Summary
בעבודה זו, אנו מספקים פרוטוקול לתפקוד ביולוגי של ננו-חומרים מגנטיים עם נוגדנים עבור מיקוד תאים ספציפיים. כדוגמאות, אנו משתמשים בננו-חוטי ברזל כדי לתקוף תאים סרטניים.
Abstract
ננו-חומרים מגנטיים זכו לתשומת לב רבה ביישומים ביו-רפואיים שונים. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חומרים אלה עם סוכני מיקוד ספציפיים היא היבט חיוני לשיפור יעילותם באבחון ובטיפולים תוך מזעור תופעות הלוואי. היתרון של ננו-חומרים מגנטיים בהשוואה לננו-חומרים שאינם מגנטיים הוא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים ללא מגע ולמרחקים גדולים. זה מאפשר להנחות או לצבור אותם, בעוד שהם יכולים גם להיות פיקוח. לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) עם תכונות ייחודיות פותחו עבור יישומים ביו-רפואיים. המומנט המגנטי הגדול של NW אלה מאפשר שליטה יעילה יותר מרחוק על תנועתם על ידי שדה מגנטי. זה נוצל בהצלחה רבה בטיפול בסרטן, אספקת תרופות, מעקב אחר תאים, התמיינות תאי גזע או הדמיית תהודה מגנטית. בנוסף, ייצור NW על ידי תצהיר אלקטרוכימי בסיוע תבנית מספק שיטה רב-תכליתית עם שליטה הדוקה על תכונות NW. במיוחד NW ברזל תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה) NW מתאימים ליישומים ביו-רפואיים, בשל המגנטיזציה הגבוהה שלהם רעילות נמוכה.
בעבודה זו, אנו מספקים שיטה לתפקוד ביולוגי של NW של תחמוצת ברזל/ברזל עם נוגדנים ספציפיים המכוונים כנגד סמן פני תא ספציפי המתבטא יתר על המידה במספר רב של תאים סרטניים. מכיוון שהשיטה מנצלת את התכונות של משטח תחמוצת הברזל, היא ישימה גם לננו-חלקיקי תחמוצת ברזל על-פאראמגנטיים. ה- NWs מצופים תחילה ב- 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silane (APTES) הפועל כמקשר, אליו הנוגדנים מחוברים באופן קוולנטי. ציפוי APTES והביו-פונקציונליזציה של הנוגדנים מוכחים על ידי ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) ומדידות פוטנציאליות zeta. בנוסף, האנטיגניות של הנוגדנים על NWs נבדקת באמצעות immunoprecipitation ו כתם מערבי. המיקוד הספציפי של NWs ביו-פונקציונליים והתאימות הביולוגית שלהם נחקרים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי ובדיקת כדאיות התא.
Introduction
תכונה ייחודית של ננו-חומרים מגנטיים היא יכולתם להגיב לשדות מגנטיים1, אשר ניתן לנצל לתועלת כדי להפעיל אותם בדרכים רבות , בעוד שהם יכולים גם להיות מנוטר, למשל, על ידי דימות תהודה מגנטית (MRI). בעת החלת שדה מגנטי לסירוגין בתדר גבוה, הם יכולים ליצור חום, אשר יכול לגרום היפרתרמיה, מתן אפשרות טיפולית1. גישה נוספת היא טיפול פוטותרמי, אותו ניתן לממש באמצעות לייזר אינפרא אדום קרוב (NIR) 2,3.
בין המספר הגדול של ננו-חומרים מגנטיים, תחמוצת ברזל קיבלה את תשומת הלב הגדולה ביותר ביישומים ביולוגיים כגון הפרדה מגנטית, היפרתרמיה2,4, הנחיית תאים5, אספקת תרופות 6,7,8, וכחומר ניגוד ב- MRI 9,10. זאת בשל תאימות ביולוגית גבוהה שלהם 11,12, מגנטיזציה גדולה 11,12, יכולת להיות מצופה 9,13,14,15, יכולת לשאת תרופות 2,16, יכולת לתפקד עם תרופות2,16 או/ו סוכני מיקוד12,13,17,18, ויכולת להמיר אנרגיה אופטית לחום2. לאחרונה, MagForce החלה בניסויים קליניים בחולי סרטן המשתמשים בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל לטיפול בהיפרתרמיה19.
לאחרונה, ננו-חוטים מגנטיים (NWs) מנוצלים יותר ויותר ליישומים ביו-רפואיים 3,11,16,20,21,22. יש להם תכונות דומות לננו-חרוזים מגנטיים, אך הם מציעים צורה אנאיזוטרופית ומומנט מגנטי גדול מאוד, המאפשר שליטה מרחוק יעילה מאוד על ידי שדה מגנטי23,24, כולל הפעלה בתדר נמוך כדי לגרום לאפקטים מגנטו-מכניים 25,26,27,28,29. כתוצאה מכך, NWs יושמו עבור יישומים ביולוגיים שונים כגון בידוד אקסוזומים30 מעקב אחר תאים 21, טיפול בסרטן 3,11,16, אספקת תרופות 16,31,32, וכחומר ניגוד MRI 33.
