Summary
Hier wird ein Protokoll zur vorübergehenden Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) entweder fokal oder in einem Mausgehirn vorgestellt, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern und Mikroglia zu aktivieren. Ebenfalls vorgestellt wird eine Methode zum Nachweis der Abgabe von Antikörpern und der Aktivierung von Mikroglia durch die Histologie.
Abstract
Nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, wird vom Gehirn aufgenommen. Fokussierter Ultraschall bietet die Möglichkeit, die Aufnahme von Antikörpern und das Engagement durch vorübergehende Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu erhöhen. In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die BHS abgegeben wird, begleitet von einer fokussierten Ultraschallanwendung durch den Schädel, der auf mehrere Stellen abzielt, ein Ansatz, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen. Die mechanische Wirkung von Mikroblasen und Ultraschall auf Blutgefäße erhöht den parazellulären Transport über die BHS, indem sie Tight Junctions vorübergehend trennt und die vesikelvermittelte Transzytose verbessert, so dass Antikörper und Therapeutika effektiv kreuzen können. Darüber hinaus erleichtert Ultraschall auch die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen, in denen sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritische Prozesse verteilt. In unseren Studien werden fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt, mit intern hergestellten lipidbasierten Mikroblasen gemischt und in Mäuse injiziert, unmittelbar bevor SUS auf das Gehirn aufgetragen wird. Anschließend wird die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn quantifiziert. Um Veränderungen in der normalen Homöostase des Gehirns zu berücksichtigen, kann die Mikroglia-Phagozytose als zellulärer Marker verwendet werden. Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist.
Introduction
Therapeutischer Ultraschall ist eine aufstrebende Technologie, die darauf abzielt, Hirnerkrankungen auf nichtinvasive Weise zu behandeln, zum Teil durch Erleichterung des Zugangs von Therapeutika zum Gehirn1,2,3. Da nur ein kleiner Teil der therapeutischen Antikörper, die auf Hirnerkrankungen abzielen, vom Gehirn aufgenommen und im Gehirn zurückgehalten werden4, bietet therapeutischer Ultraschall die Möglichkeit, ihre Aufnahme und ihr gezieltes Engagement zu erhöhen5,6.
In unserem Labor entwickeln wir Therapieansätze für neurodegenerative Erkrankungen, bei denen ein Antikörper in verschiedenen Formaten mittels Mikrobläschen über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) abgegeben wird. Um dies zu erreichen, wird Ultraschall durch den Schädel an mehreren Stellen in das Gehirn angewendet, wobei ein Scanning-Modus verwendet wird, den wir als Scanning-Ultraschall (SUS) bezeichnen7. Die mechanische Wechselwirkung zwischen der Ultraschallenergie, den intravenös injizierten Mikrobläschen und dem Gefäßsystem des Gehirns trennt vorübergehend die Engstellen der BHS in einem gegebenen Beschallungsvolumen, so dass Antikörper und andere Ladungen, einschließlich therapeutischer Wirkstoffe, diese Barriere effektiv überwinden können7,8,9 . Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Ultraschall die Aufnahme von Antikörpern aus dem interstitiellen Gehirn in Gehirnzellen wie Neuronen erleichtert, wo sich der Antikörper im gesamten Zellkörper und sogar in neuritischen Prozessen verteilt5,10.
Die Alzheimer-Krankheit ist durch eine Amyloid-β- und Tau-Pathologie gekennzeichnet11, und eine Vielzahl von Tiermodellen steht zur Verfügung, um pathogene Mechanismen zu sezieren und therapeutische Strategien zu validieren. Ein SUS-Ansatz, bei dem Ultraschall in einem sequentiellen Muster über das gesamte Gehirn angewendet wird, kann, wenn er über mehrere Behandlungssitzungen wiederholt wird, die Amyloid-Plaque-Pathologie im Gehirn von Amyloid-β-ablagernden Amyloid-Vorläuferprotein-mutierten Mäusen (APP) reduzieren und Mikroglia aktivieren, die das Amyloid aufnehmen, was zu einer Verbesserung der kognitiven Funktion führt7. Die BBB-Öffnung mit Ultraschall und Mikroblasen reduziert auch die Tau-Pathologie bei pR5, K3 und rTg4510 tau-transgenen Mäusen5,12,13. Während Mikroglia extrazelluläre Proteinablagerungen entfernen, ist einer der zugrunde liegenden Clearance-Mechanismen für intraneuronale Pathologien, die durch SUS induziert werden, die Aktivierung der neuronalen Autophagie12.
