Summary
I dette arbeidet gir vi en protokoll for å biofunksjonalisere magnetiske nanomaterialer med antistoffer for spesifikk cellemålretting. Som eksempler bruker vi jernnanotråder for å målrette kreftceller.
Abstract
Magnetiske nanomaterialer har fått stor oppmerksomhet i ulike biomedisinske applikasjoner. Biofunksjonalisering av disse nanomaterialene med spesifikke målrettingsmidler er et avgjørende aspekt for å forbedre effektiviteten i diagnostikk og behandlinger samtidig som bivirkningene minimeres. Fordelen med magnetiske nanomaterialer sammenlignet med ikke-magnetiske er deres evne til å reagere på magnetfelt på en kontaktfri måte og over store avstander. Dette gjør det mulig å veilede eller akkumulere dem, mens de også kan overvåkes. Nylig ble magnetiske nanotråder (NW) med unike egenskaper utviklet for biomedisinske applikasjoner. Det store magnetiske momentet til disse NW-ene muliggjør en mer effektiv fjernkontroll av bevegelsen deres med et magnetfelt. Dette har blitt brukt med stor suksess i kreftbehandling, medikamentlevering, cellesporing, stamcelledifferensiering eller magnetisk resonansavbildning. I tillegg gir NW-fabrikasjon ved malassistert elektrokjemisk avsetning en allsidig metode med tett kontroll over NW-egenskapene. Spesielt jern NW og jern-jernoksid (core-shell) NW er egnet for biomedisinske applikasjoner, på grunn av deres høye magnetisering og lav toksisitet.
I dette arbeidet gir vi en metode for å biofunksjonalisere jern / jernoksid NW med spesifikke antistoffer rettet mot en spesifikk celleoverflatemarkør som overuttrykkes i et stort antall kreftceller. Siden metoden utnytter egenskapene til jernoksidoverflaten, er den også anvendelig for superparamagnetiske jernoksid nanopartikler. NWene er først belagt med 3-aminopropyl-tri-etoksy-silan (APTES) som fungerer som en linker, som antistoffene er kovalent festet til. APTES-belegget og antistoffbiofunksjonaliseringen er påvist ved elektronenergitapspektroskopi (EELS) og zeta-potensielle målinger. I tillegg testes antigeniteten til antistoffene på NWene ved bruk av immunutfelling og western blot. Den spesifikke målrettingen av de biofunksjonaliserte NWene og deres biokompatibilitet studeres ved konfokal mikroskopi og en celle levedyktighetsanalyse.
Introduction
En unik egenskap av magnetiske nanomaterialer er deres evne til å reagere på magnetfelt1, som kan brukes gunstig til å aktivere dem på mange måter, mens de også kan overvåkes, for eksempel ved magnetisk resonansavbildning (MR). Ved påføring av et vekslende magnetfelt ved høy frekvens kan de generere varme, noe som kan indusere hypertermi, og gir et terapeutisk alternativ1. En annen tilnærming er fototermisk behandling, som kan realiseres med en nær infrarød (NIR) laser 2,3.
Blant det store antallet magnetiske nanomaterialer har jernoksid fått størst oppmerksomhet i biologiske applikasjoner som magnetisk separasjon, hypertermi2,4, celleveiledning5, legemiddellevering 6,7,8 og som kontrastmiddel i MR 9,10. Dette skyldes deres høye biokompatibilitet 11,12, stor magnetisering 11,12, evne til å bli belagt 9,13,14,15, evne til å bære narkotika 2,16, evne til å bli funksjonalisert med narkotika2,16 eller / og målrettingsmidler12,13,17,18, og evne til å konvertere optisk energi til varme2. Nylig startet MagForce i kliniske studier på kreftpasienter som bruker jernoksid nanopartikler for hypertermibehandling19.
I det siste har magnetiske nanotråder (NW) i økende grad blitt utnyttet til biomedisinske applikasjoner 3,11,16,20,21,22. De har lignende egenskaper som magnetiske nanoperler, men tilbyr en anisotrop form og et veldig stort magnetisk moment, noe som muliggjør en meget effektiv fjernkontroll av et magnetfelt23,24, inkludert lavfrekvent aktivering for å indusere magneto-mekaniske effekter 25,26,27,28,29. Som en konsekvens har NWs blitt implementert for forskjellige biologiske applikasjoner som eksosomisolering30 cellesporing 21, kreftbehandling 3,11,16, legemiddellevering 16,31,32 og som MR-kontrastmiddel 33.
Biofunksjonaliserte magnetiske nanomaterialer med spesifikk cellemålrettingsevne har stort potensial for biomedisinske applikasjoner og i presisjonsmedisin34,35. For å feste disse målrettingsmidlene kreves det en overflatemodifisering på nanomaterialene. Vanligvis trenger de et belegg som gir en funksjonell gruppe, noe som letter vedlegget av behandlingsmidlene. I litteraturen er det et stort antall organiske og uorganiske belegg for magnetiske nanomaterialer. Basert på den funksjonelle gruppen som kan immobiliseres til nanomaterialet, kan disse beleggene kategoriseres i fire hovedgrupper: molekyler basert på karboksylsyregrupper, polymerer, histidin og molekyler basert på silangrupper.
