Summary
يظهر هنا بروتوكول لفتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بشكل عابر إما عن طريق الفوك أو في جميع أنحاء دماغ الفأر لتوصيل الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. كما تم تقديم طريقة للكشف عن تسليم الأجسام المضادة وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق علم الأنسجة.
Abstract
يتم تناول جزء صغير فقط من الأجسام المضادة العلاجية التي تستهدف أمراض الدماغ من قبل الدماغ. توفر الموجات فوق الصوتية المركزة إمكانية زيادة امتصاص الأجسام المضادة والمشاركة من خلال الفتح العابر للحاجز الدموي الدماغي (BBB). في مختبرنا ، نقوم بتطوير أساليب علاجية للأمراض العصبية التنكسية حيث يتم تسليم جسم مضاد بأشكال مختلفة عبر BBB باستخدام microbubbles ، بالتزامن مع تطبيق الموجات فوق الصوتية المركز من خلال الجمجمة التي تستهدف بقع متعددة ، وهو نهج نشير إليه باسم الموجات فوق الصوتية (SUS). تزيد التأثيرات الميكانيكية للفقاعات الدقيقة والموجات فوق الصوتية على الأوعية الدموية من النقل شبه الخلوي عبر BBB عن طريق فصل التقاطعات الضيقة بشكل عابر وتعزز نقل الخلايا بوساطة الحويصلة ، مما يسمح للأجسام المضادة والعوامل العلاجية بالعبور بفعالية. علاوة على ذلك ، تسهل الموجات فوق الصوتية أيضا امتصاص الأجسام المضادة من الدماغ الخلالي إلى خلايا الدماغ مثل الخلايا العصبية حيث ينتشر الجسم المضاد في جميع أنحاء جسم الخلية وحتى في العمليات العصبية. في دراساتنا ، يتم تحضير الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ، وخلطها مع الفقاعات الدقيقة القائمة على الدهون المحضرة داخليا وحقنها في الفئران مباشرة قبل تطبيق SUS على الدماغ. ثم يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة المتزايد في الدماغ. لحساب التغيرات في توازن الدماغ الطبيعي ، يمكن استخدام البلعمة الدبقية الدقيقة كعلامة خلوية. تشير البيانات التي تم إنشاؤها إلى أن توصيل الموجات فوق الصوتية للأجسام المضادة هو نهج جذاب لعلاج الأمراض التنكسية العصبية.
Introduction
الموجات فوق الصوتية العلاجية هي تقنية ناشئة تهدف إلى علاج أمراض الدماغ بطريقة غير جراحية ، جزئيا عن طريق تسهيل وصول العوامل العلاجية إلى الدماغ1،2،3. نظرا لأن جزءا صغيرا فقط من الأجسام المضادة العلاجية التي تستهدف أمراض الدماغ يتم تناولها والاحتفاظ بها في الدماغ4 ، فإن الموجات فوق الصوتية العلاجية توفر إمكانية زيادة امتصاصها والمشاركة المستهدفة5,6.
في مختبرنا ، نقوم بتطوير مناهج علاجية للأمراض العصبية التنكسية حيث يتم تسليم جسم مضاد بأشكال مختلفة عبر الحاجز الدموي الدماغي (BBB) باستخدام الفقاعات الدقيقة. لتحقيق ذلك ، يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية من خلال الجمجمة إلى الدماغ في بقع متعددة باستخدام وضع المسح الضوئي الذي نشير إليه باسم المسح بالموجات فوق الصوتية (SUS) 7. التفاعل الميكانيكي بين طاقة الموجات فوق الصوتية ، والفقاعات الدقيقة المحقونة عن طريق الوريد والأوعية الدموية في الدماغ يفصل بشكل عابر التقاطعات الضيقة ل BBB في حجم صوتنة معين ، مما يسمح للأجسام المضادة والشحنات الأخرى بما في ذلك العوامل العلاجية بعبور هذا الحاجز بشكل فعال7,8,9 . علاوة على ذلك ، ثبت أن الموجات فوق الصوتية تسهل امتصاص الأجسام المضادة من الدماغ الخلالي إلى خلايا الدماغ ، مثل الخلايا العصبية ، حيث ينتشر الجسم المضاد في جميع أنحاء جسم الخلية وحتى في العمليات العصبية5,10.
