Detta protokoll beskriver tillvägagångssätt för detektion och kvantisering av stora ballast- och/eller organellextruder (~4 μm) som produceras av C. elegansceller i form av membranbundna exophers. Vi beskriver stammar, tillväxt villkor, poängkriterier, timing och microscopy överväganden som behövs för att underlätta dissekering av denna skräp utvisning mekanism.
Toxicitet av felvikta proteiner och mitokondriell dysfunktion är avgörande faktorer som främjar åldersrelaterade funktionella neuronal nedgång och neurodegenerativa sjukdomar över arter. Även om dessa neurotoxiska utmaningar har länge ansetts vara cell-inneboende, betydande bevis stöder nu att felvikta mänskliga sjukdomar proteiner med ursprung i en neuron kan visas i angränsande celler, ett fenomen som föreslås för att främja patologi spridning i mänskliga neurodegenerativa sjukdom.
C. elegans vuxna nervceller som uttrycker aggregerande proteiner kan extrudera stora (~ 4 μm) membran-omgiven vesiklar som kan omfatta det aggregerade proteinet, mitokondrier, och lysosomer. Dessa stora vesicles kallas “exophers” och skiljer sig från exosomer (som är ca 100x mindre och har olika biogenes). Kasta ut cellulära skräp i exophers kan uppstå genom en bevarad mekanism som utgör en grundläggande, men tidigare okända, gren av neuronala proteostas och mitokondriell kvalitetskontroll, relevant för processer genom vilka aggregat sprids i mänskliga neurodegenerativa sjukdomar.
Medan exophers har studerats mest hos djur som uttrycker hög kopia transgena mCherry inom beröring nervceller, dessa protokoll är lika användbara i studien av exophergenesis med hjälp av fluorescerande taggade organeller eller andra proteiner av intresse i olika klasser av nervceller.
Beskrivs här är de fysiska egenskaperna hos C. elegans exophers, strategier för deras upptäckt, kriterier identifiering, optimal tidpunkt för kvantisering, och djur tillväxt protokoll som styr för påfrestningar som kan modulera exopher produktionsnivåer. Tillsammans bör uppgifter om protokoll som beskrivs här tjäna till att fastställa en standard för kvantitativ analys av exophers över laboratorier. Detta dokument syftar till att fungera som en resurs på området för laboratorier som försöker utarbeta molekylära mekanismer genom vilka exophers produceras och genom vilka exophers reageras på av angränsande och avlägsna celler.
Den neurotoxiska utmaningar aggregat och dysfunktionella mitokondrierna har länge ansetts vara cell-inneboende, men på senare tid har det blivit tydligt att felvikta mänskliga sjukdomar proteiner med ursprung i en neuron kan också sprida sig till angränsande celler, främja patologi1. Likaså kan däggdjursmitokondrierna skickas ut ur cellen av sin ursprungliga produktion för transcellulär nedbrytning2 eller för räddning av mitokondriella populationer i utmanade angränsande celler3. Vesiklar av olika storlekar har i allmänhet observerats för att överföra cellulära material till angränsande celler eller till flytande omgivning4. Vissa extruderade vesiklar närma sig storleken på den genomsnittliga neuronala soma (genomsnittlig touch neuron soma ~ 6 μm) och kan rymma stora aggregat och organeller.
Ett slående exempel på stora vesicle extrusion som kan bära protein aggregat och organeller förekommer i C. elegans touch receptor nervceller som uttrycker en hög kopia nummer reporter konstruera kodning en skadlig aggregering-benägen, nedbrytningsresistenta mCherry5. Utsprång från beröringsnerverna, så kallade exophers, är ~4 μm genomsnittlig diameter, selektivt inkluderar mCherry eller andra aggregat, och levereras direkt in i den angränsande hypodermis, som normalt omger touch receptor nervceller. Hypodermisförsöken lysosomebaserad nedbrytning, men vissa icke-lättsmälta innehåll såsom mCherry aggregat kan åter extruderas av hypodermis i vätskefyllda pseudocoelom av djuret, från vilken mCherry kan tas upp av avlägsna asätare celler kallas coelomocyter för lång tid lagring (Figur 1, Figur 2)5.
De stora extruderade exopher vesiklarna lämnar cellen omgiven av touch receptor plasmamembran och kan innehålla aggregerade mänskliga sjukdomar proteiner, mitokondrier, och lysosomer. Processen för exopher produktion verkar innebära sortering av potentiellt giftiga arter (till exempel en aggregering-benägen uttryckt mCherry är segregerad från lösliga, oförargliga proteiner som GFP som fortfarande mest i neuronala soma). På detta sätt, riktad utvisning av de hotfulla entiteter åstadkoms av neuron5. En proteostas utmaning, såsom stress framkallas genom autofagi knockdown, MG132-medierad proteasom hämning, eller transgena uttryck för mänskliga sjukdomar proteiner såsom Huntingtons sjukdom-associerade expanderat polyglutamine Q128 eller Alzheimers sjukdom-inblandade fragment Aβ1-42, kan öka antalet nervceller som producerar exophers5.