ננו-חומרים מגנטיים ביו-פונקציונליים בעלי יכולת מיקוד תאים ספציפית הם בעלי פוטנציאל גדול ליישומים ביו-רפואיים וברפואה מדויקת34,35. כדי לחבר את סוכני המיקוד הללו, נדרש שינוי פני השטח של הננו-חומרים. בדרך כלל, הם זקוקים לציפוי המספק קבוצה פונקציונלית, המאפשרת את החיבור של הסוכנים המטפלים. בספרות, יש מספר רב של ציפויים אורגניים ואי-אורגניים עבור ננו-חומרים מגנטיים. בהתבסס על הקבוצה הפונקציונלית שניתן לשתק לננו-חומר, ניתן לסווג ציפויים אלה לארבע קבוצות עיקריות: מולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית, פולימרים, היסטידין ומולקולות המבוססות על קבוצות סילאן.
המולקולות המבוססות על קבוצות חומצה קרבוקסילית היא אחת משיטות שינוי פני השטח. הוא מנצל את האהדה הגבוהה
בין קבוצת החומצה הקרבוקסילית השלילית על הציפוי לבין המטען החיובי על הננו-חומרים המגנטיים36,37,38. תהליך הקשירה של חומצה קרבוקסילית למשטח מתכת עשוי לכלול יצירה של מלחי מתכת-קרבוקסילט או היצמדות של קבוצת הקרבוקסיל למתכת. עם זאת, עבור NW רב-מקטעים, כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs, שיש להם תכונות מעולות עבור יישומים ביולוגיים39,40, סוג זה של ציפוי לא יכול להיות מיושם בקלות. הוא דורש שני ציפויים שונים בו זמנית: קבוצות תיול לשינוי מקטעי הזהב וקבוצות קרבוקסיל למקטעים מגנטיים (ברזל או ניקל)38. כמה דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות קרבוקסיל הן המטופורפירין, חומצה פימלית, חומצה פלמיטית, וחומצה פרופיונית 3-[(2-אמינואתיל) דיתיו] (AEDP)38. שינויים בפני השטח של ננו-חומרים מגנטיים באמצעות פולימרים מציעים כמה יתרונות ברורים. בשל המשקל המולקולרי הגדול של הפולימרים, הוא משפר את יציבות הננו-חומר המגנטי בתמיסה38. עם זאת, זה יגדיל באופן משמעותי את גודל ננו-חומר38. פוליוויניל פירולידון (PVP), פוליאתילנימין (PEI), חומצה אספרטית ארגינין-גליצין-D (RGD) ופוליאתילן גליקול (PEG) הם כמה דוגמאות לפולימרים הנפוצים ביותר לשינויים בפני שטח. לכל אחד מהם תכונות משלו ומשתמשב-38. שיטת שינוי פני השטח השלישית היא באמצעות ציפוי היסטידין. היסטידין הוא חלבון בעל שרשרת צדדית של חומצות אמינו היסטידין בעל זיקה גבוהה למספר מוגבל של ננו-חומרים מגנטיים כגון ניקל38. ניתן להשתמש בו לתהליכי טיהור חלבונים 38,41,42. ציפוי היסטידין יכול להיות מיושם גם על NW רב-מקטעים, כגון ניקל/זהב NWs38. סילניזציה של משטח ננו-חומר היא תהליך מבוסס היטב 38,43,44. הוא מבוסס על אטום סיליקון המקושר לכל משטח תחמוצת מתכת באמצעות שלושה קשרים בודדים, ובמקביל אטום סיליקון זה נקשר לקבוצה הפונקציונלית בסוף דרך שרשרת אלקיל 38,43,44. היתרון של ציפוי זה הוא מתן קבוצות אמין חופשיות, ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים38,45, כגון ניקל וזהב, בהתאמה. לכן, שימוש במולקולות המבוססות על קבוצת המלח הוא מסלול מעשי לביו-פונקציונליזציה של NW רב-מקטעים. דוגמאות למולקולות המבוססות על קבוצות סילאן הן (3-aminopropyl), triethoxysilane (APTES) ו-(3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS)38,45.
הוספת חומר מיקוד לציפוי יכולה למלא תפקיד משמעותי הן באבחון והן בטיפול בתאים חולים, ובמקביל למזער את תופעות הלוואי על רקמות בריאות46,47. הוספת חומר מיקוד על פני השטח של ננו-חומרים משפרת הן את הקישור הסלקטיבי התאי והן את ההפנמה באמצעות קולטני אנדוציטוזה7. ללא ליגנדות מטרה אלה, ננו-חומרים מתקשרים באופן לא ספציפי עם קרום התא, אשר נקשר בקצב נמוך יותר בהשוואה לננו-חומרים עם ליגנדות48. אחד האתגרים במיקוד רקמות סרטניות הוא הדמיון האופייני שלהן לרקמות בריאות. לכן, הצלחת המיקוד תלויה בעיקר בקביעת הליגנד המתאים לשימוש כמטרה ביולוגית49,50. סוכני מיקוד שונים שימשו כדי לכוון ננו-חומרים לתאי סרטן48,51 (למשל, CD44, בשל הביטוי הגבוה שלו בתאי סרטן בהשוואה לתאים בריאים52,53,54,55).
