Anvendelse af Laser Microdissection at afdække regionale Transcriptomics i Human Nyre Tissue

Summary

Vi beskriver en protokol for laser mikrodissementering af undersegmenter af den menneskelige nyre, herunder glomerulus, proksimal tubule, tykt stigende lem, opsamlingskanal og interstitium. RNA'et isoleres derefter fra de opnåede rum, og der udføres RNA-sekventering for at bestemme ændringer i transskriptionssignaturen inden for hvert undersegment.

Abstract

Genekspressionsanalyse af humant nyrevæv er et vigtigt redskab til at forstå homøostase og sygdomspatofysiologi. Det er nødvendigt at øge opløsningen og dybden af denne teknologi og udvide den til niveauet af celler i vævet. Selv om brugen af enkelt nuklear og enkelt celle RNA sekventering er blevet udbredt, udtrykket underskrifter af celler opnået fra væv dissociation ikke opretholde rumlige sammenhæng. Lasermikrobiagesektion (LMD) baseret på specifikke fluorescerende markører ville gøre det muligt at isolere specifikke strukturer og cellegrupper af interesse med kendt lokalisering, hvilket ville gøre det muligt at erhverve rumligt forankrede transskriptionssignaturer i nyrevæv. Vi har optimeret en LMD-metode, styret af en hurtig fluorescensbaseret plet, til at isolere fem forskellige rum i den menneskelige nyre og udføre efterfølgende RNA-sekventering fra værdifulde humane nyrevævsprøver. Vi præsenterer også kvalitetskontrolparametre, der gør det muligt at vurdere tilstrækkeligheden af de indsamlede prøver. Den arbejdsgang, der er skitseret i dette manuskript, viser gennemførligheden af denne tilgang til at isolere subsegmentale transskriptionssignaturer med høj tillid. Den metodologiske fremgangsmåde, der præsenteres her, kan også anvendes på andre vævstyper med substitution af relevante antistofmarkører.

Introduction

Teknologiske fremskridt i studiet af vævsprøver har forbedret forståelsen af sundhedstilstanden og sygdommen i forskellige organer. Sådanne fremskridt har understreget, at patologi kan starte i begrænsede regioner eller i specifikke celletyper, men har vigtige konsekvenser for hele organet. Derfor er det i den nuværende æra af personlig medicin vigtigt at forstå biologien på både celle- og regionalt niveau og ikke kun globalt¹. Dette gælder især i nyrerne, som består af forskellige specialiserede celler og strukturer, der differentieret indleder og / eller reagerer på patologisk stress. Patogenese af forskellige typer af menneskelig nyresygdom er stadig ikke godt forstået. Generering af en metode til undersøgelse af ændringer i genekspression i specifikke rørformede segmenter, strukturer eller områder af interstitium i den menneskelige nyre vil forbedre evnen til at afdække regionen specifikke ændringer, der kan informere om sygdomspatogenese.

Human nyre biopsi prøver er en begrænset og kostbar ressource. Derfor bør teknologier, der afhører transcriptomics i nyrevæv, optimeres til at spare væv. De tilgængelige metoder til at studere transcriptomics på celle- og regionalt plan omfatter enkeltcellet RNA-sekventering (scRNaseq), enkelt nuklear RNaseq (snRNaseq), in situ rumlig hybridisering og lasermikrodissement (LMD). Sidstnævnte er velegnet til præcis isolering af regioner eller strukturer af interesse inden for vævssektioner , til downstream-RNA-sekventering og analyse^2,3,4,5. LMD kan anvendes til at basere sig på identifikation af specifikke celletyper eller strukturer baseret på validerede markører ved hjælp af fluorescensbaseret billeddannelse under dissektion.

De unikke træk ved lasermikrodissection assisteret regional transskription omfatter: 1) bevarelse af den rumlige kontekst af celler og strukturer, som supplerer enkeltcelleteknologier, hvor celler identificeres ved udtryk snarere end histologisk; 2) teknologien informerer og informeres af andre billeddannelsesteknologier, fordi en antistofmarkør definerer udtrykssignaturer 3) evnen til at identificere strukturer, selv når markører ændrer sig i sygdom; 4) påvisning af lavt udtrykte udskrifter i ca. 20.000 gener; og 5) bemærkelsesværdig vævsøkonomi. Teknologien er skalerbar for en nyrebiopsi med mindre end 100 μm tykkelse af en kerne, der er nødvendig for tilstrækkelig RNA-erhvervelse og muliggør brug af arkiveret frosset væv, som er almindeligt tilgængelige i store depoter eller akademiske centre⁶.

