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Bioengineering

चुंबकीय नैनोमटेरियल्स का बायोफंक्शनलाइजेशन

Published: July 16, 2020 doi: 10.3791/61360
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Division of Biological and Environmental Sciences and Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Division of Computer, Electrical and Mathematical Sciences and Engineering, King Abdullah University of Science and Technology

Summary

इस काम में, हम विशिष्ट सेल लक्ष्यीकरण के लिए एंटीबॉडी के साथ चुंबकीय नैनोमटेरियल्स को बायोफंक्शनलाइज करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, हम कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए लोहे के नैनोवायर्स का उपयोग करते हैं।

Abstract

चुंबकीय नैनोमटेरियल्स को विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में बहुत ध्यान दिया गया है। साइड इफेक्ट्स को कम करते हुए निदान और उपचार में उनकी प्रभावकारिता को बढ़ाने के लिए विशिष्ट लक्ष्यीकरण एजेंटों के साथ इन नैनोमटेरियल्स को बायोफंक्शनलाइज करना एक महत्वपूर्ण पहलू है। गैर-चुंबकीय नैनोमटेरियल्स की तुलना में चुंबकीय नैनोमटेरियल्स का लाभ संपर्क-मुक्त तरीके से और बड़ी दूरी पर चुंबकीय क्षेत्रों का जवाब देने की उनकी क्षमता है। यह उन्हें मार्गदर्शन या जमा करने की अनुमति देता है, जबकि उनकी निगरानी भी की जा सकती है। हाल ही में, जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए अद्वितीय विशेषताओं के साथ चुंबकीय नैनोवायर्स (एनडब्ल्यू) विकसित किए गए थे। इन एनडब्ल्यू का बड़ा चुंबकीय क्षण एक चुंबकीय क्षेत्र द्वारा उनके आंदोलन का अधिक कुशल रिमोट कंट्रोल सक्षम बनाता है। इसका उपयोग कैंसर उपचार, दवा वितरण, सेल ट्रेसिंग, स्टेम सेल भेदभाव या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग में बड़ी सफलता के साथ किया गया है। इसके अलावा, टेम्पलेट-असिस्टेड इलेक्ट्रोकेमिकल जमाव द्वारा एनडब्ल्यू निर्माण एनडब्ल्यू गुणों पर कड़े नियंत्रण के साथ एक बहुमुखी विधि प्रदान करता है। विशेष रूप से लौह एनडब्ल्यू और लौह-लौह ऑक्साइड (कोर-शेल) एनडब्ल्यू उनके उच्च चुंबकीकरण और कम विषाक्तता के कारण बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं।

इस काम में, हम एक विशिष्ट सेल सतह मार्कर के खिलाफ निर्देशित विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ आयरन / आयरन ऑक्साइड एनडब्ल्यू को बायोफंक्शनलाइज करने की एक विधि प्रदान करते हैं जो बड़ी संख्या में कैंसर कोशिकाओं में अतिरंजित होता है। चूंकि विधि लौह ऑक्साइड सतह के गुणों का उपयोग करती है, इसलिए यह सुपरपैरामैग्नेटिक आयरन ऑक्साइड नैनोकणों पर भी लागू होती है। एनडब्ल्यू को पहले 3-एमिनोप्रोपिल-ट्राई-एथोक्सी-सिलेन (एपीटीईएस) के साथ लेपित किया जाता है जो एक लिंकर के रूप में कार्य करता है, जिससे एंटीबॉडी सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। एपीटीईएस कोटिंग और एंटीबॉडी बायोफंक्शनलाइजेशन इलेक्ट्रॉन ऊर्जा हानि स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईईएलएस) और जेटा संभावित माप द्वारा साबित होते हैं। इसके अलावा, एनडब्ल्यू पर एंटीबॉडी की एंटीजेनेसिटी का परीक्षण इम्यूनोप्रेसिपेशन और वेस्टर्न ब्लॉट का उपयोग करके किया जाता है। बायोफंक्शनलाइज्ड एनडब्ल्यू के विशिष्ट लक्ष्यीकरण और उनकी जैव-रासायनिकता का अध्ययन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और सेल व्यवहार्यता परख द्वारा किया जाता है।

Introduction

चुंबकीय नैनोमटेरियल्स की एक अनूठी संपत्ति चुंबकीय क्षेत्र1 का जवाब देने की उनकी क्षमता है, जिसका उपयोग उन्हें कई तरीकों से सक्रिय करने के लिए लाभकारी रूप से किया जा सकता है, जबकि उन्हें चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा भी निगरानी की जा सकती है। उच्च आवृत्ति पर एक वैकल्पिक चुंबकीय क्षेत्र लागू करते समय, वे गर्मी उत्पन्न कर सकते हैं, जो हाइपरथर्मिया को प्रेरित कर सकता है, एक चिकित्सीय विकल्पप्रदान करता है। एक अन्य दृष्टिकोण फोटोथर्मल उपचार है, जिसे निकट अवरक्त (एनआईआर) लेजर 2,3 के साथ महसूस किया जा सकता है।

चुंबकीय नैनोमटेरियल्स की बड़ी संख्या में, लौह ऑक्साइड को जैविक अनुप्रयोगों जैसे चुंबकीय पृथक्करण, हाइपरथर्मिया2,4, सेल मार्गदर्शन5, दवा वितरण 6,7,8 और एमआरआई 9,10 में एक कंट्रास्ट एजेंट के रूप में सबसे अधिक ध्यान दिया गया है। यह उनकी उच्च जैव-रासायनिकता 11,12, बड़े चुंबकीकरण 11,12, लेपित होने की क्षमता 9,13,14,15, दवाओं को ले जाने की क्षमता 2,16, दवाओं के साथ कार्यात्मक होने की क्षमता2,16 या / और लक्षित एजेंटों 12,13,17 के कारण है।, 18, और ऑप्टिकल ऊर्जा को गर्मी में परिवर्तित करने की क्षमता2. हाल ही में, मैग्फोर्स ने हाइपरथर्मिया उपचारके लिए आयरन ऑक्साइड नैनोकणों का उपयोग करके कैंसर रोगियों पर नैदानिक परीक्षण शुरू किया।

हाल ही में, बायोमेडिकलअनुप्रयोगों 3,11,16,20,21,22 के लिए चुंबकीय नैनोवायर्स (एनडब्ल्यू) का तेजी से शोषण किया गया है। उनके पास चुंबकीय नैनोबीड्स के समान गुण हैं, लेकिन एक अनिसोट्रोपिक आकार और एक बहुत बड़ा चुंबकीय क्षण प्रदान करते हैं, जो चुंबकीय क्षेत्र23,24 द्वारा एक बहुत ही कुशल रिमोट कंट्रोल को सक्षम बनाता है, जिसमें मैग्नेटो-मैकेनिकल प्रभाव 25,26,27,28,29 को प्रेरित करने के लिए कम आवृत्ति एक्ट्यूएशन शामिल है।. नतीजतन, एनडब्ल्यू को विभिन्न जैविक अनुप्रयोगों जैसे एक्सोसोम आइसोलेशन30 सेल ट्रैकिंग21, कैंसर उपचार 3,11,16, दवा वितरण 16,31,32 और एमआरआई कंट्रास्ट एजेंट 33 के रूप में लागू किया गया है।