Som exophers har först nyligen dokumenterats, vad som är känt om deras biologi meriter beskrivning. Exophers upptäcktes i, och är de mest väl studerade i, C. elegans touch receptor nervceller. Det finns sex C. elegans mechanosensory touch nervceller som har cellkroppar fördelade runt kroppen ( Figur3A) och kallas mikrotubuliceller eftersom deras ultrastruktur funktioner särskiljande 15 protofilament mikrotubuli. Den beröring receptorn nervceller är den främre AVM (främre ventrala microtubule neuron), ALMR, och ALML (främre laterala microtubule nervceller höger och vänster), den mer centrala PVM (posterior ventrala microtubule neuron), och den bakre PLMR och PLML (posterior laterala microtubule nervceller höger och vänster) i svansen. Intressant, de sex touch receptor nervceller producerar exophers i olika takt, trots att uttrycka samma offensiva transgena (Figur 3C). Av de sex mechanosensory touch receptor nervceller, genomgår ALMR neuron exophergenesis oftare än de andra touch nervceller. Quantitation av exopher nummer från beröring nervceller är alltså vanligtvis fastställts genom att fokusera på ALMR.
Exophergenesis är en dynamisk process som typiskt börjar med svullnad av neuronal cytoplasman (Figur 1A-B). Cellulära innehåll, organeller, eller protein aggregat samlas in på ena sidan av neuronala soma, oftast mot den bakre änden av ALMR neuron (bort från den utplanande neurit), bildar en pre-exopher domän (PED) (Figur 1B). Den tidiga utskjutningen observeras när PED börjar projicera utåt och bildar en igenkännlig utstickad knopp. Den sena knoppen definieras när den bredaste diametern på domänen före exopher är ungefär 1/3 större än diametern på förträngningen av soma-exopher-halsen (Figur 1C). Exophers kan kastas ut i nästan vilken riktning som helst från soma, men de flesta exophers avsluta posteriorly från cellen kroppen och förbli i ungefär samma fokalplan som den ursprungliga soma.
Exopheren kan flytta bort från den påbörjande soma som halsen av knoppen smalnar in i en tunn glödtråd. Exophers kan förbli fäst vid soma via denna glödtråd (Figur 1D, pil) och kan senare bli fristående. Cellulära innehåll som kalcium, aggregat, och mitokondrierna kan överföras via denna glödtråd i den bifogade exopher5, även om huvuddelen av extruderade material sätts in i exopher facket av den massiva spirande händelsen. Exophers anses mogna när det inte finns något synligt anslutningsrör eller tunt glödtråd och exopher är helt skild från den sändande soma (bild 1E).
Exophers produceras av C. elegans touch nervceller omedelbart stöter på hypodermis, den vävnad som omger touch neuron. Vanligast verkar exopher vesikeln att resa inom hypodermis posteriort mot svansen, och kan vara ganska långt från soma innan exopher innehåll visas riktade för nedbrytning (till exempel, avståndet kan vara ~ 100 μm bort från soma (Figur 1F)). Den fluorescerande exopher vesikel bryts upp i många mindre vesiklar inom hypodermis, ta på ett utseende som kallas “stjärnklar natt” (Figur 1G och figur 2). I “starry night” scenen, punktat fluorescerande material kan observeras utspridda över hypodermal syncytium i många mindre punkter av fluorescens jämfört med den ursprungliga ensamma exopher. Stjärnklar natt kan se punktat under låg förstoring och med högre förstoring, kan se punktat och / eller nätverk inom hypodermis. Den stjärnklara nattens lysrörssignal är typiskt dimmer än exophern och den neuronalt uttryckta fluorescensen (Figur 2B-C). Spridningen av mCherry i många punktat vesiklar är tänkt att involvera phagosome mognad och fusion med endosomal/lysosomal nätverket av hypodermal cellen. Vissa exopher material är sannolikt försämras i det hypodermala lysosomalt nätverk, men kvarvarande arter som är resistenta mot nedbrytning (såsom mCherry aggregat) kastas ut ur hypodermis i pseudocoelom, en vätska fack som kan innehålla cellulära skräp. Det fluorescerande materialet tas senare in av avlägsna asätare celler som kallas coelomocyter (Figur 2C), som kan koncentrera sig, lagra, och återigen försök nedbrytning av mCherry.
