Live-Cell Forward Genetisk tilnærming til å identifisere og isolere utviklingsmutanter i Chlamydia trachomatis

Summary

Denne protokollen benytter fluorescerende promotor-reportere, live-celle mikroskopi, og individuell inkludering utvinning i en rettet fremover genetisk tilnærming for å identifisere og isolere utviklingsmutanter av Chlamydia trachomatis.

Abstract

Det intracellulære bakterielle patogenet Chlamydia trachomatis gjennomgår en utviklingssyklus bestående av to morfologisk diskrete utviklingsformer. Den ikke-repliktive elementære kroppen (EB) initierer infeksjon av verten. Når du er inne, skiller EB seg inn i reticulate kroppen (RB). RB gjennomgår deretter flere runder med replikering, før de differensierer tilbake til den smittsomme EB-formen. Denne syklusen er avgjørende for klamydia overlevelse som unnlatelse av å bytte mellom celletyper hindrer enten vert invasjon eller replikering.

Begrensninger i genetiske teknikker på grunn av den obligatoriske intracellulære naturen til Klamydia har hindret identifisering av molekylære mekanismer som er involvert i celletypeutviklingen. Vi designet et nytt dobbelt promoter-reporter plasmid system som, sammen med live-celle mikroskopi, tillater visualisering av celletype bytte i sanntid. For å identifisere gener som er involvert i reguleringen av celletypeutvikling, ble live-cell promoter-reporter-systemet utnyttet for utviklingen av en fremadstormende genetisk tilnærming ved å kombinere kjemisk mutagenese av den doble reporterstammen, bildebehandling og sporing av Klamydia med endret utviklingskinetikk, etterfulgt av klonnal isolasjon av mutanter. Denne fremadgående genetiske arbeidsflyten er et fleksibelt verktøy som kan endres for ledet avhør til et bredt spekter av genetiske veier.

Introduction

Chlamydia trachomatis (Ctr) er et obligatorisk intracellulært patogen som utvikler seg gjennom en bifasisk utviklingssyklus som er avgjørende for overlevelse og spredning¹. Denne syklusen består av to utviklingsformer, den elementære kroppen (EB) og reticulate kroppen (RB). EB er replikering inkompetent, men formidler celleinvasjon gjennom effector indusert endocytosis². En gang i verten modnes EB til den replikerte RB. RB utfører flere runder med replikering før konvertering tilbake til EB for å initiere påfølgende runder med infeksjon.

Det begrensede utvalget av genetiske verktøy har begrenset det meste av klamydiaforskningen til biokjemiske studier eller bruk av surrogatsystemer. Som en konsekvens har belysning av genregulering og kontroll av utviklingssyklusen vært vanskelig^3,4. En av de viktigste utfordringene i klamydialfeltet er den høyoppløsnings temporale sporingen av klamydiautviklingssyklusen og identifisering av proteinene som er involvert i reguleringen. Genuttrykk under klamydiautviklingssyklusen har tradisjonelt blitt utført ved destruktive "sluttpunkt" metoder, inkludert RNAseq, qPCR og fast cellemikroskopi^5,,6. Selv om disse metodene har gitt uvurderlig informasjon, teknikkene ansatt er arbeidskrevende og har lav timelig^{oppløsning 5,6}.

I løpet av det siste tiåret har genetisk manipulering av Ctr utviklet seg med innføringen av plasmid transformasjon og metoder for mutagenese^7,8,9. For denne studien ble et plasmidbasert system utviklet for å overvåke klamydiautvikling i individuelle inneslutninger i sanntid i løpet av en infeksjon. En klamydial transformant ble opprettet som uttrykte både en RB og EB celle-type spesifikk promotor-reporter. Den RB spesifikke reporteren ble konstruert ved å fikse promoteren av det tidlige RB-genet euo oppstrøms av det fluorescerende proteinet Clover. EUO er en transkripsjonsregulator som undertrykker en undergruppe av sene EB-tilknyttede gener¹⁰. Arrangøren av hctB, som koder en histone-lignende protein involvert i EB nukleoid kondens, ble klonet direkte oppstrøms av mKate2 (RFP) for å lage EB spesifikk reporter¹¹. Ryggraden for hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover var p2TK2SW2⁷. HctB- og euo-promotorene ble forsterket fra Ctr-L2 genomisk DNA. Hver promotorsekvens besto av ~100 basispar oppstrøms av det forventede transkripsjonsstartstedet for det angitte klamydiagenet pluss de første 30 nukleotid (10 aminosyrene) av de respektive ORF. De fluorescerende FP-variantene ble kommersielt oppnådd som Ctr codon optimaliserte genblokker og klonet i rammen med de første 30 nukleotid av hvert klamydiale gen og promotor. IncD-terminatoren ble klonet direkte nedstrøms av mKate2. Den andre promotor-reporteren ble satt inn nedstrøms av incD-terminatoren. Ampicillinresistensgenet (bla) i p2TK2SW2 ble erstattet med aadA-genet (Spectinomycin resistens) fra pBam4. Dette resulterte i den endelige konstruksjonen p2TK2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover (Figur 1A) som ble forvandlet til Ctr-L2⁷. Denne RB / EB reporter belastning tillatt for observasjon av utviklingssyklusen innenfor enkelt inneslutninger ved hjelp av live-celle mikroskopi (Figur 1B, C).

Ved hjelp av vår promotor-reporter konstruere i kombinasjon med kjemisk mutagenese, ble en protokoll utviklet for å spore og isolere individuelle kloner som viste utviklingsmessige abnormiteter fra mutageniserte populasjoner av Ctr serovar L2. Denne protokollen muliggjør direkte overvåking av individuelle klamydial inneslutninger, sporing av genuttrykksprofiler over tid, identifisering av klamydial kloner som uttrykker et endret utviklingsgenuttrykksmønster og klonalt isolasjon av Klamydia fra individuelle inneslutninger.

Selv om denne protokollen er opprettet spesielt for identifisering av gener involvert i klamydial utvikling, kan det lett tilpasses for å avhøre en rekke klamydiagene veier.

