Summary
Présenté ici est un protocole pour ouvrir transitoirement la barrière hémato-encéphalique (BHE) soit de manière focale, soit dans tout le cerveau d’une souris pour délivrer des anticorps marqués par fluorescence et activer la microglie. Une méthode permettant de détecter l’administration d’anticorps et l’activation de la microglie par histologie est également présentée.
Abstract
Seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés par le cerveau. L’échographie focalisée offre la possibilité d’augmenter l’absorption des anticorps et l’engagement par l’ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Dans notre laboratoire, nous développons des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives dans lesquelles un anticorps de différents formats est délivré à travers le BBB à l’aide de microbulles, en même temps que l’application d’ultrasons focalisés à travers le crâne ciblant plusieurs points, une approche que nous appelons échographie de balayage (SUS). Les effets mécaniques des microbulles et des ultrasons sur les vaisseaux sanguins augmentent le transport paracellulaire à travers la BHE en séparant transitoirement les jonctions serrées et améliorent la transcytose médiée par les vésicules, permettant aux anticorps et aux agents thérapeutiques de se croiser efficacement. De plus, l’échographie facilite également l’absorption des anticorps du cerveau interstitiel dans les cellules du cerveau telles que les neurones où l’anticorps se distribue dans tout le corps cellulaire et même dans les processus neurigineux. Dans nos études, des anticorps marqués par fluorescence sont préparés, mélangés à des microbulles à base de lipides préparées en interne et injectés à des souris immédiatement avant l’application du SUS sur le cerveau. L’augmentation de la concentration d’anticorps dans le cerveau est ensuite quantifiée. Pour tenir compte des altérations de l’homéostasie cérébrale normale, la phagocytose microgliale peut être utilisée comme marqueur cellulaire. Les données générées suggèrent que l’administration d’anticorps par ultrasons est une approche attrayante pour traiter les maladies neurodégénératives.
Introduction
L’échographie thérapeutique est une technologie émergente visant à traiter les maladies du cerveau de manière non invasive, en partie en facilitant l’accès des agents thérapeutiques au cerveau1,2,3. Comme seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés et retenus dans le cerveau4, les ultrasons thérapeutiques offrent la possibilité d’augmenter leur absorption et leur engagement cible5,6.
Dans notre laboratoire, nous développons des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives dans lesquelles un anticorps de différents formats est délivré à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) à l’aide de microbulles. Pour ce faire, l’échographie est appliquée à travers le crâne dans le cerveau à plusieurs endroits en utilisant un mode de balayage que nous appelons échographie de balayage (SUS)7. L’interaction mécanique entre l’énergie ultrasonore, les microbulles injectées par voie intraveineuse et la vascularisation cérébrale sépare transitoirement les jonctions serrées du BHE dans un volume de sonication donné, permettant aux anticorps et autres cargaisons, y compris les agents thérapeutiques, de traverser efficacement cette barrière7,8,9 . De plus, il a été démontré que les ultrasons facilitent l’absorption des anticorps du cerveau interstitiel dans les cellules du cerveau, telles que les neurones, où l’anticorps se distribue dans tout le corps cellulaire et même dans les processus neurigineux5,10.
La maladie d’Alzheimer est caractérisée par une pathologie β et tau amyloïde11, et une foule de modèles animaux sont disponibles pour disséquer les mécanismes pathogènes et valider les stratégies thérapeutiques. Une approche SUS, par laquelle l’échographie est appliquée de manière séquentielle sur l’ensemble du cerveau, lorsqu’elle est répétée au cours de plusieurs séances de traitement, peut réduire la pathologie de la plaque amyloïde dans le cerveau des souris mutantes de la protéine précurseur amyloïde β déposant l’amyloïde (APP) et activer la microglie qui absorbe l’amyloïde, conduisant à une amélioration de la fonction cognitive7. L’ouverture BBB avec ultrasons et microbulles réduit également la pathologie tau chez les souris transgéniques pR5, K3 et rTg4510 tau5,12,13. Il est important de noter que si les microglies éliminent les dépôts de protéines extracellulaires, l’un des mécanismes de clairance sous-jacents aux pathologies intraneuronales induites par le SUS est l’activation de l’autophagie neuronale12.
