Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om de bloed-hersenbarrière (BBB) tijdelijk te openen, hetzij focale of door een muizenbrein om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren en microglia te activeren. Ook gepresenteerd is een methode om de afgifte van antilichamen en microglia-activering door histologie te detecteren.
Abstract
Slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt door de hersenen opgenomen. Gerichte echografie biedt een mogelijkheid om de opname van antilichamen en betrokkenheid te verhogen door tijdelijke opening van de bloed-hersenbarrière (BBB). In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten over de BBB wordt afgeleverd met behulp van microbubbels, gelijktijdig met gerichte echografietoepassing door de schedel gericht op meerdere plekken, een benadering die we scanning ultrasound (SUS) noemen. De mechanische effecten van microbubbels en echografie op bloedvaten verhogen het paracellulaire transport over de BBB door het tijdelijk scheiden van tight junctions en verbeteren vesikel-gemedieerde transcytose, waardoor antilichamen en therapeutische middelen effectief kunnen kruisen. Bovendien vergemakkelijkt echografie ook de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen zoals neuronen waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen verspreidt. In onze studies worden fluorescerend gelabelde antilichamen bereid, gemengd met in-house bereide lipide-gebaseerde microbubbels en geïnjecteerd in muizen onmiddellijk voordat SUS op de hersenen wordt aangebracht. De verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen wordt vervolgens gekwantificeerd. Om rekening te houden met veranderingen in de normale homeostase van de hersenen, kan microgliale fagocytose worden gebruikt als een cellulaire marker. De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen.
Introduction
Therapeutische echografie is een opkomende technologie gericht op de behandeling van hersenziekten op een niet-invasieve manier, deels door de toegang van therapeutische middelen tot de hersenen te vergemakkelijken1,2,3. Aangezien slechts een klein deel van de therapeutische antilichamen gericht tegen hersenziekten wordt opgenomen door en vastgehouden in de hersenen4, biedt therapeutische echografie de mogelijkheid om hun opname en doelbetrokkenheid te verhogen5,6.
In ons laboratorium ontwikkelen we therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten waarbij een antilichaam in verschillende formaten wordt afgeleverd over de bloed-hersenbarrière (BBB) met behulp van microbubbels. Om dit te bereiken, wordt echografie via de schedel in de hersenen op meerdere plekken toegepast met behulp van een scanmodus die we scanning ultrasound (SUS) noemen 7. De mechanische interactie tussen de ultrasone energie, de intraveneus geïnjecteerde microbubbels en de vasculatuur van de hersenen scheidt tijdelijk de tight junctions van de BBB in een bepaald ultrasoonapparaat, waardoor antilichamen en andere ladingen, waaronder therapeutische middelen, deze barrière effectief kunnen passeren7,8,9 . Bovendien is aangetoond dat echografie de opname van antilichamen uit de interstitiële hersenen in hersencellen, zoals neuronen, vergemakkelijkt, waar het antilichaam zich door het cellichaam en zelfs in neuritische processen verdeelt5,10.
De ziekte van Alzheimer wordt gekenmerkt door een amyloïde-β en tau-pathologie11, en een groot aantal diermodellen is beschikbaar om pathogene mechanismen te ontleden en therapeutische strategieën te valideren. Een SUS-benadering, waarbij echografie wordt toegepast in een sequentieel patroon over de hele hersenen, wanneer herhaald gedurende verschillende behandelingssessies, kan amyloïde plaquepathologie in de hersenen van amyloïde-β-deponerende amyloïde precursor eiwit (APP) mutante muizen verminderen en microglia activeren die het amyloïde opnemen, wat leidt tot verbetering van de cognitieve functie7. BBB-opening met echografie en microbubbels vermindert ook tau-pathologie in pR5, K3 en rTg4510 tau transgene muizen5,12,13. Belangrijk is dat, terwijl microglia extracellulaire eiwitafzettingen verwijderen, een van de onderliggende klaringsmechanismen voor intraneuronale pathologieën geïnduceerd door SUS de activering van neuronale autofagie12 is.
