وأكدت أن NWs غير المطلية ، والمغلفة ب APTES ، والأجسام المضادة المغلفة كانت متوافقة حيويا حتى مع التركيز العالي (الشكل 8).
الشكل 1: يمثل الرسم التخطيطي طريقة الطلاء والوظيفة الحيوية للأسلاك النانوية. (أ) طلاء الحديد NWs مع APTES. (ب) تنشيط الأجسام المضادة باستخدام EDC + Sulfo-NHS ، ليكون في النهاية (C) سلك نانوي وظيفي للجسم المضاد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قرص ألومنيوم مترسب من الحديد. (أ) قرص الألومنيوم قبل القطع. (B) توضح الخطوط الحمراء مكان قطع القرص. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: خطوات إطلاق الأسلاك النانوية. (أ) تطفو مجموعات من الأسلاك النانوية في محلول NaOH . تم التقاط الصورة بعد 10 دقائق من إضافة NaOH وبعد إزالة غشاء Al . ب: أسلاك نانوية معلقة في الإيثانول. تم التقاط الصورة في خطوة الإصدار الأخيرة ، مباشرة بعد خطوة الصوتنة. (ج) حبيبات الأسلاك النانوية السوداء التي يجمعها مغناطيس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خريطة التحليل الطيفي لفقدان الطاقة الإلكترونية (EELS). (أ) الأسلاك النانوية المطلية ب APTES (APTES-NW). يمثل اللونان الأزرق والوردي ذرات الحديد والسيليكون على التوالي. (ب) الأسلاك النانوية غير المطلية (NW). يمثل اللونان الأزرق النباح والأزرق الفاتح رسم خرائط مزيج الحديد والحديد / الأكسجين ، على التوالي. رسم خرائط EELS المقابلة ل (C) النواة و (D) غلاف NWs غير المطلية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تأكيد وظيفة ونشاط الأسلاك النانوية المترافقة بالأجسام المضادة. تم تأكيد مستضدية CD44-NWs باستخدام الترسيب المناعي (IP) واللطخة الغربية (WB). + Ve: يمثل التحكم الإيجابي (تحلل الخلية الكاملة). -Ve: يمثل التحكم السلبي (فقط NW غير المطلي). – خلايا CD44: تمثل الخلايا التي لا تعبر عن مستضد CD44 ؛ + خلايا CD44: تمثل خلايا سرطان القولون التي تعبر عن مستضد CD44. هذه لطخة تمثيلية ل n = 3 تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: قيم زيتا المحتملة ل NWs و APTES-NWs والأجسام المضادة. تمثل الأشرطة متوسط الخطأ ± القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تظهر الصور المجهرية متحدة البؤر الاستهداف المحدد. تظهر CD44-NWs مرفقة (A و C) ، في حين أن Isotype-NWs (التحكم السلبي) لم تعلق (B و D). تمثل الألوان الأحمر والأزرق والأخضر غشاء الخلية والنواة ومجموعة CD44-NWs على التوالي. A و B هما صور المجال الساطع ل C و D ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: دراسة صلاحية الخلية لخلايا سرطان القولون (HCT116) المحتضنة بتركيبات مختلفة من الأسلاك النانوية. عولجت الخلايا ب NWs بعد 24 ساعة من الحضانة ثم حضنت لمدة 24 ساعة مع NWs. أجريت جميع التجارب داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية. تمثل الأشرطة متوسط الخطأ ± القياسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البارامتر | قيمة | وحدة | ||
| طول الحديد شمال غرب (ح) | 2.6 | ميكرومتر | ||
| نصف القطر (القطر / 2) (ص) | 0.01679231 | ميكرومتر | ||
| كثافة الحديد (D) | 7.87 | جم / سم3 | ||
| 1 حجم Fe NW (V) = π r ^ 2h | 2.30E-15 | سم3 | ||
| 1 كتلة الحديد شمال غرب = V × D | 1.80E-08 | ميكروغرام | ||
| 1 مساحة سطح Fe NW = 2π r ^ 2 + 2πrh | 2.76E-01 | ميكرومتر2 | 2.8E+05 | نانومتر2 |
الجدول 1: حساب كتلة الحديد NW.