Ici, nous décrivons un processus expérimental, par lequel des anticorps marqués par fluorescence sont préparés, puis mélangés à des microbulles internes à base de lipides, suivis d’une injection rétroorbitaire dans des souris anesthésiées. L’injection rétroorbitaire est une alternative à l’injection de veine caudale qui, nous l’avons trouvée, est tout aussi efficace et plus simple à effectuer à plusieurs reprises. Ceci est immédiatement suivi par l’application de SUS au cerveau. Pour déterminer l’absorption d’anticorps thérapeutiques, les souris sont sacrifiées et l’augmentation de la concentration d’anticorps dans le cerveau est ensuite quantifiée. En tant que proxy du changement dans l’homéostasie cérébrale, l’activité phagocytaire microgliale est déterminée par l’histologie et la reconstruction 3D volumétrique.
Les données générées suggèrent que l’administration d’anticorps par échographie est une approche potentiellement attrayante pour traiter les maladies neurodégénératives. Le protocole peut être appliqué de la même manière à d’autres candidats médicaments, ainsi qu’à des cargaisons modèles telles que le dextrans marqué par fluorescence de tailles définies14.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Université du Queensland.
1. Préparation interne des microbulles
- Peser un rapport molaire de 9:1 de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine et de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000] (sel d’ammonium). 0,5 mg de mélange lipidique est nécessaire pour 1 mL de solution de microbulles. Alternativement, les lipides peuvent être achetés déjà dans le chloroforme, si vous utilisez des lipides pré-dissous, passez à l’étape 1.3.
- Dissoudre le lipide dans un petit volume de chloroforme dans un bécher en verre.
- Évaporer le chloroforme avec un évaporateur ou un flux d’azote.
- Réhydrater le film lipidique séché avec 10 mL de PBS + 10% de glycérol + 10% de solution de propylène glycol qui a été filtré à travers un filtre de 0,22 μm.
- Placer la solution lipidique réhydratée dans un sonicateur au bain-marie réglé à 55 °C (au-dessus de la température de fusion des lipides) et soniquer jusqu’à dissolution complète.
- Solution lipidique aliquote dans des flacons HPLC autoclavés de 1,5 mL et visser les capuchons septa.
- Aspirer tout l’air dans le flacon avec une seringue de 5 mL équipée d’une aiguille de 27 G et créer un vide dans le flacon.
- Ajouter l’octofluoropropane au flacon avec la seringue incluse, en aspirant le gaz de la cartouche. Remplissez le flacon avec 1-2 mL d’octafluoropropane en lisant le volume dans la seringue.
- Sceller chaque flacon avec un film de paraffine et réfrigérer.
- Le jour de l’expérience, amener le flacon à température ambiante, ajouter 0,5 mL de solution de NaCl à 0,9% au flacon, puis placer le flacon dans un amalgamateur et agiter pendant 45 s (temps prédéfini) pour produire les microbulles.
2. Contrôle de la qualité des microbulles à l’aide d’un compteur de coulter
- Retirez la solution de microbulles de l’amalgamateur et évacuez le gaz du flacon en perçant les septa avec une aiguille de 19 G.
- Diluer la solution de microbulles en effectuant des dilutions en série en deux étapes 1:5 000 en ajoutant 100 μL de solution de microbulles dans 5 mL de solution à écoulement filtré à l’aide d’une seringue de 1 ml avec aiguille de 19 G, puis en prenant 100 μL de solution de microbulles diluées 1:50 et en pipetant dans une solution à écoulement filtré de 10 mL dans une cuvette à l’aide d’une pipette.
- Vérifiez que le réservoir d’électrolyte a une solution d’écoulement suffisante et que le réservoir de déchets est vide.
- Placez la cuvette dans la plate-forme du comptoir coulter et verrouillez-la en place. Utilisez une ouverture de 30 μm pour l’acquisition d’échantillons.