I det efterfølgende arbejde beskriver vi den regionale og bulk transcriptomics teknologi i detaljer, optimeret med en ny hurtig fluorescens farvning protokol til brug med humant nyrevæv. Denne tilgang forbedrer klassiske LMD-udforskninger, fordi den giver separate udtryksdata for interstitium- og nephron-undersegmenterne i modsætning til det samlede tubulointerstitial-udtryk. Herunder hører de kvalitetssikrings- og kontrolforanstaltninger, der er gennemført for at sikre stringens og reproducerbarhed. Protokollen muliggør visualisering af celler og interesseregioner, hvilket resulterer i tilfredsstillende erhvervelse af RNA fra disse isolerede områder for at muliggøre downstream RNA-sekventering.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt til brug af Institutional Review Board (IRB) på Indiana University.

BEMÆRK: Brug denne protokol med nyrenephrectomy væv (op til 2 cm i både X- og Y-dimensionerne), der er bevaret i den optimale skæretemperaturforbindelse (OLT) og opbevaret ved -80 °C. Udfør alt arbejde på en måde, der begrænser RNA-forurening, brug rene engangshandsker og en ansigtsmaske. Sørg for renligheden af alle overflader. Det udstyr, som denne protokol blev optimeret til, er et lasermikrodisseringssystem med pulserende UV-laser.

1. Cryosectioning

1. 1,2 μm LMD PPS-membranen (poly(p-phenylensulfid) lyser for UV-lys (i en vævskultur laminar flow hætte) i 30 minutter, umiddelbart før cryosectioning. Opbevar rutsjebanerne ved stuetemperatur for optimal vævsvedhæftning.
2. Kryostaten afkøles til -20 °C. Rengør arbejdsfladerne, og installer et nyt skæreblad.
3. Placer en lille slide box (rengøres med RNase overflade dekontaminering løsning) inde i cryostat kammer til at gemme dias med friskskåret væv.
4. Vedhæft prøven i OLT til en vævsholder, og lad den ekvilibrere i et par minutter for at nå kammertemperaturen og styrke vedhæftning mellem OLT-blokken og holderen. Hjælpe processen ved hjælp af en varmeudsugning.
5. Prøven skæres til en tykkelse på 12 μm, og den anbringes på det specialiserede LMD-dias ved hjælp af diasadapteren. Hvert dias indeholder en nephrectomy sektion pr dias eller op til to nyre biopsi sektioner pr dias. Opbevar rutsjebanerne ved -80 °C med en desiccantpatron og inde i en tæt lukket plastikpose for at forhindre, at overskydende fugt akkumuleres inde i glideboksen.
6. Mærk hvert dias med et prøve-id, en dato og et diasnummer.
7. Brug diasene med prøver inden for 10 dage fra den oprindelige dato for kryosectioning.

2. Laser mikrodissection

1. Umiddelbart før farvningen fremstilles Antistofblandingen (Ab-Mix) i 10% BSA i RNase-fri PBS ved at tilføje følgende: 4 μL FITC-Phalloidin 1,5 μL DAPI, 2 μL Tamm-Horsfall Protein (THP) antistof direkte konjugeret til Alexa Fluor 546, 3,3 μL RNase Inhibitor og 89,2 μL 10% BSA i PBS (for at nå et volumen på 100 μL).
   BEMÆRK: Alternative antistoffer kan anvendes i stedet for THP-antistoffet. For eksempel kan 2 μL megalin/LRP2 antistof, direkte konjugeret til Alexa Fluor 568, bruges til at mærke den proksimale tubule. Ab-Mix indeholder enten LRP2 eller THP antistof (for at visualisere enten proksimale tubules eller tykke opstigende lemmer, henholdsvis). Andre antistoffer kan valideres i henhold til brugernes behov.
2. Rutsjebanen vaskes i iskold (-20 °C) 100% acetone i 1 min. og flyttes til fugtighedskammeret.
3. Vask toppen af rutsjebanen med RNase-fri PBS i 30 s. Gentag.
4. Vask toppen af rutsjebanen med 10% BSA i RNase-fri PBS i 30 s. Gentag.
5. Påfør Ab-Mix i 5 min.
6. Vask toppen af rutsjebanen med 10% BSA i RNase-fri PBS i 30 s. Gentag.
7. Lufttørre diaset i 5 min og læg det på laser mikrodissection skæreplatformen.
8. Opsamlingsrørene (autoklaverede 0,5 mL mikrocentrifugerør), der er egnede til PCR-arbejde, og som indeholder 50 μL ekstraktionsbuffer fra RNA-isolationssættet.
9. Fortsæt med LMD. Fuldfør hver LMD-session inden for højst 2 timer.
   1. Indsamle præ- og post-LMD immunfluorescens billeder, ved hjælp af mikroskop kamera til at validere dissektion for inter-operatør variabilitet samt arkivering formål, uddannelse og kvalitetsvurdering af den udførte protokol. For at opnå 0,5 – 1 ng RNA kræves der mindst 500.000 μm² areal. Dette kræver ofte brug af op til 8 x12 μm tykke sektioner for at opnå en tilstrækkelig mængde materiale til alle undersegmenter af interesse.
   2. Identificer områder af interesse ved farvning, morfologi og placering og punktafgifter dem ved hjælp af laser magt større end 40.
      BEMÆRK: Her er dissektionskriterierne. Den proksimale tubule er defineret af FITC-Phalloidin og LRP2 mærkning. Den tykke stigende lemmer er defineret ved THP mærkning. Opsamlingskanalen defineres af nuklear morfologi (DAPI) og fravær af anden farvning. Glomerulus defineres af FITC-Phalloidin og morfologi. Interstitium er defineret som området mellem farvede tubules.
10. Opnå en masse tværsnitsudtrykssignatur ved at anbringe to 12 μm sektioner på et LMD-dias og dissekere hele sektionerne i udtræksbufferen.
11. Når LMD-processen er afsluttet, skal du lukke de opsamlende mikrocentrifugerør og svirpe kraftigt for at sikre, at indholdet flyttes fra hætten til bunden af røret
12. Centrifuge rørene ved 3.000 x g i 30 s.
13. Rørene inkuberes i vandbad på 42 °C i 30 min.
14. Centrifuge rørene ved 3.000 x g i 2 min.
15. Supernatanten overføres til et nyt 0,5 mL rør, og det opbevares i -80 °C.