Protocol

Alle Python-skript som brukes i denne protokollen, er tilgjengelige på Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing

1. Mutagenize Reporter Klamydia

MERK: Ctr-L2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover EBs ble direkte mutagenisert ved hjelp av etylmetansulfonat (EMS) i akseniske medier CIP-1 som dette mediet støtter EB metabolisme og vedlikehold av EB infectivity¹².

1. Tin en klamydial lager på is som inneholder ~ 3 x 10^{7 EBs} forvandlet med p2TK2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover reporter plasmid og pellet på > 14.000 x g for 30 min ved 4 ° C.
   MERK: Klamydiaorganismer som ble brukt til disse eksperimentene var 30 % renografin tetthet renset og frosset ved -80 °C i 1x sukrose-fosfat-glutamatbuffer (SPG).
2. Kast den overnaturlige og resuspend EB pellet i 100 μL CIP-1 buffer med sonikering på is ved 10% effekt for 10 s. Del 100 μL EB-suspensjonen i to 50 μL aliquots for mutageniserte og mock behandlede prøver.
3. Forbered 20 mg/ml EMS-CIP-1-oppløsning i et separat 1,5 ml mikrocentrifugerør. For å gjøre dette, tilsett 6,8 μL EMS i 375 μL totalt volum.
4. Tilsett 50 μL av EMS-CIP-1-løsningen i en av klamydia aliquots for mutagenesis og 50 μL CIP-1 bare til den andre klamydial aliquot for mock mutagenesis.
   MERK: Endelig EMS-konsentrasjon er 10 mg/ml. Klamydiateret, EMS-konsentrasjonen og eksponeringstiden som brukes i denne protokollen fører til omtrent 60-80 % reduksjon i smittsom avkom. Dette reduksjonsnivået tilsvarer ~5-20 DNA-lesjoner per klamydiagenom⁸.
5. Inkuber i 20 min ved romtemperatur. Mutageniserte EBer vil bli brukt direkte til å infisere monolayers i avsnitt 2.
   FORSIKTIG: EMS er et kjent kreftfremkallende stoff. Alt utstyr og materialer som kommer i kontakt med EMS må være gjennomvåt i 1 M NaOH i 24 timer før deponering, hansker skal brukes til enhver tid under protokollen og opprydding av EMS-materialer.