- Dans le logiciel, chargez le mode d’exploitation standard (SOM), puis sélectionnez Modifier la concentration de | SOM. Entrez la dilution 5000x.
- Dans le logiciel, choisissez un nom de fichier approprié. Par exemple, microbubble_1_date.
- Chargez et fixez la cuvette dans la plate-forme.
- Dans le logiciel, sélectionnez Exécuter| Prévisualisez et vérifiez que la concentration de l’échantillon est inférieure à 10 %. Si ce nombre est supérieur à 10%, effectuez une nouvelle dilution des microbulles avec un facteur de dilution plus élevé.
- Sélectionnez « Démarrer » pour commencer l’acquisition de l’échantillon afin d’obtenir la lecture initiale.
- Rincez l’ouverture du compteur Coulter avec une solution d’écoulement filtrée après chaque mesure. Répétez les étapes 2.2 à 2.9 pour obtenir 3 réplications.
- Placer une cuvette avec une solution de microbulles diluées dans un bain-marie sonique et sonicate pendant 30 s.
- Mesurez la solution avec des microbulles soniquées et étiquetez-la comme étant vierge.
- Dans le logiciel, soustrayez la lecture finale de la lecture initiale. Cela soustrait toutes les particules qui ne sont pas des microbulles et ne contiennent pas de gaz.
- Sélectionnez Afficher les résultats dans le logiciel pour afficher la concentration en microbulles, la distribution de taille, la taille moyenne et la concentration en volume.
3. Marquage des anticorps fluorescents
- Obtenir une solution de 1 mg/mL d’IgG de souris dans le PBS sans aucun additif.
- Étiqueter 1 mg d’IgG de souris avec AlexaFluor 647 dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 M en suivant les instructions du fabricant situées dans le kit. Cette quantité d’IgG marquées par fluorescence est suffisante pour effectuer cette procédure sur 5 à 7 souris adultes où une dose de 5 mg / kg d’anticorps est administrée.
- Ajouter le colorant à la solution d’IgG dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 M et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Purifier l’anticorps marqué par fluorescence en pipetant la solution d’anticorps dans une colonne de spin et en centrifugant à 1 000 x g pendant 5 min. Le colorant libre restera dans le lit de la colonne.
- Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration en protéines. Mesurer l’absorbance de la solution conjuguée à 280 nm et 650 nm (A280 et A650). Calculer la concentration de protéines dans l’échantillon à l’aide de l’équation :
Concentration en protéines (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x facteur de dilution / 203 000. - Utilisez un spectrophotomètre pour calculer le degré d’étiquetage à l’aide de l’équation :
colorant moles par protéine mole = A650 x facteur de dilution / 239 000 x concentration en protéines (M).
REMARQUE: Un degré acceptable d’étiquetage est de 3 à 7 moles de colorant par protéine de mole et le degré d’étiquetage généralement obtenu est d’environ 6.
4. Configuration de l’échographie
- À l’aide du système à ultrasons focalisés, ajoutez l’espaceur de 5 mm au bol d’eau pour positionner le foyer à ultrasons à 9 mm sous le fond du bol d’eau.
- Remplissez le bol d’eau avec environ 300 mL d’eau désionisée qui a été dégazée avec un dégazeur en ligne pendant 20 min (la teneur en oxygène doit être inférieure à 3 ppm). Placez le réseau annulaire dans le bolus d’eau rempli et utilisez un miroir dentaire pour vérifier qu’il n’y a pas de bulles d’air à la surface. S’il est présent à la surface, retirez le réseau annulaire et remplacez-le dans le bolus d’eau.
- Lancez le logiciel d’application. Dans le menu Forme d’onde, sélectionnez Définir le rapport cyclique de la forme d’onde. Les réglages sont PRF (Hz) 10, rapport cyclique 10%, mise au point 80 mm, fréquence centrale 1 MHz, amplitude (pression négative de crête MPa) 0,65 MPa, indice mécanique = 0,65. Appuyez sur Définir pour définir la forme d’onde et la stocker en mémoire.