Hier schetsen we een experimenteel proces, waarbij fluorescerend gelabelde antilichamen worden bereid en vervolgens worden gemengd met in-house lipide-gebaseerde microbubbels, gevolgd door retroorbitale injectie in verdoofde muizen. Retroorbitale injectie is een alternatief voor staartaderinjectie waarvan we hebben vastgesteld dat het even effectief en eenvoudiger is om herhaaldelijk uit te voeren. Dit wordt onmiddellijk gevolgd door het aanbrengen van SUS op de hersenen. Om de therapeutische antilichaamopname te bepalen, worden muizen opgeofferd en wordt de verhoogde antilichaamconcentratie in de hersenen vervolgens gekwantificeerd. Als proxy van de verandering in de homeostase van de hersenen wordt microgliale fagocytische activiteit bepaald door histologie en volumetrische 3D-reconstructie.
De gegenereerde gegevens suggereren dat ultrasone toediening van antilichamen een potentieel aantrekkelijke benadering is om neurodegeneratieve ziekten te behandelen. Het protocol kan op dezelfde manier worden toegepast op andere kandidaat-geneesmiddelen, evenals modelladingen zoals fluorescerend gelabelde dextrans van gedefinieerde afmetingen14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de dierethiekcommissie van de Universiteit van Queensland.
1. In-house microbubbelbereiding
- Weeg een molaire verhouding van 9:1 af van 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholine en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[amino(polyethyleenglycol)-2000] (ammoniumzout). 0,5 mg lipidenmengsel is vereist per 1 ml microbubbeloplossing. Als alternatief kunnen lipiden al in chloroform worden gekocht, als u voorgeïsoleerde lipiden gebruikt, gaat u verder met stap 1.3.
- Los het lipide op in een klein volume chloroform in een glazen bekerglas.
- Verdamp de chloroform met een verdamper of een stikstofstroom.
- Rehydrateer de gedroogde lipidenfilm met 10 ml PBS + 10% glycerol + 10% propyleenglycoloplossing die is gefilterd door een filter van 0,22 μm.
- Plaats de gerehydrateerde lipide-oplossing in een waterbad sonicator ingesteld op 55 °C (boven de smelttemperatuur van de lipiden) en soniceer totdat deze volledig is opgelost.
- Aliquot lipide-oplossing in geautoclaveerde 1,5 ml HPLC-injectieflacons en schroef de septa-doppen vast.
- Zuig alle lucht in de injectieflacon op met een spuit van 5 ml uitgerust met een naald van 27 G en creëer een vacuüm in de injectieflacon.
- Voeg octofluorpropaan toe aan de injectieflacon met de meegeleverde spuit en zuig het gas uit de bus op. Vul de injectieflacon met 1-2 ml octafluorpropaan door het volume in de spuit af te lezen.
- Sluit elke injectieflacon af met paraffinefilm en koel.
- Breng de injectieflacon op de dag van het experiment op kamertemperatuur, voeg 0,5 ml 0,9% NaCl-oplossing toe aan de injectieflacon, plaats de injectieflacon in een amalgamator en roer gedurende 45 s (vooraf ingestelde tijd) om de microbubbels te produceren.
2. Microbubble kwaliteitscontrole met behulp van een coulter counter
- Haal de microbubbeloplossing uit de amalgamator en ontlucht het gas uit de injectieflacon door de septa te doorboren met een naald van 19 G.
- Verdun de microbubbeloplossing door tweestaps 1:5.000 seriële verdunningen uit te voeren door 100 μL microbubbeloplossing toe te voegen aan 5 ml gefilterde stroomoplossing met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 19 G, en vervolgens 100 μL 1:50 verdunde microbubbeloplossing te nemen en met een pipet in een cuvette te pipetteren in 10 ml gefilterde stroomoplossing.
- Controleer of de elektrolyttank voldoende stroomoplossing heeft en of de afvaltank leeg is.
- Plaats de cuvette in het coulter counter platform en vergrendel deze op zijn plaats. Gebruik een diafragma van 30 μm voor monsterverwerving.
- Laad in de software de standaardwerkmethode (SOM) en selecteer vervolgens SOM bewerken | concentratie. Voer 5000x verdunning in.