2. Bildebehandling av mutert ctr

1. Vertscellekultur for avbildning og isolering av mutagenisert ctr
   1. Seed en 6 brønn glass bunnplate med 6 x 10⁵ Cos-7 celler (ATCC) per brønn i 2 ml komplett media (RPMI-1640 supplert med 10% fostervin serum og 10 mg / ml gentamicin). Bruk denne glassbunnplaten til avbildning av mutagenisert ctr.
   2. Seed en 24 brønnpolystyrenplate med 1 x 10⁵ Cos-7-celler (ATCC) per brønn i 1 ml komplette medier. Bruk denne polystyrenplaten for gjeninfeksjon av isolerte klamydia av interesse.
   3. Inkuber begge platene ved 5 % CO_2,37 °C i ca. 18 timer. Når cellene når samløpet, erstatt utskriftsmaterialet med komplette medier supplert med 1 μg/ml cykloheximid og inkuber over natten.
2. Infisere vertscellekulturen med mutagenisert ctr
   1. Infisere 5 brønner av glassbunnplaten med ~ 6 x^{10 5} av mutageniserte EBer i 1,5 ml / godt iskald HBSS. Dette vil resultere i MOI på ~ 0,3 som ~ 70% dødelighet forventes på grunn av mutagenese.
   2. Infisere de resterende godt med ~ 2 x 10⁵ mock mutagenized EBs i 1,5 ml / brønn iskald HBSS. Uten mutagenese, forvent mindre dødelighet, og dermed brukes en tredjedel av inoculum til å oppnå MOI på ~ 0,3.
      MERK: MOI på ~ 0,3 sikrer at vertsceller er infisert av en enkelt EB og gir nok separasjon mellom infiserte celler for klonalt isolasjon.
   3. Inkuber platen i 15 min, med gynge, ved 37 °C.
   4. Vask de infiserte vertscellene med forvarmet (37 °C) HBSS som inneholder 1 mg/ml heparin etterfulgt umiddelbart av en HBSS-skylling. Gjenta heparinvask, skyll straks 2x med HBSS for å sikre at heparin fjernes.
      MERK: Heparin hemmer og kan reversere de tidlige elektrostatiske interaksjonene mellom vertscellen og EBs¹³. Heparin vasker fjerne EBer som ennå ikke har kommet inn i vertscellene, synkronisere infeksjonen. Når du vasker celler, gjør det forsiktig for å forhindre at cellene løsner fra overflaten av brønnene. HBSS- og heparinløsninger inneholder gjenværende EMS og skal plasseres i et beger som inneholder 1 M NaOH i 24 timer før deponering.
   5. Erstatt HBSS med 4 ml/brønn med forhåndsvarte (37 °C) bildemedier (komplette medier, 1 μg/ml cykloheximid, 20 mM HEPES og ingen fenolrød).
   6. Fyll interwell-områdene med forvarmet (37 °C) deionisert H₂O for å hjelpe til med temperaturkontrollen og redusere fordampningen. Inkuber platen ved 37 °C inkubator med 5 % CO₂ i 10 timer.
3. Mikroskop satt opp og bildebehandling
   MERK: Flerfarget flerfunksjonsautomatisk live-celle fluorescerende bildebehandling brukes til å samle inn tidsforløpsbilder for å identifisere klamydialmutanter som varierer i utviklingsgenuttrykksdynamikken. Denne protokollen benytter åpen kildekode μManager programvarepakke for automatisert mikroskopkontroll¹⁴.
   1. Begynn mikroskopet oppsett 10 h etter infeksjon. Sett mikroskopets fase inkubator til 5 % CO_2,37 °C. Plasser den infiserte 6-brønnens glassbunnsplate i sceneinkubatoren og sett prøvetistoren inn i interbrønnen H₂O.
   2. Kalibrer XY-fasen ved hjelp av plugin-modulen For visning av høyt innhold(HCS). Klikk på Programtillegg | Anskaffelsesverktøy | HCS Site Generator i μManager mikroskop kontroll programvare (JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
   3. Velg 6-brønnsplatemalen og generer en bildeposisjonsliste bestående av 12 synsfelt (FOV) per brønn i HCS-plugin (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Åpne listen over trinnposisjon, og fokuser manuelt, og angi den opprinnelige Z-posisjonen for hver FOV ved hjelp av plugin-modulenFortrinnskontroll( JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6 ). Juster XY-koordinatene til enhver FOV som har manglende celler eller ikke inneholder en ensartet monolag.
      MERK: På grunn av tiden det tar for hvert bilde å bli tatt, kan maksimalt 72 FOV tas per 30 min intervall.
   4. Bruk en objektiv objektiv på 20 x for bildebehandling. Denne forstørrelsen gjør at ~ 8 inneslutninger kan avbildes per FOV samtidig som den gir ønsket oppløsning.
   5. Lagre posisjonslisten da dette vil bli brukt til å finne inkluderinger av interesse etter dataanalyse (JoVE61365_screenfile7).
   6. Bruk alternativet Autofokus i bildeprogramvaren til å angi fokus for automatisert bildebehandling (JoVE61365_screenfile8).
   7. Bruk følgende valg og verdier til å produsere de mest konsekvente fokusresultatene ved hjelp av bildebasert autofokus i μManager. I vinduet Egenskaper for autofokus velger du OughtaFocus fra rullegardinmenyen og bruker følgende innstillinger. OughtaFocus-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0,5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Ja, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
      MERK: Hvis du reduserer bildevinduet for autofokus ved å redusere avlingsfaktoren, kan du fokusere mer konsekvent automatisk fokusering. Hvis du velger Ja for OughtaFocus-ShowImages, kan brukeren vise autofokusbildet.
   8. Fang opp kinetikken i utviklingssyklusen ved å bilde i 24 timer med 30 min tidsintervaller (JoVE61365_screenfile9). Bildebehandling mellom 12-36 HPI sikrer at Chlamydia fullfører utviklingssyklusen, men ikke lyser vertscellen.
   9. Bilde cellemonolagene med en eksponering på 250 ms med henholdsvis 4 % og 18 % intensitet i GFP- og RFP-kanalene (JoVE61365_screenfile10). Oppdag Kløversignalet (GFP) ved eksitasjon ved 470 nm med et 514/30 nm båndpassutslippsfilter. Oppdag mKate2 (RFP)-signalet ved eksitasjon ved 595 nm og med et utslippsfilter på 641/75 nm båndpass.
      MERK: Minimere eksitasjonsintensiteten er avgjørende for å minimere fluorophore photobleaching og fototoksisitet til Klamydia. Den minste eksitasjonsintensiteten for å generere et løst bilde med en eksponering på 200-300 ms bør bestemmes empirisk i pilotstudier.
   10. Ta opp flere Z-skiver med en rekke fokus som slutter på hver side av fokusskiven. I dette eksperimentet, ved 20x forstørrelse, ble dette oppnådd med 4 skiver ved 10 μm trinn (JoVE61365_screenfile11).
   11. Velg Relativ Z for å bilde av flere stykker i anskaffelsesvinduet. Det relative Z-alternativet bruker Z-planplasseringen som er lagret i bildeposisjonslisten som utgangspunkt for neste tidsintervall. Skriv inn de riktige Z-offset-verdiene for fluorescensbildekanaler (JoVE61365_screenfile12).
       MERK: Det bildebaserte fokussystemet er ufullkomment, og over en 24-timers bildeperiode fører dette til fokusdrift. Det ble funnet at ved å fange 3-4 Z fokusfly for hvert gang punkt et fokusbilde ble opprettholdt. Z-offset er nødvendig for å korrigere for forskjellene i fokale fly mellom fluorescerende bildekanaler og DIC-kanalen. Det vil være nødvendig med en empiric bestemmelse av denne Z-offseten.
   12. Lagre bilder ved å velge rotkatalogen og navngi eksperimentet. Bruk alternativet μManager bildestakkfil til å lagre bilder som tiff-stakkfiler (JoVE61365_screenfile13).
   13. Registrere eksperimentelle detaljer i boksen Innhentingskommentarer i vinduet Multi-D Acquisition (JoVE61365_screenfile13). det vil si, Vel A1: Ubehandlet kontroll. Vel A2-3 og B1-3: EMS Mutants. Bildebehandling: 12-36HPI. Start bildeoppkjøpet på 12 HPI.
       MERK: Hvis du bruker μManager, lar du programmet, eksperimentell oppsett og mikroskopmaskinvare kjøre etter at eksperimentet er fullført. Bildestedene vil bli besøkt for inkluderingsisolering når analysen av den mutabiliserte populasjonen er fullført.