REMARQUE: Le système à ultrasons focalisés est pré-étalonné par le fabricant à partir de mesures prises par un hydrophone étalonné. - Dans le logiciel du système d’échographie focalisée, définissez un plan de traitement. Cela nécessite de définir une région de traitement composée de plusieurs sites de traitement individuels et de définir les mesures à prendre dans chacun de ces sites de traitement. Dans ce cas, la zone de traitement est un hémisphère du cerveau de la souris.
- Dans la fenêtre du contrôleur de mouvement, accédez à l’onglet Numérisation et entrez la valeur de début, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la dimension x, et la valeur de démarrage, d’arrêt et d’incrément pour le mouvement dans la direction y. Entrez les valeurs pour X: start -4, stop 3.50 et Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
- Définir les actions pour les sites de traitement. Dans la fenêtre du contrôleur de mouvement, sélectionnez le bouton Événement . Dans la fenêtre d’édition de script, sélectionnez une liste d’actions qui seront exécutées dans l’ordre sélectionné sur chaque site de traitement. Définissez Type de mouvement sur Grille raster en haut de la fenêtre de script. Dans l’onglet Événements, sélectionnez Ajouter des actions pour les déplacer vers le panneau de script, puis ajoutez Déplacer de manière synchrone, Démarrer le déclencheur arb, Attendre, Arrêter le déclencheur arb. Cliquez sur l’action d’attente et sélectionnez un temps d’attente de 6 000 ms.
REMARQUE: Ces réglages feront du traitement une grille de 6 x 5 points de traitement espacés de 1,5 mm, chaque point ayant une durée de traitement de 6 s. La durée totale pour soniquer le cerveau d’une souris est d’environ 3 min. Cette grille de traitement de taille convient aux souris adultes C57/Bl6 pesant environ 30 g. La taille de la grille de points de traitement peut être ajustée vers le haut ou vers le bas en fonction de la taille de la souris.
5. Préparation des animaux
- Pesez la souris avec une balance précise à 0,1 g.
- Anesthésier la souris avec 90 mg/kg de kétamine et 6 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale. Testez l’absence de réflexes avec un pincement des orteils. Alternativement, les souris peuvent être anesthésiées avec de l’isoflurane à l’aide d’un appareil anesthésique par inhalation approprié avec un masque facial approprié. Si vous utilisez de l’isoflurane, la souris doit être placée sur un coussin chauffant pendant l’échographie pour prévenir l’hypothermie.
- Utilisez un rasoir électrique pour raser les poils de la tête de l’animal, puis appliquez une crème dépilatoire avec un coton-tige, laissez agir pendant 2-3 minutes ou jusqu’à ce que les poils soient nettoyés avec un morceau de gaze humide. Veillez à ce que la crème dépilatoire ne pénètre pas dans les yeux de la souris.
- Marquez le centre de la tête de la souris avec un marqueur permanent. Le transducteur a un trou en son centre et la mise au point et le point focal du transducteur peuvent être alignés visuellement.
- Remplissez un petit bateau de pesage dont le fond a déjà été coupé et remplacé par une pellicule de plastique collée au fond du bateau de pesée avec du gel à ultrasons. Cela sert d’entretoise de 8 mm et fournit un bon couplage à la tête de la souris et permet une inspection visuelle de la mise au point du transducteur aligné avec la tête de la souris.
6. Préparation des microbulles
- Réchauffer un flacon de microbulle à température ambiante. Pour activer, ajouter 0,5 mL de solution de NaCl à 0,9% au flacon et placer dans un amalgamateur pour agiter pendant 45 s pour produire les microbulles.
- Ventilez le flacon en perçant les septa avec une aiguille de 27 G.
7. Traitement par ultrasons
- Inverser le flacon de microbulles et aspirer doucement 1 μL/g de poids corporel de la solution. À cela, ajoutez une solution d’anticorps marqués par fluorescence et mélangez doucement dans la seringue. Le volume maximal injecté est de 150 μL.