Molekylene basert på karboksylsyregrupper er en av overflatemodifikasjonsmetodene. Den utnytter den høye affiniteten
mellom den negative karboksylsyregruppen på belegget og den positive ladningen på magnetiske nanomaterialer36,37,38. Bindingsprosessen av en karboksylsyre til en metalloverflate kan involvere generering av metallkarboksylatsalter eller adhesjon av karboksylgruppen til metallet. For multisegmenterte NW-er, som jern/gull eller nikkel/gull-NW, som har suverene egenskaper for bioapplikasjoner39,40, kan imidlertid ikke denne typen belegg påføres enkelt. Det krever to forskjellige belegg samtidig: tiolgrupper for modifisering av gullsegmentene og karboksylgrupper for magnetiske segmenter (jern eller nikkel)38. Noen eksempler på molekyler basert på karboksylgrupper er hematoporfyrin, pimelsyre, palmitinsyre og 3-[(2-aminoetyl) dithio] propionsyre (AEDP)38. Overflatemodifikasjoner av magnetiske nanomaterialer ved bruk av polymerer gir noen klare fordeler. På grunn av polymerens store molekylvekt forbedrer den stabiliteten til det magnetiske nanomaterialet i en løsning38. Det vil imidlertid øke størrelsen på nanomaterialet38 betydelig. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyetylenimin (PEI), arginin-glycin-D asparaginsyre (RGD) og polyetylenglykol (PEG) er noen eksempler på de mest brukte polymerene for overflatemodifikasjoner. Hver og en har sine egne funksjoner og bruker38. Den tredje overflatemodifikasjonsmetoden bruker et histidinbelegg. Histidin er et protein med en histidinaminosyre sidekjede som har høy affinitet til begrenset antall magnetiske nanomaterialer som nikkel38. Den kan brukes til proteinrensingsprosesser 38,41,42. Et histidinbelegg kan også påføres multisegmenterte NWer, for eksempel nikkel / gull NWs38. Silaniseringen av en nanomaterialoverflate er en veletablert prosess 38,43,44. Den er basert på et silisiumatom knyttet til en hvilken som helst metalloksydoverflate gjennom tre enkeltbindinger, og samtidig binder dette silisiumatomet til den funksjonelle gruppen på slutten gjennom en alkylkjede 38,43,44. Fordelen med dette belegget er å gi frie amingrupper, og det har evnen til å belegge både magnetiske og ikke-magnetiske materialer38,45, som henholdsvis nikkel og gull. Derfor er bruk av molekyler basert på saltvannsgruppen en praktisk rute for biofunksjonalisering av multisegmenterte NWer. Noen eksempler på molekyler basert på silangrupper er (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES) og (3-aminopropyl) trimetoksysilan (APTMS) 38,45.
Tilsetningen av et målrettingsmiddel til belegget kan spille en betydelig rolle i både diagnose og behandling av syke celler, og samtidig minimere bivirkningene på sunt vev46,47. Tilsetningen av et målrettingsmiddel på overflaten av nanomaterialer forbedrer både cellulær selektiv binding og internalisering gjennom endocytosereseptorer7. Uten disse målrettede ligandene interagerer nanomaterialer ikke-spesifikt med cellemembraner, som binder seg i lavere hastighet sammenlignet med nanomaterialene med ligandene48. En av utfordringene med å målrette kreftvev er deres karakteristiske likhet med sunt vev. Derfor avhenger suksessen med målretting hovedsakelig av å bestemme riktig ligand som skal brukes som et biologisk mål49,50. Ulike målrettingsmidler har blitt brukt til å lede nanomaterialer til kreftceller48,51 (f.eks. CD44, på grunn av det høye uttrykket i kreftceller sammenlignet med friske celler52,53,54,55).
Målrettingsagenter kan kategoriseres i tre hovedgrupper, basert på komponentene de er laget av og deres kompleksitet: aptamerbasert målretting, ligandbasert målretting og antistoffbasert målretting. Aptamerer er korte kjemisk syntetiserte tråder av DNA eller RNA-oligonukleotider som brettes i to- og tredimensjonale strukturer, noe som gjør dem i stand til å målrette mot et spesifikt antigen, oftest proteiner56. Ligandbasert målretting inkluderer peptider og korte aminosyrekjeder57. Antistoffbasert målretting innebærer bruk av et helt antistoff eller antistofffragmenter, for eksempel enkeltkjedede variable fragmenter eller antigenbindende fragmenter51. Bruk av denne metoden har fordelen av å ha to bindingssteder med høy bindingsaffinitet til sitt spesifikke målantigen, noe som gir den en svært høy selektivitet58. Bindingsstedene er analoge med en lås og antigenet til en nøkkel58.
I dette arbeidet ble NW-ene som ble brukt fremstilt ved elektrodeponering på aluminiumoksidmembraner, en metode beskrevet i detalj i en tidligere publikasjon59. Fokuset her er på å frigjøre disse jernjernoksid (core-shell) NWene fra membranene og biofunksjonalisere dem med spesifikke antistoffer for å gi en målrettingsevne. Antistoffene kan ikke binde seg direkte til jern-jernoksid NW og krever en linker. Coating av NWs med APTES gir frie amingrupper, noe som muliggjør kovalent festing via karboksylgruppen på antistoffene (figur 1). Fordelen med APTES-belegget er dets evne til å arbeide for både magnetiske21 og ikke-magnetiske60-materialer , for eksempel jern / gull eller nikkel / gull NWs45. Alle beleggings- og biofunksjonaliseringstrinnene som er forklart i denne protokollen, kan brukes med ethvert jern / jernoksid nanomateriale generelt. Jern/jernoksid NW ble her brukt som eksempel. Resultatene viser at antistofffunksjonaliserte NWer har en høy antigenisitet mot spesifikke celleoverflatereseptorer, som kan brukes til forskjellige applikasjoner. Eksempler er celleseparasjon, legemiddellevering, spesifikk kreftcellebehandling ved hjelp av fototermiske og / eller magnetomekaniske behandlinger.
Protocol
FORSIKTIG: Se alltid alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Bruk alle relevante sikkerhetsrutiner og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, laboratoriefrakk, bukser i full lengde, sko med lukket tå). Utfør alle biologiske reaksjoner i den biologiske avtrekkshetten.
MERK: Denne protokollen er ment å produsere 2 x 10 10 biofunksjonaliserte NWs/ml tilsvarende 0,36 mg jern/ml belagt med anti-CD44 antistoffer med en tetthet på 3 x10 4 antistoffer/NW. Jernjernoksidet (kjerneskall) NW er 2,5 μm lange og har en diameter på 41,5 nm.
1. Frigjøring av jern nanotråder
MERK: Fabrikasjonsprosessen av jern / jernoksid NWs ble forklart i detalj i en tidligere publikasjon59.
- På en skjærematte kutter du aluminiumsskivene (Al) (figur 2A) i små biter (figur 2B) med et blad med én kant og en liten hammer for å passe inn i et rør på 2 ml. Bruk pinsett til å overføre de små Al-bitene til røret.
- Fyll 2 ml slangen, som inneholder de små Al-bitene, med 1 ml 1 M natriumhydroksid (NaOH). Forsikre deg om at alle Al-stykkene er dekket med NaOH.