يتميز مرض الزهايمر بأمراض أميلويد β وتاو 11، وتتوفر مجموعة من النماذج الحيوانية لتشريح الآليات المسببة للأمراض والتحقق من صحة الاستراتيجيات العلاجية. يمكن لنهج SUS ، الذي يتم من خلاله تطبيق الموجات فوق الصوتية في نمط متسلسل عبر الدماغ بأكمله ، عند تكراره على مدى عدة جلسات علاجية ، أن يقلل من أمراض لوحة الأميلويد في أدمغة الفئران الطافرة لبروتين السلائف الأميلويد المودعة β (APP) وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تأخذ الأميلويد ، مما يؤدي إلى تحسن في الوظيفة المعرفية 7. فتح BBB مع الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة يقلل أيضا من أمراض تاو في pR5 و K3 و rTg4510 تاو الفئران المعدلة وراثيا5،12،13. الأهم من ذلك ، في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة تزيل رواسب البروتين خارج الخلية ، فإن إحدى آليات التطهير الأساسية للأمراض داخل الخلايا العصبية التي يسببها SUS هي تنشيط الالتهام الذاتي العصبي12.
هنا ، نحدد عملية تجريبية ، يتم من خلالها إعداد الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية ، ثم يتم خلطها مع الفقاعات الدقيقة القائمة على الدهون في المنزل ، تليها الحقن بأثر رجعي في الفئران المخدرة. الحقن خلف الحجاج هو بديل لحقن الوريد الذيل الذي وجدنا أنه فعال بنفس القدر وأبسط في الأداء المتكرر. ويتبع ذلك مباشرة تطبيق SUS على الدماغ. لتحديد امتصاص الأجسام المضادة العلاجية ، يتم التضحية بالفئران ثم يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة المتزايد في الدماغ. كوكيل للتغيير في توازن الدماغ ، يتم تحديد نشاط البلعمة الدبقية الدقيقة من خلال علم الأنسجة وإعادة البناء الحجمي 3D.
تشير البيانات التي تم إنشاؤها إلى أن توصيل الموجات فوق الصوتية للأجسام المضادة هو نهج جذاب محتمل لعلاج الأمراض التنكسية العصبية. ويمكن تطبيق البروتوكول بالمثل على الأدوية المرشحة الأخرى، فضلا عن الشحنات النموذجية مثل الدكسترونات ذات الأحجام المحددة بالفلورسنت14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان بجامعة كوينزلاند.
1. في المنزل إعداد microbubble
- وزن نسبة مولية 9: 1 من 1،2-ديستيرويل-sn-glycero-3-phosphocholine و 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] (ملح الأمونيوم). مطلوب 0.5 ملغ من خليط الدهون لكل 1 مل من محلول microbubble. بدلا من ذلك ، يمكن شراء الدهون بالفعل في الكلوروفورم ، إذا انتقل استخدام الدهون الذائبة مسبقا إلى الخطوة 1.3.
- يذوب الدهون في حجم صغير من الكلوروفورم في كوب زجاجي.
- تبخر الكلوروفورم باستخدام مبخر أو تيار نيتروجين.
- أعد ترطيب فيلم الدهون المجفف باستخدام 10 مل من PBS + 10٪ جلسرين + محلول بروبيلين جليكول 10٪ تم ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
- ضع محلول الدهون المعاد ترطيبه في سونيكتور حمام مائي مضبوط على 55 درجة مئوية (أعلى من درجة حرارة انصهار الدهون) وسونيكات حتى تذوب تماما.
- Aliquot محلول الدهون في قوارير HPLC 1.5 مل معقمة والمسمار على قبعات الحاجز.
- استنشق كل الهواء في القارورة باستخدام حقنة سعة 5 مل مجهزة بإبرة 27 جم وقم بإنشاء فراغ في القارورة.
- أضف الأوكتوفلوروبروبان إلى القارورة باستخدام المحقنة المضمنة ، واسحب الغاز من العلبة. املأ القارورة ب 1-2 مل من ثماني فلورو بروبان عن طريق قراءة الحجم في المحقنة.
- أغلق كل قارورة بفيلم بارافين وضعيها في الثلاجة.
- في يوم التجربة ، أحضر القارورة إلى درجة حرارة الغرفة ، وأضف 0.5 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ إلى القارورة ، ثم ضع القارورة في ملغمة وحرك لمدة 45 ثانية (وقت محدد مسبقا) لإنتاج الفقاعات الدقيقة.
2. مراقبة جودة Microbubble باستخدام عداد coulter
- أخرج محلول الفقاعة الدقيقة من الملغم وقم بتنفيس الغاز من القارورة عن طريق ثقب الحاجز بإبرة 19 جم.
- قم بتخفيف محلول microbubble عن طريق إجراء تخفيفات تسلسلية من خطوتين 1: 5,000 عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول microbubble إلى 5 مل من محلول التدفق المصفى باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 19 G ، ثم أخذ 100 ميكرولتر من محلول microbubble المخفف 1:50 والسحب إلى محلول تدفق مصفى 10 مل في كوفيت باستخدام ماصة.