ניתן לסווג את סוכני המיקוד לשלוש קבוצות עיקריות, בהתבסס על המרכיבים מהם הם עשויים ומורכבותם: מיקוד מבוסס אפטמר, מיקוד מבוסס ליגנד ומיקוד מבוסס נוגדנים. Aptamers הם גדילים קצרים מסונתזים כימית של DNA או RNA-oligonucleotides המקופלים למבנים דו ותלת ממדיים, מה שהופך אותם מסוגלים להתמקד אנטיגן מסוים, לרוב חלבונים56. מיקוד מבוסס ליגנד כולל פפטידים ושרשראות חומצות אמינו קצרות57. מיקוד מבוסס נוגדנים כרוך בשימוש בנוגדן שלם, או במקטעי נוגדנים, כגון מקטעים משתנים בעלי שרשרת אחת או מקטעים קושרי אנטיגן51. לשימוש בשיטה זו יש יתרון בכך שיש לו שני אתרי קשירה בעלי זיקה גבוהה לאנטיגן המטרה הספציפי שלו, מה שמקנה לו סלקטיביות גבוהה ביותר58. אתרי הקשירה מקבילים למנעול והאנטיגן למפתח58.
בעבודה זו, NWs בשימוש יוצרו על ידי אלקטרודפוזיציה על ממברנות תחמוצת אלומיניום, שיטה שתוארה בפירוט בפרסום קודם59. ההתמקדות כאן היא בשחרור NW אלה של תחמוצת ברזל-ברזל (קליפת הליבה) מהממברנות ותפקודם הביולוגי עם נוגדנים ספציפיים כדי לספק יכולת מיקוד. הנוגדנים אינם יכולים להיקשר ישירות לתחמוצת הברזל-ברזל NWs ודורשים מקשר. ציפוי ה-NWs ב-APTES מספק קבוצות אמין חופשיות, מה שמאפשר את ההתקשרות הקוולנטית דרך קבוצת הקרבוקסיל על הנוגדנים (איור 1). היתרון של ציפוי APTES הוא היכולת שלו לעבוד הן עבור חומרים מגנטיים21 והן עבור חומרים לא מגנטיים60 , כגון ברזל/זהב או ניקל/זהב NWs45. ניתן להשתמש בכל שלבי הציפוי והביו-פונקציונליזציה המוסברים בפרוטוקול זה עם כל ננו-חומר של תחמוצת ברזל/ברזל, באופן כללי. NW של תחמוצת ברזל / ברזל שימשו כאן כדוגמה. התוצאות מראות כי NWs פונקציונלי נוגדנים יש אנטיגניות גבוהה קולטנים פני התא ספציפיים, אשר יכול לשמש עבור יישומים שונים. דוגמאות כוללות הפרדת תאים, אספקת תרופות, טיפול ספציפי בתאים סרטניים באמצעות טיפולים פוטותרמיים ו / או מגנטו-מכניים.
Protocol
אזהרה: יש להיוועץ תמיד בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים ובציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות). בצע את כל התגובות הביולוגיות במכסה האדים הביולוגי.
הערה: פרוטוקול זה מיועד לייצר 2 x 10 10 NWs/mL ביו-פונקציונליים שווה ערך ל-0.36 מ"ג ברזל/מ"ל המצופים בנוגדנים נגד CD44 עם צפיפות של 3 x10 4 נוגדנים/NW. תחמוצת ברזל-ברזל (מעטפת הליבה) NW הם באורך 2.5 מיקרומטר ויש להם קוטר של 41.5 ננומטר.
1. שחרור ננו-חוטי ברזל
הערה: תהליך הייצור של תחמוצת ברזל / תחמוצת ברזל NW הוסבר בפירוט בפרסום קודם59.
- על משטח חיתוך, חתכו את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) באמצעות להב קצה יחיד ופטיש קטן כדי להתאים לצינור של 2 מ"ל. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את חתיכות האל הקטנות לצינור.
- מלאו את צינור 2 מ"ל, המכיל את חתיכות Al הקטנות, עם 1 מ"ל של 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH). ודא שכל חתיכות Al מכוסות ב- NaOH.
- השאירו את התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתוך מכסה אדים כימי.
- הסירו רק את חתיכות ה-Al באמצעות הפינצטה ושמרו את ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) ששוחררו בתמיסת NaOH למשך 30 דקות נוספות. אל תשנה את פתרון NaOH.
- אספו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף מגנטי והמתינו 2 דקות לפני הסרת תמיסת ה-NaOH הישנה בנפח 1 מ"ל. החלף אותו בתמיסת NaOH טרייה.
- סוניק את צינור 2 מ"ל המכיל את NWs במשך 30 שניות ולהשאיר אותו 1 שעה בתוך מכסה אדים כימי.
- חזור על שלבים 1.5-1.6 לפחות ארבע פעמים.
- שטפו את ה-NWs על ידי הנחת הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.
- השליכו את תמיסת NaOH והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט.
- סוניק את הצינור למשך 30 שניות.
- הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל במדף המגנטי והמתינו 2 דקות.
- השליכו את תמיסת האתנול האבסולוטית הישנה והחליפו אותה ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 30 שניות.
- חזור על שלבים 1.11 ו- 1.12 לפחות ארבע פעמים.