3. Identifisere og isolere mutagenisert klamydia med endrede utviklingsfenotyper

1. Opprette en bildestakk i fokus
   1. Trekk ut det mest fokussterkde bildet fra Z-stakkene ved hjelp av de lagrede bildedataene som inneholder 4 Z-skiver per tidspunkt. Bruk kurtosemålingsalternativet (Analyser | Mål) i ImageJ / FIJI for å automatisk identifisere mest i fokus Z skive (høyeste kurtose score) og lage en ny bildestakk med bare disse in-focus bilder. Et Python-skript er inkludert som en tilleggsfil (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) for å automatisere denne prosessen.
2. Kvantifisere fluorescensuttrykk i individuelle inneslutninger
   MERK: For å kvantifisere uttrykket kinetikk av de to reporterne bruke åpen kildekode bildeanalyse programmet ImageJ / FIJI og plugin Trackmate¹⁵. Trackmate identifiserer "flekker" (tilsvarende inneslutninger i dette tilfellet) og følger dem gjennom en time-lapse bildestakk registrere X, Y plassering og signalintensitet for hver inkludering over tid (JoVE61365_screenfile14). Denne informasjonen lagres som en CSV-fil og importeres til en egendefinert Python-notatblokk for analyse.
   1. Åpne den in-focus Z-reduserte bildestakken i ImageJ / FIJI ved hjelp av Bio-formater Importør ved å klikke Plugins | Bio-formater | Bio-formater Importør. Velg Hyperstakk og Kompositt (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
   2. Trekk fra bildebakgrunnen ved å klikke på Prosess | Trekk bakgrunn ved hjelp av en Rolling ball radius på 50,0 piksler og forbedre bildekontrasten til 0,3% for mettede piksler ( Prosess| Forbedre kontrasten). Multipliser bildeverdiene med 10,0 (Prosess | Matematikk | Multipliser) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
   3. I Trackmate (Plugins | Sporing | Trackmate), velg en estimert blob diameter på 48 piksler (empirisk bestemt basert på størrelsen på inkluderingen på slutten av bildet). Produser ikke-fragmenterte inkluderingsspor ved å velge en linking maks avstand og Gap-lukking maks avstand på 8,0 piksler og Gap-lukke maks ramme gap på 1 ( JoVE61365_screenfile23 -JoVE61365_screenfile25).
      MERK: For å forbedre Trackmate evne til å identifisere og spore inneslutninger gjennom hele syklusen en egen bildekanal er opprettet ved å legge til euoprom og hctBprom kanaler sammen ved hjelp av bilde matte funksjon i ImageJ / FIJI. Denne kanalen brukes deretter av Trackmate til å identifisere og følge inneslutninger over tid. De fluorescerende verdiene av euoprom og hctBprom kanaler blir deretter registrert i kanaler 2 og 3.
   4. Registrere spor som oppfyller en minimum kontinuerlig varighet: Varighet av sporet: 20 (JoVE61365_screenfile26). Analyser sporene og lagre flekkene i sporstatistikk som en CSV-fil (JoVE61365_screenfile27).
      MERK: Denne prosessen har blitt automatisert ved hjelp av et egendefinert Python-skript som er angitt i tilleggsdataene (TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
3. Identifisere inkluderingsspor med endrede utviklingsprofiler
   MERK: For å identifisere inkluderinger som inneholder Chlamydia med endrede utviklingsprofiler ble hvert inkluderingsspor visualisert ved hjelp av Python-notatblokk. Disse visualiseringene tillater identifisering av inkluderinger med kinetiske genuttrykksprofiler som skilte seg fra den spottebehandlede befolkningen. Python-notatboken som brukes til identifisering av inkluderinger med endret utviklingsprogrammering, er gitt i tilleggsdataene (EMS_Screen-Markdown).
   1. Importer inkluderingsspordataene fra Spots i spor statistikk CSV-filer til Pandas dataramme ved hjelp av Importer-cellen i EMS_Screen-Markdown Python Notebook.
   2. Opprinnelig plan korrigerer hvert spor ved å trekke minimumsverdien for hvert spor fra resten av sporverdiene ved hjelp av cellene For opprinnelig plan. Lagre de resulterende verdiene som en pickle-fil ved hjelp av Lagre som Pickle-cellen. Dette vil lagre kanalverdiene permanent etter grunnlinjeundertraksjon for senere henting.
      MERK: Undertraksjon ved baseline setter startfluoreserintensiteten for hver inkludering til null.
   3. Eliminer spor fra inneslutninger nær kantene av FOV ved hjelp av Filter Edges-cellen, da deres fluorescerende profiler kanskje ikke er fullstendig fanget; disse sporene kan produsere falske positive utviklingsprofiler.
   4. Kalibrer rammen (totalFrames) verdier fra bildeskiver til tid (startTid, intervall) verdier med Time-lapse Kalibrering celle ved hjelp av eksperimentell starttids- og bildetidsintervall. Utelat delvis inkludering leser ved å filtrere ut spor som ikke strekker seg over de siste 20 timene av eksperimentet (16-36 HPI) ved hjelp av sporvarighetfiltercellen.
   5. Skill spor i individuelle datarammer etter eksperimentell tilstand med Tilordne behandlingscellen. Filtrer for inneslutninger som viser tilstrekkelig vekst ved hjelp av filter for vekst-cellen. I cellen Filter for vekst angir du intensitetsterskelen for fluorescensintensiteten for euo-skoleballkanalenved å endre verdiene innenfor de to siste kodelinjene. Dette vil filtrere ut Klamydia som ikke vokste.
      MERK: Vær forsiktig når du angir terskelfiltre, hvis filteret er for lavt, vil de resulterende scatterplottene være støyende, men hvis filtreringen er satt for høye viktige mutanter kan elimineres.
   6. Beregn prosentdødeligheten forårsaket av EMS ved å dele antall mutageniserte spor / brønn med antall mock-behandlede spor / godt. Multipliser antall mock-behandlede spor med den første fortynningsfaktoren på 3 for å beregne antall mock-behandlede spor / godt. Bruk cellene Count Inclusion Tracks og Beregn prosentdødelighet til å utføre denne oppgaven.
   7. Beregn tid til halvt maksimumsuttrykk for både tidlige og avdøde reportere for hvert spor ved hjelp av Beregn-cellen. Disse verdiene vil bli brukt til å sammenligne mutageniserte og spotte populasjoner for å identifisere utviklingsmutanter.
   8. Innenfor Half-Max Plot cellen bruke bokeh plotting pakken for å visualisere tid til halv-max uttrykk for hver promotor, grafer euoprom tid til halv-maksimal uttrykk mot at av hctBprom. Identifiser inkluderinger fra den muterte befolkningen som faller utenfor den mock-behandlede scatter-skyen ved hjelp av bokeh interaktiv spor-ID-utforskeren. Legg merke til FOV- og XY-koordinatene for interesseinklutninger (figur 2).
      MERK: Velg kandidatinkluderinger som visuelt faller utenfor kontrollskyen, da verifisering og statistisk evaluering av hver klone vil bli utført senere.
   9. I den animerte plotcellen visualisere endringer i promotor uttrykk kinetikk dynamisk gjennom tiden ved å grafere uttrykket intensiteter av euoprom mot hctBprom ved hjelp av plotting verktøyet Plotly¹⁶. Scatter-funksjonen til Plotly brukes til å animere genuttrykket over tid (Video 1).
   10. Visualiser et øyeblikksbilde fra den plotte animerte grafen i inclusion Locator-cellen, plotting av euo-skoleballog hctBprom-uttrykk på et bestemt tidspunkt (det vil si 28 HPI) ved hjelp av bokeh-pakken (figur 3). Identifiser inkluderinger fra den muterte befolkningen som beskrevet i trinn 3.3.8.
       MERK: Denne analysen må utføres raskt (<4 h) etter hvert som inkluderingene fortsatt utvides og vil begynne å lyse vertsceller ~48 timer etter infeksjon.
4. Isolere utviklingsmutanter fra interessedeslutninger
   MERK: For å isolere Klamydia fra inneslutninger som var fast bestemt på å vise endret genregulering, ble det brukt en mikromanipulator med kapillære nåler. Brønn-ID-, FOV- og X-Y-koordinatene for inkluderinger av interesse ble bestemt ved hjelp av datavisualiseringen i pkt. 3.3.
   1. Forbered kapillære nåler ved å holde midten av kapillærrøret i en flamme og trekke begge ender av kapillærrøret til det er skilt. Lag en åpning i den trukket kapillærnålen ved å bryte den trukket spissen på et mikroskop lysbilde. For å bryte nålen, plasser den lukkede spissen på den frostede delen av mikroskopet i en vinkel og trykk.
      MERK: Spesifikasjonene for kapillærrør var 1,0 mm O.D., 0,5 mm ID.
   2. Kontroller at nåleåpningen er omtrent på størrelse med en inkludering under et mikroskop, 20x mål.
   3. Prepull ~ 25-30 kapillære nåler for isolering av kandidatinkludering (en nål per inkludering).
   4. Fyll mikroinjektoren med mineralolje, slik at det ikke er luftbobler til stede.
   5. Fest en glasskapillær nål til mikroinjektoren og utvis olje til spissen av nålen, og utflating av eventuelle luftbobler. Plasser kapillærnålen i komplette medier og trekk mediene opp halvveis. Fylling av kapillærnålen med media forhindrer oljeforurensning i brønnen.
   6. Ved hjelp av listen over lagrede posisjoner i μManager fra trinn 2.3.5, migrere til brønnen og FOV av en inkludering av interesse identifisert i Python visualiseringsnotatblokken.
   7. Bruk joysticken til mikromanipulatoren til å lokalisere kapillærnålen til XY-koordinatene for inkludering av interesse.
   8. Bruk 595 nm eksitasjonskanal til å visualisere EB for ekstraksjon og fase/DIC hvitt lys kanal for nål visualisering. Manøvrer kapillærnålen til inkluderingen, ruptur inkluderingen og trekk deretter EB-ene inn i kapillærnålen ved hjelp av mikroinjektoren.
   9. Fjern EB-ene fra kapillærnålen til en enkelt brønn av den tilberedte 24 brønnpolystyrenplaten tilberedt i trinn 2.1.2. Fjern kapillærnålen og bytt ut med en frisk kapillær nål for neste inklusjonsavsug. Gjenta pkt. 3.4 for alle kandidatinkluderinger.
      MERK: For utvidelse og for å sikre en høy nok titer for re-imaging, inkuber mutant isolater i en 5% CO_2,37 ° C inkubator til de fleste av vertscellene er infisert (~ 1 uke). Brønner bør overvåkes nøye som ulike isolater kan vise ulike vekstrater.
5. Harvest mutant isolater
   1. På is forstyrrer du det infiserte monolayeret ved å skrape med en 1 ml mikropipettespiss. Overfør media, celleavfall og sluppet Klamydia til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
   2. Pellet Klamydia ved sentrifugering i 30 min ved 4 °C, >14 000 x g. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 75 μL iskald 1x SPG. Aliquot i tre 1,5 ml skrue-cap mikrocentrifuge rør. Oppbevares ved -80 °C.