REMARQUE : Les microbulles préparées à l’interne sont environ 60 fois moins concentrées que les microbulles utilisées cliniquement (p. ex., les microbulles Definity). Ajuster le volume ou la concentration de manière à ce que le nombre de microbulles injectées soit similaire à celui utilisé cliniquement (c.-à-d. Définition 1,2 x 108 microbulles/kg de poids corporel). - Injecter la solution de microbulles et d’anticorps rétroorbitalement, en prenant soin d’injecter doucement et lentement. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
- Placez la souris dans le porte-tête (voir Tableau des matériaux) et fixez le nez de la souris. Ensuite, placez le petit bateau de pesage rempli de gel à ultrasons sur le dessus de la tête.
- Abaissez le bolus d’eau jusqu’à ce qu’il repose sur le gel à ultrasons dans le bateau de pesée.
- Utilisez le joystick pour déplacer la mise au point du transducteur vers le centre de la tête. Sélectionnez Réinitialiser l’origine dans l’onglet Mouvement.
- Sélectionnez Terminer l’analyse. Les étapes 7.3 à 7.6 prendront 2 min.
- Pour plus de cohérence, réglez une minuterie pour assurer un délai de 2 minutes entre l’injection de microbulles et la sélection du scan complet.
- Une fois le traitement terminé, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux et placez la souris dans une chambre de récupération chauffée. Si une hypothermie est observée pendant la procédure, un coussin chauffant peut être placé sous la souris pour fournir une chaleur supplémentaire pendant la procédure.
8. Prélèvement et transformation des tissus
- Au moment de l’intérêt après l’accouchement par échographie (au moins 1 h pour détecter des niveaux élevés d’anticorps dans le cerveau), anesthésier en profondeur la souris avec un surdosage de solution de pentobarbitone (100 mg / kg) et perfuser la souris avec 30 mL de PBS. Une bonne perfusion est nécessaire pour détecter spécifiquement les anticorps marqués par fluorescence qui ont été délivrés au cerveau.
- Recueillir le cerveau et fixer par immersion dans 4% de PFA pendant 24 h à 4 °C, puis laver avec du PBS.
- Imagez le cerveau dans un scanner infrarouge en plaçant le cerveau sur le plateau et en acquérant une image dans le canal 700 nm.
REMARQUE: Après la fixation, le cerveau est retiré du PFA, lavé dans pbS et sectionné. Alternativement, il peut être placé dans une solution cryoprotectrice d’éthylène glycol pendant 24 h à 4 °C ou jusqu’à ce qu’il soit immergé, puis déplacé vers un nouveau flacon contenant un cryoprotecteur et placé à -20 °C pour un stockage à long terme. - Coupez le rhume cérébral dans PBS à l’aide d’un vibratome. Collez le cerveau à la plate-forme et coupez des sections de 30 à 40 μm et collectez-les dans PBS.
REMARQUE: L’autofluorescence lysosomale (répandue dans les sections d’animaux âgés de plus de 12 mois environ) doit être blanchie par un éclairage nocturne des sections dans une boîte à chambre à lumière, à température ambiante et dans du PBS contenant de l’azoture (0,02%) pour bloquer la croissance bactérienne.
9. Coloration tissulaire et acquisition d’images
- Transférer les sections dans la solution bloquante (5% de BSA dans 0,2% de Triton/PBS) pendant 2 h à température ambiante, puis laver les sections 3x en remplaçant la solution par 0,2% de Triton/PBS.
- Incuber des coupes à 4 °C pendant la nuit avec les anticorps primaires contre Iba1 (dilution 1:1 000) et CD68 (dilution 1:500), dans 0,2 % Triton/PBS, suivies de 3x lavages avec 0,2 % Triton/PBS.
- Incuber des sections pendant 2 h à température ambiante avec des anticorps secondaires fluorescents (dilution 1:500), suivies de 3x lavages avec 0,2% de Triton/PBS uniquement.