- שמור את NWs ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט בטמפרטורת החדר עד שהם נחוצים.
- למדוד את ריכוז הברזל ומכאן את NWs באמצעות ספקטרומטריית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS).
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. עם זאת, עבור אחסון לאורך זמן, אל תשחרר את NWs מתבנית Al עד שיהיה צורך. שמירה על NW משוחרר מזרז אתנול במשך זמן רב ללא סוניקציה תכופה תיצור צברים כי יהיה צורך פעמים ארוכות יותר של סוניקציה כדי להיות מופרד.
2. ציפוי הננו-חוטים ב-APTES
הערה: בפרוטוקול זה, 100 μL של תמיסת APTES (צפיפות של 0.946 גרם/מ"ל61) מספיקים כדי לצפות 1.6 x 107 מ'2/g של NWs. אם יש שינוי ביחס או במסה של הננו-חומר, יש להתאים את נפח APTES בהתאם.
- העבר את NWs משלב 1.14 לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
- כדי לאסוף את כל NWs שנותרו בצינור 2 מ"ל, לשטוף את הצינור הריק 2 מ"ל פעמיים על ידי הוספת 1 מ"ל של אתנול מוחלט ולהעביר אותו לצינור זכוכית 5 מ"ל באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
- באמצעות פיפטה, לקחת 100 μL של APTES ולהוסיף אותו לפתרון NW ישירות.
- מערבול את צינור הזכוכית 5 מ"ל במשך 10 שניות.
- כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל על המהדק של מעמד תגובה במעבדה.
- מניחים מחצית מצינור הזכוכית 5 מ"ל בתוך המים של האמבטיה העל-קולית וסוניקטים למשך שעה אחת.
- הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה העל-קולית והוסיפו 400 מיקרוליטר מים דה-יוניים (DI) ואחריו 20 מיקרוליטר של 1 M NaOH (קטליזה בסיסית).
זהירות: חשוב להוסיף תחילה את מי DI. - כוונן את צינור הזכוכית 5 מ"ל, כפי שמוסבר בשלבים 2.5-2.6, וסוניקט למשך שעה נוספת.
- הוציאו את צינור הזכוכית 5 מ"ל מהאמבטיה הקולית.
- הניחו מגנט ליד צינור הזכוכית למשך 5 דקות כדי לאסוף את ה- NWs.
- החליפו את הסופרנאטנט ב-1 מ"ל אתנול מוחלט טרי וסוניקט למשך 10 שניות.
- חזור על שלבים 2.10-2.11 ארבע פעמים.
- העבר את כל האתנול המרחף NW לצינור זכוכית חדש של 5 מ"ל באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
הערה: ניתן לאחסן את NW מצופה APTES בשפופרת זכוכית עם אתנול עד שהם נחוצים. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. ביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים
- הפעלת הנוגדנים
הערה: כדי להשיג כ-3 x 104 חלקים של נוגדן/NW, יש להשתמש ב-30 מיקרוליטר של נוגדן (1 מ"ג/מ"ל) לכל 0.1 מ"ג ברזל.- בצינור של 2 מ"ל, יש להמיס 0.4 מ"ג של 3-3-דימתיל-אמינופרופיל קרבודימיד (EDC) ו-1.1 מ"ג של סולפו-N-הידרוקסי-סולפוסוקסינימיד (Sulfo-NHS) ב-1 מ"ל של הידרט חומצה אתנסולפונית 2-N-מורפולינו (MES) (pH 4.7).
הערה: תערובת EDC/sulfo-NHS צריכה להיות טרייה ומוכנה לפני השימוש. - בצינור חדש של 2 מ"ל, הוסף 30 μL של נוגדן נגד CD44 (1 מ"ג / מ"ל), 960 μL של 0.1 M של מלח חוצץ פוספט (PBS, pH 7), ו 10 μL של תערובת EDC / sulfo-NHS (מוכן בשלב 3.1.1), בהתאמה.
- הניחו את הצינור בנפח 2 מ"ל בשייקר צינור בגודל 10 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- בצינור של 2 מ"ל, יש להמיס 0.4 מ"ג של 3-3-דימתיל-אמינופרופיל קרבודימיד (EDC) ו-1.1 מ"ג של סולפו-N-הידרוקסי-סולפוסוקסינימיד (Sulfo-NHS) ב-1 מ"ל של הידרט חומצה אתנסולפונית 2-N-מורפולינו (MES) (pH 4.7).
- הכנת ננו-חוטים מצופים APTES
- במהלך הדגירה בת 15 הדקות בשלב 3.1.3, שטפו את ה-NWs על ידי הצבת מגנט ליד צינור ה-NWs המצופה APTES (משלב 2.13) למשך 2 דקות כדי לאסוף את ה-NWs.
- השליכו את האתנול והחליפו אותו ב-1 מ"ל של 0.1 מ"ל PBS (pH 7), ולאחר מכן בצעו סוניקציה למשך 10 שניות.
- חזור על שלב 3.2.1-3.2.2 ארבע פעמים.
- אסוף את ה- NWs, כפי שמוסבר בשלב 3.2.1, והשלך את PBS 0.1 M. שמור את NWs בצינור ללא כל פתרון.