- La oppløsningen virke i 30 minutter ved romtemperatur inne i en kjemisk avtrekkshette.
- Fjern bare Al-bitene ved hjelp av pinsetten og oppbevar de frigjorte NW-ene (svarte klynger, figur 3A) i NaOH-oppløsningen i ytterligere 30 minutter. Ikke endre NaOH-oppløsningen.
- Samle NW-ene ved å plassere 2 ml røret i et magnetstativ og vent i 2 minutter før du fjerner den gamle 1 M NaOH-løsningen. Bytt den ut med fersk NaOH-løsning.
- Sonikere 2 ml røret som inneholder NWs i 30 s og la det stå i 1 time inne i en kjemisk avtrekkshette.
- Gjenta trinn 1,5–1,6 minst fire ganger.
- Vask NW-ene ved å plassere 2 ml røret i magnetstativet og vent i 2 minutter.
- Kast NaOH-oppløsningen og erstatt den med 1 ml absolutt etanol.
- Sonikere røret i 30 s.
- Plasser 2 ml røret i magnetstativet og vent 2 min.
- Kast den gamle absolutte etanoloppløsningen og erstatt den med 1 ml fersk absolutt etanol og sonicate i 30 s.
- Gjenta trinn 1.11 og 1.12 minst fire ganger.
- Oppbevar NW i 1 ml absolutt etanol ved romtemperatur til de trengs.
- Mål konsentrasjonen av jern og dermed NWs ved å bruke induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS).
MERK: Protokollen kan settes på pause her. For langtidslagring må du imidlertid ikke frigi NW-ene fra Al-malen før det er nødvendig. Å holde de frigjorte NWene som utfeller i etanolen i lang tid uten hyppig sonikering, vil skape aggregeringer som vil trenge lengre sonikeringstider som skal skilles.
2. Belegg nanotrådene med APTES
MERK: I denne protokollen er 100 μL APTES-løsning (tetthet på 0,946 g / ml61) nok til å belegge 1,6 x 107 m2 / g NW. Hvis det er en endring i forholdet eller massen av nanomaterialet, bør APTES-volumet justeres tilsvarende.
- Overfør NWs fra trinn 1,14 til et 5 ml glassrør ved hjelp av en 1 ml pipette.
- For å samle opp eventuelle NWs som er igjen i 2 ml røret, vask det tomme 2 ml røret to ganger ved å tilsette 1 ml absolutt etanol og overfør det til 5 ml glassrøret ved hjelp av en 1 ml pipette.
- Ved å bruke pipetten, ta 100 μL APTES og legg den direkte til NW-løsningen.
- Vortex 5 ml glassrør i 10 s.
- Juster 5 ml glassrøret på klemmen på et laboratorieretortstativ.
- Plasser halvparten av 5 ml glassrøret inne i vannet i ultralydbadet og sonicate i 1 time.
- Ta ut 5 ml glassrøret fra ultralydbadet og tilsett 400 μL deionisert (DI) vann etterfulgt av 20 μL 1 M NaOH (basisk katalyse).
FORSIKTIG: Det er viktig å tilsette DI-vannet først. - Juster 5 ml glassrøret, som forklart i trinn 2,5-2,6, og sonicate i ytterligere 1 time.
- Ta ut 5 ml glassrøret fra ultralydbadet.
- Plasser en magnet ved siden av glassrøret i 5 minutter for å samle NW-ene.
- Bytt supernatanten med 1 ml fersk absolutt etanol og sonicate i 10 s.
- Gjenta trinn 2.10–2.11 fire ganger.
- Overfør all NWs suspendert etanol til et nytt 5 ml glassrør ved hjelp av en 1 ml pipette.
MERK: APTES-belagte NW-er kan lagres i et glassrør med etanol til de trengs. Protokollen kan settes på pause her.
3. Biofunksjonalisering av nanotrådene
- Aktivering av antistoffene
MERK: For å oppnå ca. 3 x 104 deler antistoff/NW, bruk 30 μL antistoff (1 mg/ml) per 0,1 mg jern.- I et 2 ml rør oppløses 0,4 mg 3-3-dimetylaminopropylkarbodiimid (EDC) og 1,1 mg sulfo-N-hydroksysulfosuccinid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morfolinoetansulfonsyrehydrat (MES) (pH 4,7).
MERK: EDC / sulfo-NHS-blandingen skal være frisk og tilberedt før bruk. - I et nytt 2 ml rør, tilsett 30 μL anti-CD44-antistoff (1 mg / ml), 960 μL 0,1 M fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7) og 10 μL EDC / sulfo-NHS-blanding (fremstilt i trinn 3.1.1).
- Plasser 2 ml røret i en rørrister ved 10 x g i 15 minutter ved romtemperatur.
- I et 2 ml rør oppløses 0,4 mg 3-3-dimetylaminopropylkarbodiimid (EDC) og 1,1 mg sulfo-N-hydroksysulfosuccinid (Sulfo-NHS) i 1 ml 2-N-morfolinoetansulfonsyrehydrat (MES) (pH 4,7).
- Klargjøring av APTES-belagte nanotråder
- I løpet av 15 minutters inkubasjon i trinn 3.1.3, vask NWene ved å plassere en magnet ved siden av APTES-belagte NW-rør (fra trinn 2.13) i 2 minutter for å samle NW-ene.
- Kast etanolen og erstatt den med 1 ml 0,1 M PBS (pH 7), og soniker deretter i 10 s.
- Gjenta trinn 3.2.1-3.2.2 fire ganger.
- Samle NW-ene, som forklart i trinn 3.2.1, og kast 0,1 M PBS. Hold NWs i røret uten noen løsning.
- Vedlegg av antistoffene
- Overfør all aktivert antistoffoppløsning (fremstilt i trinn 3.1.3) til NW-røret (fremstilt i 3.2.4) og sonicate i 10 s.
- Plasser glassrøret i rotatoren over natten ved 4 °C.
- Samle NW-ene ved hjelp av en magnet som i trinn 3.2.1 og kast supernatanten.
- Tilsetning av 1 ml 2 % bovint serumalbumin (BSA) oppløsning i 1 time ved 4 °C for å blokkere reaksjonen.