- تحقق من أن خزان المنحل بالكهرباء يحتوي على محلول تدفق كاف وأن خزان النفايات فارغ.
- ضع الكوفيت في منصة عداد كولتر وقم بتثبيته في مكانه. استخدم فتحة عدسة 30 ميكرومتر للحصول على العينة.
- في البرنامج، قم بتحميل طريقة التشغيل القياسية (SOM)، ثم حدد تحرير SOM | تركيز. أدخل تخفيف 5000x.
- في البرنامج ، اختر اسم ملف مناسب. على سبيل المثال ، microbubble_1_date.
- قم بتحميل وتأمين cuvette في المنصة.
- في البرنامج ، حدد تشغيل| معاينة والتحقق من أن تركيز العينة أقل من 10٪. إذا كان هذا الرقم أعلى من 10٪ ، فقم بإجراء تخفيف جديد للفقاعات الدقيقة مع عامل تخفيف أعلى.
- حدد "ابدأ" لبدء الحصول على العينة للحصول على القراءة الأولية.
- اشطف فتحة عدسة عداد كولتر بمحلول التدفق المصفى بعد كل قياس. كرر الخطوات 2.2-2.9 للحصول على 3 نسخ متماثلة.
- ضع كوفيت بمحلول microbubble مخفف في حمام مائي سونيكتور وسونيكات لمدة 30 ثانية.
- قم بقياس المحلول باستخدام الفقاعات الدقيقة الصوتية وقم بتصنيفه على أنه فارغ.
- في البرنامج، اطرح القراءة النهائية من القراءة الأولية. هذا يطرح أي جزيئات ليست فقاعات صغيرة ولا تحتوي على غاز.
- حدد عرض النتائج في البرنامج، لعرض تركيز الفقاعة الدقيقة وتوزيع الحجم ومتوسط الحجم وتركيز الحجم.
3. وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية
- احصل على محلول 1 ملغم / مل من الماوس IgG في PBS دون أي إضافات.
- تسمية 1 ملغ من الماوس IgG مع AlexaFluor 647 في 0.1 M بيكربونات الصوديوم المخزن المؤقت باتباع تعليمات الشركات المصنعة الموجودة في المجموعة. هذه الكمية من IgG المسمى بالفلورسنت كافية لتنفيذ هذا الإجراء على 5-7 فئران بالغة حيث يتم إعطاء جرعة 5 ملغم / كغم من الأجسام المضادة.
- أضف الصبغة إلى محلول IgG في مخزن مؤقت بيكربونات الصوديوم 0.1 M واحتضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتنقية الجسم المضاد الموسوم بالفلورسنت عن طريق سحب محلول الأجسام المضادة في عمود دوار والطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق. ستبقى الصبغة الحرة في سرير العمود.
- استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز البروتين. قم بقياس امتصاص المحلول المقترن عند 280 نانومتر و 650 نانومتر (A280 و A650). احسب تركيز البروتين في العينة باستخدام المعادلة:
تركيز البروتين (M) = [A280 - (A650 × 0.03)] × عامل التخفيف / 203000. - استخدم مقياس الطيف الضوئي لحساب درجة وضع العلامات باستخدام المعادلة:
صبغة الشامات لكل بروتين مول = A650 × عامل التخفيف / 239000 × تركيز البروتين (M).
ملاحظة: درجة مقبولة من وضع العلامات هي 3-7 شامات صبغة لكل بروتين مول وعادة ما تكون درجة وضع العلامات التي يتم الحصول عليها حوالي 6.
4. إعداد الموجات فوق الصوتية
- باستخدام نظام الموجات فوق الصوتية المركزة، أضف الفاصل 5 مم إلى بلعة الماء لوضع تركيز الموجات فوق الصوتية على بعد 9 مم أسفل الجزء السفلي من بلعة الماء.
- املأ البلعة المائية بحوالي 300 مل من الماء منزوع الأيونات الذي تم نزع غازه باستخدام مزيل مضمن لمدة 20 دقيقة (يجب أن يكون محتوى الأكسجين أقل من 3 أجزاء في المليون). ضع الصفيف الحلقي في بلعة الماء المملوءة واستخدم مرآة الأسنان للتحقق من عدم وجود فقاعات هواء على السطح. إذا كانت موجودة على السطح ، فقم بإزالة الصفيف الحلقي واستبدله في بلعة الماء.
- قم بتشغيل البرنامج التطبيقي. في قائمة الشكل الموجي، حدد تعيين دورة عمل الشكل الموجي. الإعدادات هي PRF (هرتز) 10 ، دورة العمل 10 ٪ ، التركيز 80 مم ، تردد المركز 1 ميجاهرتز ، السعة (ذروة الضغط السلبي في MPa) 0.65 ميجا باسكال ، المؤشر الميكانيكي = 0.65. اضغط على Set (تعيين ) لتحديد الشكل الموجي وتخزينه في الذاكرة.