- התקשרות הנוגדנים
- העבר את כל תמיסת הנוגדנים המופעלת (שהוכנה בשלב 3.1.3) לצינור NWs (מוכן ב- 3.2.4) וסוניקט למשך 10 שניות.
- הניחו את צינור הזכוכית במסובב למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- אספו את ה-NWs באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והשליכו את הסופר-נטנט.
- הוספת 1 מ"ל של תמיסת אלבומין בסרום בקר 2% (BSA) למשך שעה אחת ב-4°C כדי לחסום את התגובה.
- בדוק את האנטיגניות של NW פונקציונלי נוגדנים, למשל, באמצעות immunoprecipitation (IP) ו כתם מערבי (WB) assays.
הערה: לקבלת תוצאות טובות יותר, השתמש ב- NW הפונקציונלי ביולוגית בבדיקת IP, WB או תאימות ביולוגית מיד לאחר שלב החסימה.
4. בדיקת תאימות ביולוגית
הערה: כדי לחקור את התאימות הביולוגית של NWs, ניתן להשתמש במבחני כדאיות תאים שונים ובקווי תאים שונים. ריכוז ה-NWs המשמשים כאן מבוסס על פרסום קודם16. זריעת התאים צריכה להיעשות יום אחד לפני התפקוד הביולוגי של NW.
זהירות: כל השלבים הבאים צריכים להיעשות תחת ארון הבטיחות הביולוגית.
- בצלחת של 96 בארות, זרעו תשע בארות עם 4 x 104 של תאי סרטן המעי הגס (קו תאי HCT116) מרחפים במדיה של תרבית תאים של McCoy (100 μL / באר) ומניחים אותו בתוך האינקובטור למשך הלילה ב 37 ° C ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).
- שטפו את ה-NWs (משלב 3.3.4) עם PBS על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחלף את התמיסה הישנה ב-1 מ"ל של 0.01 M PBS (pH 7). חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- שטפו את ה-NWs (משלב 4.2) עם המדיה המחוממת של McCoy על ידי איסופם באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 והחליפו את PBS הישן ב-1 מ"ל של מדיה מחוממת של McCoy. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
- איסוף NWs (משלב 4.3) באמצעות מגנט כמו בשלב 3.2.1 ולהחליף את 1 מ"ל של מדיה מחוממת McCoy עם 900 μL של מדיה מחוממת McCoy. ריכוז NWs צריך להיות 0.02 מ"ג של NWs לכל מ"ל.
- קח את צלחת 96 בארות (משלב 4.1) מן האינקובטור אל ארון הבטיחות הביולוגית.
- מתחת לארון הבטיחות הביולוגית, השליכו את המדיה הישנה מהתאים והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של NW מרחף (שהוכן בשלב 4.4).
- נערו את הצלחת (שהוכנה בשלב 4.6) ביד ולאחר מכן דגרו עליה במשך 24 שעות בתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- למחרת, הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.7) מהאינקובטור. תחת ארון הבטיחות הביולוגית, הוסף 11 μL של מגיב כדאיות התא (טבלה של חומרים) לכל באר באמצעות פיפטה מרובת דפנות.
- נערו את הצלחת עם שייקר הצלחת במהירות של 10 x גרם במשך 10 שניות.
- דוגרים על הצלחת במשך שעה באינקובטור.
- הוציאו את צלחת 96 הקידוחים (שהוכנה בשלב 4.10) מהאינקובטור. קרא את הלוח בקורא המיקרו-צלחות (רשימת חומרים) על-ידי מדידת הספיגה של מגיב הכדאיות של התא (עירור 540 ננומטר, פליטה 590 ננומטר).
Representative Results
חשוב לחתוך את דיסקיות האלומיניום (Al) (איור 2A) לחתיכות קטנות (איור 2B) כדי שיתאימו לצינור שבו משתמשים. לאחר הוספת 1 M NaOH לחתיכות אל, תגובה צריכה להתחיל מיד, אשר נצפתה על ידי יצירת בועות. אם לא מתרחשת תגובה תוך דקה אחת או אם התגובה מהירה מאוד והתמיסה הופכת עכורה לחלוטין עם ענן לבן, הסר מיד את תמיסת NaOH הישנה והחלף אותה בתמיסה חדשה. בדוק את ערך ה- pH של תמיסת NaOH. זה צריך להיות pH>12. כאשר ה-NWs משתחררים מחתיכות ה-Al ב-30 הדקות הראשונות עם NaOH, ה-NWs (אשכולות שחורים, איור 3A) יצופו בתוך תמיסת NaOH. בשלב האחרון של שחרור NWs, הפתרון צריך להיות הומוגני. שום אשכול של NWs לא צריך להיות שם (איור 3B). אם NW נאספו עם מגנט במשך 3 דקות, התמיסה צריכה להיות ברורה, וגלולת NW צריכה להיות שחורה (איור 3C). אם הגלולה הייתה אפורה, השליכו את הצינורית והתחילו שוב עם דגימת Al חדשה.