विशिष्ट सेल लक्ष्यीकरण क्षमता के साथ बायोफंक्शनलाइज्ड चुंबकीय नैनोमटेरियल्स में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों और सटीक चिकित्सा में34,35 की बड़ी क्षमता है। इन लक्ष्यीकरण एजेंटों को संलग्न करने के लिए, नैनोमटेरियल्स पर एक सतह संशोधन की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, उन्हें एक कोटिंग की आवश्यकता होती है जो एक कार्यात्मक समूह प्रदान करती है, जो उपचार एजेंटों के लगाव की सुविधा प्रदान करती है। साहित्य में, चुंबकीय नैनोमटेरियल्स के लिए कार्बनिक और अकार्बनिक कोटिंग्स की एक बड़ी संख्या है। कार्यात्मक समूह के आधार पर जिसे नैनोमटेरियल में स्थिर किया जा सकता है, इन कोटिंग्स को चार मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है: कार्बोक्जिलिक एसिड समूहों पर आधारित अणु, पॉलिमर, हिस्टिडाइन और सिलेन समूहों के आधार पर अणु।

कार्बोक्जिलिक एसिड समूहों पर आधारित अणु सतह संशोधन विधियों में से एक है। यह उच्च आत्मीयता का उपयोग करता है
कोटिंग पर नकारात्मक कार्बोक्जिलिक एसिड समूह और चुंबकीय नैनोमटेरियल्स पर सकारात्मक चार्ज 36,37,38 के बीच। एक धातु की सतह पर कार्बोक्जिलिक एसिड की बाध्यकारी प्रक्रिया में धातु-कार्बोक्सिलेट लवण की पीढ़ी या धातु के लिए कार्बोक्सिल समूह का आसंजन शामिल हो सकता है। हालांकि, बहु-खंडित एनडब्ल्यू के लिए, जैसे लोहा / सोना या निकल / सोने के एनडब्ल्यू, जिनमें जैव-अनुप्रयोगों के लिए शानदार गुण हैं39,40, इस प्रकार की कोटिंग आसानी से लागू नहीं की जा सकती है। इसे एक ही समय में दो अलग-अलग कोटिंग्स की आवश्यकता होती है: सोने के खंडों को संशोधित करने के लिए थिओल समूह और चुंबकीय खंडों (लोहा या निकल) के लिए कार्बोक्सिल समूह। कार्बोक्सिल समूहों पर आधारित अणुओं के कुछ उदाहरण हेमटोपोरफाइरिन, पिमेलिक एसिड, पामिटिक एसिड और 3-[(2-एमिनोथाइल) डिथियो] प्रोपियोनिक एसिड (एईडीपी)38 हैं। पॉलिमर का उपयोग करके चुंबकीय नैनोमटेरियल्स के सतह संशोधन कुछ अलग फायदे प्रदान करते हैं। पॉलिमर के बड़े आणविक भार के कारण, यह एक समाधान38 में चुंबकीय नैनोमटेरियल की स्थिरता को बढ़ाता है। हालांकि, यह नैनोमटेरियल38 के आकार में काफी वृद्धि करेगा। पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी), पॉलीथाइलीनमाइन (पीईआई), आर्जिनिन-ग्लाइसिन-डी एस्पार्टिक एसिड (आरजीडी), और पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) सतह संशोधनों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले पॉलिमर के कुछ उदाहरण हैं। प्रत्येक की अपनी विशेषताएं हैं और38 का उपयोग करती हैं। तीसरी सतह संशोधन विधि हिस्टिडाइन कोटिंग का उपयोग कर रही है। हिस्टिडाइन एक प्रोटीन है जिसमें हिस्टिडाइन एमिनो एसिड साइड चेन होती है जिसमें निकल38 जैसे चुंबकीय नैनोमटेरियल्स की सीमित संख्या के लिए उच्च संबंध होता है। यह प्रोटीन शोधन प्रक्रियाओं 38,41,42 के लिए नियोजित किया जा सकता है। एक हिस्टिडाइन कोटिंग को बहु-खंडित एनडब्ल्यू पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि निकल / नैनोमटेरियल सतह का सिलनाइजेशन एक अच्छी तरह से स्थापित प्रक्रियाहै 38,43,44. यह तीन एकल बंधों के माध्यम से किसी भी धातु ऑक्साइड की सतह से जुड़े एक सिलिकॉन परमाणु पर आधारित है, और एक ही समय में यह सिलिकॉन परमाणु एक अल्काइल श्रृंखला 38,43,44 के माध्यम से अंत में कार्यात्मक समूह से जुड़ा हुआ है। इस कोटिंग का लाभ मुक्त अमाइन समूह प्रदान कर रहा है, और इसमें क्रमशः निकल और सोने जैसे चुंबकीय और गैर-चुंबकीय सामग्री38,45 दोनों को कोट करने की क्षमता है। इसलिए, खारा समूह पर आधारित अणुओं का उपयोग करना बहु-खंडित एनडब्ल्यू को बायोफंक्शनलाइज करने के लिए एक व्यावहारिक मार्ग है। सिलेन समूहों पर आधारित अणुओं के कुछ उदाहरण (3-एमिनोप्रोपाइल) ट्राइएथोक्सीसिलेन (एपीटीईएस) और (3-एमिनोप्रोपाइल) ट्राइमेथॉक्सीसिलेन (एपीटीएमएस) 38,45 हैं।

कोटिंग के लिए एक लक्ष्यीकरण एजेंट के अतिरिक्त रोगग्रस्त कोशिकाओं के निदान और उपचार दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है, और साथ ही, स्वस्थ ऊतकों पर दुष्प्रभाव ों को कम कर सकताहै46,47. नैनोमैटेरियल्स की सतह पर एक लक्ष्यीकरण एजेंट के अलावा एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर्स7 के माध्यम से सेलुलर चयनात्मक बंधन और आंतरिककरण दोनों को बढ़ाता है। इन लक्ष्यीकरण लिगेंड के बिना, नैनोमटेरियल्स कोशिका झिल्ली के साथ गैर-विशिष्ट रूप से बातचीत करते हैं, जो लिगेंड48 के साथ नैनोमटेरियल्स की तुलना में कम दर पर बांधता है। कैंसर के ऊतकों को लक्षित करने की चुनौतियों में से एक स्वस्थ ऊतकों के लिए उनकी विशिष्ट समानता है। इसलिए, लक्ष्यीकरण की सफलता मुख्य रूप से जैविक लक्ष्य49,50 के रूप में उपयोग करने के लिए उपयुक्त लिगैंड का निर्धारण करने पर निर्भर करती है। कैंसर कोशिकाओं48,51 (जैसे, सीडी 44, स्वस्थ कोशिकाओं 52,53,54,55 की तुलना में कैंसर कोशिकाओं में इसकी उच्च अभिव्यक्ति के कारण) को नैनोमटेरियल्स को निर्देशित करने के लिए विभिन्न लक्ष्यीकरण एजेंटों को नियोजित किया गया है।