ملاحظة: تتم معايرة نظام الموجات فوق الصوتية المركز مسبقا من قبل الشركة المصنعة من القياسات التي يتم إجراؤها بواسطة هيدروفون معايرة. - في برنامج نظام الموجات فوق الصوتية المركزة ، حدد خطة علاجية. وهذا يتطلب تحديد منطقة علاج تتكون من مواقع علاج فردية متعددة، وتحديد الإجراءات الواجب اتخاذها في كل موقع من مواقع العلاج هذه. في هذه الحالة ، تكون منطقة العلاج عبارة عن نصف كرة واحد من دماغ الفأر.
- في نافذة وحدة التحكم في الحركة، انتقل إلى علامة التبويب المسح الضوئي وأدخل قيمة البدء والإيقاف والزيادة للحركة في البعد x، وقيمة البدء والتوقف والزيادة للحركة في الاتجاه y. أدخل قيم X: ابدأ -4، أوقف 3.50 و Y: -3.00، إيقاف 3، زيادة 1.5، # حلقات: 1.
- تحديد الإجراءات الخاصة بمواقع العلاج. في نافذة وحدة التحكم في الحركة، حدد زر الحدث . في نافذة تحرير البرنامج النصي، حدد قائمة بالإجراءات التي سيتم تنفيذها بالترتيب المحدد في كل موقع معالجة. اضبط نوع الحركة على شبكة البيانات النقطية أعلى نافذة البرنامج النصي. في علامة التبويب الأحداث، حدد إضافة إجراءات لنقلها إلى لوحة البرنامج النصي، وأضف نقل متزامن، وابدأ تشغيل arb، وانتظر، وإيقاف تشغيل arb. انقر فوق إجراء الانتظار وحدد وقت انتظار 6000 مللي ثانية.
ملاحظة: ستجعل هذه الإعدادات المعالجة عبارة عن شبكة 6 × 5 من بقع المعالجة متباعدة بمقدار 1.5 مم ، مع كل بقعة لها مدة علاج تبلغ 6 ثوان. المدة الإجمالية لسونيك دماغ الفأر حوالي 3 دقائق. شبكة المعالجة ذات الحجم هذه مناسبة للفئران البالغة C57 / Bl6 التي تزن حوالي 30 جم. يمكن تعديل حجم شبكة بقع المعالجة لأعلى أو لأسفل اعتمادا على حجم الماوس.
5. إعداد الحيوانات
- وزن الماوس بميزان دقيق يصل إلى 0.1 جم.
- تخدير الفأر مع 90 ملغم / كغ من الكيتامين و 6 ملغ / كغ من الزيلازين داخل الصفاق. اختبار عدم وجود ردود الفعل مع قرصة إصبع القدم. بدلا من ذلك ، يمكن تخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران باستخدام جهاز تخدير استنشاقي مناسب مع قناع وجه مناسب. في حالة استخدام الأيزوفلوران ، يجب وضع الماوس على وسادة حرارية أثناء الموجات فوق الصوتية لمنع انخفاض حرارة الجسم.
- استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لحلق الشعر من رأس الحيوان ، ثم ضع كريم إزالة الشعر مع برعم قطني ، واتركه لمدة 2-3 دقائق أو حتى يتم مسح الشعر نظيفا بقطعة رطبة من الشاش. احرص على ألا يدخل كريم إزالة الشعر في عيون الماوس.
- ضع علامة على مركز رأس الماوس بعلامة دائمة. يحتوي محول الطاقة على ثقب في مركزه ويمكن محاذاة تركيز المحول والبقعة البؤرية بصريا.
- املأ قارب وزن صغير سبق أن تم قطع القاع واستبداله بغلاف بلاستيكي ملتصق بقاع قارب الوزن باستخدام هلام الموجات فوق الصوتية. هذا بمثابة فاصل 8 مم ويوفر اقتران جيد برأس الماوس ويسمح بالفحص البصري لتركيز محول الطاقة المحاذي لرأس الماوس.
6. إعداد الفقاعات الدقيقة
- قم بتسخين قارورة microbubble إلى درجة حرارة الغرفة. للتنشيط ، أضف 0.5 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ إلى القارورة وضعها في ملغم للتحريك لمدة 45 ثانية لإنتاج الفقاعات الدقيقة.
- تنفيس القارورة عن طريق ثقب الحاجز بإبرة 27 جم.
7. العلاج بالموجات فوق الصوتية
- عكس قارورة الفقاعات الدقيقة ورسم بلطف 1 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من المحلول. لهذا إضافة محلول من الأجسام المضادة المسمى بالفلورسنت وتخلط بلطف في المحقنة. الحد الأقصى لحجم الحقن هو 150 ميكرولتر.