- Kies in de software een geschikte bestandsnaam. Bijvoorbeeld microbubble_1_date.
- Laad en bevestig de cuvette in het platform.
- Selecteer in de software Uitvoeren| Bekijk een voorbeeld en controleer of de monsterconcentratie lager is dan 10%. Als dit aantal hoger is dan 10%, voer dan een nieuwe verdunning van de microbubbels uit met een hogere verdunningsfactor.
- Selecteer 'Start' om te beginnen met het verkrijgen van het monster om de eerste uitlezing te verkrijgen.
- Spoel de opening van de Coulter-teller na elke meting af met een gefilterde stromingsoplossing. Herhaal stap 2.2-2.9 om 3 herhalingen te verkrijgen.
- Plaats een cuvette met verdunde microbubbeloplossing in een sonicatorwaterbad en soniceer gedurende 30 s.
- Meet de oplossing met gesonificeerde microbubbels en label als blanco.
- Trek in de software de uiteindelijke uitlezing af van de eerste uitlezing. Dit trekt alle deeltjes af die geen microbubbels zijn en geen gas bevatten.
- Selecteer Resultaten weergeven in de software om de microbubbelconcentratie, grootteverdeling, gemiddelde grootte en volumeconcentratie weer te geven.
3. Fluorescerende antilichaametikettering
- Verkrijg een 1 mg/ml oplossing van muis IgG in PBS zonder toevoegingen.
- Label 1 mg muis-IgG met AlexaFluor 647 in 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer door de instructies van de fabrikant in de kit te volgen. Deze hoeveelheid fluorescerend gelabeld IgG is voldoende om deze procedure uit te voeren bij 5-7 volwassen muizen waarbij een dosis antilichaam van 5 mg/ kg wordt toegediend.
- Voeg de kleurstof toe aan de oplossing van IgG in 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuiver het fluorescerend gelabelde antilichaam door de antilichaamoplossing in een spinkolom te pipetteren en gedurende 5 minuten bij 1.000 x g te centrifugeren. Vrije kleurstof blijft in het kolombed.
- Gebruik een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten. Meet de absorptie van de geconjugeerde oplossing bij 280 nm en 650 nm (A280 en A650). Bereken de concentratie van eiwit in het monster met behulp van de vergelijking:
Eiwitconcentratie (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x verdunningsfactor / 203.000. - Gebruik een spectrofotometer om de mate van etikettering te berekenen met behulp van de vergelijking:
molkleurstof per mol eiwit = A650 x verdunningsfactor / 239 000 x eiwitconcentratie (M).
OPMERKING: Een aanvaardbare mate van etikettering is 3-7 mol kleurstof per mol eiwit en meestal verkregen mate van etikettering is ongeveer 6.
4. Ultrasone opstelling
- Voeg met behulp van het gerichte echografiesysteem de afstandhouder van 5 mm toe aan de waterbolus om de ultrasone focus 9 mm onder de bodem van de waterbolus te plaatsen.
- Vul de waterbolus met ongeveer 300 ml gedeïoniseerd water dat gedurende 20 minuten is ontgast met een inline ontgasser (het zuurstofgehalte moet lager zijn dan 3 ppm). Plaats de ringvormige array in de gevulde waterbolus en gebruik een tandheelkundige spiegel om te controleren of er geen luchtbellen op het oppervlak zijn. Indien aanwezig op het oppervlak, verwijder de ringvormige array en vervang deze in de waterbolus.
- Start de toepassingssoftware. Selecteer in het menu Golfvorm de optie Golfvormtaakcyclus instellen. Instellingen zijn PRF (Hz) 10, duty cycle 10%, focus 80 mm, center frequency 1 MHz, amplitude (MPa peak negative pressure) 0,65 MPa, mechanische index = 0,65. Druk op Set om de golfvorm te definiëren en op te slaan in het geheugen.