REMARQUE: Les noyaux peuvent également être colorés à l’aide d’une solution de DAPI (0,5 μg / mL). - Transférez les sections sur une glissière et un couvercle avec un support de montage rigide. Prévoyez suffisamment de temps pour que le support de montage se solidifie avant la visualisation et l’acquisition d’images (pendant la nuit).
- Avec un microscope confocal, obtenez des images z-stack (au moins 10 μm de profondeur et 0,3 μm de taille de pas, 10 images par animal) de la zone cérébrale ciblée par ultrasons à l’aide d’un microscope confocal et d’un objectif d’un grossissement d’au moins 40x.
REMARQUE: Veillez à acquérir des images dans la plage dynamique du signal, en évitant la sous-exposition / surexposition. Enregistrez les fichiers image dans le format logiciel correspondant utilisé par le microscope.
10. Analyse d’images
- Convertissez les fichiers de microscopie z-stack à l’aide de l’importateur de fichiers du logiciel d’analyse d’images.
- Ouvrez les fichiers convertis dans le logiciel et ajustez l’intensité du canal Iba1 pour observer les cellules microgliales.
- Recadrez une seule cellule microgliale en dessinant une boîte autour d’elle, sélectionnez 'recadrer' et enregistrez le nouveau fichier.
- Construisez le rendu de surface 3D du signal IBA1 en :
- Ouvrez le fichier Imaris à cellule unique généré à l’étape précédente.
- Ajoutez une surface au fichier.
- Sélectionnez le canal correspondant à la coloration Iba1.
- Appliquer un seuil qui devrait chevaucher la coloration Iba1
- Sélectionnez uniquement la structure d’intérêt qui forme la cellule microgliale d’intérêt
- Finaliser le processus
- Obtenir et enregistrer le volume de la coloration Iba1
- Construire le rendu de surface 3D de la coloration CD68
- À l’intérieur du sous-fichier de surface IBA1, masquez le canal CD68 et retirez les voxels à l’extérieur de la coloration IBA1
- Ajouter une nouvelle surface au fichier
- Sélectionnez le canal correspondant à la coloration CD68
- Appliquer un seuil qui doit chevaucher la coloration CD68 et qui correspond le plus possible aux volumes de coloration
- Finaliser le processus, car seules les structures cd68 intra-microgliales seront présentes dans ce fichier et, par conséquent, elles ne nécessitent pas une autre étape de filtrage de seuil
- Obtenir et enregistrer le nombre et le volume moyen des structures positives CD68
- Calculer le volume relatif des structures CD68 selon ses structures IBA1 correspondantes comme mesure de l’activation microgliale à l’état phagocytaire.
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Representative Results
En utilisant ce protocole, des anticorps marqués par fluorescence sont délivrés au cerveau et peuvent être détectés, ainsi que l’activation de la microglie. La conclusion que l’on peut tirer est que l’utilisation d’ultrasons focalisés et de microbulles améliore considérablement l’absorption des anticorps par le cerveau et peut délivrer des anticorps à l’ensemble du cerveau ou de l’hémisphère d’une souris lorsqu’elle est utilisée en mode de balayage. La figure 1 montre le dispositif d’application à ultrasons TIPS (différents composants étiquetés) qui est utilisé pour ouvrir le BBB. La figure 2 montre les résultats représentatifs des mesures de taille et de concentration du compteur Coulter qui doivent être obtenues lorsque les microbulles sont produites correctement. Pour visualiser facilement l’administration, les anticorps ont été marqués avec un colorant fluorescent rouge lointain. L’absorption d’anticorps par le cerveau peut être facilement visualisée dans tout le cerveau ou des sections à l’aide d’un scanner infrarouge ou à l’aide de microscopies fluorescentes sur des sections du cerveau. Les coupes cérébrales montrent l’emplacement de l’anticorps marqué par fluorescence à un niveau microscopique. Les résultats représentatifs de l’échographie délivrée à l’hippocampe par fluorescence de l’anticorps anti-tau RN2N marqué par fluorescence sont présentés à la figure 3. Pour observer toute altération de l’homéostasie cérébrale normale à la suite du SUS et de l’administration d’anticorps, une lecture était le contenu lysosomal microglial par rapport à la phagocytose. La figure 4 montre la coloration représentative de la microglie à l’aide d’Iba1 et du marqueur spécifique du lysosome microglial CD68 pour déterminer si la microglie devient plus phagocytaire après l’administration de l’anticorps.