लक्ष्यीकरण एजेंटों को तीन मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है, उन घटकों के आधार पर जो वे बने हैं और उनकी जटिलता: एपटामर-आधारित लक्ष्यीकरण, लिगैंड-आधारित लक्ष्यीकरण और एंटीबॉडी-आधारित लक्ष्यीकरण। एपटामर डीएनए या आरएनए-ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के छोटे रासायनिक रूप से संश्लेषित किस्में हैं जो दो और तीन-आयामी संरचनाओं में मुड़े हुए हैं, जिससे वे एक विशिष्ट एंटीजन को लक्षित करने में सक्षम होते हैं, अक्सर प्रोटीन56। लिगैंड-आधारित लक्ष्यीकरण में पेप्टाइड्स और लघु अमीनो एसिड चेन57 शामिल हैं। एंटीबॉडी-आधारित लक्ष्यीकरण में एक पूरे एंटीबॉडी, या एंटीबॉडी टुकड़े का उपयोग शामिल है, जैसे कि एकल-श्रृंखला चर टुकड़े या एंटीजन-बाइंडिंग टुकड़े51। इस विधि का उपयोग करने से अपने विशिष्ट लक्ष्य एंटीजन के लिए उच्च बाध्यकारी संबंध के साथ दो बाध्यकारी साइटों को रखने का लाभ होता है, जो इसे अत्यधिक उच्च चयनात्मकतादेता है। बाइंडिंग साइटें एक लॉक के अनुरूप होती हैं और एंटीजन एक कुंजी58 के अनुरूप होती हैं।

इस काम में, उपयोग किए गए एनडब्ल्यू को एल्यूमीनियम ऑक्साइड झिल्ली पर इलेक्ट्रोडपोजिशन द्वारा निर्मित किया गया था, एक विधि जो पिछले प्रकाशन59 में विस्तार से वर्णित थी। यहां ध्यान इन लौह-लौह ऑक्साइड (कोर-शेल) एनडब्ल्यू को झिल्ली से जारी करने और लक्ष्यीकरण क्षमता प्रदान करने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ बायोफंक्शनिंग करने पर है। एंटीबॉडी सीधे लौह-लौह ऑक्साइड एनडब्ल्यू से नहीं बंध सकते हैं और उन्हें एक लिंकर की आवश्यकता होती है। एपीटीईएस के साथ एनडब्ल्यू को कोटिंग मुक्त अमाइन समूह प्रदान करता है, जिससे एंटीबॉडी पर कार्बोक्सिल समूह के माध्यम से सहसंयोजक लगाव सक्षम होता है (चित्रा 1)। एपीटीईएस कोटिंग का लाभ चुंबकीय21 और गैर-चुंबकीय60 सामग्री दोनों के लिए काम करने की क्षमता है, जैसे लोहा / सोना या निकल / सोनाएनडब्ल्यू 45। इस प्रोटोकॉल में बताए गए सभी कोटिंग और बायोफंक्शनलाइजेशन चरणों का उपयोग सामान्य रूप से किसी भी लौह / लौह ऑक्साइड नैनोमटेरियल के साथ किया जा सकता है। आयरन/आयरन ऑक्साइड एनडब्ल्यू का उपयोग यहां एक उदाहरण के रूप में किया गया था। परिणाम बताते हैं कि एंटीबॉडी-कार्यात्मक एनडब्ल्यू में विशिष्ट सेल सतह रिसेप्टर्स के लिए एक उच्च एंटीजेनिकता होती है, जिसका उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। उदाहरणों में सेल पृथक्करण, दवा वितरण, फोटोथर्मल और / या मैग्नेटो-मैकेनिकल उपचार का उपयोग करके विशिष्ट कैंसर सेल उपचार शामिल हैं।

Protocol

सावधानी: उपयोग करने से पहले हमेशा सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) से परामर्श करें। सभी उपयुक्त सुरक्षा प्रथाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, लैब कोट, पूर्ण लंबाई पैंट, बंद पैर के जूते) का उपयोग करें। जैविक फ्यूम हुड में सभी जैविक प्रतिक्रियाएं करें।

नोट: इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य 3 x 10 4 एंटीबॉडी / एनडब्ल्यू के घनत्व के साथ एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी के साथ लेपित 0.36 मिलीग्राम लोहे / एमएल के बराबर 2 x 10 1010 बायोफंक्शनलाइज्ड एनडब्ल्यू / एमएल का उत्पादन करना है। लौह-लौह ऑक्साइड (कोर-शेल) एनडब्ल्यू 2.5 μm लंबे होते हैं और इनका व्यास 41.5 एनएम होता है।

1. लोहे के नैनोवायर्स की रिहाई

नोट: आयरन/आयरन ऑक्साइड एनडब्ल्यू की निर्माण प्रक्रिया को पिछले प्रकाशन59 में विस्तार से समझाया गया था।

  1. एक काटने की चटाई पर, एल्यूमीनियम (एएल) डिस्क (चित्रा 2 ए) को छोटे टुकड़ों (चित्रा 2 बी) में काट लें, जिसमें 2 एमएल ट्यूब में फिट होने के लिए एकल किनारे ब्लेड और एक छोटे हथौड़ा का उपयोग किया जाता है। छोटे अल टुकड़ों को ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
  2. 2 एमएल ट्यूब भरें, जिसमें छोटे अल टुकड़े होते हैं, 1 एमएल 1 एम सोडियम हाइड्रॉक्साइड (एनएओएच) के साथ। सुनिश्चित करें कि सभी अल टुकड़े NaOH के साथ कवर किए गए हैं।
  3. रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान को काम करने दें।
  4. चिमटी का उपयोग करके केवल अल टुकड़ों को निकालें और जारी किए गए एनडब्ल्यू (काले क्लस्टर, चित्रा 3 ए) को अतिरिक्त 30 मिनट के लिए एनएओएच समाधान में रखें। NaOH समाधान को न बदलें।
  5. एक चुंबकीय रैक में 2 एमएल ट्यूब रखकर एनडब्ल्यू एकत्र करें और पुराने 1 एम एनएओएच समाधान को हटाने से पहले 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इसे ताजा NaOH समाधान के साथ बदलें।
  6. एनडब्ल्यू युक्त 2 एमएल ट्यूब को 30 सेकंड के लिए सोनिकेट करें और इसे रासायनिक फ्यूम हुड के अंदर 1 घंटे के लिए छोड़ दें।
  7. चरण 1.5-1.6 को कम से कम चार बार दोहराएं।
  8. चुंबकीय रैक में 2 एमएल ट्यूब रखकर एनडब्ल्यू को धोएं और 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
  9. NaOH समाधान को त्याग दें और इसे पूर्ण इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  10. ट्यूब को 30 सेकंड के लिए सोनिकेट करें।
  11. चुंबकीय रैक में 2 एमएल ट्यूब रखें और 2 मिनट प्रतीक्षा करें।
  12. पुराने पूर्ण इथेनॉल समाधान को त्याग दें और इसे 30 सेकंड के लिए 1 मिलीलीटर ताजा पूर्ण इथेनॉल और सोनिकेट के साथ बदलें।
  13. चरण 1.11 और 1.12 को कम से कम चार बार दोहराएं।
  14. एनडब्ल्यू को कमरे के तापमान पर 1 एमएल पूर्ण इथेनॉल में रखें जब तक कि उनकी आवश्यकता न हो।
  15. लोहे की एकाग्रता को मापें और इसलिए अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) का उपयोग करके एनडब्ल्यू।
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। हालांकि, लंबे समय तक भंडारण के लिए, आवश्यकता होने तक अल टेम्पलेट से एनडब्ल्यू जारी न करें। लगातार सोनिकेशन के बिना लंबे समय तक इथेनॉल में जारी एनडब्ल्यू को रखने से एकत्रीकरण पैदा होगा जिसे अलग करने के लिए सोनिकेशन के लंबे समय की आवश्यकता होगी।