3. RNA-isolation

BEMÆRK: Til denne RNA-isolationsprotokol har vi tilpasset en protokol fra et kommercielt RNA-isolationssæt. Producentens protokol er blevet ændret for at opfylde de kvalitetskontrolkrav, der er angivet for projektet.

1. Der tilsættes 250 μL konditioneret buffer (CB) til hver RNA-rensningskolonne (PC) og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
2. Centrifuge alle pc'er i 1 min ved 16.000 x g.
3. Der tilsættes 50 μL 70% ethanol (i sættet) i rørene med vævsprøver. Bland prøverne godt ved pipetter op og ned. Må ikke hvirvler. Må ikke centrifuges.
4. Overfør blandingen til konditionerede pc'er og centrifuge i 2 min ved 100 x g (for at binde RNA), følg hurtigt med centrifugering i 30 s ved 16.000 x g (for at fjerne flow igennem). Gentag dette trin, hvis der findes mere end 1 rør med vævsprøver for et givet undersegment.
5. Der tilsættes 100 μL vaskebuffer 1 (WB1) til pc'erne og centrifuge i 1 minut ved 8.000 x g.
6. Der fremstilles 40 μL DNase pr. prøve (Tilsættes 5 μL DNase til 35 μL RDD-buffer). Derefter tilsættes 40 μL af blandingen direkte på membranen på pc'en og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
7. Der tilsættes 40 μL WB1 på pc'ens membran og centrifuge i 15 s ved 8.000 x g.
8. Der tilsættes 100 μL vaskebuffer 2 (WB2) på pc'ens membran og centrifuge i 1 min ved 8.000 x g.
9. Der tilsættes 100 μL WB2 på pc'ens membran, centrifuge i 2 min ved 16.000 x g, umiddelbart efterfulgt af centrifugering i 1 min ved 16.000 x g.
10. Overfør pc'en til et nyt 0,5 mL rør.
11. Der tilsættes 12 μL elueringsbuffer (EB) på membranen og inkuberes i 7 minutter ved stuetemperatur. Det endelige volumen af alle dissekerede vævsprøver i puljen er således 12 μL pr. delsegment.
12. Centrifuge prøverne i 1 min ved 1.000 x g og derefter i 2 min ved 16.000 x g.
13. 2 μL overføres til et nyt rør til Bioanalyzer-analyse (for at forhindre fryse-optøningshændelser).
14. Alle rør opbevares i -80 °C, indtil de er klar til videreforarbejdning.