Figure 1 : Système à ultrasons focalisés utilisé pour délivrer des ultrasons avec des composants critiques étiquetés. (A) Le porte-gel fait maison servant d’entretoise de 8 mm. (B) Vue à travers le transducteur montrant comment la cible est alignée avec la mise au point visuellement (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Mesures de contrôle de la qualité des microbulles préparées à l’interne. (A) Équipement de comptoir Coulter utilisé pour obtenir des statistiques sommaires (B) et la distribution granulométrique des microbulles en nombre (C) et en volume (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Administration d’anticorps marqués par fluorescence dans le cerveau à l’aide de SUS. (A) Un fragment d’anticorps marqué par fluorescence spécifique pour une isoforme tau délivrée seule, SUS seule, et un traitement combiné ont révélé une absorption accrue de l’anticorps par un hémisphère sonique lorsqu’il est combiné avec SUS en utilisant l’imagerie fluorescente proche infrarouge d’un hémisphère du cerveau. Une table de recherche (LUT) a été appliquée, avec une intensité de fluorescence plus élevée dans des unités arbitraires affichées dans des couleurs plus chaudes. (B) La quantification de la fluorescence a été effectuée sans soustraire les niveaux de contrôle SUS uniquement de la fluorescence de fond. SEM ± moyen affiché. (C) Augmentation de l’absorption de l’anticorps marqué par fluorescence par les neurones de l’hippocampe montrée dans les images à faible et à fort grossissement des sections du cerveau. Dans le traitement combiné, l’anticorps se distribue dans les corps cellulaires et même les dendrites comme indiqué pour les neurones de l’hippocampe. Bleu = DAPI, magenta = fragment d’anticorps. Barre d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Marquage d’immunofluorescence représentatif pour la microglie, montrant la morphologie attendue de la microglie et rendu en 3D avec le logiciel d’analyse d’images. La morphologie de la microglie est observée en vert et les niveaux et la distribution de CD68 sont observés en rouge. Barre d’échelle 10 μm. Vert =Iba1, rouge = CD68. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être délivrés au cerveau à l’aide d’ultrasons focalisés et de microbulles appliquées en mode balayage. L’administration d’anticorps, la morphologie microgliale et l’élargissement lysosomal peuvent être détectés par microscopie à fluorescence après une échographie à balayage. Les microglies peuvent absorber dans leurs lysosomes des anticorps et des antigènes auxquels les anticorps se sont liés dans un processus médié par le récepteur Fc4.
Il existe un certain nombre d’étapes critiques pour obtenir une ouverture BBB reproductible et une administration d’anticorps en utilisant cette méthode. Il est essentiel d’assurer un bon couplage entre le transducteur à ultrasons et la tête de la souris. Retirez tous les poils sur la tête de la souris et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans l’accouplement. Les caractéristiques des microbulles préparées en interne sont essentielles au succès. Les microbulles doivent avoir une concentration suffisante de 108 microbulles/mL et une distribution granulométrique telle que plus de 90 % des microbulles ont un diamètre inférieur à 10 μm. En effet, les microbulles plus grosses sont connues pour être filtrées hors de la circulation par les poumons. Une taille médiane acceptable est comprise entre 1 et 3 μm. Les microbulles doivent être manipulées et injectées doucement pour éviter de les détruire dans la seringue. Il est important que l’échographie soit appliquée au plus tard 2 minutes après l’injection des microbulles qui peut être réalisée avec la pratique. Le ciblage d’un cerveau entier ou d’un hémisphère entier est facilement réalisé avec l’approche SUS et la précision du ciblage est peu susceptible d’être un problème lors du ciblage de grandes régions. Une région cérébrale plus petite telle que l’hippocampe ou le striatum peut également être ciblée avec succès, mais dans ce cas, il est important que le foyer chevauche la région ciblée. La hauteur du cerveau d’une souris est similaire à la longueur axiale du faisceau d’ultrasons focalisé à 1 MHz à l’aide d’un transducteur à ultrasons typique, de sorte que le transducteur n’a besoin d’être déplacé que dans la dimension x et y et non dans la dimension z. Cela peut être déterminé par la connaissance des coordonnées stéréotaxiques d’une structure cérébrale particulière et par la visualisation des sutures lambdoïdes et sagittales à travers la peau épilée de la souris.