ملاحظة: الفقاعات الدقيقة المحضرة داخليا أقل تركيزا بحوالي 60 ضعفا من الفقاعات الدقيقة المستخدمة سريريا (على سبيل المثال، الفقاعات الدقيقة المحددة). اضبط الحجم أو التركيز بحيث يكون عدد الفقاعات الدقيقة التي يتم حقنها مشابها لتلك المستخدمة سريريا (أي. تحديد 1.2 × 108 ميكروفقاعات / كجم من وزن الجسم). - حقن الفقاعة الدقيقة ومحلول الأجسام المضادة بأثر رجعي ، مع الحرص على الحقن بلطف وببطء. ثم ، ضع مرهم العيون على عيون الماوس.
- ضع الماوس في حامل الرأس (انظر جدول المواد) وقم بإصلاح أنف الماوس. ثم ضع قارب الوزن الصغير المملوء بالموجات فوق الصوتية المملوء بالهلام فوق الرأس.
- اخفض بلعة الماء حتى تجلس فوق هلام الموجات فوق الصوتية في قارب الوزن.
- استخدم عصا التحكم لنقل تركيز محول الطاقة إلى وسط الرأس. حدد إعادة تعيين الأصل في علامة التبويب الحركة.
- حدد الفحص الكامل. ستستغرق الخطوات من 7.3 إلى 7.6 دقيقتين.
- من أجل الاتساق ، قم بتعيين مؤقت لضمان تأخير 2 دقيقة بين حقن microbubbles وتحديد الفحص الكامل.
- بعد اكتمال العلاج ، ضع مرهم العيون على العينين وضع الماوس في غرفة الشفاء الدافئة. إذا لوحظ انخفاض حرارة الجسم أثناء الإجراء ، يمكن وضع وسادة الاحترار تحت الماوس لتوفير حرارة تكميلية أثناء الإجراء.
8. حصاد الأنسجة ومعالجتها
- في الوقت المناسب من الاهتمام بعد التسليم بالموجات فوق الصوتية (على الأقل 1 ساعة للكشف عن مستويات عالية من الأجسام المضادة في الدماغ) تخدير عميق للفأر مع جرعة زائدة من محلول بنتوباربيتون (100 ملغ / كغ) وأداء الماوس عبر القلب مع 30 مل PBS. مطلوب تروية جيدة للكشف على وجه التحديد عن الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت التي تم تسليمها إلى الدماغ.
- جمع الدماغ وإصلاحه عن طريق الغمر في PFA 4٪ لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، ثم اغسله باستخدام PBS.
- قم بتصوير الدماغ في ماسح ضوئي بالأشعة تحت الحمراء عن طريق وضع الدماغ على الدرج والحصول على صورة في قناة 700 نانومتر.
ملاحظة: بعد التثبيت ، تتم إزالة الدماغ من PFA ، وغسله في PBS وتقسيمه. بدلا من ذلك ، يمكن وضعه في محلول مبرد الإيثيلين جلايكول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية أو حتى يغمرها المياه ، ثم يتم نقله إلى مادة تبريد جديدة تحتوي على قارورة ووضعها عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. - قسم الدماغ البارد في PBS باستخدام اهتزاز. قم بلصق الدماغ على المنصة وقطع أقسام 30-40 ميكرومتر وجمعها في PBS.
ملاحظة: يجب تبييض التألق الذاتي الليزوزومي (المنتشر في أقسام من الحيوانات التي يزيد عمرها عن 12 شهرا تقريبا) عن طريق الإضاءة الليلية للأقسام في صندوق غرفة الضوء ، في درجة حرارة الغرفة وفي PBS التي تحتوي على أزيد (0.02٪) لمنع نمو البكتيريا.
9. تلطيخ الأنسجة والحصول على الصور
- انقل الأقسام إلى محلول الحجب (5٪ BSA في 0.2٪ Triton / PBS) لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل الأقسام 3x عن طريق استبدال المحلول ب 0.2٪ Triton / PBS.
- احتضان الأقسام عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية ضد Iba1 (التخفيف 1: 1000) و CD68 (التخفيف 1: 500) ، في 0.2 ٪ Triton / PBS ، تليها 3x يغسل مع 0.2 ٪ Triton / PBS.
- احتضان الأقسام لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية الفلورية (التخفيف 1:500) ، تليها غسلات 3x مع 0.2٪ Triton / PBS فقط.
ملاحظة: يمكن أيضا تلطيخ النوى باستخدام محلول DAPI (0.5 ميكروغرام / مل). - انقل الأقسام إلى شريحة وغطاء مع وسائط تركيب ثابتة. امنح وقتا كافيا لتصلب وسيط التركيب قبل التصور والحصول على الصورة (بين عشية وضحاها).