2. एपीटीईएस के साथ नैनोवायर्स को कोटिंग

नोट: इस प्रोटोकॉल में, एपीटीईएस समाधान के 100 μL (0.946 g / mL61 का घनत्व) NWs के 1.6 x 107 m2/g को कोट करने के लिए पर्याप्त है। यदि नैनोमटेरियल के अनुपात या द्रव्यमान में कोई बदलाव होता है, तो एपीटीईएस वॉल्यूम को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए।

  1. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एनडब्ल्यू को चरण 1.14 से 5 एमएल ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. 2 एमएल ट्यूब में बचे किसी भी एनडब्ल्यू को इकट्ठा करने के लिए, खाली 2 एमएल ट्यूब को 1 एमएल पूर्ण इथेनॉल जोड़कर दो बार धोएं और इसे 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके 5 एमएल ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. पिपेट का उपयोग करके, एपीटीईएस के 100 μL लें और इसे सीधे NW समाधान में जोड़ें।
  4. भंवर 10 सेकंड के लिए 5 एमएल ग्लास ट्यूब।
  5. एक प्रयोगशाला रिटॉर्ट स्टैंड के क्लैंप पर 5 एमएल ग्लास ट्यूब को समायोजित करें।
  6. अल्ट्रासोनिक स्नान के पानी के अंदर 5 एमएल ग्लास ट्यूब का आधा हिस्सा रखें और 1 घंटे के लिए सोनिकेट करें।
  7. अल्ट्रासोनिक स्नान से 5 एमएल ग्लास ट्यूब निकालें और 400 μL विआयनीकृत (डीआई) पानी जोड़ें, इसके बाद 1 M NaOH (मूल उत्प्रेरण) के 20 μL जोड़ें।
    सावधानी: पहले डीआई पानी जोड़ना महत्वपूर्ण है।
  8. 5 एमएल ग्लास ट्यूब को समायोजित करें, जैसा कि चरण 2.5-2.6 में समझाया गया है, और एक और 1 घंटे के लिए सोनिकेट।
  9. अल्ट्रासोनिक स्नान से 5 एमएल ग्लास ट्यूब निकालें।
  10. एनडब्ल्यू को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए ग्लास ट्यूब के बगल में एक चुंबक रखें।
  11. सतह पर तैरनेवाले को 10 सेकंड के लिए ताजा पूर्ण इथेनॉल और सोनिकेट के 1 मिलीलीटर के साथ बदलें।
  12. चरण 2.10-2.11 को चार बार दोहराएं।
  13. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके सभी एनडब्ल्यू निलंबित इथेनॉल को एक नए 5 एमएल ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: एपीटीईएस लेपित एनडब्ल्यू को इथेनॉल के साथ एक ग्लास ट्यूब में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि उनकी आवश्यकता न हो। प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है।

3. नैनोवायर्स का बायोफंक्शनलाइजेशन।

  1. एंटीबॉडी को सक्रिय करना
    नोट: एंटीबॉडी / एनडब्ल्यू के लगभग 3 x 104 भागों को प्राप्त करने के लिए, प्रति 0.1 मिलीग्राम लोहे के प्रति एंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / एमएल) के 30 μL का उपयोग करें।
    1. 2 एमएल ट्यूब में, 3-3-डाइमिथाइल-एमिनोप्रोपिल कार्बोडिमाइड (ईडीसी) के 0.4 मिलीग्राम और 2-एन-मॉर्फोलिनो एथेनसल्फोनिक एसिड हाइड्रेट (एमईएस) (पीएच 4.7) के 1 मिलीलीटर में 1.1 मिलीग्राम सल्फो-एन-हाइड्रॉक्सीसल्फोसुसिनिमाइड (सल्फो-एनएचएस) को भंग करें।
      नोट: ईडीसी / सल्फो-एनएचएस मिश्रण ताजा होना चाहिए और उपयोग करने से पहले तैयार किया जाना चाहिए।
    2. एक नई 2 एमएल ट्यूब में, क्रमशः एंटी-सीडी 44 एंटीबॉडी (1 मिलीग्राम / एमएल) के 30 μL, फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस, पीएच 7) के 0.1 एम के 960 μL, और EDC/ सल्फो-एनएचएस मिश्रण के 10 μL (चरण 3.1.1 में तैयार) जोड़ें।
    3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 10 x g पर एक ट्यूब शेकर में 2 एमएल ट्यूब रखें।
  2. एपीटीईएस लेपित नैनोवायर्स की तैयारी
    1. चरण 3.1.3 में 15 मिनट इनक्यूबेशन के दौरान, एनडब्ल्यू को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए एपीटीईएस लेपित एनडब्ल्यू ट्यूब (चरण 2.13 से) के बगल में एक चुंबक रखकर एनडब्ल्यू को धोएं।
    2. इथेनॉल को त्याग दें और इसे 0.1 एम पीबीएस (पीएच 7) के 1 एमएल के साथ बदलें, और फिर 10 एस के लिए सोनिकेटेड करें।
    3. चरण 3.2.1-3.2.2 को चार बार दोहराएं।
    4. चरण 3.2.1 में बताए गए अनुसार एनडब्ल्यू एकत्र करें, और 0.1 एम पीबीएस को छोड़ दें। एनडब्ल्यू को बिना किसी समाधान के ट्यूब में रखें।
  3. एंटीबॉडी का अनुलग्नक
    1. सभी सक्रिय एंटीबॉडी समाधान (चरण 3.1.3 में तैयार) को एनडब्ल्यूएस ट्यूब (3.2.4 में तैयार) और 10 सेकंड के लिए सोनिकेट में स्थानांतरित करें।
    2. ग्लास ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घूमने वाले में रखें।
    3. चरण 3.2.1 में चुंबक का उपयोग करके एनडब्ल्यू एकत्र करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें।
    4. प्रतिक्रिया को अवरुद्ध करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान के 1 मिलीलीटर को जोड़ना।
    5. एंटीबॉडी कार्यात्मक एनडब्ल्यू की एंटीजेनिसिटी की जांच करें, उदाहरण के लिए, इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) और वेस्टर्न ब्लॉट (डब्ल्यूबी) परख का उपयोग करके।
      नोट: बेहतर परिणामों के लिए, ब्लॉकिंग चरण के तुरंत बाद आईपी, डब्ल्यूबी, या बायोकम्पैटिबिलिटी परख में बायोफंक्शनलाइज्ड एनडब्ल्यू का उपयोग करें।