- Kontroller antigeniteten til antistofffunksjonaliserte NWs, for eksempel ved bruk av immunoprecipitation (IP) og western blot (WB) analyser.
MERK: For bedre resultater, bruk biofunksjonaliserte NWer i IP-, WB- eller biokompatibilitetsanalysen umiddelbart etter blokkeringstrinnet.
4. Analyse av biokompatibilitet
MERK: For å studere biokompatibiliteten til NWs, kan ulike celle levedyktighetsanalyser og forskjellige cellelinjer anvendes. Konsentrasjonen av NW-ene som brukes her er basert på en tidligere publikasjon16. Cellesåingen bør gjøres en dag før NW-biofunksjonaliseringen.
FORSIKTIG: Alle trinnene nedenfor skal gjøres under biosikkerhetsskapet.
- I en 96-brønnsplate frø ni brønner med 4 x 104 tykktarmskreftceller (HCT116-cellelinje) suspendert i McCoys cellekulturmedium (100 μL / brønn) og plasser den inne i inkubatoren over natten ved 37 ° C og 5% karbondioksid (CO2).
- Vask NWene (fra trinn 3.3.4) med PBS ved å samle dem med en magnet som i trinn 3.2.1 og erstatt den gamle løsningen med 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Vask NW-ene (fra trinn 4.2) med oppvarmede McCoy-medier ved å samle dem med en magnet som i trinn 3.2.1 og erstatt den gamle PBS med 1 ml oppvarmet McCoys media. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Samle NW-ene (fra trinn 4.3) ved hjelp av en magnet som i trinn 3.2.1 og erstatte 1 ml oppvarmet McCoys medier med 900 μL oppvarmet McCoys medier. NW-konsentrasjonen bør være 0,02 mg NW per ml.
- Ta 96-brønnplaten (fra trinn 4.1) fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet.
- Under biosikkerhetsskapet, kast det gamle mediet fra cellene og erstatt det med 100 μL suspendert NW (utarbeidet i trinn 4.4).
- Rist platen (tilberedt i trinn 4.6) for hånd og inkuber den deretter i 24 timer inne i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2.
- Neste dag, ta ut 96-brønnplaten (utarbeidet i trinn 4.7) fra inkubatoren. Under biosikkerhetsskapet, tilsett 11 μL av cellens levedyktighetsreagens (materialfortegnelse) til hver brønn ved hjelp av flerveggpipetten.
- Rist platen med plateristeren med en hastighet på 10 x g i 10 s.
- Inkuber platen i 1 time i inkubatoren.
- Ta ut 96-brønnplaten (utarbeidet i trinn 4.10) fra inkubatoren. Les platen i mikroplateleseren (materialfortegnelse) ved å måle absorbansen av cellens levedyktighetsreagens (eksitasjon 540 nm, utslipp 590 nm).
Representative Results
Det er viktig å kutte aluminiumsskivene (Al) (figur 2A) i små biter (figur 2B) for å passe inn i røret som brukes. Etter å ha tilsatt 1 M NaOH til Al-stykkene, bør en reaksjon starte umiddelbart, som observeres ved dannelse av bobler. Hvis ingen reaksjon oppstår på 1 min eller hvis reaksjonen er veldig rask og løsningen blir helt uklar med en hvit sky, fjern den gamle NaOH-løsningen umiddelbart og erstatt den med en ny løsning. Kontroller pH-verdien til NaOH-løsningen. Det skal være pH>12. Når NWene frigjøres fra Al-stykkene i løpet av de første 30 minuttene med NaOH, vil NW-ene (svarte klynger, figur 3A) flyte i NaOH-løsningen. I det siste trinnet med å frigjøre NWene, bør løsningen være homogen. Ingen klynge av NWs bør være der (figur 3B). Hvis NW ble samlet opp med en magnet i 3 minutter, bør oppløsningen være klar, og NW-pelleten skal være svart (figur 3C). Hvis pelleten var grå, kast røret og start på nytt med en ny Al-prøve.
Under frigjøringsprosessen oppnår NWene et naturlig jernoksidlag med rundt 5 nm tykkelse, som ligner på tidligere rapporter11,16,20. Dette oksidlaget har et viktig bidrag til biokompatibilitet 16, funksjonalisering16,18 og magnetiske egenskaper20 av NWs. Men å holde NWs i malen (dvs. ikke slippe dem) til det er nødvendig, vil forhindre dem fra miljøeffekter på dem. Gjennomsnittlig diameter og lengde på NWene etter frigjøringsprosessen var henholdsvis 2,5 μm og 41,5 nm. Massen til en enkelt NW kan beregnes som forklart i tabell 1, og den bekreftes ved induktivt koblet plasmamassespektroskopi (ICP-MS). Her inneholdt hver aluminaplate rundt 0,3 mg jern.
For å redusere aggregeringen av NW-ene etter frigjøring og muliggjøre ytterligere funksjonalisering, ble NW-ene belagt med APTES. Dette belegget gir frie amingrupper og har evnen til å belegge både magnetiske og ikke-magnetiske materialer39,45, noe som gjør det egnet for å belegge flersegmenterte NW-er som jern/gull-NW. Under nanotrådbelegget er det viktig å fokusere på to ting. Beregn først det nødvendige volumet fra APTES-molekyler62 basert på overflaten og massen av NWene. Disse beregningene er presentert i tabell 2. For det andre, hold nanotrådene i kontinuerlig bevegelse for å forhindre agglomerering og blokkering av enkelte deler av NW-overflater fra APTES-belegg. For eksempel, i denne protokollen, ble nanotrådene inkubert under ultralydbadet og rotatoren under henholdsvis APTES-belegget og antistofffunksjonaliseringen. Hvert APTES-molekyl inneholder et silisiumatom og en terminal funksjonell amingruppe21. Derfor kan elektronenergitapsspektroskopi (EELS) kart brukes til å bekrefte tilstedeværelsen av APTES-belegget ved å vise silisiumatomer (rosa farge) på NW-overflaten (figur 4A). Derimot viser de ikke-belagte NW-ene jernatomene i barkblå (figur 4B) og jern/oksygenblandingsatomer i lyseblått (figur 4B). Den tilsvarende EELS-kartleggingen av ikke-belagte NWer (figur 4C,4D) viser en høyere intensitet av jern vs. oksygen i midten (figur 4C) enn på overflaten (figur 4D), noe som indikerer en jern-jernoksid (kjerneskall) struktur. EELS-kartleggingen (figur 4 C, 4D) ble identifisert at jernoksidlaget på NWs er Fe 3 O4 mer enn Fe2O3, som ligner på en tidligere publikasjon20.