Ici, nous démontrons une technique qui utilise des injections rétroorbitaires pour délivrer des microbulles et des anticorps. Une alternative aux injections rétroorbitaires est l’injection de veine caudale qui est également une technique efficace pour délivrer des microbulles et des anticorps. Les avantages de l’injection rétroorbitaire sont qu’elle est techniquement moins difficile que les injections de veine caudale et peut être répétée plusieurs fois (alternance d’injection oculaire) avec un risque très minime de lésions tissulaires.
Si aucun anticorps marqué par fluorescence n’est détecté dans le cerveau, il est probable que le BBB ne s’est pas ouvert. Le dépannage doit se concentrer sur l’obtention d’une solution de microbulles concentrées et son injection afin de ne pas détruire les microbulles et de délivrer l’échographie dans les deux minutes suivant le temps d’injection. Si aucune ouverture BBB ne se produit, le réglage de pression négative de crête peut être augmenté, avec la mise en garde que des pressions négatives de crête plus élevées augmentent le risque de provoquer des microhémorragies que nous ne détectons pas à un réglage de pression négative de pointe de 0,65 MPa en utilisant les paramètres décrits. Selon la spécificité de l’antigène de l’anticorps, le schéma de coloration sera différent. Le motif de coloration obtenu lors de l’injection d’un anticorps anti-tau est illustré à la figure 2.
Cette technique peut être appliquée à une gamme d’anticorps et tant que l’ouverture BBB cohérente est obtenue, la liaison de l’anticorps à une cible dans le cerveau peut être évaluée. L’approche par ultrasons à balayage permet d’ouvrir le BBB sur tout le cerveau d’une souris de manière reproductible.
Une limitation de cette technique est que l’occurrence et l’étendue de l’ouverture BBB ne sont pas observées pendant que la souris est vivante. Cette limitation pourrait être surmontée en incluant l’imagerie IRM avec un agent de contraste au gadolinium à la procédure, mais cela augmente considérablement le temps et le coût de la procédure.
Décrit ici est une sonication unique et une administration unique du protocole d’anticorps qui peut être utilisé pour déterminer combien d’absorption accrue d’anticorps peut être obtenue, ainsi que l’endroit où ils se trouvent dans le cerveau après l’accouchement. Le protocole peut également être utilisé dans une étude longitudinale pour évaluer les effets thérapeutiques de l’administration d’anticorps. Dans une étude de traitement, le protocole peut être répété avec un intervalle d’inter-traitement d’une semaine ou plus afin d’évaluer le potentiel thérapeutique d’un anticorps délivré au cerveau. Le potentiel thérapeutique de l’anticorps délivré par échographie peut être évalué dans des modèles murins transgéniques de maladies neurodégénératives. Les lectures de l’effet thérapeutique pourraient inclure des tests comportementaux, ainsi que l’histologie et la biochimie pour les niveaux de protéines pathologiques, par exemple tau, β amyloïde ou synucléine.
En conclusion, nous avons décrit une méthode pour ouvrir la barrière hémato-encéphalique chez la souris afin de délivrer des anticorps marqués par fluorescence. Cette méthode intéressera les chercheurs qui évaluent des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives.
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Disclosures
Nous n’avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien de la succession du Dr Clem Jones AO, du Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie [GNT1145580, GNT1176326], de la Metal Foundation et du gouvernement de l’État du Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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