- باستخدام المجهر متحد البؤرة ، احصل على صور z-stack (عمق 10 ميكرومتر على الأقل وحجم خطوة 0.3 ميكرومتر ، 10 صور لكل حيوان) لمنطقة الدماغ المستهدفة بالموجات فوق الصوتية باستخدام مجهر متحد البؤرة وهدف تكبير 40x على الأقل.
ملاحظة: احرص على الحصول على صور ضمن النطاق الديناميكي للإشارة، وتجنب التعرض الناقص/الزائد. احفظ ملفات الصور بتنسيق البرنامج المقابل الذي يستخدمه المجهر.
10. تحليل الصور
- قم بتحويل ملفات المجهر z-stack باستخدام مستورد ملف برنامج تحليل الصور.
- افتح الملفات المحولة إلى البرنامج واضبط كثافة قناة Iba1 لمراقبة الخلايا الدبقية الصغيرة.
- اقتصاص خلية دبقية صغيرة واحدة عن طريق رسم مربع حولها ، وحدد "اقتصاص" واحفظ الملف الجديد.
- بناء العرض السطحي ثلاثي الأبعاد لإشارة IBA1 من خلال:
- افتح ملف Imaris أحادي الخلية الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة.
- إضافة سطح إلى الملف.
- حدد القناة المقابلة لتلطيخ Iba1.
- تطبيق عتبة يجب أن تتداخل مع تلطيخ Iba1
- حدد فقط بنية الاهتمام التي تشكل الخلية الدبقية الصغيرة ذات الأهمية
- وضع اللمسات الأخيرة على العملية
- الحصول على حجم تلطيخ Iba1 وتسجيله
- بناء تقديم سطح 3D من تلطيخ CD68
- داخل الملف الفرعي لسطح IBA1 ، قم بإخفاء قناة CD68 وإزالة voxels خارج تلطيخ IBA1
- إضافة سطح جديد إلى الملف
- حدد القناة المقابلة لتلطيخ CD68
- تطبيق عتبة يجب أن تتداخل مع تلطيخ CD68 وتكون مطابقة قدر الإمكان لأحجام التلطيخ
- قم بوضع اللمسات الأخيرة على العملية ، حيث لن تكون موجودة في هذا الملف سوى هياكل CD68 داخل الدبقية الدقيقة ، وبالتالي ، فإنها لا تتطلب خطوة تصفية عتبة أخرى
- الحصول على وتسجيل عدد ومتوسط حجم الهياكل الإيجابية CD68
- احسب الحجم النسبي لهياكل CD68 وفقا لهياكل IBA1 المقابلة لها كمقياس للتنشيط الدبقي الصغير في حالة البلعمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تسليم الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية إلى الدماغ ويمكن اكتشافها ، إلى جانب تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. الاستنتاج الذي يمكن استخلاصه هو استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة والفقاعات الدقيقة يعزز بشكل ملحوظ امتصاص الدماغ للأجسام المضادة ويمكن أن يوصل الأجسام المضادة إلى الدماغ بأكمله أو نصف الكرة الأرضية للفأر عند استخدامه في وضع المسح الضوئي. يوضح الشكل 1 جهاز تطبيق الموجات فوق الصوتية TIPS (مكونات مختلفة مسماة) يستخدم لفتح BBB. ويبين الشكل 2 النتائج التمثيلية المستمدة من قياسات كولتر المضادة للحجم والتركيز التي ينبغي الحصول عليها عند إنتاج الفقاعات الدقيقة بشكل صحيح. لتصور التسليم بسهولة ، تم تصنيف الأجسام المضادة بصبغة فلورسنت حمراء بعيدة. يمكن تصور امتصاص الأجسام المضادة من قبل الدماغ بسهولة في الدماغ بأكمله أو الأقسام باستخدام ماسح ضوئي بالأشعة تحت الحمراء أو باستخدام المجهر الفلورسنت على أقسام الدماغ. تظهر أقسام الدماغ موقع الجسم المضاد المسمى بالفلورسنت على المستوى المجهري. تظهر النتائج التمثيلية لمسح توصيل الموجات فوق الصوتية إلى الحصين من الأجسام المضادة المضادة لتاو RN2N الموسومة بالفلورسنت في الشكل 3. لمراقبة أي تغيير في التوازن الطبيعي للدماغ نتيجة ل SUS وتسليم الأجسام المضادة ، كانت إحدى القراءات هي محتوى الليزوسومات الدبقية الدقيقة فيما يتعلق بالبلعمة. يوضح الشكل 4 تلطيخا تمثيليا للدبقية الصغيرة باستخدام Iba1 وعلامة الليزوسوم الدبقية الدقيقة CD68 لتحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة تصبح أكثر البلعمة بعد تسليم الجسم المضاد.