4. जैव रासायनिकता परख

नोट: एनडब्ल्यू की जैव-रासायनिकता का अध्ययन करने के लिए, विभिन्न सेल व्यवहार्यता परख और विभिन्न सेल लाइनों को नियोजित किया जा सकता है। यहां उपयोग किए जाने वाले एनडब्ल्यू की एकाग्रता पिछले प्रकाशन16 पर आधारित है। सेल सीडिंग एनडब्ल्यू बायोफंक्शनलाइजेशन से एक दिन पहले की जानी चाहिए।

सावधानी: नीचे दिए गए सभी कदम जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत किए जाने चाहिए।

  1. 96-वेल प्लेट में, मैककॉय के सेल कल्चर मीडिया (100 μL / well) में निलंबित कोलन कैंसर कोशिकाओं (HCT116 सेल लाइन) के 4 x 104 के साथ नौ कुओं को बीज दिया जाता है और इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) पर रात भर इनक्यूबेटर के अंदर रखा जाता है।
  2. चरण 3.2.1 में चुंबक का उपयोग करके एनडब्ल्यू (चरण 3.3.4 से) को पीबीएस के साथ धोएं और पुराने समाधान को 0.01 एम पीबीएस (पीएच 7) के 1 एमएल के साथ बदलें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  3. चरण 3.2.1 में चुंबक का उपयोग करके उन्हें इकट्ठा करके गर्म मैककॉय के मीडिया के साथ एनडब्ल्यू (चरण 4.2 से) धोएं और पुराने पीबीएस को गर्म मैककॉय के मीडिया के 1 एमएल के साथ बदलें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  4. चरण 3.2.1 में चुंबक का उपयोग करके एनडब्ल्यू (चरण 4.3 से) एकत्र करना और गर्म मैककॉय के मीडिया के 1 एमएल को गर्म मैककॉय के मीडिया के 900 μL के साथ प्रतिस्थापित करना। एनडब्ल्यू की एकाग्रता 0.02 मिलीग्राम एनडब्ल्यू प्रति एमएल होनी चाहिए।
  5. इनक्यूबेटर से बायोसेफ्टी कैबिनेट तक 96-वेल प्लेट (चरण 4.1 से) लें।
  6. जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, कोशिकाओं से पुराने मीडिया को छोड़ दें और इसे निलंबित एनडब्ल्यू के 100 μL (चरण 4.4 में तैयार) के साथ बदलें।
  7. प्लेट (चरण 4.6 में तैयार) को हाथ से हिलाएं और फिर इसे इनक्यूबेटर के अंदर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. अगले दिन, इनक्यूबेटर से 96-वेल प्लेट (चरण 4.7 में तैयार) निकालें। जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, मल्टीवॉल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक (सामग्री की तालिका) के 11 μL जोड़ें।
  9. प्लेट शेकर के साथ प्लेट को 10 सेकंड के लिए 10 x g की गति से हिलाएं।
  10. इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  11. इनक्यूबेटर से 96-वेल प्लेट (चरण 4.10 में तैयार) निकालें। सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक (उत्तेजना 540 एनएम, उत्सर्जन 590 एनएम) के अवशोषण को मापकर माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका) में प्लेट पढ़ें।

Representative Results

उपयोग की जाने वाली ट्यूब में फिट होने के लिए एल्यूमीनियम (एएल) डिस्क (चित्रा 2 ए) को छोटे टुकड़ों (चित्रा 2 बी) में काटना महत्वपूर्ण है। अल टुकड़ों में 1 एम एनएओएच जोड़ने के बाद, एक प्रतिक्रिया तुरंत शुरू होनी चाहिए, जो बुलबुले के निर्माण से देखी जाती है। यदि 1 मिनट में कोई प्रतिक्रिया नहीं होती है या यदि प्रतिक्रिया बहुत तेज होती है और समाधान पूरी तरह से सफेद बादल के साथ बदल जाता है, तो पुराने एनएओएच समाधान को तुरंत हटा दें और इसे एक ताजा समाधान के साथ बदलें। NaOH समाधान के pH मान की जाँच करें। यह pH>12 होना चाहिए। जब एनडब्ल्यू को एनएओएच के साथ पहले 30 मिनट में अल टुकड़ों से छोड़ा जाता है, तो एनडब्ल्यू (ब्लैक क्लस्टर, चित्रा 3 ए) एनएओएच समाधान के भीतर तैर रहे होंगे। एनडब्ल्यू को जारी करने के अंतिम चरण में, समाधान सजातीय होना चाहिए। राष्ट्रीय जलमार्गों का कोई समूह वहां नहीं होना चाहिए (रेखाचित्र 3ख)। यदि एनडब्ल्यू को 3 मिनट के लिए चुंबक के साथ एकत्र किया गया था, तो समाधान स्पष्ट होना चाहिए, और एनडब्ल्यू गोली काली होनी चाहिए (चित्रा 3 सी)। यदि गोली ग्रे थी, तो ट्यूब को छोड़ दें और एक नए अल नमूने के साथ फिर से शुरू करें।

रिलीज िंग प्रक्रिया के दौरान, एनडब्ल्यू लगभग 5 एनएम मोटाई के साथ एक देशी लौह ऑक्साइड परत प्राप्त करते हैं, जो पिछली रिपोर्ट11,16,20 के समान है। इस ऑक्साइड परत का एनडब्ल्यू के जैव-अनुकूलता 16, कार्यात्मकता16,18 और चुंबकीय गुणों20 में महत्वपूर्ण योगदान है। हालांकि, एनडब्ल्यू को उनके टेम्पलेट में रखना (यानी, उन्हें जारी नहीं करना) जब तक कि आवश्यक न हो, उन्हें उन पर किसी भी पर्यावरणीय प्रभाव से रोक देगा। रिलीज प्रक्रिया के बाद एनडब्ल्यू का औसत व्यास और लंबाई क्रमशः 2.5 μm और 41.5 एनएम थी। एकल एनडब्ल्यू के द्रव्यमान की गणना तालिका 1 में व्याख्या के रूप में की जा सकती है और इसकी पुष्टि अपरिवर्तनीय रूप से युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोस्कोपी (आईसीपी-एमएस) द्वारा की जाती है। यहां, प्रत्येक एल्यूमिना डिस्क में लगभग 0.3 मिलीग्राम लोहा होता है।