במהלך תהליך השחרור, NWs מקבלים שכבת תחמוצת ברזל טבעית עם עובי סביב 5 ננומטר, אשר דומה לדיווחים קודמים11,16,20. לשכבת תחמוצת זו תרומה חשובה לתאימות ביולוגית 16, פונקציונליות16,18 ותכונות מגנטיות20 של NWs. עם זאת, שמירה על NWs בתבנית שלהם (כלומר, לא לשחרר אותם) עד הצורך תמנע מהם השפעות סביבתיות עליהם. הקוטר והאורך הממוצעים של ה-NW לאחר תהליך השחרור היו 2.5 מיקרומטר ו-41.5 ננומטר, בהתאמה. ניתן לחשב את המסה של NW יחיד כפי שמוסבר בטבלה 1 והיא אושרה על ידי ספקטרוסקופיית מסה פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). כאן, כל דיסק אלומינה הכיל סביב 0.3 מ"ג ברזל.
כדי להפחית את הצבירה של NWs לאחר שחרורם ולאפשר פונקציונליות נוספת, NWs צופו ב-APTES. ציפוי זה מספק קבוצות אמין חופשיות ויש לו את היכולת לצפות חומרים מגנטיים ולא מגנטיים39,45, מה שהופך אותו מתאים לציפוי NW רב מקטעים כגון NW ברזל / זהב. במהלך ציפוי ננו-חוטים, חשוב להתמקד בשני דברים. ראשית, חשב את הנפח הדרוש ממולקולות APTES62 בהתבסס על שטח הפנים והמסה של NWs. חישובים אלה הוצגו בלוח 2. שנית, שמור על ננו-חוטים בתנועה רציפה כדי למנוע הצטברות שלהם וחסימה של חלקים מסוימים של משטחי NW מציפוי APTES. לדוגמה, בפרוטוקול זה, הננו-חוטים הודגרו תחת האמבטיה העל-קולית והמסובב במהלך ציפוי APTES ותפקוד הנוגדנים, בהתאמה. כל מולקולת APTES מכילה אטום סיליקון וקבוצת אמין פונקציונלית טרמינלית21. לכן, ניתן להשתמש במפות ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה אלקטרונים (EELS) כדי לאשר את נוכחותו של ציפוי APTES על-ידי הצגת אטומי סיליקון (צבע ורוד) על פני השטח של NW (איור 4A). לעומת זאת, אטומי NW שאינם מצופים מראים אטומי ברזל בכחול קליפה (איור 4B) ואטומי תערובת ברזל/חמצן בכחול בהיר (איור 4B). מיפוי EELS המתאים של NW לא מצופה (איור 4C,4D) מראה עוצמה גבוהה יותר של ברזל לעומת חמצן במרכז (איור 4C) מאשר על פני השטח (איור 4D), מה שמצביע על מבנה תחמוצת ברזל (מעטפת הליבה). מיפוי EELS (איור 4 C,4D) זוהה כי שכבת תחמוצת הברזל על NWs היא Fe 3 O4 יותר מאשר Fe2O3, בדומה לפרסום קודם20.
ניתן לאשר את האנטיגניות של הנוגדנים המצורפים באמצעות מבחני IP ו-WB, שבהם ניתן לצפות בפס על הדגימה החיובית אך לא על קבוצת הבקרה השלילית (איור 5). שימו לב שכדי לשמור על פס ברור, אין להשתמש בפחות מ-0.1 מ"ג NWs/10 x 106 תאים. בדיקת BCA (טבלה של חומרים) בשילוב עם כמה חישובים המוצגים בטבלה 3 שימשה לכימות מספר הנוגדנים על NW.
יתר על כן, מדידת פוטנציאל הזטה שימשה להבהרת פונקציונליות פני השטח. קבוצת האמינים הסופיים ב-APTES הפחיתה את המטען השלילי של NW ללא ציפוי, כפי שניתן לראות באיור 6. NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים גם שינו את המטען בהשוואה ל-NW מצופה APTES (איור 6). כל מדידות פוטנציאל הזטה נעשו ב-pH 7.
ניתן לאשר את מיקוד התאים הספציפיים של NWs המתפקדים על-ידי נוגדנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 7). יש לבדוק את התאימות הביולוגית של כל ננו-חומר חדש לפני תחילת כל יישום. לכן, נעשה שימוש בבדיקת כדאיות התא, והיא אישרה שה-NW הלא-מצופה, המצופה APTES והנוגדנים היו תואמים ביולוגית אפילו עם ריכוז גבוה (איור 8).