Hier skizzieren wir einen experimentellen Prozess, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper hergestellt und dann mit hauseigenen lipidbasierten Mikrobläschen gemischt werden, gefolgt von einer retroorbitalen Injektion in anästhesierte Mäuse. Die retroorbitale Injektion ist eine Alternative zur Schwanzveneninjektion, die sich als ebenso wirksam und einfacher erwiesen hat, wiederholt durchzuführen. Unmittelbar danach wird SUS auf das Gehirn angewendet. Um die therapeutische Antikörperaufnahme zu bestimmen, werden Mäuse geopfert und die erhöhte Antikörperkonzentration im Gehirn anschließend quantifiziert. Als Stellvertreter für die Veränderung der Homöostase des Gehirns wird die mikrogliale phagozytäre Aktivität durch Histologie und volumetrische 3D-Rekonstruktion bestimmt.
Die generierten Daten deuten darauf hin, dass die Ultraschallabgabe von Antikörpern ein potenziell attraktiver Ansatz zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen ist. Das Protokoll kann in ähnlicher Weise auf andere Arzneimittelkandidaten sowie auf Modellladungen wie fluoreszierend markiertes Dextrans definierter Größen angewendet werden14.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden von der Tierethikkommission der University of Queensland genehmigt.
1. Eigene Mikroblasenaufbereitung
- Wiegen Sie ein 9:1 molares Verhältnis von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[amino(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) ab. Pro 1 ml Mikroblasenlösung werden 0,5 mg Lipidmischung benötigt. Alternativ können Lipide bereits in Chloroform gekauft werden, wenn mit vorgelösten Lipiden mit Schritt 1.3 fortgefahren wird.
- Lösen Sie das Lipid in einem kleinen Volumen Chloroform in einem Glasbecherglas auf.
- Verdampfen Sie das Chloroform mit einem Verdampfer oder einem Stickstoffstrom.
- Rehydrieren Sie den getrockneten Lipidfilm mit 10 ml PBS + 10% Glycerin + 10% Propylenglykollösung, die durch einen 0,22-μm-Filter gefiltert wurde.
- Die rehydrierte Lipidlösung in einen auf 55 °C eingestellten Wasserbadbeschaller (über der Schmelztemperatur der Lipide) geben und bis zur vollständigen Auflösung beschallen.
- Aliquot-Lipidlösung in autoklavierte 1,5-ml-HPLC-Fläschchen und Schrauben Sie die Septakappen auf.
- Saugen Sie die gesamte Luft in der Durchstechflasche mit einer 5-ml-Spritze ab, die mit einer 27-G-Nadel ausgestattet ist, und erzeugen Sie ein Vakuum in der Durchstechflasche.
- Fügen Sie Octofluorpropan mit der mitgelieferten Spritze in die Durchstechflasche ein und ziehen Sie das Gas aus dem Kanister an. Füllen Sie die Durchstechflasche mit 1-2 ml Octafluorpropan, indem Sie das Volumen in der Spritze ablesen.
- Verschließen Sie jede Durchstechflasche mit Paraffinfolie und kühlen Sie sie ab.
- Am Tag des Experiments bringen Sie die Durchstechflasche auf Raumtemperatur, geben Sie 0,5 ml 0,9% NaCl-Lösung in die Durchstechflasche, legen Sie die Durchstechflasche dann in einen Amalgamator und rühren Sie für 45 s (voreingestellte Zeit), um die Mikroblasen zu erzeugen.
2. Mikroblasen-Qualitätskontrolle mit einem Scharzähler
- Nehmen Sie die Mikroblasenlösung aus dem Amalgamator und entlüften Sie das Gas aus der Durchstechflasche, indem Sie die Septen mit einer 19-G-Nadel durchstechen.
- Verdünnen Sie die Mikroblasenlösung, indem Sie zweistufige serielle Verdünnungen von 1:5.000 durchführen, indem Sie 100 μL Mikroblasenlösung in 5 ml gefilterte Durchflusslösung mit einer 1-ml-Spritze mit 19-G-Nadel geben und dann 100 μL 1:50 verdünnte Mikroblasenlösung nehmen und mit einer Pipette in eine 10 ml gefilterte Durchflusslösung in einer Küvette pipettieren.
- Überprüfen Sie, ob der Elektrolyttank über eine ausreichende Durchflusslösung verfügt und ob der Abfallbehälter leer ist.
- Legen Sie die Küvette in die Scharzählerplattform und verriegeln Sie sie. Verwenden Sie eine Öffnung von 30 μm für die Probenaufnahme.
- Laden Sie in der Software die Standardarbeitsmethode (SOM) und wählen Sie dann SOM bearbeiten | Konzentration. Geben Sie die 5000x-Verdünnung ein.
- Wählen Sie in der Software einen geeigneten Dateinamen aus. Beispiel: microbubble_1_date.
- Laden und befestigen Sie die Küvette in der Plattform.
- Wählen Sie in der Software Ausführen aus| Zeigen Sie eine Vorschau an und überprüfen Sie, ob die Stichprobenkonzentration weniger als 10 % beträgt. Wenn diese Zahl höher als 10% ist, führen Sie eine neue Verdünnung der Mikroblasen mit einem höheren Verdünnungsfaktor durch.