| البارامتر | قيمة | وحدة |
| كثافة APTES/100 ميكرولتر* | 9.50E-01 | g |
| وايت الجزيئي (MW) من APTES | 2.21E+02 | غ/مول |
| عدد الخلد APTES = الكتلة / ميجاوات | 4.29E-03 | مول |
| عدد جزيئات APTES/100 ميكرولتر** | 2.57E+21 | الجزيئات |
| حجم APTES *** | 5.00E-01 | نانومتر |
| مساحة سطح APTES | 2.00E-01 | نانومتر2 |
| مساحة السطح الشمالية الغربية**** | 2.76E+05 | نانومتر2 |
| عدد الأسلحة النووية في 0.3mg من NW **** | 1.70E+10 | الأسلحة النووية |
| عدد جزيئات APTES اللازمة لإنشاء طبقة واحدة حول NW | 1.38E+06 | جزيء APTES |
| عدد جزيئات APTES اللازمة ل 0.3 ملغ من NWs | 2.35E+16 | جزيء APTES |
| *المرجع رقم 61 | ||
| ** عدد الجزيئات = عدد mol * avogadro عدد (6E + 23) | ||
| المرجع رقم 62 | ||
| من الجدول 1 | ||
الجدول 2: حساب عدد جزيئات APTES المطلوبة لطلاء NWs.
| الجسم المضاد IgG على شكل Y | شمال غرب | |
| كتلة لجسم مضاد واحد | 2.3E-13 ميكروغرام | 1.8E-08 ميكروغرام* |
| مساحة السطح لجسم مضاد واحد | 23 نانومتر2 | 2.6E+05 نانومتر2 |
| بناء على مقايسة BCA | 0.3 ملغ لكل 1 ملغ | |
| عدد جزيء الجسم المضاد و NW في 0.3 ملغ من الجسم المضاد لكل ملغ من NW | ~ 1E + 15 الأجسام المضادة ** لكل ~ 5.6E + 10 NWs | |
| عدد جزيء الأجسام المضادة لكل NW | ~ 2E + 04 الأجسام المضادة لكل 1 NW *** | |
| * محسوبة من الجدول 1 | ||
| ** تم حساب عدد الأجسام المضادة في 0.3 ملغ بقسمة عدد الأجسام المضادة التي تلقيناها من مقايسة BSA (0.3 مجم) على متوسط الوزن الجزيئي للأجسام المضادة IgG على شكل Y (180 كيلو دالتون = 3E-16 مجم). | ||
| استنادا إلى مساحة سطح جزيء واحد من الأجسام المضادة IgG على شكل Y (~ 23 نانومتر 2) ومساحة سطح NW واحد (~ 2.6E + 05 نانومتر 2) ، سيكون حوالي 1E + 04 من الأجسام المضادة كافيا لإنشاء طبقة أحادية على NW. في حالتنا ، كانت كثافة الجسم المضاد أكثر مرتين من الكمية المتوقعة. يمكن أن يكون هذا مرتبطا بطلاء APTES الذي يوفر المزيد من الأذرع التي تسمح بالتعلق العالي للأجسام المضادة. تضمن هذه الحالة تغطية NW بالكامل بالأجسام المضادة وأن فرصة الجسم المضاد للارتباط بمستضد سطح الخلية ، بغض النظر عن اتجاه NWs ستكون عالية. ومع ذلك ، إذا كانت كثافة الجسم المضاد أقل من العدد المتوقع (1E + 04 جزيء من الجسم المضاد) ، فإن فرصة الارتباط بين الخلية و NWs ستكون أقل. | ||
الجدول 3: حساب عدد الأجسام المضادة على السلك النانوي.