Antigeniteten til de vedlagte antistoffene kan bekreftes ved hjelp av IP- og WB-analysene, der et bånd kan observeres på den positive prøven, men ikke på de negative kontrollene (figur 5). Merk at for å observere et klart bånd, ikke bruk mindre enn 0,1 mg NWs/10 x 106 celler. BCA-analyse (Table of Materials) i kombinasjon med noen beregninger presentert i tabell 3 ble brukt til å kvantifisere antistofftallet på NW.
Videre ble zeta-potensialmålingen brukt for å belyse overflatefunksjonaliseringen. Den terminale amingruppen på APTES reduserte den negative ladningen til de ikke-belagte NWene, som vist i figur 6. De antistofffunksjonaliserte NWene endret også ladningen sammenlignet med APTES-belagte NWs (figur 6). Alle zeta-potensialmålingene ble gjort ved pH 7.
Den spesifikke cellemålrettingen av antistofffunksjonaliserte NW kan bekreftes ved hjelp av konfokalmikroskopi (figur 7). Biokompatibiliteten til ethvert nytt nanomateriale bør testes før du starter noen applikasjon. Derfor ble cellelevedyktighetsanalysen brukt, og den bekreftet at de ikke-belagte, APTES-belagte og antistoffbelagte NWene var biokompatible selv med høy konsentrasjon (figur 8).
Figur 1: Skjematisk representerer belegget og biofunksjonaliseringsmetoden til nanotrådene. (A) Belegg av jern NWs med APTES. (B) Aktivering av antistoffene ved å bruke EDC + Sulfo-NHS, for å ha på slutten (C) et antistoff funksjonalisert nanotråd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Jernavsatt aluminiumsplate. (A) Aluminiumsskiven før skjæringen. (B) De røde linjene viste hvor platen skulle kuttes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fremgangsmåte for frigjøring av nanotråd. (A) Klynger av nanotråder flyter i NaOH-løsning. Bildet ble tatt 10 min etter å ha lagt til NaOH og etter fjerning av Al-membranen. (B) Nanotråder suspendert i etanol. Bildet ble tatt i det siste utgivelsestrinnet, umiddelbart etter sonikeringstrinnet. (C) Svart nanotrådpellet samlet av en magnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Elektron energitapsspektroskopi (EELS) kart. (A) APTES-belagt nanotråd (APTES-NW). De blå og rosa fargene representerer henholdsvis jern- og silisiumatomer. (B) Ikke-belagt nanotråd (NW). Barkblå og lyseblå farger representerer henholdsvis jern- og jern/oksygenblandingskartleggingen. Den tilsvarende EELS-kartleggingen av (C) kjernen og (D) skallet til de ikke-belagte NWene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bekreftelse av funksjonalisering og aktivitet av antistoffkonjugerte nanotråder. Antigenisiteten til CD44-NW ble bekreftet ved bruk av immunpresipitasjon (IP) og western blot (WB). +Ve: representerer den positive kontrollen (fullcellelysat). -Ve: representerer den negative kontrollen (bare ikke-belagt NW). - CD44-celler: representerer celler som ikke uttrykker CD44-antigen; + CD44-celler: representerer tykktarmskreftceller som uttrykker CD44-antigen. Dette er en representativ flekk av n = 3 uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Zeta-potensialverdier for NW, APTES-NW og antistoff. Stolpene representerer gjennomsnittet ± standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Konfokale mikroskopiske bilder viser den spesifikke målrettingen. CD44-NW er vist å feste (A og C), mens Isotype-NWene (negativ kontroll) ikke festet seg (B og D). De røde, blå og grønne fargene representerer henholdsvis cellemembranen, kjernen og klyngen av CD44-NW. A og B er de lyse feltbildene av henholdsvis C og D. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Cellelevedyktighetsstudie av tykktarmskreftceller (HCT116) inkubert med forskjellige formuleringer av nanotråder. Cellene ble behandlet med NWs etter 24 timers inkubasjon og deretter inkubert i 24 timer med NWs. Alle forsøkene ble utført inne i en inkubator ved 37 °C. Stolpene representerer gjennomsnittet ± standardfeil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Parameter | Verdi | Enhet | ||
| Lengde Fe NW (h) | 2.6 | μm | ||
| Radius (diameter/2) (r) | 0.01679231 | μm | ||
| Fe tetthet (D) | 7.87 | g/cm3 | ||
| 1 Fe NW volum (V) = π r ^ 2h | 2.30E-15 | cm3 | ||
| 1 Fe NW-masse = V x D | 1.80E-08 | μg | ||
| 1 Fe NW overflateareal = 2π r ^ 2 + 2πrh | 2.76E-01 | μm2 | 2,8E+05 | NM2 |
Tabell 1: Beregning av jern NW-massen.
| Parameter | Verdi | Enhet |
| Tetthet av APTES/100 μL* | 9.50E-01 | g |
| Moleculer wight (MW) av APTES | 2,21E+02 | g/mol |
| Antall APTES mol = masse/MW | 4.29E-03 | Mol |
| Antall APTES-molekyler/100 μL** | 2,57E+21 | Molekyler |
| APTES størrelse *** | 5.00E-01 | Nm |
| APTES overflateareal | 2.00E-01 | NM2 |
| NW overflate **** | 2,76E+05 | NM2 |
| Antall NWs i 0,3 mg NW **** | 1,70E+10 | NWs |
| Antall APTES-molekyler som trengs for å lage ett lag rundt NW | 1,38E+06 | APTES-molekyl |
| Antall APTES-molekyler som trengs for 0,3 mg NW | 2,35E+16 | APTES-molekyl |
| * Refrence nummer 61 | ||
| ** Antall molekyler = Antall mol*avogadro-tall (6E+23) | ||
| Refrence nummer 62 | ||
| Fra tabell 1 | ||
Tabell 2: Beregning av antall APTES-molekyler som kreves for NWs belegg.