OPMERKING: Het gerichte echografiesysteem is vooraf gekalibreerd door de fabrikant op basis van metingen die zijn uitgevoerd door een gekalibreerde hydrofoon. - Definieer in de software van het gerichte echografiesysteem een behandelplan. Dit vereist het definiëren van een behandelingsgebied dat bestaat uit meerdere individuele behandelingsplaatsen en het definiëren van acties die op elk van die behandelingslocaties moeten worden ondernomen. In dit geval is de behandelingszone één hemisfeer van het muizenbrein.
- Ga in het bewegingscontrollervenster naar het tabblad Scannen en Voer de waarde start, stop en increment in voor beweging in de x-dimensie in en start, stop en verhoog de waarde voor beweging in de y-richting. Voer waarden in voor X: start -4, stop 3.50 en Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
- Definieer de acties voor behandelplaatsen. Selecteer in het venster van de bewegingscontroller de knop Gebeurtenis . Selecteer in het venster Scriptbewerking een lijst met acties die worden uitgevoerd in de volgorde die op elke behandelingslocatie is geselecteerd. Stel Bewegingstype in op rasterraster boven aan het scriptvenster. Selecteer op het tabblad Gebeurtenissen de optie Acties toevoegen om ze naar het scriptvenster te verplaatsen en voeg Synchroon verplaatsen, Trigger arb starten , wachten, Trigger arb stoppen toe. Klik op de wachtactie en selecteer een wachttijd van 6.000 ms.
OPMERKING: Deze instellingen maken van de behandeling een raster van 6 x 5 van behandelingsplekken op een afstand van 1,5 mm uit elkaar, waarbij elke plek een behandelingsduur van 6 s heeft. De totale duur om een muizenbrein te soniceren is ongeveer 3 minuten. Dit formaat behandelingsrooster is geschikt voor volwassen C57/Bl6 muizen met een gewicht van ongeveer 30 g. De grootte van het raster van behandelingsvlekken kan omhoog of omlaag worden aangepast, afhankelijk van de grootte van de muis.
5. Bereiding van dieren
- Weeg de muis met een balans tot op 0,1 g nauwkeurig.
- Verdoving muis met 90 mg/kg ketamine en 6 mg/kg xylazine intraperitoneaal. Test op afwezigheid van reflexen met een teenknelpunt. Als alternatief kunnen muizen worden verdoofd met isofluraan met behulp van een geschikt inhalatie-anesthesieapparaat met een geschikt gezichtsmasker. Bij gebruik van isofluraan moet de muis tijdens de echografie op een warmtekussen worden geplaatst om onderkoeling te voorkomen.
- Gebruik een elektrisch scheermes om het haar van het hoofd van het dier te scheren, breng vervolgens ontharingscrème aan met een wattenstaafje, laat het 2-3 minuten intrekken of totdat het haar is weggeveegd met een vochtig stuk gaas. Zorg ervoor dat de ontharingscrème niet in de ogen van de muis komt.
- Markeer het midden van het hoofd van de muis met een permanente markering. De transducer heeft een gat in het midden en de focus en brandpuntsplek van de transducer kunnen visueel worden uitgelijnd.
- Vul een kleine weegboot waarvan eerder de bodem is afgesneden en vervangen door plasticfolie die op de bodem van de weegboot is gelijmd met ultrasone gel. Dit dient als een afstandhouder van 8 mm en biedt een goede koppeling aan de kop van de muis en maakt visuele inspectie mogelijk van de focus van de transducer die is uitgelijnd met de kop van de muis.
6. Microbubbel bereiding
- Verwarm een injectieflacon met microbubbel tot kamertemperatuur. Om te activeren, voegt u 0,5 ml 0,9% NaCl-oplossing toe aan de injectieflacon en plaatst u deze in een amalgamator om gedurende 45 s te roeren om de microbubbels te produceren.
- Ontlucht de injectieflacon door de septa te doorboren met een naald van 27 G.
7. Echografie behandeling
- Keer de injectieflacon met microbubbels om en zuig voorzichtig 1 μL/g lichaamsgewicht van de oplossing op. Voeg hieraan oplossing van fluorescerend gelabeld antilichaam toe en meng voorzichtig in de spuit. Het maximale geïnjecteerde volume is 150 μL.