जारी करने के बाद एनडब्ल्यू के एकत्रीकरण को कम करने और आगे कार्यात्मककरण को सक्षम करने के लिए, एनडब्ल्यू को एपीटीईएस के साथ लेपित किया गया था। यह कोटिंग मुक्त अमाइन समूह प्रदान करती है और इसमें चुंबकीय और गैर-चुंबकीय सामग्री39,45 दोनों को कोट करने की क्षमता होती है, जिससे यह लोहे / सोने के एनडब्ल्यू जैसे बहु-खंडित एनडब्ल्यू को कोटिंग के लिए उपयुक्त बनाता है। नैनोवायर्स कोटिंग के दौरान, दो चीजों पर ध्यान केंद्रित करना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, सतह क्षेत्र और एनडब्ल्यू के द्रव्यमान के आधार पर एपीटीईएस अणुओं62 से आवश्यक मात्रा की गणना करें। इन गणनाओं को तालिका 2 में प्रस्तुत किया गया था। दूसरे, नैनोवायर्स को उनके समूह को रोकने और एपीटीईएस कोटिंग से एनडब्ल्यू सतहों के कुछ हिस्सों को अवरुद्ध करने से रोकने के लिए एक निरंतर आंदोलन में रखें। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में, नैनोवायर्स को क्रमशः एपीटीईएस कोटिंग और एंटीबॉडी फंक्शनलाइजेशन के दौरान अल्ट्रासोनिक स्नान और घूर्णन के तहत इनक्यूबेट किया गया था। प्रत्येक एपीटीईएस अणु में एक सिलिकॉन परमाणु और एक टर्मिनल कार्यात्मक अमाइन समूह21 होता है। इसलिए, इलेक्ट्रॉन ऊर्जा-हानि स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईईएलएस) मानचित्रों का उपयोग एनडब्ल्यू सतह (चित्रा 4 ए) पर सिलिकॉन परमाणुओं (गुलाबी रंग) को दिखाकर एपीटीईएस कोटिंग की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है। इसके विपरीत, गैर-लेपित एनडब्ल्यू लोहे के परमाणुओं को छाल नीले रंग (चित्रा 4 बी) में और लोहे / ऑक्सीजन मिश्रण परमाणुओं को हल्के नीले रंग में दिखाते हैं (चित्रा 4 बी)। गैर-लेपित एनडब्ल्यू की संबंधित ईएलएस मैपिंग (चित्रा 4 सी, 4 डी) सतह (चित्रा 4 डी) की तुलना में केंद्र (चित्रा4 सी) में लोहे बनाम ऑक्सीजन की उच्च तीव्रता दिखाती है, जो लौह-लौह ऑक्साइड (कोर-शेल) संरचना को दर्शाती है। ईईएलएस मैपिंग (चित्रा 4 सी, 4 डी) की पहचान की गई थी कि एनडब्ल्यू पर लौह ऑक्साइड परत Fe2O 3 से3 O4 अधिक है, जो पिछले प्रकाशन20 के समान है।

संलग्न एंटीबॉडी की एंटीजेनिकता की पुष्टि आईपी और डब्ल्यूबी परख का उपयोग करके की जा सकती है, जहां सकारात्मक नमूने पर एक बैंड देखा जा सकता है लेकिन नकारात्मक नियंत्रण पर नहीं (चित्रा 5)। ध्यान दें कि एक स्पष्ट बैंड का निरीक्षण करने के लिए, 0.1 मिलीग्राम एनडब्ल्यू / 10 x 106 कोशिकाओं से कम का उपयोग न करें। तालिका 3 में प्रस्तुत कुछ गणनाओं के साथ संयोजन में बीसीए परख (सामग्री की तालिका) का उपयोग एनडब्ल्यू पर एंटीबॉडी संख्या को निर्धारित करने के लिए किया गया था।

इसके अलावा, सतह कार्यात्मकता को स्पष्ट करने के लिए जेटा-संभावित माप का उपयोग किया गया था। एपीटीईएस पर टर्मिनल अमाइन समूह ने गैर-लेपित एनडब्ल्यू के नकारात्मक चार्ज को कम कर दिया, जैसा कि चित्र 6 में दिखाया गया है। एंटीबॉडी-कार्यात्मक एनडब्ल्यू ने एपीटीईएस-लेपित एनडब्ल्यू (चित्रा 6) की तुलना में चार्ज को भी बदल दिया। सभी जीटा-संभावित माप पीएच 7 पर किए गए थे।