4. RNA-sekventering

1. Vurder hver prøve, der er beregnet til sekventering, til kvalitet ved hjælp af en kommerciel Bioanalyzer og en chip dedikeret til måling af små mængder RNA.
2. Efter kvalitetskontrol (QC) parametre forud for biblioteket prep og sekventering er påkrævet: Mængde RNA større end 4 ng for bulk og større end 0,5 - 1 ng for hvert undersegment; Procentdelen af udskrifter, der er længere end 200 nukleotider (DV200), skal være større end 25 % for LMD-prøver (optimalt > 75 %).
3. Udfør biblioteksforberedelse med et kommercielt cDNA-biblioteksforberedelsessæt, der er beregnet til små mængder forringet RNA. For det kommercielle kit, der er anført i tillægget, foreslår vi at bruge mulighed 2, som kræver et minimum DV200 på 25% og ingen fragmentering. Nogle sekventeringsteknologier kan kræve højere minimum tærskler for DV200, f.eks.
4. Tilføj cDNA-kort og -indeks.
5. Rense RNAseq biblioteker ved hjælp af magnetisk perle teknologi.
6. Udtøm ribosomal cDNA ved hjælp af en kommerciel rRNA fjernelse kit forud for RNAseq bibliotek forstærkning trin.
7. Det endelige RNAseq-bibliotek renses ved hjælp af magnetisk perleteknologi ved en koncentration på 2 ng/μL cDNA-biblioteket.
8. Udfør RNA-sekventering af 75 bp parret ende på et kommercielt sekventeringssystem med 30 millioner læsninger / prøve til bulk og 100 millioner læser / prøver til subsegmentale sektioner.
9. Brug et reference-RNA (25 μg) ved hver sekvenseringskørsel for at give mulighed for kontrol af batcheffekten. Den første koncentration af vores reference-RNA er 1 μg/μL, mens den endelige koncentration, der anvendes ved sekventering, er 25 ng/μL. Kør reference-RNA'et som en separat prøve under biblioteksforberedelse og kør med alle LMD-prøver hver gang.
10. Udfør dataanalyse ved hjælp af FastQC-applikationen til at vurdere kvaliteten af sekventering, intergene og mitokondrielæsninger og til at bestemme læsninger, der tilskrives et gen.
11. Brug Integrativ Genomics Viewer (IGV) til justering og edgeR/rbamtools til transskriptionsudtryksmål.
12. Fjern prøver med mindre end 100.000 aflæsninger. Quantile normaliserer de rå aflæsninger i datasættet efter filtrering af lavt udtrykte gener ved en brugerdefineret tærskel.
13. Kvantificere udtrykket som et forhold mellem undersegmentet af interesse og gennemsnittet af alle andre undersegmenter og log2-transformering. Relativ ekspression af det samme gen kan sammenlignes på tværs af delsegmenter og prøver; Det er dog ikke ideelt at sammenligne relative udtryk mellem to forskellige gener på grund af potentielle forskelle i nedbrydning på tværs af gener og RNA-arter.
14. Foretage en berigelsesanalyse for at sammenligne genekspression for et sæt beslutningstagere, der er specifikke for hvert nephronundersegment, mens Reference RNA-prøver sammenlignes på tværs af batcher. En batcheffekt inden for 1 standardafvigelse for middeludtryk med R-værdi > 0,9 anses for acceptabel. Der kræves yderligere normalisering for at få en højere batcheffektscore. Alle kørselskørsler, der afviger fra den accepterede batcheffekt, kan markeres. Q30 skal være større end >90% for hver rækkefølgekørsel.

Representative Results

Prøver

Vi præsenterer data fra ni referencenephrectomies (3 prøver opnået på Indiana University og 6 prøver opnået gennem Kidney Precision Medicine Project), ved hjælp af den hurtige fluorescens farvning protokol til at isolere nyre nephron segmenter og interstitielle områder. De sektioner, der anvendes i denne proces blev opnået fra afdøde nyredonorer eller upåvirket tumor nephrectomies. Disse prøver havde ikke patologiske tegn på sygdom som visualiseret i H&E-pletten taget fra sammenhængende afsnit (Figur 1A).

Laser Microdissection Kvalitetskontrol

Identifikation af rørformede delsegmenter i nyrerne opnås gennem antistofbegæring af unikke rørformede markører samt morfologi og strukturelle vartegn. Figur 1B-C illustrerer farvning og mikrodissection af rørformede undersegmenter fra en repræsentativ nephrectomy. Dette opnås ved farvning med DAPI (kerner), FITC-Phalloidin (F-actin) og et yderligere antistof efter behov. Den anvendte fluorescensbegæring gjorde det muligt at visualisere nyreundersegmenter med en høj grad af tillid, yderligere styret af morfologiske træk samt rumlig placering af de afbildede strukturer (Figur 2). For eksempel afsløres glomeruli ved falloidin og DAPI farvning med meget karakteristisk morfologi. På samme måde visualiseres opsamlingskanaler ved hjælp af nuklear morfologi og fraværet af andre pletter. Megalin/LRP2-antistoffet (direkte konjugeret til Alexa Fluor 568) bruges her til at identificere proksimale rør. Den tykke stigende lemmer visualiseres ved hjælp af en Tamm-Horsfall protein (THP) antistof (direkte konjugeret til Alexa Fluor 546). I modsætning hertil er interstitium fjernet langs den ydre membran af tubules og omfatter stromale og immunceller samt små kapillærer.