4. Verifisering av muterte isolatfenotyper

1. Vertscellekultur for avbildning av mutageniserte isolater
   1. Seed en 96 brønn glass bunnplate med 1,6 x 10⁴ Cos-7 celler (ATCC) per brønn i 100 μL av komplette medier. Inkuber ved 5 % CO_2,37 °C. Celler skal nå samløpet i ca. 24 timer. Etter at cellene er sammenføyd, erstatt media med komplette medier supplert med 1 μg/ml cykloheximid, inkuber over natten.
2. Infisere celler med kandidatisoler for fenotypisk verifisering
   1. Tin mutant kloner og wildtype Klamydia på is.
   2. I den tilberedte 96-brønnplaten utfører du en todobling av seriell fortynning av muterte isolater ved hjelp av én kolonne per isolat (11 kolonner). Start med en innledende fortynning på 1:20 i 100 μl HBSS.
      MERK: Seriell fortynning av Klamydia utføres for å sikre at muterte prøver blir avbildet ved en MOI < 1.
   3. Infisere den gjenværende (12. ) kolonnen med wildtype Klamydia på MOI ~ 0,5.
      MERK: Wildtype Chlamydia brukes som en kontroll for sammenligning mot mutageniserte isolater.
   4. Inkuber i 15 min gynge ved 37 °C.
   5. Vask infiserte vertsceller med forvarmede (37 °C) HBSS med 1 mg/ml heparin og HBSS som angitt i pkt. 2.2.
   6. Erstatt med 200 μL per brønn med forhåndswarmed (37 °C) bildemedier.
   7. Fyll interwell-plassene med forhåndsvarslede (37 °C) deionisert H₂O.
   8. Inkuber ved 5 % CO_2,37 °C i 10 timer.
3. Oppsett av mikroskop
   MERK: Se avsnitt 2.3 for mikroskopoppsett, denne delen inneholder bare de nødvendige oppsettsendringene.
   1. Velg 96-brønnplatemalen fra HCS-plugin-modulen.
   2. Empirisk bestemme brønner som tilsvarer en MOI < 1 for hver mutert isolat. Kløveruttrykk under kontroll av euo-arrangøren kan observeres ved ~10 HPI som gjør tidlig visualisering av inkluderinger mulig (figur 1B).
   3. Velg tre brønner per mutertisosolering som tilsvarer en MOI < 1 og generer en bildeposisjonsliste bestående av to FOV per brønn.
      MERK: Bare 72 bilder kan tas per tidsintervall på grunn av maskinvarebegrensninger, dette tilsvarer tre fortynninger (brønner) per belastning ved hjelp av to bildesteder per brønn hvis 12 prøver blir avbildet.
   4. Registrer utviklingssyklusen til hver mutertisolering i 36 timer ved 30 min tidsintervaller fra 12 HPI.
   5. Registrer de eksperimentelle detaljene i boksen Merknader om anskaffelse. i. e., Vel ABC1: wildtype kontroll. Vel ABC2: Mutant stamme 1, ABC3: Mutant stamme 2, etc ... Bildebehandling: 12-48 HPI.
   6. Start bildeoppkjøpet på 12 HPI.