Discussion
كما هو الحال مع أي طريقة لتصنيع وطلاء المواد النانوية ، يلزم وجود جودة عالية للحلول المستخدمة. يمكن إعادة استخدام حلول الإصدار (1 M NaOH) والتشغيل الوظيفي (MES) عدة مرات. ومع ذلك ، فإن التحقق من قيمة الأس الهيدروجيني قبل البدء في عملية جديدة أمر مهم للغاية. في خطوة الإطلاق ، يجب أن يتم غسل الأسلحة النووية باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أربع مرات على الأقل. كلما كان الغسيل أفضل ، كان استقرار الأسلحة النووية أفضل وقل تجميعها. تعزز طبقة الأكسيد استقرار الأسلحة النووية عند الغمر في الإيثانول أو الماء63.
تأثر قطر وطول NWs بعد طلائها ب APTES والأجسام المضادة. هنا ، زاد القطر من 41.5 نانومتر إلى 70 نانومتر ، وانخفض الطول من 2.5 ميكرومتر إلى 1.6 ميكرومتر ، بسبب خطوات الصوتنة التي تكسر NWs. لذلك ، من الضروري توصيف مورفولوجيا الأسلحة النووية بعد خطوة الوظائف الحيوية.
يعتمد ارتباط الأجسام المضادة بالأسلحة النووية على التفاعل التساهمي بين مجموعة الأمين (على APTES) ومجموعة الكربوكسيل (على الجسم المضاد). لذلك ، يعد تأكيد وجود طلاء APTES خطوة مهمة ، استخدمنا من أجلها رسم خرائط EELS. طريقة الطلاء آمنة ومباشرة. لا يحتاج إلى درجات حرارة عالية أو أوقات حضانة طويلة. أيضا ، يعمل طلاء APTES كرابط لتمكين الارتباط التساهمي للأجسام المضادة أو البروتينات الأخرى التي تحتوي على مجموعة كربوكسيل.
في حالة الوظائف الحيوية للأسلحة النووية بجسم مضاد ، يمكن أن تتأثر مستضدية مواقع ربط الأجسام المضادة بعد عملية الوظيفة الحيوية. يمكن استخدام طريقة IP و WB للتحقيق في هذه المشكلة. سيسمح استخدام طريقة الوظائف الحيوية المذكورة في هذا البروتوكول للأجسام المضادة بالارتباط بالدول الحائزة للأسلحة النووية ذات المستضدات العالية لمستقبل خلية معين. علاوة على ذلك ، أضاف الأداء الحيوي ل NWs بالأجسام المضادة القدرة على استهداف الخلايا بمستقبل الاهتمام ، CD44 هنا. تم تأكيد ذلك عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. على الرغم من أن التوافق الحيوي للأسلحة النووية غير المطلية كان مرتفعا (>95٪) ، إلا أن إضافة طلاء APTES أو الأجسام المضادة إلى NWs عزز توافقها الحيوي بنسبة 100٪.
علاوة على ذلك ، فإن بروتوكول الطلاء والوظائف الحيوية فعال واقتصادي وقابل للتكرار. يجب أن يكون قابلا للتطبيق على أي مادة نانوية أخرى من أكسيد الحديد والحديد ، حيث يجب تحسين تركيز كل من الطلاء والأجسام المضادة المرفقة بناء على مساحة السطح وكتلة المادة النانوية. يمكن إجراء هذا البروتوكول بأمان في الظروف المحيطة في المختبر العام. وقد عززت الوظائف الأحيائية بشكل كبير التوافق الأحيائي للمواد النانوية وقدرتها على الاستهداف. وبشكل عام، تعتبر الأسلحة النووية مواد واعدة للغاية للتطبيقات الطبية النانوية (بما في ذلك العلاجات متعددة الوسائط أو التوافقية، والكشف عن الخلايا أو توجيهها، والاستشعار البيولوجي). إلى جانب الوظيفة الحيوية ، كما هو موضح هنا ، يمكن تحقيق استهداف محدد للخلايا لزيادة الدقة والفعالية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل جامعة الملك عبد الله للعلوم والتقنية (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
- Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
- Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
- Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
- Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
- Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
- Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
- Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
- Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
- Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
- Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
- Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
- Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
- Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
- Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
- Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
- Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
- Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
- Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
- Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
- Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
- Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
- Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
- Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
- Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
- Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
- Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
- Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
- Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
- Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
- Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
- Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
- Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
- Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
- Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
- Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
- Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
- Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
- Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
- Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
- Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
- Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
- Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
- Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
- Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
- Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L.
- Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
- Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
- Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
- Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).