| Y-formet IgG-antistoff | NW | |
| Masse for ett antistoff | 2.3E-13 μg | 1,8E-08 μg* |
| Overflateareal for ett antistoff | 23 NM2 | 2,6E+05 nm2 |
| Basert på BCA-analyse | 0,3 mg per 1 mg | |
| Antallet antistoffmolekyl og NW i 0,3 mg antistoff per mg NW | ~1E+15 antistoffer ** per ~5.6E+10 NWs | |
| Antall antistoffmolekyler per NW | ~2E+04 antistoffer per 1 NW*** | |
| *Beregnet fra tabell 1 | ||
| **Antall antistoffer i 0,3 mg ble beregnet ved å dele antistofftallet vi fikk fra BSA-analysen (0,3 mg) på gjennomsnittlig molekylvekt av Y-formede IgG-antistoffer (180 kDa = 3E-16 mg). | ||
| Basert på overflaten av ett molekyl av Y-formede IgG-antistoffer (~ 23 nm2) og overflaten av en NW (~ 2,6E + 05 nm2), ville rundt 1E + 04 antistoffer være nok til å skape et monolag på NW. I vårt tilfelle var tettheten av antistoff to ganger mer enn forventet mengde. Dette kan være relatert til APTES-belegget som gir flere armer som tillater høy festing av antistoffene. Denne saken sikrer at NW er fullt dekket med antistoffene og muligheten for antistoffet til å binde seg til et celleoverflateantigen, uavhengig av orienteringen til NWene vil være høy. Imidlertid, hvis antistofftettheten er lavere enn det forventede antallet (1E + 04 molekyl antistoff), vil bindingssjansen mellom cellen og NWene være lavere. | ||
Tabell 3: Beregning av antall antistoffer på nanotråden.
Discussion
Som med alle nanomaterialfabrikasjons- og beleggingsmetoder, kreves en høy kvalitet på løsningene som brukes. Frigjøringsløsningene (1 M NaOH) og funksjonaliseringsløsningen (MES) kan gjenbrukes flere ganger. Det er imidlertid svært viktig å sjekke pH-verdien før du starter en ny prosess. I utgivelsestrinnet bør vasking av NWs med NaOH utføres minst fire ganger. Jo bedre vask, jo bedre stabilitet av NWs og jo mindre de er samlet. Oksidlaget forbedrer stabiliteten til NWene ved nedsenkning i etanol eller vann63.
Diameteren og lengden på NWene ble påvirket etter å ha belagt dem med APTES og antistoffer. Her økte diameteren fra 41, 5 nm til 70 nm, og lengden ble redusert fra 2, 5 μm til 1, 6 μm på grunn av sonikeringstrinnene som bryter NWene. Derfor er det viktig karakterisere morfologien til NWene etter biofunksjonaliseringstrinnet.
Vedlegget av antistoffene til NWs er avhengig av den kovalente interaksjonen mellom amingruppen (på APTES) og karboksylgruppen (på antistoffet). Derfor er bekreftelse av tilstedeværelsen av APTES-belegget et viktig skritt, som vi brukte EELS-kartlegging for. Belegningsmetoden er trygg og grei. Det trenger ikke høye temperaturer eller lange inkubasjonstider. APTES-belegg fungerer også som en linker for å muliggjøre kovalent vedlegg av andre antistoffer eller proteiner som har en karboksylgruppe.
Ved biofunksjonalisering av NWene med et antistoff kan antigenisiteten til antistoffenes bindingssteder etter biofunksjonaliseringsprosessen påvirkes. IP- og WB-metoden kan brukes til å undersøke dette problemet. Ved å bruke biofunksjonaliseringsmetoden nevnt i denne protokollen, vil antistoffene binde seg til NWene med høy antigenisitet til en spesifikk cellereseptor. Videre tilførte biofunksjonalisering av NWene med antistoffer evnen til å målrette cellene med reseptoren av interesse, CD44 her. Dette ble bekreftet ved konfokal mikroskopi. Selv om biokompatibiliteten til de ubelagte NW-ene var høy (>95%), forbedret tilsetning av APTES-belegg eller antistoffer mot NW-ene deres biokompatibilitet 100%.
Videre er beleggings- og biofunksjonaliseringsprotokollen effektiv, økonomisk og reproduserbar. Det bør gjelde for alle andre jern-jernoksid nanomaterialer, hvorved konsentrasjonen av både belegget og de vedlagte antistoffene skal optimaliseres basert på overflaten og massen av nanomaterialet. Denne protokollen kan gjøres trygt ved omgivelsesforhold i det generelle laboratoriet. Biofunksjonaliseringen har betydelig forbedret biokompatibiliteten til nanomaterialet og deres målrettingsevne. Generelt er NWs ekstremt lovende materialer for nanomedisinske applikasjoner (inkludert multimodale eller kombinatoriske behandlinger, celledeteksjon eller veiledning og biologisk sensing). Kombinert med biofunksjonalisering, som beskrevet her, kan spesifikk cellemålretting oppnås for økt presisjon og effekt.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-402-7 | |
| 2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES) | Thermscientific | AC172590250 | Concentration 0.1 M and pH 4.7 |
| 3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC) | Thermofisher | PG82079 | |
| 3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES) | Sigma Aldrich | 919302 | |
| 5 mL glass tube | Fisherscientific | 03-339-22C | |
| 96-well plate ( flat bottom) | Sigma Aldrich | CLS3595 | |
| Anti-CD44 antibody | BD Biosciences | 550990 | Clone 515, concentration 1 mg/mL |
| APTES ((3-Aminopropyl)triethoxysilane), 99% | Sigma Aldrich | 919-30-2 | Concentration 99% |
| BCA assay (Pierce BCA Protein Assay Kit) | Thermofisher | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin solution (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Concentration 35% |
| Cell incubator | Thermofisher | 50116047 | |
| Cell viability reagent | AlamarBlue,Thermofisher | DAL1025 | |
| Colon cancer cells - HCT116 cell line | ATCC | 430641 | |
| Hardwood Hammer | Any hammer tool can be used, there is no specific brand. | ||
| Inductively coupled plasma Mass Spectrometer (ICP-MS) | Perkin Elmer | ELAN 9000 ICP-MS | The used software is "Elan instrument control session" |
| Laboratory Retort Stand with Clamp | RVFM | 13-0140 | This is used to handle the 5 mL glass tube in the sonicator bath. |
| Magnetic rack (DynaMag-2 Magnet) | Thermofisher | 12321D | |
| McCoy’s 5A Medium 1x | Gibco | 16600082 | |
| Microplate reader (Bio-Rad xMark Absorbance Spectrophotometer) | Bio-Rad | 1681150 | Microplate Manager 6 software (#168-9520) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Gibco | 14200067 | Concentration 0.1 M (No calcuim, no magnesium) |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 14190136 | Concentration 0.01 M (No calcuim, no magnesium) |
| Plate shaker (Microplate Genie) | Scientific Industries (Genie) | SI-0400 | |
| Single Edge Razor blades | Polysciences | 08410-1 | |
| Sodum hydrixide (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | Concentration 1 M, pH 13 |
| Sulfo-N-HydroxySulfosuccinimide (sulfo-NHS) | Thermofisher | 106627-54-7 | |
| Trypsin | ATCC | 30-2101 | |
| Tube rotator | VWR | 10136-084 | |
| Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2.0 mL) | Eppendorf, Fisherscientific | 05-400-204 | |
| Ultrasonic bath (2510) | Branson | 2489502 |
References
- Dürr, S. Magnetic nanoparticles for cancer therapy. Nanotechnology Reviews. 2 (4), 395-409 (2013).