5. Dataanalyse for isolat verifisering

1. Lag bildestabler i fokus og kvantifisere fluorescensuttrykk i individuelle inneslutninger
   1. Generer fluorescerende intensitetsspor for hver inkludering som angitt i pkt. 3.1 - 3.2.
2. Kontroller ctr mutagent isolerte
   MERK: For å bekrefte de endrede utviklingsprofilene til mutantisoler, sammenlignes uttrykksprofilene deres med wildtype-uttrykksprofilen ved hjelp av Python-notatblokk. Python-notatboken som brukes til verifisering av muterte kloner med endret utviklingsprogrammering er gitt i tilleggsdataene (clone_check-Markdown).
   1. Importer og filtrer sporingsdataene for inkludering i clone_check-Markdown Python-notatblokken som gjort i del 3.3.
   2. Beregn gjennomsnitts- og standardavviket (STD) fra sporene av hver isolerende og wildtype kontrollpopulasjon ved hjelp av cellen Beregn gjennomsnitt og STD.
   3. Med Graph Iso vs WT-celleplottet er gjennomsnittet og standardfeilen til gjennomsnittet (SEM) for hver mutert klone mot wildtype-kontrollen for å avgjøre om det muterte uttrykket kinetikk er divergerende fra wildtype-prøven (figur 4).
   4. Bestem om den isolerte muterte populasjonen er klonal ved å plotte mutantsporene og sammenligne dem med wildtype-inkluderingsspor ved hjelp av et spredningsplott som gjort i avsnitt 3.3 (trinn 3.3.7-3.3.10) (figur 2, figur 3). Hvis isolatet er en blandet befolkning, vil plottet vise en befolkning overlegg med wildtype og en annen distinkt befolkning utenfor wildtype scatter skyen. Hvis populasjonen ser blandet ut, kan mutanten isoleres på ny ved hjelp av den opprinnelige prosedyren som er beskrevet i pkt. 3.4.
      MERK: For å finne ut om utviklingsprofilen til et isolat er statistisk forskjellig fra wildtype, bør kurvene for hver isolat sammenlignes med wildtype ved hjelp av ANOVA.

Representative Results

Direkte EMS mutagenesis av vår promotor-reporter klamydial belastning resulterte i en ~ 75% reduksjon i infectivity. Ved hjelp av den beskrevne live-cell imaging protokollen, ~ 600 inneslutninger ble avbildet og sporet over en 24 t periode. Den fluorescerende uttrykkskinetikken til begge journalistene i hver inkludering ble visualisert ved hjelp av tilpassede Python-notatbokskript. To visualiseringstilnærminger ble implementert for å identifisere kandidatmutatisert Klamydia for isolasjon. Den første metodikken (trinn 3.3.8) visualiserer tiden til halvimimalt uttrykk for euo- og HCTB-arrangører fra individuelle klamydialisoler i et interaktivt spredningsplott (figur 2). Inneslutninger ble identifisert for isolasjon hvis de falt utenfor den mock-behandlede scatterskyen. Kandidatkloner ble plukket som visuelt falt utenfor kontrollskyen. Verifisering av hver klone ble utført senere. Klonene A3-6-67 og B3-8-58 ble valgt for isolasjon da de produserte kortere ganger til halvmaksimalt uttrykk fra euo-arrangøren og lengre tider for hctB (figur 2).

Den andre visualiseringsmetoden for å identifisere inkluderinger med endret kinetikk (trinn 3.3.9-10) identifiserer individuelle inkluderinger basert på visualisering av dynamisk genuttrykk fra de to promotorene (Video 1). Igjen ble kandidatkloner med dynamiske inkluderingsuttrykksmønstre som var merkbart forskjellig fra kontrollinkluderinger plukket. B3-6-62 ble valgt på grunn av økt fluorescerende akkumulering fra euo-arrangøren mellom 23 og 29 HPI (Video 1). Et øyeblikksbilde av den animerte grafen ble tatt for å identifisere plasseringen av inkluderinger av interesse (Figur 3).

Ved hjelp av de to visualiseringsmetodene ble totalt 24 inkluderinger identifisert for isolasjon. Av de 24 totale isolatene viste 10 differensialkinetikk ved retesting. Disse isolatene falt i tre fenotypiske kategorier; 8 isolater viste redusert euoprom uttrykk på ~ 24 HPI, tilsvarende tidspunktet for RB-EB konvertering, som demonstrert av klone A3-6-67 (Figur 4A). De resterende to klonene viste unike fenotypiske profiler, B3-8-58 isolaten viste også redusert euoprom uttrykk på ~ 24 HPI, men en generell økning i hctBprom uttrykk (Figur 4B), mens B3-6-62 uttrykte økte nivåer av fluorescens fra euo arrangøren etterfulgt av et plutselig tap av uttrykk i begge arrangørene (Figur 4C). Analyse av live-celle mikrografer for mutant B3-6-62 viste at vertscellelyse skjedde i celler infisert med denne mutanten mye tidligere enn i wildtype infiserte celler (Video 2).