OPMERKING: In-house bereide microbubbels zijn ongeveer 60 keer minder geconcentreerd dan de klinisch gebruikte (bijv. Definity microbubbels). Pas het volume of de concentratie zodanig aan dat het aantal geïnjecteerde microbubbels vergelijkbaar is met die welke klinisch worden gebruikt (dwz. Definiteit 1,2 x 108 microbubbels/kg lichaamsgewicht). - Injecteer de microbubbel- en antilichaamoplossing retroorbitaal en zorg ervoor dat u voorzichtig en langzaam injecteert. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan op de ogen van de muis.
- Plaats de muis in de kophouder (zie Materialentabel) en bevestig de neus van de muis. Plaats vervolgens de met ultrasone gel gevulde kleine weegboot bovenop het hoofd.
- Laat de waterbolus zakken totdat deze bovenop de ultrasone gel in de weegboot zit.
- Gebruik de joystick om de focus van de transducer naar het midden van het hoofd te verplaatsen. Selecteer Origin opnieuw instellen op het tabblad Beweging.
- Selecteer volledige scan. Stap 7.3-7.6 duurt 2 minuten.
- Stel voor consistentie een timer in om een vertraging van 2 minuten te garanderen tussen het injecteren van microbubbels en het selecteren van de volledige scan.
- Nadat de behandeling is voltooid, brengt u oogheelkundige zalf aan op de ogen en plaatst u de muis in een verwarmde herstelkamer. Als onderkoeling wordt waargenomen tijdens de procedure, kan een verwarmingskussen onder de muis worden geplaatst om tijdens de procedure extra warmte te leveren.
8. Weefseloogst en -verwerking
- Op het moment van interesse na echografie (ten minste 1 uur om hoge niveaus van antilichamen in de hersenen te detecteren) verdoven de muis diep met een overdosis Pentobarbitone-oplossing (100 mg / kg) en transcardiaal perfuseren de muis met 30 ml PBS. Een goede perfusie is nodig om specifiek fluorescerend gelabelde antilichamen te detecteren die aan de hersenen zijn afgegeven.
- Verzamel de hersenen en fixeer door onderdompeling in 4% PFA gedurende 24 uur bij 4 °C en was vervolgens met PBS.
- Stel de hersenen in een infraroodscanner in beeld door de hersenen op de lade te plaatsen en door een beeld te krijgen in het 700 nm-kanaal.
OPMERKING: Na fixatie worden de hersenen uit de PFA verwijderd, gewassen in PBS en gesneden. Als alternatief kan het gedurende 24 uur bij 4 °C of tot onderdompeling in ethyleenglycol cryoprotectantoplossing worden geplaatst en vervolgens worden verplaatst naar een nieuwe cryoprotectant bevattende injectieflacon en bij -20 °C worden geplaatst voor langdurige opslag. - Sectie de hersenkoude in PBS met behulp van een vibratome. Lijm de hersenen op het platform en snijd 30-40 μm secties en verzamel in PBS.
OPMERKING: Lysosomale autofluorescentie (veel voorkomend in secties van dieren ouder dan ongeveer 12 maanden) moet worden gebleekt door nachtelijke verlichting van de secties in een lichtkamerdoos, bij kamertemperatuur en in PBS met azide (0,02%) om bacteriegroei te blokkeren.
9. Weefselkleuring en beeldverwerving
- Breng secties over naar een blokkerende oplossing (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en was vervolgens de secties 3x door de oplossing te vervangen door 0,2% Triton/PBS.
- Incubeer secties bij 4 °C 's nachts met de primaire antilichamen tegen Iba1 (verdunning 1:1.000) en CD68 (verdunning 1:500), in 0,2% Triton/PBS, gevolgd door 3x wasbeurten met 0,2% Triton/PBS.
- Incubeer secties gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met fluorescerende secundaire antilichamen (verdunning 1:500), gevolgd door 3x wasbeurten met alleen 0,2% Triton/PBS.