- Espinosa, A. Duality of iron oxide nanoparticles in cancer therapy: amplification of heating efficiency by magnetic hyperthermia and photothermal bimodal treatment. ACS Nano. 10 (2), 2436-2446 (2016).
- Martínez Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery, Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. , (2019).
- Das, R. Tunable high aspect ratio iron oxide nanorods for enhanced hyperthermia. The Journal of Physical Chemistry. 120 (18), 10086-10093 (2016).
- Chen, J., et al. Guidance of stem cells to a target destination in vivo by magnetic nanoparticles in a magnetic field. ACS Applied Materials Interfaces. 5 (13), 5976-5985 (2013).
- Juneja, R., Roy, I. Iron oxide-doped niosomes as drug carriers for magnetically targeted drug delivery. International Journal of Nanomedicine. 13, 7 (2018).
- Aires, A., et al. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective drug delivery to CD44-positive cancer cells. Nanotechnology. 27 (6), 065103 (2016).
- Trabulo, S., Aires, A., Aicher, A., Heeschen, C., Cortajarena, A. L. Multifunctionalized iron oxide nanoparticles for selective targeting of pancreatic cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta -General Subjects. 1861 (6), 1597-1605 (2017).
- Blanco-Andujar, C., et al. Design of iron oxide-based nanoparticles for MRI and magnetic hyperthermia. Nanomedicine. 11 (14), 1889-1910 (2016).
- Hachani, R., et al. Polyol synthesis, functionalisation, and biocompatibility studies of superparamagnetic iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agents. Nanoscale. 8 (6), 3278-3287 (2016).
- Contreras, M. F., Sougrat, R., Zaher, A., Ravasi, T., Kosel, J. Non-chemotoxic induction of cancer cell death using magnetic nanowires. International Journal of Nanomedicine. 10, 2141 (2015).
- Perez, J. E., et al. Cytotoxicity. , IntechOpen. Ch. 12 (2018).
- Kievit, F. M., Zhang, M. Surface engineering of iron oxide nanoparticles for targeted cancer therapy. Accounts of Chemical Research. 44 (10), 853-862 (2011).
- Xu, H. Antibody conjugated magnetic iron oxide nanoparticles for cancer cell separation in fresh whole blood. Journal of Biomaterials. 32 (36), 9758-9765 (2011).
- Zhang, L., Dong, W. F., Sun, H. B. Multifunctional superparamagnetic iron oxide nanoparticles: design, synthesis and biomedical photonic applications. Nanoscale. 5 (17), 7664-7684 (2013).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Functionalized magnetic nanowires for chemical and magneto-mechanical induction of cancer cell death. Scientific Reports. 6, 35786 (2016).
- Tian, Q., et al. Multifunctional Polypyrrole@ Fe3O4 Nanoparticles for Dual-Modal Imaging and In Vivo Photothermal Cancer Therapy. Small. 10 (6), 1063-1068 (2014).
- Alsharif, N. A., Martiìnez-Banderas, A. I., Merzaban, J., Ravasi, T., Kosel, J. Biofunctionalizing Magnetic Nanowires Toward Targeting and Killing Leukemia Cancer Cells. IEEE Transactions on Magnetics. 2 (99), 1-5 (2018).
- Ventola, C. L. Progress in nanomedicine: approved and investigational nanodrugs. Journal of Pharmacy Therapeutics. 42 (12), 742 (2017).
- Ivanov, Y. P., et al. Tunable magnetic nanowires for biomedical and harsh environment applications. Scientific Reports. 6, 24189 (2016).
- Margineanu, M. B., et al. Semi-automated quantification of living cells with internalized nanostructures. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 4 (2016).
- Jeon, Y. S., et al. Metallic Fe-Au Barcode Nanowires as a Simultaneous T Cell Capturing and Cytokine Sensing Platform for Immunoassay at the Single-Cell Level. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (27), 23901-23908 (2019).
- Lee, E., et al. Highly selective CD44-specific gold nanorods for photothermal ablation of tumorigenic subpopulations generated in MCF7 mammospheres. Nanotechnology. 23 (46), 465101 (2012).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. J. J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rozhkova, E. A., et al. Ferromagnetic microdisks as carriers for biomedical applications. Journal of Applied Physics. 105 (7), 306 (2009).
- Kim, D. H., et al. Biofunctionalized magnetic-vortex microdiscs for targeted cancer-cell destruction. Nature Materials. 9 (2), 165-171 (2010).
- Kim, D. H., et al. Mechanoresponsive system based on sub-micron chitosan-functionalized ferromagnetic disks. Journal of Materials Chemistry. 21 (23), 8422-8426 (2011).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Multifunctional ferromagnetic disks for modulating cell function. IEEE Transactions on Magnetics. 48 (11), 3269-3274 (2012).