Fenomenet med ballast extrudering och överföring verkar bevaras över phyla, har rapporterats i genetiska modeller som C. elegans5,6,7 och D. melanogaster8,9 samt i flera däggdjur modeller. Exopher-liknande extruderingar har rapporterats för däggdjursceller10, en observation som tyder på att bevarade mekanismer kan stödja aggregerade och organelle utvisning. Exopher produktion kan alltså vara en bevarad mekanism för cellulära skräp förvaltning som utgör en grundläggande, men tidigare okända, gren av neuronala proteostas och mitokondriell kvalitetskontroll, som, när obalans, kan aktivt bidra till neurodegenerativ sjukdom. Identifiering av de molekyler som är inblandade i skräp diskriminering och sortering, transport till en distinkt subcellulär lokal, extrudering, bildning / sax av den rörformiga anslutningen som förbinder soma och sen exopher, och erkännande av de stora extruderade vesikel för avlägsna nedbrytning av en angränsande cell kvar för framtida arbete. Studier i nematod och flyga modeller kommer att vara avgörande för att definiera mekanismer för aggregat och organell insamling och överföring, utnyttja opartiska genetiska metoder och kraftfulla cellbiologiska verktyg som erbjuds av dessa modeller för att identifiera deltagande molekyler i fysiologiska sammanhang.
Kritiska första stegen i dechiffrera mekanismer avgörande i exopher biologi innebär att definiera protokoll för reproducerbara in vivo exopher kvantifiering. C. elegans modellen erbjuder en särskild fördel för sådana insatser eftersom kroppen är transparent och exophers kan lätt observeras när de innehåller fluorescerande taggade proteiner eller organeller. Exophers har rapporterats genereras av C. elegans dopaminerga nervceller PDE och CEP, ASE och ASER sensoriska nervceller, och färgämne-fyllning amphid nervceller5. Eftersom exophers produceras av touch-receptorn nervceller är bäst kännetecknas, fokus här är på användning av beröring nervceller för exopher analys. Men den grundläggande metoden kan tillämpas för att mäta exopher produktion från någon cell. Protokoll för att upptäcka och kvantifiera exophers produceras av C. elegans touch receptor nervceller som transgeniskt uttrycka mCherry protein beskrivs, med betoning på laster som kan övervakas och tidsmässiga begränsningar i scoring. Denna artikel definierar tillvägagångssätt mot in vivo exopher identifiering, och kvantifiering av miljömässiga och genetiska förhållanden som modulerar exopher produktion. Protokoll betona kritisk uppmärksamhet på konstant icke-stress villkor för bestämning av baslinjen exopher produktion och för jämförelser över genotyper.
Karakteriseringen av in vivo molekylära mekanismerna för aggregat och organell eliminering i form av stora exophers är i sin linda. Frågor om utnämningen av laster för utvisning, den polariserade insamling av dessa laster inom cellen, regleringen av beslutet att generera exophers, maskiner som förmedlar extruder, och samspelet mellan exophers med de nedbrytande maskiner i en angränsande cell alla återstår att behandlas. Dessutom är in vivo visualisering av rörformiga anslutningar som kan passera biologiska material som inkluderar kalcium, aggregat och mitokondrierna intressant och understudied biologi i sin egen rätt. Frågor om varför vissa celler är mer benägna att exopher produktion än andra också är olösta, men kan börja genetiskt dissekeras med de metoder som beskrivs i detta protokoll.
Beskrivs i detalj i detta protokoll är de metoder för att uppnå reproducerbara scoring av exopher produktion, med uppmärksamhet på att skilja exophers från närliggande cell somas, tidpunkten för analyser för att fånga toppen av exopher produktion, och strikt kontroll av tillväxtvillkor för att eliminera oavsiktliga påfrestningar som kan modulera exopher nivåer. Båda åtskillnad av den stora tidiga exopher, eller “starry night” spridning i den omgivande hypodermis kan kvantifieras som bevis på exopher produktion. Med detta sagt, nervceller uttrycker mCherry under basala förhållanden är oftast associerade med 5-25% av nervceller av en specifik typ producerar en exopher. Kontrollerad introduktion av stress villkor skulle kunna tillämpas för att öka exopher produktionen till upptäckt så hög som 90% av nervceller som producerar extruderingar, särskilt användbar för genetiska eller farmakologiska skärmar för modifierare.