OPMERKING: De kernen kunnen ook worden gekleurd met BEHULP VAN DAPI-oplossing (0,5 μg / ml). - Breng de secties over naar een schuif- en afdekplaat met hard ingestelde montagemedia. Geef het montagemedium voldoende tijd om te stollen voordat u ('s nachts) visualisatie en beeldacquisitie maakt.
- Met een confocale microscoop verkrijgen z-stack beelden (ten minste 10 μm diepte en 0,3 μm stapgrootte, 10 beelden per dier) van het ultrasone gerichte hersengebied met behulp van een confocale microscoop en een objectief van ten minste 40x vergroting.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u beelden binnen het signaaldynamische bereik maakt en vermijd onder- / overbelichting. Sla de afbeeldingsbestanden op in het bijbehorende softwareformaat dat door de microscoop wordt gebruikt.
10. Beeldanalyse
- Converteer de z-stack microscopiebestanden met behulp van de bestandsimporteur van de software voor beeldanalyse.
- Open de geconverteerde bestanden in de software en pas de intensiteit van het Iba1-kanaal aan om microgliale cellen te observeren.
- Snijd een enkele microgliale cel bij door er een vak omheen te tekenen, selecteer 'bijsnijden' en sla het nieuwe bestand op.
- Bouw de 3D-oppervlakteweergave van het IBA1-signaal door:
- Open het imaris-bestand met één cel dat in de vorige stap is gegenereerd.
- Voeg een oppervlak toe aan het bestand.
- Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de Iba1-kleuring.
- Breng een drempel aan die de Iba1-kleuring moet overlappen
- Selecteer alleen de structuur van belang die de microgliale cel van belang vormt
- Het proces afronden
- Verkrijg en registreer het volume van de Iba1-kleuring
- Bouw de 3D-oppervlakteweergave van de CD68-kleuring
- Maskeer in het subbestand van het IBA1-oppervlak het CD68-kanaal en verwijder de voxels buiten de IBA1-kleuring
- Een nieuw oppervlak aan het bestand toevoegen
- Selecteer het kanaal dat overeenkomt met de CD68-kleuring
- Breng een drempel aan die de CD68-kleuring moet overlappen en zo goed mogelijk overeenkomt met de kleuringsvolumes
- Voltooi het proces, omdat alleen de intra-microgliale CD68-structuren in dit bestand aanwezig zijn en ze dus geen nieuwe drempelfilterstap vereisen
- Verkrijg en registreer het aantal en het gemiddelde volume van de CD68 positieve structuren
- Bereken het relatieve volume van CD68-structuren volgens de overeenkomstige IBA1-structuren als een maat voor microgliale activering in een fagocytische toestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol worden fluorescerend gelabelde antilichamen aan de hersenen afgegeven en kunnen ze worden gedetecteerd, samen met microglia-activering. De conclusie die kan worden getrokken, is dat het gebruik van gerichte echografie en microbubbels de opname van antilichamen in de hersenen aanzienlijk verbetert en antilichamen kan leveren aan de hele hersenen of hemisfeer van een muis bij gebruik in een scanmodus. Figuur 1 toont het TIPS-apparaat voor echografie (verschillende componenten gelabeld) dat wordt gebruikt om de BBB te openen. Figuur 2 toont de representatieve resultaten van Coulter-tegenmetingen van grootte en concentratie die moeten worden verkregen wanneer de microbubbels correct worden geproduceerd. Om de bevalling gemakkelijk te visualiseren, werden de antilichamen gelabeld met een verrode fluorescerende kleurstof. De opname van antilichamen door de hersenen kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in hele hersenen of secties met behulp van een infraroodscanner of met behulp van fluorescerende microscopie op hersensecties. Hersensecties tonen de locatie van het fluorescerend gelabelde antilichaam op microscopisch niveau. Representatieve resultaten voor het scannen van echografie aan de hippocampus van fluorescerend gelabeld anti-tau-antilichaam RN2N zijn weergegeven in figuur 3. Om elke verandering van normale hersenhomeostase als gevolg van SUS en antilichaamafgifte te observeren, was één uitlezing de microgliale lysosomale inhoud in relatie tot fagocytose. Figuur 4 toont representatieve kleuring voor microglia met behulp van Iba1 en de microgliale lysosoomspecifieke marker CD68 om te bepalen of microglia fagocytischer worden na de toediening van het antilichaam.