- Wählen Sie "Start", um mit der Erfassung der Probe zu beginnen und die erste Anzeige zu erhalten.
- Spülen Sie die Blende des Scharzählers nach jeder Messung mit gefilterter Durchflusslösung ab. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.9, um 3 Replikate zu erhalten.
- Legen Sie eine Küvette mit verdünnter Mikroblasenlösung in ein Ultraschallwasserbad und beschallen Sie für 30 s.
- Messen Sie die Lösung mit beschallten Mikroblasen und beschriften Sie sie als leer.
- Subtrahieren Sie in der Software die endgültige Anzeige von der anfänglichen Anzeige. Dadurch werden alle Partikel abgezogen, die keine Mikroblasen sind und kein Gas enthalten.
- Wählen Sie in der Software Ergebnisse anzeigen aus, um die Mikroblasenkonzentration, die Größenverteilung, die Durchschnittsgröße und die Volumenkonzentration anzuzeigen.
3. Markierung fluoreszierender Antikörper
- Erhalten Sie eine 1 mg / ml Lösung von Maus-IgG in PBS ohne Zusatzstoffe.
- Beschriften Sie 1 mg Maus-IgG mit AlexaFluor 647 in 0,1 M Natriumbicarbonat-Puffer, indem Sie die Anweisungen des Herstellers im Kit befolgen. Diese Menge an fluoreszierend markiertem IgG reicht aus, um dieses Verfahren an 5-7 erwachsenen Mäusen durchzuführen, bei denen eine Dosis von 5 mg/kg Antikörper verabreicht wird.
- Fügen Sie den Farbstoff der Lösung von IgG in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer hinzu und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur.
- Reinigen Sie den fluoreszierend markierten Antikörper, indem Sie die Antikörperlösung in eine Schleudersäule pipettieren und bei 1.000 x g für 5 min zentrifugieren. Freier Farbstoff verbleibt im Säulenbett.
- Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Proteinkonzentration zu messen. Messen Sie die Absorption der konjugierten Lösung bei 280 nm und 650 nm (A280 und A650). Berechnen Sie die Proteinkonzentration in der Probe unter Verwendung der Gleichung:
Proteinkonzentration (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x Verdünnungsfaktor / 203.000. - Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um den Grad der Beschriftung anhand der Gleichung zu berechnen:
Mol Farbstoff pro Mol Protein = A650 x Verdünnungsfaktor / 239 000 x Proteinkonzentration (M).
HINWEIS: Ein akzeptabler Markierungsgrad beträgt 3-7 Mol Farbstoff pro Mol-Protein und typischerweise liegt der erhaltene Markierungsgrad bei etwa 6.
4. Ultraschall-Setup
- Verwenden Sie das fokussierte Ultraschallsystem, fügen Sie den 5-mm-Abstandshalter zum Wasserbolus hinzu, um den Ultraschallfokus 9 mm unter dem Boden des Wasserbolus zu positionieren.
- Füllen Sie den Wasserbolus mit ca. 300 ml entionisiertem Wasser, das 20 Minuten lang mit einem Inline-Entgaser entgast wurde (der Sauerstoffgehalt sollte unter 3 ppm liegen). Legen Sie das ringförmige Array in den gefüllten Wasserbolus und verwenden Sie einen Zahnspiegel, um zu überprüfen, ob sich keine Luftblasen auf der Oberfläche befinden. Wenn auf der Oberfläche vorhanden, entfernen Sie das ringförmige Array und ersetzen Sie es im Wasserbolus.
- Starten Sie die Anwendungssoftware. Wählen Sie im Wellenformmenü die Option Wellenform-Tastverhältnis einstellen aus. Die Einstellungen sind PRF (Hz) 10, Tastverhältnis 10%, Fokus 80 mm, Mittenfrequenz 1 MHz, Amplitude (MPa-Spitzenunterdruck) 0,65 MPa, mechanischer Index = 0,65. Drücken Sie Festlegen , um die Wellenform zu definieren und im Speicher zu speichern.
HINWEIS: Das fokussierte Ultraschallsystem wird vom Hersteller anhand von Messungen eines kalibrierten Hydrophons vorkalibriert. - Definieren Sie in der fokussierten Ultraschallsystemsoftware einen Behandlungsplan. Dies erfordert die Definition einer Behandlungsregion, die aus mehreren einzelnen Behandlungsstellen besteht, und die Definition von Maßnahmen, die an jeder dieser Behandlungsstellen zu ergreifen sind. In diesem Fall ist die Behandlungszone eine Hemisphäre des Mäusegehirns.