I mänskliga neurodegenerativa sjukdom, kan stora aggregat överföra från sjuka nervceller till angränsande celler för att främja patologi spridning. Exopher mekanismen kan spira via en bevarad mekanism som används för aggregerad extrudering över phyla. Definiera in vivo molekyler som antingen öka effektiviteten i denna process (anses effektivare proteostas kontroll) eller blockera det kan utnyttjas för att påverka utformningen av nya strategier för att bekämpa flera neurodegenerativa sjukdomar. Som sådan, det protokoll som beskrivs här kan användas för klassisk genetiska mutagenes skärmar, genomet hela RNAi skärmar som systematiskt slå ner gener för att identifiera förstärkare och suppressors, eller för läkemedelsintervention studier som identifierar kandidat farmakologiska modifierare av denna process. Tillvägagångssättet är enkelt, men något mödosamt. Exophers är så stora att de kan ses med en hög förstoring dissekera mikroskop. Fortfarande, C. elegans nervceller är relativt små och titta på deras organeller eller deras membran kräver högre effekt confocal bilder och är en långsam process. Alternativ för högre dataflöde kan innebära hög innehållsavbildning metoder i flera brunnsplåt format.
Tillämpningen av en standardiserad strategi för exopher scoring bör understiga en samordnad genetisk dissekering av processen genom vilken nervceller kan organisera och eliminera cellulära skräp.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner följande NIH-bidrag: R01AG047101 och R37AG56510. Medlemmar av Driscoll och Grant labs har bidragit mycket till utveckling och finjustering av protokoll som beskrivs, med rigorösa experiment och stark kommunikation.
95B Scientific CMOS camera | Photometrics Prime | ||
1,000 μL low retention tips | Sarstedt | ||
10 mL serological pipette | Appleton Woods | CC214 | |
10 μL low retention tips | Sarstedt | 70.1130.105 | |
13% sodium hypochlorite | Acros Organics | AC219255000 | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
2 L erlenmeyer flasks | Scientific Laboratory Supplies | FLA4036 | |
25 mL serological pipette | Appleton Woods | CC216 | |
300 μL low retention tips | Sarstedt | 70.765.105 | |
50 mL serological pipette | Appleton Woods | CC117 | |
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98% | Alfa Aesar | L16497.ME | |
9 cm sterile Petri dishes | Fisher Scientific | 11309283 | |
absolute ethanol | Vwr | 20821.33 | |
Agar | Sigma Aldrich | A1296 | |
C. elegans strain wild type | Supplied by CGC | N2 | C. elegans strain |
calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C3881 | |
cholesterol | Acros | 110190250 | |
dibasic sodium phosphate | Sigma Aldrich | S3264 | |
E. coli strain OP50 | Supplied by CGC | Op50 | E coli strain |
FBS10 Standard microscope | Meyer Instruments | KSC 410-1-100-1 | FBS10 Standard with Plate Base, 100/100 Trinocular Head and Flip zoom |
glass pipette 270 mm | Fisherbrand | FB50255 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermofisher scientific | 75004515 | |
Inoculating Spreaders | Fisher Scientific | 11821741 | |
LB medium capsules | MP biomedicals | 3002-031 | |
LDI – Laser Diode Illuminator | 89 North | ||
levamisole | Sigma Aldrich | 16595-80-5 | |
M4 multipette | Eppendorf | 4982000012 | |
magnesium sulphate | Sigma Aldrich | M7506 | |
monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P0662 | |
Multitron Standard shaking incubator | Infors HT | INFO28573 | |
Nalgene 1 L Centrifuge pots | Fisher Scientific | 3120-1000 | |
P10 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000020 | |
P1000 pipette | Eppendorf Research Plus | ||
P200 pipette | Eppendorf Research Plus | 3123000055 | |
pipeteboy 2 | VWR | 612-0927 | |
Polystyrene microbeads | Sigma Aldrich | MFCD00131491 | |
RC5C plus floor mounted centrifuge | Sorvall | 9900884 | |
Reusable ringed cytology slides | ThermoFisher Scientific | 22037242 | |
SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP] | contract Driscoll lab | GFP expressed in touch neurons | |
sodium chloride | Sigma Aldrich | 13422 | |
Sodium hydroxide | Fisher Chemical | S/4880/53 | |
Tactrol 2 Autoclave | Priorclave | ||
Triton-X | Thermofisher scientific | 28313 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
X-Light V2 Spinning Disk Confocal Unit | CrestOptics | ||
ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry] | contract Driscoll lab | mCherry expressed in touch neurons | |
ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4]; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128::cfp lin-15+] | contract Driscoll lab | Q128 expressed in touch neurons | |
ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry]; bzIs168[Pmec-7LMP-1::GFP] | contract Driscoll lab | mitoROGFP expressed in touch neurons | |
ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry]; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS::ROGFP] | contract Driscoll lab | autophagy marker expressed in touch neurons | |
ZEISS Axio Vert.A1 | Zeiss |