एंटीबॉडी-कार्यात्मक एनडब्ल्यू के विशिष्ट सेल लक्ष्यीकरण की पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 7) का उपयोग करके की जा सकती है। किसी भी नए नैनोमटेरियल की जैव-रासायनिकता का परीक्षण किसी भी आवेदन को शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। इसलिए, सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग किया गया था, और इसने पुष्टि की कि गैर-लेपित, एपीटीईएस लेपित-और एंटीबॉडी लेपित-एनडब्ल्यू उच्च सांद्रता के साथ भी जैव-संगत थे (चित्रा 8)।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध नैनोवायर्स की कोटिंग और बायोफंक्शनलाइजेशन विधि का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) एपीटीईएस के साथ लौह एनडब्ल्यू कोटिंग। (बी) ईडीसी + सल्फो-एनएचएस का उपयोग करके एंटीबॉडी को सक्रिय करना, अंत में (सी) एक एंटीबॉडी कार्यात्मक नैनोवायर होना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: लोहे जमा एल्यूमीनियम डिस्क। (ए) काटने से पहले एल्यूमीनियम डिस्क। (B) लाल रेखाओं से पता चलता है कि डिस्क को कहाँ काटना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नैनोवायर रिलीज चरण। (ए) नैनोवायर्स के समूह एनएओएच समाधान में तैर रहे हैं। तस्वीर को एनएओएच जोड़ने और अल झिल्ली को हटाने के 10 मिनट बाद लिया गया था। (बी) इथेनॉल में निलंबित नैनोवायर्स। यह तस्वीर सोनिकेशन स्टेप के तुरंत बाद, आखिरी रिलीजिंग स्टेप में ली गई थी। (सी) एक चुंबक द्वारा एकत्र किए गए काले नैनोवायर गोली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इलेक्ट्रॉन ऊर्जा-हानि स्पेक्ट्रोस्कोपी (ईईएलएस) मानचित्र। (ए) एपीटीईएस लेपित नैनोवायर (एपीटीईएस-एनडब्ल्यू)। नीले और गुलाबी रंग क्रमशः लोहे और सिलिकॉन परमाणुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) गैर-लेपित नैनोवायर (एनडब्ल्यू)। छाल नीला और हल्का नीला रंग क्रमशः लोहे और लोहे / ऑक्सीजन मिश्रण मानचित्रण का प्रतिनिधित्व करते हैं। (C) कोर और (D) गैर-लेपित NWs के खोल का संबंधित EELS मानचित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एंटीबॉडी संयुग्मित नैनोवायर्स की कार्यात्मकता और गतिविधि की पुष्टि। सीडी 44-एनडब्ल्यू की एंटीजेनिसिटी की पुष्टि इम्यूनोप्रेसिपेशन (आईपी) और वेस्टर्न ब्लॉट (डब्ल्यूबी) का उपयोग करके की गई थी। +वीई: सकारात्मक नियंत्रण (पूर्ण सेल लाइसेट) का प्रतिनिधित्व करता है। -वे: नकारात्मक नियंत्रण (केवल गैर-लेपित एनडब्ल्यू) का प्रतिनिधित्व करता है। - सीडी 44 कोशिकाएं: उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं जो सीडी 44 एंटीजन को व्यक्त नहीं करती हैं; + सीडी 44 कोशिकाएं: कोलन कैंसर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं जो सीडी 44 एंटीजन को व्यक्त करती हैं। यह एन = 3 स्वतंत्र प्रयोगों का एक प्रतिनिधि धब्बा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एनडब्ल्यू, एपीटीईएस-एनडब्ल्यू और एंटीबॉडी के लिए जेटा संभावित मूल्य। पट्टियाँ माध्य ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपिक छवियां विशिष्ट लक्ष्यीकरण दिखाती हैं। सीडी 44-एनडब्ल्यू को संलग्न (ए और सी) दिखाया गया है, जबकि आइसोटाइप-एनडब्ल्यू (नकारात्मक नियंत्रण) संलग्न (बी और डी) नहीं है। लाल, नीले और हरे रंग क्रमशः कोशिका झिल्ली, नाभिक और सीडी 44-एनडब्ल्यू के क्लस्टर का प्रतिनिधित्व करते हैं। A और B क्रमशः C और D के उज्ज्वल क्षेत्र चित्र हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: कोलन कैंसर कोशिकाओं (एचसीटी 116) की सेल व्यवहार्यता अध्ययन नैनोवायर्स के विभिन्न योगों के साथ इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं को 24 घंटे की इनक्यूबेशन के बाद एनडब्ल्यू के साथ इलाज किया गया और फिर एनडब्ल्यू के साथ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। सभी प्रयोग 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के अंदर किए गए थे। पट्टियाँ माध्य ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राचल मूल्य इकाई
Fe NW (h) की लंबाई 2.6 μm
त्रिज्या (व्यास/2) (r) 0.01679231 μm
Fe घनत्व (D) 7.87 g/cm3
1 Fe NW वॉल्यूम (V) = π r^2h 2.30E-15 सेमी3
1 Fe NW द्रव्यमान = V x D 1.80E-08 μg
1 Fe NW सतह क्षेत्र = 2 : r^2 + 2 : rh 2.76E-01 μm2 2.8E+05 nm2

तालिका 1: लोहे के एनडब्ल्यू द्रव्यमान की गणना।

प्राचल मूल्य इकाई
APTES/100 μL* का घनत्व 9.50E-01 ग्राम
एपीटीईएस के अणु (एमडब्ल्यू) 2.21E +02 g/mol
एपीटीईएस मोल की संख्या = द्रव्यमान/मेगावाट 4.29E-03 mol
APTES अणुओं की संख्या/100 μL** 2.57E +21 अणुओं
APTES आकार *** 5.00E-01 एनएम
एपीटीईएस सतह क्षेत्र 2.00E-01 nm2
एनडब्ल्यू सतह क्षेत्र **** 2.76E +05 nm2
0.3 mg NW में NWs की संख्या **** 1.70E +10 NWs
एनडब्ल्यू के चारों ओर एक परत बनाने के लिए आवश्यक एपीटीईएस अणुओं की संख्या 1.38E+06 एपीटीईएस अणु
0.3 मिलीग्राम एनडब्ल्यू के लिए आवश्यक एपीटीईएस अणुओं की संख्या 2.35E +16 एपीटीईएस अणु
* रेफ्रेन्स नंबर 61
** अणुओं की संख्या = mol* avogadro संख्या की संख्या (6E + 23)
रेफ्रेन्स नंबर 62
तालिका 1 से

तालिका 2: एनडब्ल्यू कोटिंग के लिए आवश्यक एपीटीईएस अणुओं की संख्या की गणना।

  वाई-आकार आईजीजी एंटीबॉडी उत्तर- पश्चिमी
एक एंटीबॉडी के लिए द्रव्यमान। 2.3E-13 μg 1.8E-08 μg*
एक एंटीबॉडी के लिए सतह क्षेत्र 23 nm2 2.6E + 05 nm2
बीसीए परख पर आधारित 0.3 मिलीग्राम प्रति 1 मिलीग्राम
प्रति मिलीग्राम एनडब्ल्यू में एंटीबॉडी अणु और एनडब्ल्यू की संख्या 0.3 मिलीग्राम एंटीबॉडी है। ~ 1E + 15 एंटीबॉडी ** प्रति ~ 5.6E + 10 NWs
प्रति एनडब्ल्यू एंटीबॉडी अणु की संख्या ~ 2E + 04 एंटीबॉडी प्रति 1 NW ***
* तालिका 1 से गणना की गई
** 0.3 मिलीग्राम में एंटीबॉडी की संख्या की गणना बीएसए परख (0.3 मिलीग्राम) से प्राप्त एंटीबॉडी संख्या को वाई-आकार के आईजीजी एंटीबॉडी (180 केडीए = 3 ई -16 मिलीग्राम) के औसत आणविक भार से विभाजित करके की गई थी।
वाई-आकार के आईजीजी एंटीबॉडी (~ 23 एनएम 2) के एक अणु के सतह क्षेत्र और एक एनडब्ल्यू (~ 2.6 ई + 05 एनएम 2) के सतह क्षेत्र के आधार पर, एनडब्ल्यू पर एक मोनोलेयर बनाने के लिए लगभग 1 ई + 04 एंटीबॉडी पर्याप्त होंगे। हमारे मामले में, एंटीबॉडी का घनत्व अपेक्षित मात्रा से दो गुना अधिक था। यह एपीटीईएस कोटिंग से संबंधित हो सकता है जो अधिक हथियार प्रदान करता है जो एंटीबॉडी के उच्च लगाव की अनुमति देता है। यह मामला सुनिश्चित करता है कि एनडब्ल्यू पूरी तरह से एंटीबॉडी के साथ कवर किया गया है और एंटीबॉडी के लिए सेल सतह एंटीजन से जुड़ने का अवसर अधिक होगा, भले ही एनडब्ल्यू के अभिविन्यास की परवाह किए बिना। हालांकि, यदि एंटीबॉडी घनत्व अपेक्षित संख्या (एंटीबॉडी के 1ई + 04 अणु) से कम है, तो सेल और एनडब्ल्यू के बीच बाध्यकारी मौका कम होगा।