For at opnå et tilstrækkeligt RNA på 0,5 – 1 ng pr. delsegment søger vi at dissekere et areal på mindst 500.000 μm². Dette kræver generelt, at 5-8 12 μm tykke sektioner (1 sektion pr. dias) opnår tilstrækkeligt materiale til alle delsegmenter. Dissektion af ethvert dias er afsluttet på mindre end 2 timer for at bevare RNA-kvalitet, som gør det muligt at skære ~ 4 segmenter pr dias. Erhvervet væv fra samme undersegment samles fra flere lysbilleder til downstream-sekventering. Der opnås et immunfluorescensbillede før og efter LMD for at validere indsamlingen af undersegmenter af interesse ved hjælp af et tilsluttet kamera. Figur 3 afgrænser succesraten for dissektionsområdet og minimums-RNA-input. Succesraten for at opfylde minimumsområdet input var >90% i denne repræsentative datasæt. Hvis kildevævet har en lille mængde cd'en eller interstitium, er der mulighed for, at dissektionsområdet vil være under 500.000 μm² for disse segmenter efter brug af 8 dias. Yderligere dias kan skæres afhængigt af brugerens behov; som det ses i figur 3, og området er tæt på 500.000 μm², har det ønskede antal fundne gener imidlertid en høj succesrate (100 %) og den samlede læse tælle succesrate er 98,6% (1 prøve faldt til under QC metriske). Således var der nok væv til at opnå tilstrækkelige gen- og læsetællinger uden at udnytte yderligere væv.

Styring af rækkefølge af inputkvalitet

Den valgte kommercielle biblioteksforberedelses- og sekventeringsplatform giver mulighed for reproducerbare målinger af transskriptionsudtryk, selv med lave mængder stærkt forringet RNA. Den mindste RNA-indgang er 500 pg og den mindste DV200 (andel af læser længere end 200 nukleotider i længden) er over 25%. Der er ingen minimum RIN. Sekventering med 100 millioner læser per prøve, vi søger at mætte de tilgængelige læser for at opdage lavt udtrykte udskrifter. Den samlede læsning kan justeres i henhold til brugerens behov.

Det er ligetil at opnå tilstrækkeligt RNA fra to 12 μm bulk tværsnitsafsnit, så vi søger at opnå en højere samlet minimumsmRNA-mængde på 4 ng til bulksekvensering. Som afgrænset i protokollen kræver hvert undersegment 0,5-1 ng i alt RNA. Den optimale RNA-koncentration er over 50 pg/μL efter isolering. RNA-mængder, der er lavere end dette, kan føre til reducerede observerede gendetektions- og læsetal. Størstedelen af prøverne giver >20.000 fundne gener og >1 million aflæsninger. En DV200 større end 25% for alle prøver er påkrævet af producenten (>75% anses for optimal). Selvom RIN måles, reducerer processen med lasermikrodissering RIN, og RNA-sekventeringsplatformene er optimeret til fragmenteret RNA. RNA-kvantitet og -kvalitet vurderes af en bioanalyzer inden sekventering. Den hurtige plet reducerer den tid, vævet udsættes for stuetemperatur og vandige forhold, hvilket i videst muligt omfang minimerer nedbrydningen af RNA. DV200-kvalitetskontrolmetrikværdien for sekventering af input findes også i figur 3.

Styring af rækkefølge af outputkvalitet

Downstream-databehandling anvender kvantil normalisering til at gøre det muligt at sammenligne prøver i forskellige batches. Et minimumsantal af gendetektering på 10.000 og et minimumsantal aflæsninger på 1 million anvendes som tærskler til at inkludere prøver i kvantil normalisering. Prøver med lavere gendetektions- eller læsetal er udelukket fra kvantitetsnormalisering og efterfølgende sammenlignende analyser. Kun 1 ud af 98 dissekerede delsegmentprøver opfyldte ikke disse tærskler (figur 3). Q30 (andelen af læsninger kortlagt med en 99,9% tillid) har været større end 93% for hvert sekventeringseksperiment(figur 4).