Figuur 1: Het gerichte echografiesysteem dat wordt gebruikt voor het afleveren van echografie waarbij kritieke componenten worden gelabeld. (A) De zelfgemaakte gelhouder dient als afstandhouder van 8 mm. (B) Bekijk door de transducer en laat zien hoe het doel visueel is uitgelijnd met de focus (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kwaliteitscontrolemetingen van in eigen huis bereide microbubbels. (A) Coultertellerapparatuur die wordt gebruikt voor het verkrijgen van samenvattende statistieken (B) en grootteverdeling van microbubbels in aantal (C) en volumeverdeling (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Afgifte van fluorescerend gelabeld antilichaam in de hersenen met behulp van SUS. (A) Een fluorescerend gelabeld antilichaamfragment specifiek voor een tau-isovorm die op zichzelf wordt afgeleverd, SUS op zichzelf, en een combinatiebehandeling onthulden een verhoogde opname van het antilichaam door een gesoniseerd halfrond in combinatie met SUS met behulp van nabij-infrarood fluorescerende beeldvorming van één hersenhelft. Een look-up-table (LUT) werd toegepast, met een hogere fluorescentie-intensiteit in willekeurige eenheden weergegeven in warmere kleuren. (B) Kwantificering van fluorescentie werd gedaan zonder de SUS-only controleniveaus van achtergrondfluorescentie af te trekken. Gemiddelde ± SEM weergegeven. (C) Verhoogde opname van het fluorescerend gelabelde antilichaam door hippocampale neuronen getoond in lage en hoge vergrotingsbeelden van hersensecties. Bij de combinatiebehandeling distribueert het antilichaam zich in cellichamen en zelfs dendrieten zoals aangetoond voor hippocampale neuronen. Blauw=DAPI, magenta=antilichaam fragment. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve immunofluorescentie-etikettering voor microglia, die de verwachte morfologie van microglia toont en in 3D wordt weergegeven met de beeldanalysesoftware. Microglia morfologie wordt waargenomen in groen en niveaus en distributie van CD68 wordt waargenomen in rood. Schaalbalk 10 μm. Groen=Iba1, rood=CD68. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorescerend gelabelde antilichamen kunnen aan de hersenen worden geleverd met behulp van gerichte echografie samen met microbubbels die in een scanmodus worden toegepast. Antilichaamafgifte, microgliale morfologie en lysosomale vergroting kunnen worden gedetecteerd door fluorescentiemicroscopie na scanning echografie. Microglia kunnen in hun lysosomen antilichamen en antigenen opnemen waaraan de antilichamen zich hebben gebonden in een Fc-receptor-gemedieerd proces4.
Er zijn een aantal kritieke stappen om herhaalbare BBB-opening en antilichaamafgifte te bereiken met behulp van deze methode. Het is van cruciaal belang om te zorgen voor een goede koppeling tussen de ultrasone transducer en de kop van de muis. Verwijder al het haar op de kop van de muis en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de koppeling zitten. De kenmerken van de in-house bereide microbubbels zijn van cruciaal belang voor succes. Microbubbels moeten een voldoende concentratie van 108 microbubbels/ml hebben en een zodanige grootteverdeling dat meer dan 90% van de microbubbels minder dan 10 μm in diameter is. Dit komt omdat van grotere microbubbels bekend is dat ze door de longen uit de bloedsomloop worden gefilterd. Een acceptabele mediane grootte ligt tussen 1 -3 μm. Microbubbels moeten voorzichtig worden behandeld en geïnjecteerd om te voorkomen dat ze in de spuit worden vernietigd. Het is belangrijk dat de echografie uiterlijk 2 minuten na de injectie van de microbubbels wordt aangebracht, wat met oefening kan worden bereikt. Targeting van een hele hersenen of hele hemisfeer wordt gemakkelijk bereikt met de SUS-benadering en nauwkeurigheid van targeting is waarschijnlijk geen probleem bij het targeten van grote regio's. Een kleiner hersengebied zoals de hippocampus of het striatum kan ook met succes worden gericht, maar in dit geval is het belangrijk dat de focus het beoogde gebied overlapt. De hoogte van een muizenbrein is vergelijkbaar met de axiale lengte van de gerichte ultrasone straal op 1 MHz met behulp van een typische ultrasone transducer, zodat de transducer alleen in de x- en y-dimensie hoeft te worden verplaatst en niet in de z-dimensie. Dit kan worden bepaald door de kennis van stereotaxische coördinaten voor een bepaalde hersenstructuur en door het bekijken van de lambdoïde en sagittale hechtingen door de ontharen huid van de muis.