Figur 1: Overvåking av celletypeutvikling med Ctr promotor-reportere.
(A)Skjematisk av promotor-reporter konstruere, p2TK2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover. (B)Live-celle mikrograf av euoprom-Clover og hctBprom-mKate2 uttrykk i Ctr på 10 HPI(C) Live-celle mikrograf av Ctr uttrykker euoprom-kløver og hctBprom-mKate2 på 36 HPI. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Identifikasjon av representant isolerer A3-6-67 og B3-8-58 ved visualisering av tiden til halvmaksimalt uttrykk for hver promotor.
Den interaktive grafen brukes til å identifisere mutagenized Chlamydia som viser uttrykksprofiler som er forskjellige fra den spottebehandlede kontrollspittskyen. Hvert sted i diagrammet representerer én inkludering. Inkludering flekker A3-6-67 og B3-8-58 er uthevet som de faller utenfor mock-behandlet skyen, begge viser kortere tid til halv maksimal uttrykk for euo arrangør i kombinasjon med lengre tid til halv maksimal uttrykk for hctB. euoprom: x-akse, hctBprom: y-akse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Interaktivt øyeblikksbilde for identifisering av inkluderingssted.
Grafen som presenteres er et øyeblikksbilde på 28 HPI fra den animerte scatter-plottet (Video 1) og ble brukt til å identifisere FOV og XY koordinere plasseringen av inkluderinger av interesse. B3-6-62 vises som det ble valgt for isolasjon fra den animerte scatter plot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Verifisering av representative mutant isolater.
Utviklingsprofiler av mutagenisert isolerer A3-6, B3-8 og B3-6. (A)A3-6 mutant viser en reduksjon euoprom uttrykk på ~ 24 HPI. (B)B3-8 mutant isolat viser en nedgang euoprom uttrykk på ~ 24 HPI, men en generell økning i hctBprom uttrykk. (C) B3-6 isolat viser økte nivåer av euoprom uttrykk etterfulgt av et plutselig tap av uttrykk i begge arrangører på ~ 40 HPI. Hvert utvalg er gjennomsnittet av den angitte populasjonen, n > 25. Cloud representerer SEM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Arbeidsflyt for rettet frem genetisk analyse av promotor-reporter Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2 /euoprom-Clover EBs ble direkte mutagenisert med EMS i akseniske medier, CIP-1. Mutageniserte EBer ble brukt til å infisere Cos-7 celle monolayers for bildebehandling og fluorescerende uttrykksanalyse. Klamydia som uttrykker endret utviklingsdynamikk ble identifisert ved visualisering i interaktive grafer. Inneslutninger med endrede utviklingsprofiler ble isolert ved hjelp av en mikromanipulator. Fenotypene av isolatene ble verifisert ved gjeninfeksjon. Muterte isolater blir utsatt for WGS for å identifisere DNA-lesjoner forbundet med fenotyper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Identifikasjon av mutagenisert Klamydia som viser divergerende uttrykkskinetikk ved hjelp av et dynamisk genuttrykksplott. Promoter uttrykk for euo og hctB for individuelle inneslutninger ble plottet og visualisert gjennom tiden for å identifisere mutagenisert Klamydia med endret uttrykksdynamikk. B3-6-62 ble valgt for isolasjon som det viser høyere euoprom uttrykk i forhold til wildtype skyen. euoprom: x-akse, hctBprom: y-akse. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Representativ mutant B3-6-62 forårsaker for tidlig vertscellelys. Time-lapse live-cell mikrograf av B3-6-62 infiserte vertsceller gjennomgår for tidlig lysis (~ 40 HPI). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfiler. Vennligst klikk her for å laste ned disse filene.

Discussion

Dissekere mekanismene som styrer klamydia utviklingssyklusen har blitt hindret av begrensningene i de tilgjengelige genetiske verktøy. Ved hjelp av vår promotor-reporter Chlamydia sammen med live-cell automatisert mikroskopi, ble det bygget et system som muliggjør overvåking av celletypeutvikling i individuelle inneslutninger over en 24-timersperiode. Dette systemet, i kombinasjon med kjemisk mutagenese og direkte inkludering isolasjon har etablert en metode for raskt og klontalt velge Klamydia uttrykker endrede utviklingsprofiler (Figur 5).

Klamydial-EBer er metabolsk aktive utenfor verten når de leveres med intracellulære ioniske tilstander og en energikilde^5,12. Denne EB akseniske metabolismen ble utnyttet til å mutande rense renset EBer utenfor vertsceller. I denne protokollen ble metaboliserende EBer direkte mutagenisert med EMS. Det ble observert at EMS-behandling effektivt reduserte EB levedyktighet og genererte EB som produserte variabel utviklingskinetikk som forventet.

Det er anslått at den beskrevne EMS mutagenesis protokollen genererer ~ 5-20 DNA-endringer / EB. Den levende mikroskopi arbeidsflyten beskrevet er i stand til å bilde ~ 8 inneslutninger per synsfelt (FOV) og 72 FOVs hver i et 30 min intervall. Derfor er det anslått at effekten av ~ 3000-10.000 mutasjoner kan visualiseres per kjøring. Flere runs (3-5) vil resultere i visualisering av effekten av 9000-50.000 mutasjoner. Ctr-L2-genomet koder ~850 gener, noe som tyder på at denne protokollen vil resultere i visualisering av > 10 mutasjoner per gen. Disse estimatene indikerer at genomdekningen, selv om den ikke er fullført, bør være tilstrekkelig.

Styrken i denne protokollen er evnen til å spore og registrere uttrykket kinetikk av flere promotor-reportere på enkelt inkludering oppløsning i nær sanntid. Forward genetikk er avhengig av observerbare fenotyper og klonnal isolasjon. Tidligere metoder for fremover genetikk i Klamydia stolte på statiske observasjoner og plaquing med agar overlegg⁸. Med vår metodikk registreres dynamisk promoteraktivitet gjennom hele utviklingssyklusen og visualiseres deretter for å identifisere inkluderinger som inneholder Klamydia med endret genuttrykkskinetikk. Identifisering av kandidatinkludering ved hjelp av flere parametere (det vil si tid til halvmaksimalt uttrykk og total fluorescerende intensitet på et gitt tidspunkt) resulterer i distinkte muterte bassenger som viser ulike utviklingskinetikk. Disse klamydia er sannsynlig å ha unike mutasjoner som påvirker reguleringen av separate genetiske veier. Det faktum at disse profilene kan registreres live og visualiseres etter noen timer gir tid til å finne og isolere inkluderinger av interesse fra den infiserte monolayer. Selv om vi fokuserte på genuttrykksdynamikken under utviklingen, kan alternative genreportere brukes til å sondere andre regulatoriske veier.