Vi sekvenserer et humant reference-RNA (25 ng) med hver sekventeringskørsel for at muliggøre korrektion for batcheffekt, hvis en sådan korrektion ønskes eller kræves. Den målte batcheffekt skal være inden for 1 standardafvigelse for middeludtryk med en R-værdi > 0,9. Hvis batcheffekten er højere, kræves der yderligere normalisering for den pågældende rækkefølgekørsel. Her har batcheffekten været under 3% i de fire sekventeringseksperimenter, der er afbildet i figur 4. Batcheffekten behandles således typisk med kvantil normalisering for alle sekventeringskørsler, agnostiker til reference-RNA'et. Der er endnu ikke gennemført nogen korrektion baseret på reference-RNA'et, men disse oplysninger er tilgængelige og kan bruges afhængigt af målene for en bestemt analyse.

Stringens og reproducerbarhed

Det er vigtigt at demonstrere stringens i at identificere celletyper og strukturer. Efter lasermikrodissering tester vi for berigelse af kendte markører i glomeruli, PT, TAL, CD og interstitium sammenlignet med de andre rum (tabel 1). En berigelsesanalyse bruges til at sammenligne genekspression for forudbestemte forventede markører. Genekspression formidles som log_2-forhold i udtrykket af undersegmentet af interesse sammenlignet med gennemsnittet af de andre undersegmenter. Dette udtryk metriske blev valgt til menneskelige prøver, da det reducerer inter-individuelle variabilitet, lette sammenligninger mellem celle og rum typer på tværs af prøver. De rå aflæsninger og kvantitetsnormaliserede aflæsninger kan dog også sammenlignes i alternative analyser. Figure 5 illustrerer eksempler på immunohistokemisk farvning af disse 5 udvalgte kendte markører, som præsenteret i Human Protein Atlas.

Vi præsenterer således ortogonale datakilder, som giver tillid til, at det korrekte delsegment indsamles: 1) den billeddannelse, der omfatter segmentets/segmentets antistofplet og morfologi, og 2) udtrykket output, der viser kendte markører, udtrykkes i det tilsvarende undersegment.

Den regionale transskriptiske analyse af gener udtrykt i hvert undersegment giver mulighed for ny og undervurderet markøridentifikation. Figur 6 illustrerer et eksempel på en markør for hvert undersegment identificeret gennem LMD regionale transcriptomics, der også gav en specifik immunohistokemisk farvning af det tilsvarende nephronundersegment.

For at demonstrere reproducerbarhed og forstå effekten af operatørens variation udførte vi et eksperiment på en tumornephrectomy prøve. Dette eksemplar havde glomeruli, PT, og TAL re-dissekeret for at øge tilliden til RNA sekventering resultater og nu fungerer som en nyttig teknisk replikat. Med måneders mellemrum gennemgik denne prøve endnu et tilfælde af kryosectioning, antistoffarvning, LMD-dissektion, RNA-ekstraktion, biblioteksforberedelse og RNA-sekventering (Figur 7) i glomeruli-, PT- og TAL-rum. De to versioner (v1 og v2) blev sammenlignet. De glomerulære, PT- og TAL-rum var stærkt korreleret med^{r 2-værdier} >0,95, svarende til den minimale batcheffekt af vores reference-RNA.

Figur 1: Repræsentative billeder af nyrevævet.
(A) H&E-pletten af et humant reference nyrevæv. (B) Immunfluorescerende billede af humant reference nyrevæv med farvede tykke opstigende lemmer segmenter før LMD og (C) umiddelbart efter dissektion af enkelt tyk opstigende lemmer struktur. Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Repræsentative billeder af undersegmenter for referencerel, visualiseret ved 20x ved hjælp af en specifik immunfluorescerende farvningsmetode.
(A)a Glomerulus, (B) Proximal Tubule, (C) Tykt stigende lem, (D) Opsamlingskanal, (E) Interstitium. (*= p < 0,05, **= p < 0,01, ***= p < 0,001 af ANOVA). Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Kvalitetskontrolmålinger i segmentale transskriptioner.
(A) Mere end 90 % af pilotprøverne opfyldte inputtærsklen for dissektionsområdet på 500 000 μm². (B) Alle prøver undtagen én opfyldte den ønskede RNA-tilførsel på mindst 500 pg. (C) 100% af pilotprøverne opfyldte producentens minimum DV200-tærskel på 25% og (D) 100% af prøverne opfyldte vores minimumstærskel på 10.000 fundne gener. (E)Alle prøver undtagen én nåede et samlet antal på mindst 1 mio. Som forventet korrelerer lavere dissektionsområder med reducerede RNA-koncentrationer, lavere gental og lavere antal læsninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Rækkefølge af kvalitetskontrol.
(A) Sekventering kører beskæftiger en reference RNA (ikke kvantitet normaliseret) sammenlignes med gennemsnittet udtryk for alle kørsler. Der er stærk korrelation med minimal batcheffekt (alle R >0,969). (B) Mere end 93% af vores læser i alle kørsler blev kortlagt med høj tillid (Q30 eller 99,9%). Bemærk, at Q30-værdier leveres pr. vognbane med flere baner pr. løb. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Eksempler på immunohistokemisk farvning for at identificere de udvalgte kendte markører.
Billederne er afbildet for (A) NPHS1 (B) LRP2 (C) UMOD (D) SLC4A9 (E) COL6A2. Immunohistochemistry billeder er fremstillet af Human Protein Atlas. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Eksempler på immunokemisk farvning for at illustrere ekspression af utraditionelle markørgener i relevante undersegmenter.
Afbildede udskrifter med tilsvarende immunohistochemistry omfatter (A) SHANK3 i glomerulus, (B) ACSM2B i proksimal tubule, (C) RAP1GAP i den tykke opstigende lemmer, og (D) L1CAM i opsamlingskanalen. Immunohistochemistry billeder er fremstillet af Human Protein Atlas. (*= p < 0,0001 af ANOVA) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: Sammenhæng mellem to forskellige dissektioner med separat rækkefølge af den samme prøve.
Der blev observeret en høj grad af korrelation mellem forskellige dissektioner i (A) glomerulus, (B) proksimal tubule og (C) tyk opstigende løkke af Henle. Klik her for at se en større version af dette tal.