الشكل 1: نظام الموجات فوق الصوتية المركز المستخدم لتقديم الموجات فوق الصوتية مع تسمية المكونات الهامة. (أ) حامل الجل محلي الصنع الذي يعمل كفاصل 8 مم. (ب) عرض من خلال محول الطاقة يوضح كيفية محاذاة الهدف مع التركيز بصريا (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات مراقبة الجودة للفقاعات الدقيقة المعدة داخليا. (أ) معدات مكافحة كولتر المستخدمة للحصول على إحصاءات موجزة (ب) وتوزيع حجم الفقاعات الدقيقة في العدد (ج) وتوزيع الحجم (د). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيل الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية إلى الدماغ باستخدام SUS. (أ) جزء من الجسم المضاد المسمى بالفلورسنت خاص ب tau isoform يتم تسليمه من تلقاء نفسه ، SUS من تلقاء نفسه ، وكشف العلاج المركب عن زيادة امتصاص الجسم المضاد بواسطة نصف الكرة الصوتية عند دمجه مع SUS باستخدام التصوير الفلوري بالأشعة تحت الحمراء القريبة من نصف الكرة المخية لنصف الكرة المخية. تم تطبيق جدول بحث (LUT) ، مع كثافة تألق أعلى في الوحدات التعسفية المعروضة بألوان أكثر دفئا. (ب) تم إجراء القياس الكمي للتألق دون طرح مستويات التحكم في التألق في الخلفية الخاصة ب SUS فقط. متوسط ± SEM المعروضة. (ج) زيادة امتصاص الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت بواسطة الخلايا العصبية الحصينية الموضحة في صور التكبير المنخفضة والعالية لأقسام الدماغ. في العلاج المركب ، يوزع الجسم المضاد في أجسام الخلايا وحتى التشعبات كما هو موضح في الخلايا العصبية الحصينية. الأزرق = DAPI ، أرجواني = جزء من الأجسام المضادة. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: وضع العلامات التمثيلية المناعية الفلورية للخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يدل على التشكل المتوقع للخلايا الدبقية الصغيرة والمقدمة في 3D باستخدام برنامج تحليل الصور. لوحظ مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باللون الأخضر ولوحظت مستويات وتوزيع CD68 باللون الأحمر. شريط المقياس 10 ميكرومتر. أخضر = Iba1 ، أحمر = CD68. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن توصيل الأجسام المضادة الموسومة بالفلورسنت إلى الدماغ باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة جنبا إلى جنب مع الفقاعات الدقيقة المطبقة في وضع المسح. يمكن الكشف عن توصيل الأجسام المضادة ومورفولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة وتضخم الليزوسومات عن طريق الفحص المجهري الفلوري بعد المسح بالموجات فوق الصوتية. يمكن أن تستوعب الخلايا الدبقية الصغيرة في الأجسام المضادة للليزوسومات والمستضدات التي ترتبط بها الأجسام المضادة في عملية بوساطة مستقبلات FC4.
هناك عدد من الخطوات الحاسمة لتحقيق فتح BBB قابل للتكرار وتسليم الأجسام المضادة باستخدام هذه الطريقة. من الأهمية بمكان ضمان اقتران جيد بين محول الموجات فوق الصوتية ورأس الماوس. قم بإزالة كل الشعر على رأس الماوس وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الاقتران. خصائص الفقاعات الدقيقة المعدة داخليا ضرورية للنجاح. يجب أن يكون للفقاعات الدقيقة تركيز كاف من 108 microbubbles / mL وتوزيع حجم بحيث يكون أكثر من 90٪ من microbubbles أقل من 10 ميكرومتر في القطر. وذلك لأن الفقاعات الدقيقة الأكبر حجما معروفة بتصفيتها من الدورة الدموية بواسطة الرئتين. يتراوح متوسط الحجم المقبول بين 1-3 ميكرومتر. يجب التعامل مع الفقاعات الدقيقة وحقنها بلطف لتجنب تدميرها في المحقنة. من المهم أن يتم تطبيق الموجات فوق الصوتية في موعد لا يتجاوز 2 دقيقة بعد حقن الفقاعات الدقيقة التي يمكن تحقيقها من خلال الممارسة. يمكن تحقيق استهداف الدماغ بأكمله أو نصف الكرة الأرضية بأكمله بسهولة باستخدام نهج SUS ومن غير المرجح أن تكون دقة الاستهداف مشكلة عند استهداف مناطق كبيرة. يمكن أيضا استهداف منطقة أصغر في الدماغ مثل الحصين أو المخطط بنجاح ولكن في هذه الحالة من المهم أن يتداخل التركيز مع المنطقة المستهدفة. يشبه ارتفاع دماغ الماوس الطول المحوري لشعاع الموجات فوق الصوتية المركز عند 1 ميجاهرتز باستخدام محول الموجات فوق الصوتية النموذجي ، بحيث يحتاج المحول فقط إلى التحرك في البعدين x و y وليس البعد z. يمكن تحديد ذلك من خلال معرفة الإحداثيات المجسمة لبنية دماغية معينة ومن خلال عرض الغرز اللامبدودية والسهمية من خلال الجلد المزيل للفأر.