איור 1: סכמטי מייצג את שיטת הציפוי והביו-פונקציונליזציה של ננו-חוטים. (A) ציפוי ברזל NW עם APTES. (B) הפעלת הנוגדנים באמצעות EDC + Sulfo-NHS, כדי שיהיה בסוף (C) ננו-חוט פונקציונלי של נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דיסק אלומיניום שהושקע בברזל. (א) דיסק האלומיניום לפני החיתוך. (B) הקווים האדומים הראו היכן לחתוך את הדיסק. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שלבי שחרור ננו-חוטים. (A) אשכולות של ננו-חוטים צפים בתמיסת NaOH. התמונה צולמה 10 דקות לאחר הוספת NaOH ולאחר הסרת קרום Al . (B) ננו-חוטים המרחפים באתנול. התמונה צולמה בשלב השחרור האחרון, מיד לאחר שלב הסוניקציה. (C) גלולת ננו-חוט שחורה שנאספה על ידי מגנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מפת ספקטרוסקופיית אובדן אנרגיה של אלקטרונים (EELS). (A) ננו-חוט מצופה APTES (APTES-NW). הצבעים הכחול והוורוד מייצגים אטומי ברזל וסיליקון, בהתאמה. (B) ננו-חוט לא מצופה (NW). צבעי הכחול והתכלת מייצגים את מיפוי תערובת הברזל והברזל/חמצן, בהתאמה. מיפוי EELS המתאים של (C) הליבה ו-(D) המעטפת של NW שאינם מצופים. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אישור תפקוד ופעילות של ננו-חוטים מצומדים של נוגדנים. האנטיגניות של CD44-NWs אושרה באמצעות משקעים חיסוניים (IP) וכתם מערבי (WB). +Ve: מייצג את הבקרה החיובית (ליזט תא מלא). -Ve: מייצג את הבקרה השלילית (רק NW לא מצופה). - תאי CD44: מייצג תאים שאינם מבטאים אנטיגן CD44; + תאי CD44: מייצג תאי סרטן המעי הגס המבטאים אנטיגן CD44. זהו כתם מייצג של n = 3 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ערכים פוטנציאליים של Zeta עבור NWs, APTES-NW ונוגדנים. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תמונות מיקרוסקופיות קונפוקליות מראות את המיקוד הספציפי. CD44-NWs מוצגים מתחברים (A ו- C), בעוד שה- Isotype-NWs (בקרה שלילית) לא התחברו (B ו - D). הצבעים אדום, כחול וירוק מייצגים את קרום התא, הגרעין וצביר CD44-NWs, בהתאמה. A ו- B הן תמונות השדה הבהירות של C ו- D, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מחקר כדאיות התא של תאי סרטן המעי הגס (HCT116) מודגרים עם פורמולציות שונות של ננו-חוטים. התאים טופלו ב-NWs לאחר 24 שעות של דגירה ולאחר מכן הודגרו במשך 24 שעות עם NWs. כל הניסויים בוצעו בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. העמודות מייצגות את הממוצע ± שגיאת תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פרמטר | ערך | יחידה | ||
| אורך Fe NW (h) | 2.6 | מיקרומטר | ||
| רדיוס (קוטר/2) (r) | 0.01679231 | מיקרומטר | ||
| צפיפות Fe (D) | 7.87 | גר'/ס"מ3 | ||
| 1 נפח Fe NW (V) = π r^2h | 2.30E-15 | ס"מ 3 | ||
| 1 Fe NW מסה = V x D | 1.80E-08 | מיקרוגרם | ||
| 1 שטח פנים Fe NW = 2π r^2 + 2πrh | 2.76E-01 | מיקרומטר2 | 2.8E+05 | נ.מ.מ 2 |
טבלה 1: חישוב מסת הברזל NW.
| פרמטר | ערך | יחידה |
| צפיפות APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| מולקולר ווייט (MW) של APTES | 2.21E+02 | גר'/מול |
| מספר שומה APTES = מסה / MW | 4.29ה-03 | מול |
| מספר מולקולות APTES/100 μL** | 2.57E+21 | מולקולות |
| גודל APTES *** | 5.00E-01 | ננומטר |
| שטח הפנים של APTES | 2.00E-01 | נ.מ.מ 2 |
| שטח פנים NW **** | 2.76E+05 | נ.מ.מ 2 |
| מספר NWs ב 0.3mg של NW **** | 1.70E+10 | NWs |
| מספר מולקולות APTES הדרושות ליצירת שכבה אחת סביב NW | 1.38E+06 | מולקולת APTES |
| מספר מולקולות APTES הדרושות עבור 0.3 מ"ג של NWs | 2.35E+16 | מולקולת APTES |
| *שבירה מספר 61 | ||
| ** מספר מולקולות = מספר מול*אבוגדרו (6E+23) | ||
| שבירה מספר 62 | ||
| מטבלה 1 | ||
טבלה 2: חישוב מספר מולקולות APTES הדרושות לציפוי NWs.
| נוגדן IgG בצורת Y | NW | |
| מסה לנוגדן אחד | 2.3E-13 מיקרוגרם | 1.8E-08 מיקרוגרם* |
| שטח פנים לנוגדן אחד | 23 נאנומטר2 | 2.6E+05 נאנומטר2 |
| מבוסס על בדיקת BCA | 0.3 מ"ג ל-1 מ"ג | |
| מספר מולקולת הנוגדן ו- NW ב- 0.3 מ"ג נוגדנים למ"ג NW | ~1E + 15 נוגדנים ** לכל ~ 5.6E + 10 NW | |
| מספר מולקולת נוגדנים לכל NW | ~2E+04 נוגדנים לכל 1 NW*** | |
| *מחושב מטבלה 1 | ||
| **מספר הנוגדנים ב-0.3 מ"ג חושב על ידי חלוקת מספר הנוגדנים שקיבלנו מבדיקת BSA (0.3 מ"ג) במשקל המולקולרי הממוצע של נוגדני IgG בצורת Y (180 kDa = 3E-16 מ"ג). | ||
| בהתבסס על שטח הפנים של מולקולה אחת של נוגדני IgG בצורת Y (~23 nm2) ושטח הפנים של NW אחד (~2.6E+05 nm2), סביב 1E+04 נוגדנים יספיקו כדי ליצור שכבה אחת על NW. במקרה שלנו, צפיפות הנוגדנים הייתה גבוהה פי שניים מהכמות הצפויה. זה יכול להיות קשור לציפוי APTES המספק יותר זרועות המאפשר חיבור גבוה של הנוגדנים. מקרה זה מבטיח כי NW מכוסה במלואו עם נוגדנים ואת ההזדמנות עבור הנוגדן להיקשר אנטיגן פני התא, ללא קשר לכיוון של NWs יהיה גבוה. עם זאת, אם צפיפות הנוגדנים נמוכה מהמספר הצפוי (מולקולת נוגדנים 1E+04), סיכויי הקישור בין התא לבין NWs יהיו נמוכים יותר. | ||
טבלה 3: חישוב מספר הנוגדנים על ננו-חוט.