Markør	Segment	Fold ændring	p-værdi
NPHS1	Glomerulus	32.64	1.97E-08
LRP2	Proksimal tubule	4.69	1.21E-05
UMOD	Tykt stigende lem	24.92	2.00E-07
SLC4A9	Opsamling af rørledning	4.09	0.000133
COL6A2	Interstitium	7.19	1.47E-06

Tabel 1: Repræsentative gennemsnitsværdier for hvert undersegment af interesse blandt tre nephrectomy-prøver sammenlignet med de resterende delsegmenter.

Discussion

LMD-baserede transskriptionsprodukter er en nyttig teknologi, der forankrer genekspression til specifikke områder i vævet. Grundlaget for denne teknologi og dens potentielle anvendelse i nyrerne er blevet beskrevet tidligere⁸. Optimering, modernisering og strømlining af fluorescensbaseret dissektion, der specifikt er rettet mod høj nøjagtighedsdissektion for downstream-RNA-sekventering, er imidlertid mindre allestedsnærværende. Fordi denne metode er rumligt funderet i vævet, det har potentiale til at afsløre nye eller undervurderede markører i væv strukturer, især i sygdomstilstande. Faktisk kan mange almindelige markører af celler ændre sig med sygdom, og dermed kun stole på cellen RNA udtryk markører for identitet domfældelse uden den rumlige sammenhæng kan være udfordrende i sygdomstilstande. Derfor vil den rumligt forankrede LMD-tilgang sandsynligvis supplere og give en jord-sandhedsplatform for mange andre transskriptionsteknologier som enkeltcelle og enkelt nuklear RNA-sekventering, som definerer celler ved overvejende ved deres genekspressionsprofil⁹. Desuden giver dybden af genekspression leveret af LMD (op til 20.000 gener pr. prøve) en anden fordel og et vigtigt sted at krydslinke data fra flere kilder og redegøre for ændringer i genekspression, der muligvis ikke er synlige uden en vis dybde. Overvejelserne om vævsøkonomi er et andet positivt træk ved denne teknologi, hvorved en tykkelse på under 100 μm i alt fra en frossen blok kan være tilstrækkelig for et helt LMD-datasæt. Dette gør det muligt at anvende sidestensvæv til andre analytiske formål.

LMD har begrænsninger. En forventet begrænsning af laser microdissection transskription transskription dataopsamling er dens lavere gennemløb karakter. Fremtidig automatisering kan vise sig at være vigtig for at forbedre skalerbarheden^10,11. To yderligere begrænsninger af LMD-transskriptioner omfatter afhængigheden af ekspertise og vævskvalitetens indvirkning på dataresultaterne. Utilsigtet indsamling af celler og materiale uden for det segment af interesse er en kendt begrænsning, fordi beriget rum af celler er indsamlet, ikke en enkelt celle. LMD er afhængig af en brugers færdigheder i at forstå vævsstrukturen og kræver derfor en vis domæneekspertise. Således skal enkeltpersoner uddannes til at identificere relevante regioner i nyrerne med og uden antistof farvning. Endelig kan virkningen af vævskvaliteten påvirke downstream-datakvaliteten. LMD-protokollen fører til vævsforringelse, så kvaliteten af udgangsmaterialet er vigtig. Denne protokol blev dog optimeret på arkiverede biopsier med flere prøver af kun moderat kvalitet. De inkluderede data viser, at den valgte transskriptionsplatform er robust.