Avhengig av de genetiske banene som blir avhørt, bør forsiktighet tas med tilsetning av cykloheximid for å være vert for celler. Selv om inkubasjon med cykloheximid forbedrer bildekarakteristika til monolayeren ved å blokkere replikering av vertscellene; denne effekten oppnås ved å hemme vertsproteinsyntese. Hemming av de novo host proteinsyntese kan påvirke resultatene av den genetiske skjermen avhengig av spørsmålet som stilles.

Fototoksisitet og fotobleaching er store hindringer i langsiktig time-lapse mikroskopi. For å overvinne disse problemene bør de spesifikke egenskapene til hvert fluorescerende protein vurderes før eksperimentering. Kløver og mKate2 har korte modningstider (20-30 m) er fotoabel, og viser relativt store kvanteutbytter^17,,18. Disse kvalitetene tillater reduksjon av eksitasjonsintensitet og eksponeringstid, og reduserer dermed mengden fototoksisitet og fotobleaching som påløper. Fase/DIC white light channel ble brukt for autofokusering som dette spekteret av lys var mindre fototoksisk til Klamydia.

For denne protokollen ble EMS brukt som en kjemisk mutagen. EMS fører G:C til A:T overganger via guaninalkylasjon¹⁹. Denne protokollen kan imidlertid utvides til å omfatte alternative mutagener som kan indusere andre typer genomiske mutasjoner. For eksempel er akridiner en klasse av DNA-intercalating forbindelser som induserer indels, noe som øker sjansen for rammeskift og derfor null mutasjoner²⁰.

Med fremskritt i klamydial transformasjon teknikker, muterte gener som er forbundet med fenotypisk komplementasjon grupper kan slås ut via innsettende genavbrudd og genetisk komplementering for verifisering av genotype-fenotype^{kobling 9}. Utvinne mutanter som blokkerer RB til EB utvikling kan være problematisk som mutasjoner av interesse kan produsere Klamydia som ikke kan reinfisere vertsceller. Denne teknikken kan endres for å identifisere utviklingsgener etter statistiske assosiasjoner (GWAS). Genomene til Klamydia fra isolerte inneslutninger kan sekvenseres direkte uten utvidelse og verifisering. Den høye gjennomstrømningen av denne teknikken ville gjøre statistiske assosiasjoner mulig. Igjen kan verifisering av disse foreningene testes gjennom genforstyrrelser og komplementering⁹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well polystyrene plates	Corning	3524	Cell culture growth for reinfection of isolates
6-well glass bottom plates	Cellvis	P06-1.5H-N	Cell culture growth for imaging
96-well glass bottom plates	Nunc	165305	Cell culture growth for imaging
Bold line CO2 Unit	OKO Labs	CO2 UNIT BL	Stage incubator CO2 control
Bold line T Unit	OKO Labs	H301-T-UNIT-BL-PLUS	Stage incubator temperature control
Borosilicate glass capillary tubes	Sutter Instrument	B1005010	Capillary tubes
BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm)	Semrock	FF01-514/30-25	Fluoescent filter cube
BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm)	Semrock	FF02-641/75-25	Fluoescent filter cube
CellTram Vario	Eppendorf	5196000030	Microinjector
Chlamydia trachmatis serovar L2	ATCC	VR-577	Chlamydia trachomatis
CIP-1 media	In house	NA	Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house.
Cos-7 cells (ATCC)	ATCC	CRL-1651	African green monkey kidney cell (host cells)
Cycloheximide	MP Biomedicals	194527	Host cell growth inhibitor
Ethyl methanesulfonate, 99%	Acros Organics	AC205260100	Mutagen
Fetal Plex	Gemini Bio-Products	100-602	Supplement for base growth media
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/Fiji	NA	Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji
Galaxy 170 S CO2 incubator	Eppendorf	CO1700100X	Cell culture incubation
gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2)	Integrated DNA Technologies	NA	gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2
Gentamycin 10mg/ml	Gibco	15710-064	Antibiotic for growth media
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)	Corning	21-020-CM	Host cells rinse
Heparin sodium	Amersham Life Science	16920	inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs
HEPES 1M	GE Life Sciences	SH30237.01	pH buffer for growth media
InjectMan	Eppendorf	5179 000.018	Micromanipulator
Jupyter Notebook	https://jupyter.org/	NA	Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/
Lambda 10-3	Sutter Instrument	LB10-3	Filter wheel controler
Oko Touch	OKO Labs	Oko Touch	Interface to control the Bold line T and CO2 Unit
Prior XY stage	Prior	H107	Motorized XY microscope stage
PrismR Centrifuge	Labnet	C2500-R	Temperature controlled microcentrifuge
Problot Hybridization oven	Labnet	H1200A	Rocking Incubator for infection with Chlamydia
Proscan II	Prior	H30V4	XYZ microscope stage controler
Purifier Class 2 Biosafety Cabinet	Labconco	362804	Cell culture work
RPMI-1640 (no phenol red)	Gibco	11835-030	Base growth media for imaging
RPMI-1640 (phenol red)	GE Life Sciences	SH30027.01	Base growth media
scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm)	scopeLED	F140	Excitation light
Sonic Dismembrator Model 500	Fisher Scientific	15-338-550	Sonicator, resuspending chlamydial pellet
Stage incubator	OKO Labs	H301-K-FRAME	Cluster well plate incubation chamber
sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG)	In house	NA	Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4)
T-75 Flasks	Thermo Scientific	156499	Cell culture growth
TE 300 inverted microscope	Nikon	16724	microscope
THOR LED	Thor Labs	LEDD1B	White light
Trypsin	Corning	25-052-CI	Dislodges host cells from flask for seeding into plates
Zyla sCMOS	Andor	ZYLA-5.5-USB3	imaging camera
µManager 2.0gamma	https://github.com/micro-manager/micro-manager	NA	Open sourse automated microscope control software package