तालिका 3: नैनोवायर पर एंटीबॉडी की संख्या की गणना।

Discussion

किसी भी नैनोमटेरियल निर्माण और कोटिंग विधि के साथ, उपयोग किए जाने वाले समाधानों की उच्च गुणवत्ता की आवश्यकता होती है। रिलीज (1 एम एनएओएच) और कार्यात्मकता (एमईएस) समाधान ों को कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, एक नई प्रक्रिया शुरू करने से पहले उनके पीएच मान की जांच करना बहुत महत्वपूर्ण है। रिलीज चरण में, एनएओएच के साथ एनडब्ल्यू को धोना कम से कम चार बार किया जाना चाहिए। धुलाई जितनी बेहतर होगी, एनडब्ल्यू की स्थिरता उतनी ही बेहतर होगी और वे उतने ही कम होंगे। ऑक्साइड परत इथेनॉल या पानी में विसर्जन पर एनडब्ल्यू की स्थिरता को बढ़ातीहै।

एपीटीईएस और एंटीबॉडी के साथ कोटिंग के बाद एनडब्ल्यू का व्यास और लंबाई प्रभावित हुई। यहां, व्यास 41.5 एनएम से बढ़कर 70 एनएम हो गया, और एनडब्ल्यू को तोड़ने वाले सोनिकेशन चरणों के कारण लंबाई 2.5 μm से घटकर 1.6 μm हो गई। इसलिए, बायोफंक्शनलाइजेशन चरण के बाद एनडब्ल्यू की आकृति विज्ञान को चिह्नित करना आवश्यक है।

एनडब्ल्यू के लिए एंटीबॉडी का लगाव अमाइन समूह (एपीटीईएस पर) और कार्बोक्सिल समूह (एंटीबॉडी पर) के बीच सहसंयोजक बातचीत पर निर्भर करता है। इसलिए, एपीटीईएस कोटिंग की उपस्थिति की पुष्टि करना एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसके लिए हमने ईईएलएस मैपिंग का उपयोग किया। कोटिंग विधि सुरक्षित और सीधी है। इसे उच्च तापमान या लंबे इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, एपीटीईएस कोटिंग अन्य एंटीबॉडी या प्रोटीन के सहसंयोजक लगाव को सक्षम करने के लिए एक लिंकर के रूप में काम करती है जिसमें कार्बोक्सिल समूह होता है।

एक एंटीबॉडी के साथ एनडब्ल्यू को बायोफंक्शनलाइज करने के मामले में, बायोफंक्शनलाइजेशन प्रक्रिया के बाद एंटीबॉडी की बाध्यकारी साइटों की एंटीजेनेसिटी प्रभावित हो सकती है। इस समस्या की जांच के लिए आईपी और डब्ल्यूबी विधि का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित बायोफंक्शनलाइजेशन विधि का उपयोग करने से एंटीबॉडी को एक विशिष्ट सेल रिसेप्टर के लिए उच्च एंटीजेनिसिटी वाले एनडब्ल्यू से बांधने की अनुमति मिलेगी। इसके अलावा, एंटीबॉडी के साथ एनडब्ल्यू को बायोफंक्शनलाइज करने से कोशिकाओं को रुचि के रिसेप्टर, सीडी 44 के साथ लक्षित करने की क्षमता बढ़ गई। इसकी पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की गई थी। यद्यपि अनकोटेड एनडब्ल्यू की जैव-रासायनिकता अधिक थी (>95%), एनडब्ल्यू में एपीटीईएस कोटिंग या एंटीबॉडी जोड़ने से उनकी जैव-रासायनिकता 100% बढ़ गई।

इसके अलावा, कोटिंग और बायोफंक्शनलाइजेशन प्रोटोकॉल कुशल, किफायती और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। यह किसी भी अन्य लौह-लौह ऑक्साइड नैनोमटेरियल पर लागू होना चाहिए, जिससे कोटिंग और संलग्न एंटीबॉडी दोनों की एकाग्रता को सतह क्षेत्र और नैनोमटेरियल के द्रव्यमान के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल सामान्य प्रयोगशाला में परिवेश की स्थिति में सुरक्षित रूप से किया जा सकता है। बायोफंक्शनलाइजेशन ने नैनोमटेरियल की जैव-रासायनिकता और उनकी लक्ष्यीकरण क्षमता में काफी वृद्धि की है। सामान्य तौर पर, एनडब्ल्यू नैनोमेडिकल अनुप्रयोगों (मल्टी-मोडल या मिश्रित उपचार, सेल डिटेक्शन या मार्गदर्शन और जैविक संवेदन सहित) के लिए बेहद आशाजनक सामग्री हैं। बायोफंक्शनलाइजेशन के साथ संयुक्त, जैसा कि यहां वर्णित है, बढ़ी हुई सटीकता और प्रभावकारिता के लिए विशिष्ट सेल लक्ष्यीकरण प्राप्त किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को किंग अब्दुल्ला यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (केएयूएसटी) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) Eppendorf, Fisherscientific 05-402-7
2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) Thermscientific AC172590250 Concentration 0.1 M and pH 4.7
3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) Thermofisher PG82079
3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) Sigma Aldrich 919302
5 mL glass tube Fisherscientific 03-339-22C
96-well plate ( flat bottom) Sigma Aldrich CLS3595
Anti-CD44 antibody BD Biosciences 550990 Clone 515, concentration 1 mg/mL
APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% Sigma Aldrich 919-30-2 Concentration 99%
BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) Thermofisher 23225
Bovine Serum Albumin solution (BSA) Sigma Aldrich 9048-46-8 Concentration 35%
Cell incubator Thermofisher 50116047
Cell viability reagent AlamarBlue,Thermofisher DAL1025
Colon cancer cells - HCT116 cell line ATCC 430641
Hardwood Hammer Any hammer tool can be used, there is no specific brand.
Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) Perkin Elmer ELAN 9000 ICP-MS The used software is "Elan instrument control session"
Laboratory Retort Stand with Clamp RVFM 13-0140 This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath.
Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) Thermofisher 12321D
McCoy’s 5A Medium 1x Gibco 16600082
Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) Bio-Rad 1681150 Microplate Manager 6 software (#168-9520)
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Gibco 14200067 Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium)
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 14190136 Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium)
Plate shaker (Microplate Genie) Scientific Industries (Genie) SI-0400
Single Edge Razor blades Polysciences 08410-1
Sodum hydrixide (NaOH) Sigma Aldrich 1310-73-2 Concentration 1 M, pH 13
Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) Thermofisher 106627-54-7
Trypsin ATCC 30-2101
Tube rotator VWR 10136-084
Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) Eppendorf, Fisherscientific 05-400-204
Ultrasonic bath (2510) Branson 2489502

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References

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