Bemærk, at det anvendte isolationssæt og RNA-sekventeringsmetoden skal skræddersys specifikt til den forventede grad af RNA-nedbrydning. Den farvning protokol, der er beskrevet her blev vedtaget, fordi det havde den mest gunstige effekt på at minimere en sådan effekt. I denne protokol blev væv indlejret i OLT for at lette fremtidige sammenligninger på tværs af andre transskriptionsteknologier. Formalin fast væv kan dog være et alternativ.

De data, der præsenteres i dette manuskript, afslører fordelene ved regionale transskriptioner, herunder optimering, kvalitetskontrolmålinger og teknologiske resultater. Fastlæggelsen af strenge kriterier for præanalyse og analytisk kvalitetskontrol samt fastlæggelse af solide beviser for stringens og reproducerbarhed er afgørende for enhver metode. Fremtidige anvendelser af regionale transskriptioner kan groft inddeles i biologiske applikationer, tekniske fremskridt og analytiske fremskridt. Fremtidige biologiske anvendelser kan være rettet mod afhøring af væv fra uskadte, sårede og regenererende tubules, samt tubules i nærheden af inflammation. Disse rum kan identificeres i samme biopsi både ved traditionelle morfologiske markører samt antistofpletter til "vej" specifikke markører. De to antistofmarkører, der er valideret til brug i denne teknologi, megalin og uromodulin, udtrykkes meget i henholdsvis den proksimale tubule og tykke opstigende lemmer. Det er dog muligt, at disse markører kan reduceres i alvorligt syge væv. I disse situationer kan yderligere antistofvalidering af vejspecifikke markører eller nye markører, der ikke ændrer deres udtryksniveau, overvinde dette problem.

LMD vil sandsynligvis være en passende metode til brug i transskriberet forhør af andre organer. Udvælgelse og optimering af antistoffer, der arbejder for hurtig farvning vil være bydende nødvendigt. Et antistof, der virker i en almindelig farvning protokol kan ikke nødvendigvis arbejde for den hurtige farvning protokol, som sandsynligvis kræver høj affinitet antistoffer. Et primært konjugeret antistof minimerer de nødvendige trin og kan give fordele. Bøjning af et antistof mod fluorophorer kan dog ændre bindingen, og der skal udføres pilotforsøg, før disse reagenser indarbejdes i protokollen.

Afslutningsvis beskriver vi en rørledning til fluorescensbaseret lasermikrodissection for at isolere specifikke områder og strukturer i den menneskelige nyre for at muliggøre en transskriptionsanalyse. Denne tilgang giver vigtige fordele og kan udvides til andre væv for at give en vævsbaseret molekylær forhør. Regionale transcriptomics supplerer andre transskriptionsteknologier ved at give et histopologisk anker til at forstå udtryk, der hjælper med fortolkningen af biologien og underskriften af sundhed og sygdom. Denne teknologi passer naturligt ind i visionen om at opbygge en transskriptionomic atlas af nyrerne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	270725-1L
AMPure Beads	Beckman Coulter	A63880
Bioanalyzer	Agilent	2100
BSA	VWR	0332-100G
DAPI	ThermoFisher	62248
Desiccant Cartridge	Bel-Art	F42046-0000
DNAse	Qiagen	79254	RDD buffer is included in the pakage
Laser Microdissection Microscope	Leica	LMD6500
Megalin/LRP2 Antibody	Abcam	ab76969	Directly conjugated to Alexa Fluor 568
Microcentrifuge tubes	ThermoFisher	AB-0350
Microscope camera	Leica	DFC700T
PBS (RNAse Free)	VWR	K812-500ML
Phalloidin (Oregon Green 488)	ThermoFisher	O7466
PicoPure RNA Isolation Kit	Applied Biosystems	KIT0204
PPS-membrane slides	Leica	11505268
qPCR Human Reference Total RNA 25 µg	Takara Clontech	636690
RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip	Agilent	5067-1513
RNAse Away	ThermoFisher	7000
RNAse Inhibitor	ThermoFisher	AM2696
Sequencer (HiSeq or NovaSeq)	Illumina	NA
SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2	Takara Clontech	634411
Tamm-Horsfall Protein Antibody	R&D Systems	AF5144	Directly conjugated to Alexa Fluor 546
Tissue-Tek® O.C.T. Compound	Sakura	4583