هنا نوضح تقنية تستخدم الحقن خلف الحجاج لتوصيل الفقاعات الدقيقة والأجسام المضادة. بديل للحقن خلف الحجاج هو حقن الوريد الذيل وهو أيضا تقنية فعالة لتوصيل الفقاعات الدقيقة والأجسام المضادة. مزايا الحقن الرجعي الحجاجي هو أنه أقل تحديا من الناحية الفنية من حقن الوريد الذيل ، ويمكن تكراره عدة مرات (العين المتناوبة للحقن) مع الحد الأدنى من خطر تلف الأنسجة.
إذا لم يتم الكشف عن أي جسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت في الدماغ ، فمن المحتمل أن BBB لم يفتح. يجب أن يركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها على الحصول على محلول microbubble مركز وحقنه حتى لا تدمر microbubbles وتسليم الموجات فوق الصوتية في غضون دقيقتين من وقت الحقن. في حالة عدم حدوث فتح BBB ، يمكن زيادة إعداد ذروة الضغط السلبي ، مع التحذير من أن الضغوط السلبية الأعلى تزيد من فرصة التسبب في نزيف دقيق لا نكتشفه عند إعداد ذروة الضغط السلبي البالغ 0.65 ميجا باسكال باستخدام الإعدادات الموصوفة. اعتمادا على خصوصية مستضد الجسم المضاد ، سيكون نمط التلطيخ مختلفا. يظهر نمط التلطيخ الذي تم الحصول عليه عند حقن جسم مضاد مضاد لتاو في الشكل 2.
يمكن تطبيق هذه التقنية على مجموعة من الأجسام المضادة وطالما تم الحصول على فتحة BBB متسقة ، يمكن تقييم ربط الجسم المضاد بهدف في الدماغ. يحقق نهج الموجات فوق الصوتية للمسح الضوئي فتح BBB عبر دماغ الماوس بأكمله بطريقة قابلة للتكرار.
أحد قيود هذه التقنية هو أن حدوث ومدى فتحة BBB لا يلاحظ أثناء وجود الماوس على قيد الحياة. يمكن التغلب على هذا القيد عن طريق تضمين التصوير بالرنين المغناطيسي مع عامل تباين الجادولينيوم في الإجراء ، ولكن هذا يزيد بشكل كبير من وقت وتكلفة الإجراء.
الموصوف هنا هو صوتنة واحدة وإدارة واحدة لبروتوكول الأجسام المضادة والتي يمكن استخدامها لتحديد مقدار زيادة امتصاص الأجسام المضادة التي يمكن تحقيقها ، وكذلك مكان وجودها في الدماغ بعد الولادة. يمكن أيضا استخدام البروتوكول في دراسة طولية لتقييم الآثار العلاجية لتوصيل الأجسام المضادة. في دراسة العلاج ، يمكن تكرار البروتوكول بفاصل زمني بين العلاج لمدة أسبوع واحد أو أكثر من أجل تقييم الإمكانات العلاجية للجسم المضاد الذي يتم تسليمه إلى الدماغ. يمكن تقييم الإمكانات العلاجية للجسم المضاد الذي يتم توصيله بواسطة الموجات فوق الصوتية في نماذج الفئران المعدلة وراثيا للأمراض العصبية التنكسية. يمكن أن تشمل قراءات التأثير العلاجي الاختبارات السلوكية ، وعلم الأنسجة والكيمياء الحيوية لمستويات البروتينات المرضية على سبيل المثال تاو أو أميلويد β أو سينوكلين.
في الختام ، حددنا طريقة لفتح حاجز الدم في الدماغ في الفئران لتقديم أجسام مضادة تحمل علامات الفلورسنت. ستكون هذه الطريقة ذات فائدة للباحثين الذين يقيمون الأساليب العلاجية للأمراض التنكسية العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشف عنه.
Acknowledgments
نحن نقدر الدعم المقدم من حوزة الدكتور كليم جونز AO ، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا [GNT1145580 ، GNT1176326] ، ومؤسسة ميتال ، وحكومة ولاية كوينزلاند (DSITI ، وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والابتكار).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M.
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