- Vitol, E. A., Novosad, V., Rozhkova, E. A. Microfabricated magnetic structures for future medicine: from sensors to cell actuators. Nanomedicine. 7 (10), 1611-1624 (2012).
- Lim, J., et al. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1-12 (2019).
- Shore, D., et al. Electrodeposited Fe and Fe–Au nanowires as MRI contrast agents. Chemical Communications. 52 (85), 12634-12637 (2016).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Iron-Based Core-Shell Nanowires for Combinatorial Drug Delivery and Photothermal and Magnetic Therapy. ACS Applied Materials Interfaces. 11 (47), 43976-43988 (2019).
- Martínez-Banderas, A. I., et al. Magnetic core-shell nanowires as MRI contrast agents for cell tracking. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 1-12 (2020).
- Zhu, L., Zhou, Z., Mao, H., Yang, L. Magnetic nanoparticles for precision oncology: theranostic magnetic iron oxide nanoparticles for image-guided and targeted cancer therapy. Nanomedicine. 12 (1), 73-87 (2017).
- Guleria, A., Priyatharchini, K., Kumar, D. Applications of Nanomaterials. , Elsevier. 345-389 (2018).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 2. Quantitative infrared spectroscopic determination of equilibrium structures of solution-adsorbed n-alkanoic acids on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 52-66 (1985).
- Allara, D. L., Nuzzo, R. G. Spontaneously organized molecular assemblies. 1. Formation, dynamics, and physical properties of n-alkanoic acids adsorbed from solution on an oxidized aluminum surface. Langmuir. 1 (1), 45-52 (1985).
- Schrittwieser, S., Reichinger, D., Schotter, J. Applications, surface modification and functionalization of nickel nanorods. Materials and Structures. 11 (1), 45 (2018).
- Lim, J., Choi, M., Lee, H., Kim, Y. H., Han, J. Y., Lee, E. S., Cho, Y. Direct isolation and characterization of circulating exosomes from biological samples using magnetic nanowires. Journal of Nanobiotechnology. 17 (1), 1 (2019).
- Nemati, Z., et al. Magnetic Isolation of Cancer-derived Exosomes Using Fe/Au Magnetic Nanowires. ACS Applied Nano Materials. 3 (2), 2058-2069 (2020).
- Hainfeld, J. F., Liu, W., Halsey, C. M., Freimuth, P., Powell, R. D. Ni-NTA-gold clusters target His-tagged proteins. Journal of Structural Biology. 127 (2), 185-198 (1999).
- Agarwal, G., Naik, R. R., Stone, M. O. Immobilization of histidine-tagged proteins on nickel by electrochemical dip pen nanolithography. Journal of the American Chemical Society. 125 (24), 7408-7412 (2003).
- Aswal, D., Lenfant, S., Guerin, D., Yakhmi, J., Vuillaume, D. Self assembled monolayers on silicon for molecular electronics. Analytica Chimica Acta. 568 (1-2), 84-108 (2006).
- Haensch, C., Hoeppener, S., Schubert, U. S. Chemical modification of self-assembled silane based monolayers by surface reactions. Chemical Society Reviews. 39 (6), 2323-2334 (2010).
- Wildt, B., Mali, P., Searson, P. C. Electrochemical template synthesis of multisegment nanowires: Fabrication and protein functionalization. Langmuir. 22 (25), 10528-10534 (2006).
- Schladt, T. D., Schneider, K., Schild, H., Tremel, W. Synthesis and bio-functionalization of magnetic nanoparticles for medical diagnosis and treatment. Dalton Transactions. 40 (24), 6315-6343 (2011).
- Kumar, C. S. Magnetic nanomaterials. , John Wiley & Sons. (2009).
- Peiris, P., et al. Precise targeting of cancer metastasis using multi-ligand nanoparticles incorporating four different ligands. Nanoscale. 10 (15), 6861-6871 (2018).
- Veiseh, O., Gunn, J. W., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Journal of Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (3), 284-304 (2010).
- Rosenblum, D., Joshi, N., Tao, W., Karp, J. M., Peer, D. Progress and challenges towards targeted delivery of cancer therapeutics. Nature Communications. 9 (1), 1410 (2018).
- Bazak, R., Houri, M., El Achy, S., Kamel, S., Refaat, T. Cancer active targeting by nanoparticles: a comprehensive review of literature. Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 141 (5), 769-784 (2015).
- Zeilstra, J., et al. CD44 expression in intestinal epithelium and colorectal cancer is independent of p53 status. PLoS One. 8 (8), 72849 (2013).
- Pesarrodona, M., et al. Intracellular targeting of CD44+ cells with self-assembling, protein only nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics. 473 (1-2), 286-295 (2014).
- Chandra, V., et al. Quantitative assessment of CD44 genetic variants and cancer susceptibility in Asians: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (45), 74286 (2016).
- Thapa, R., Wilson, G. D. The importance of CD44 as a stem cell biomarker and therapeutic target in cancer. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Gao, S., Zheng, X., Jiao, B., Wang, L.
- Das, M., Mohanty, C., Sahoo, S. K. Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opinion on Drug Delivery. 6 (3), 285-304 (2009).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. 2, Garland Pub. New York. (2001).
- Patel, N. S., Lago-Cachón, D., Mohammed, H., Moreno, J. A., Kosel, J. Iron Nanowire Fabrication by Nano-Porous Anodized Aluminum and its Characterization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60111 (2019).
- Rao, X., et al. High density gold nanoparticles immobilized on surface via plasma deposited APTES film for decomposing organic compounds in microchannels. Applied Surface Science. 439, 272-281 (2018).
- Merck. (3-Aminopropyl)triethoxysilane. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440140?lang=en®ion=SA (2020).
- Munguía-Cortés, L., et al. APTES-functionalization of SBA-15 using ethanol or toluene: Textural characterization and sorption performance of carbon dioxide. Journal of the Mexican Chemical Soceity. 61 (4), 273-281 (2017).
- Sperling, R. A., Parak, W. J. Surface modification, functionalization and bioconjugation of colloidal inorganic nanoparticles. Philosophical Transactions of the Royal Society A: Mathematical & Physical Engineering Sciences. 368 (1915), 1333-1383 (2010).