Hier demonstreren we een techniek die retroorbitale injecties gebruikt om microbubbels en antilichamen af te leveren. Een alternatief voor retroorbitale injecties zijn staartaderinjecties, wat ook een effectieve techniek is om microbubbels en antilichamen af te leveren. Het voordeel van retroorbitale injectie is dat het technisch minder uitdagend is dan staartaderinjecties en meerdere keren kan worden herhaald (afwisselend oog van injectie) met een zeer minimaal risico op weefselbeschadiging.
Als er geen fluorescerend gelabeld antilichaam in de hersenen wordt gedetecteerd, is het waarschijnlijk dat de BBB niet is geopend. Het oplossen van problemen moet gericht zijn op het verkrijgen van een geconcentreerde microbubbeloplossing en het injecteren ervan om de microbubbels niet te vernietigen en de echografie binnen twee minuten na de injectietijd af te geven. Als er geen BBB-opening optreedt, kan de pieknegatieve drukinstelling worden verhoogd, met de kanttekening dat hogere pieknegatieve drukken de kans op het veroorzaken van microhemorrhages vergroten die we niet detecteren bij een pieknegatieve drukinstelling van 0,65 MPa met behulp van de beschreven instellingen. Afhankelijk van de antigeenspecificiteit van het antilichaam zal het kleuringspatroon anders zijn. Het kleuringspatroon dat wordt verkregen bij het injecteren van een anti-tau-antilichaam is weergegeven in figuur 2.
Deze techniek kan worden toegepast op een reeks antilichamen en zolang consistente BBB-opening wordt verkregen, kan de binding van het antilichaam aan een doelwit in de hersenen worden beoordeeld. De scanning ultrasone benadering bereikt de opening van de BBB over een heel muizenbrein op een reproduceerbare manier.
Een beperking van deze techniek is dat het voorkomen en de omvang van de BBB-opening niet wordt waargenomen terwijl de muis leeft. Deze beperking kan worden ondervangen door MRI-beeldvorming met gadoliniumcontrastmiddel bij de procedure op te nemen, maar dit verhoogt de tijd en kosten van de procedure aanzienlijk.
Hier wordt een enkele ultrasoonapparaat en enkele toediening van antilichaamprotocol beschreven dat kan worden gebruikt om te bepalen hoeveel verhoogde opname van antilichamen kan worden bereikt, evenals waar ze zich na de bevalling in de hersenen bevinden. Het protocol kan ook worden gebruikt in een longitudinaal onderzoek om de therapeutische effecten van antilichaamafgifte te beoordelen. In een behandelingsstudie kan het protocol worden herhaald met een interbehandelingsinterval van een week of langer om het therapeutisch potentieel van een antilichaam dat aan de hersenen wordt toegediend te evalueren. Het therapeutisch potentieel van het antilichaam dat door echografie wordt geleverd, kan worden beoordeeld in transgene muismodellen van neurodegeneratieve ziekten. Uitlezingen van therapeutisch effect kunnen gedragstests en histologie en biochemie omvatten voor de niveaus van pathologische eiwitten zoals tau, amyloïde-β of synucleïne.
Tot slot hebben we een methode geschetst om de bloed-hersenbarrière bij muizen te openen om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren. Deze methode zal van belang zijn voor onderzoekers die therapeutische benaderingen voor neurodegeneratieve ziekten evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We erkennen de steun van dr. Clem Jones AO, de National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], de Metal Foundation en de staatsregering van Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M.
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