Discussion
כמו בכל שיטת ייצור וציפוי ננו-חומרים, נדרשת איכות גבוהה של הפתרונות המשמשים. ניתן לעשות שימוש חוזר בפתרונות השחרור (1 M NaOH) והפונקציונליות (MES) מספר פעמים. עם זאת, בדיקת ערך ה- pH שלהם לפני תחילת תהליך חדש חשובה מאוד. בשלב השחרור, שטיפת NWs עם NaOH צריך להתבצע לפחות ארבע פעמים. ככל שהכביסה טובה יותר, כך יציבות ה-NW טובה יותר ופחות הם מצטברים. שכבת התחמוצת משפרת את יציבות ה-NWs בעת טבילה באתנול או במים63.
הקוטר והאורך של ה-NW הושפעו לאחר שציפויים אותם ב-APTES ובנוגדנים. כאן, הקוטר גדל מ 41.5 ננומטר ל 70 ננומטר, ואת האורך ירד מ 2.5 מיקרומטר ל 1.6 מיקרומטר, בשל שלבי סוניקציה לשבור NWs. לכן, חיוני לאפיין את המורפולוגיה של NWs לאחר שלב biofunctionalization.
החיבור של הנוגדנים ל- NWs מסתמך על האינטראקציה הקוולנטית בין קבוצת האמין (על APTES) לבין קבוצת הקרבוקסיל (על הנוגדן). לכן, אישור נוכחותו של ציפוי APTES הוא צעד חשוב, שעבורו השתמשנו במיפוי EELS. שיטת הציפוי בטוחה ופשוטה. זה לא צריך טמפרטורות גבוהות או זמני דגירה ארוכים. כמו כן, ציפוי APTES פועל כמקשר כדי לאפשר התקשרות קוולנטית של נוגדנים או חלבונים אחרים שיש להם קבוצת קרבוקסיל.
במקרה של תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדן, האנטיגניות של אתרי הקישור של הנוגדנים לאחר תהליך biofunctionalization יכול להיות מושפע. ניתן להשתמש בשיטת IP ו- WB כדי לחקור בעיה זו. שימוש בשיטת הביו-פונקציונליזציה המוזכרת בפרוטוקול זה יאפשר לנוגדנים להיקשר ל-NWs עם אנטיגניות גבוהה לקולטן תא מסוים. יתר על כן, תפקוד ביולוגי של NWs עם נוגדנים הוסיף את היכולת לכוון את התאים עם קולטן של עניין, CD44 כאן. זה אושר על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי. למרות שהתאימות הביולוגית של NWs לא מצופים הייתה גבוהה (>95%), הוספת ציפוי APTES או נוגדנים ל- NWs שיפרה את התאימות הביולוגית שלהם ב- 100%.
יתר על כן, פרוטוקול הציפוי והביו-פונקציונליזציה יעיל, חסכוני וניתן לשחזור. זה צריך להיות ישים לכל ננו-חומר תחמוצת ברזל אחר, שבו ריכוז הציפוי והנוגדנים המחוברים צריך להיות אופטימלי בהתבסס על שטח הפנים והמסה של הננו-חומר. פרוטוקול זה יכול להיעשות בבטחה בתנאי הסביבה במעבדה הכללית. הביו-פונקציונליזציה שיפרה באופן משמעותי את התאימות הביולוגית של הננו-חומר ואת יכולת המיקוד שלו. באופן כללי, NWs הם חומרים מבטיחים ביותר עבור יישומים ננו-רפואיים (כולל טיפולים רב-מודאליים או קומבינטוריים, זיהוי או הנחיה של תאים, וחישה ביולוגית). בשילוב עם ביו-פונקציונליזציה, כפי שמתואר כאן, ניתן להשיג מיקוד תאים ספציפי לשיפור הדיוק והיעילות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
- Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
- Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
- Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
- Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
- Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
- Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
- Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
- Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
- Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
- Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
- Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
- Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
- Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
- Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
- Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
- Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
- Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
- Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
- Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
- Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
- Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
- Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
- Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
- Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
- Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
- Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
- Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
- Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
- Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
- Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
- Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
- Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
- Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
- Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
- Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
- Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
- Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
- Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
- Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
- Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
- Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
- Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
- Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
- Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
- Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L.
- Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
- Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
- Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
- Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).