- Wechseln Sie im Fenster des Motion Controllers zur Registerkarte Scan und geben Sie den Start-, Stopp- und Inkrementwert für die Bewegung in der x-Dimension sowie den Start-, Stopp- und Inkrementwert für die Bewegung in y-Richtung ein. Geben Sie Werte für X ein: start -4, stop 3.50 und Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
- Definieren Sie die Aktionen für Behandlungsstellen. Wählen Sie im Motion-Controller-Fenster die Schaltfläche Ereignis aus. Wählen Sie im Fenster Skriptbearbeitung eine Liste von Aktionen aus, die in der an jedem Behandlungsort ausgewählten Reihenfolge ausgeführt werden. Legen Sie "Bewegungstyp " oben im Skriptfenster auf das Rasterraster fest. Wählen Sie auf der Registerkarte Ereignisse Aktionen hinzufügen , um sie in das Skriptfenster zu verschieben, und fügen Sie Synchron bewegen, Trigger arb starten , warten, Trigger arb stoppen hinzu. Klicken Sie auf die Warteaktion und wählen Sie eine Wartezeit von 6.000 ms.
HINWEIS: Diese Einstellungen machen die Behandlung zu einem 6 x 5-Raster von Behandlungspunkten, die 1,5 mm voneinander entfernt sind, wobei jeder Spot eine Behandlungsdauer von 6 s hat. Die Gesamtdauer für die Beschallung eines Mausgehirns beträgt ca. 3 min. Dieses Behandlungsgitter ist für erwachsene C57/Bl6-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 30 g geeignet. Die Größe des Rasters der Behandlungspunkte kann je nach Größe der Maus nach oben oder unten eingestellt werden.
5. Tierpräparation
- Wiegen Sie die Maus mit einer Waage von genau 0,1 g.
- Betäuben Sie die Maus mit 90 mg/kg Ketamin und 6 mg/kg Xylazin intraperitoneal. Testen Sie das Fehlen von Reflexen mit einer Zehenklemme. Alternativ können Mäuse mit einem geeigneten inhalativen Anästhesiegerät mit einer geeigneten Gesichtsmaske mit Isofluran betäubt werden. Bei Verwendung von Isofluran sollte die Maus während des Ultraschalls auf ein Wärmekissen gelegt werden, um Unterkühlung zu vermeiden.
- Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um das Haar vom Kopf des Tieres zu rasieren, tragen Sie dann Haarentfernungscreme mit einem Wattestäbchen auf, lassen Sie es 2-3 Minuten einwirken oder bis das Haar mit einem feuchten Stück Gaze abgewischt ist. Achten Sie darauf, dass die Haarentfernungscreme nicht in die Augen der Maus gelangt.
- Markieren Sie die Mitte des Mauskopfes mit einem Permanentmarker. Der Wandler hat ein Loch in seiner Mitte und der Fokus und der Brennpunkt des Wandlers können visuell ausgerichtet werden.
- Füllen Sie ein kleines Wägeboot, bei dem zuvor der Boden abgeschnitten und durch Plastikfolie ersetzt wurde, die mit Ultraschallgel auf den Boden des Wägeboots geklebt wurde. Dieser dient als 8 mm Abstandshalter und bietet eine gute Kopplung an den Kopf der Maus und ermöglicht eine visuelle Inspektion des Fokus des Wandlers, der mit dem Kopf der Maus ausgerichtet ist.
6. Mikroblasen-Vorbereitung
- Erwärmen Sie ein Mikroblasenfläschchen auf Raumtemperatur. Zur Aktivierung 0,5 ml 0,9%ige NaCl-Lösung in die Durchstechflasche geben und in einen Amalgamator geben, um 45 s zu rühren, um die Mikroblasen zu erzeugen.
- Entlüften Sie die Durchstechflasche, indem Sie die Septen mit einer 27-G-Nadel durchstechen.
7. Ultraschallbehandlung
- Kehren Sie die Durchstechflasche mit Mikroblasen um und ziehen Sie vorsichtig 1 μL/g Körpergewicht der Lösung auf. Dazu fügen Sie Lösung eines fluoreszierend markierten Antikörpers hinzu und mischen Sie vorsichtig in die Spritze. Das maximale eingespritzte Volumen beträgt 150 μL.
HINWEIS: Selbst hergestellte Mikrobläschen sind etwa 60-mal weniger konzentriert als die klinisch verwendeten (z. B. Definity-Mikroblasen). Passen Sie das Volumen oder die Konzentration so an, dass die Anzahl der injizierten Mikrobläschen denen der klinisch verwendeten ähnlich ist (dh. Definity 1,2 x 108 Mikroblasen/kg Körpergewicht). - Injizieren Sie die Mikroblase und die Antikörperlösung retroorbital und achten Sie darauf, vorsichtig und langsam zu injizieren. Tragen Sie dann die Augensalbe der Maus auf.
- Legen Sie die Maus in den Kopfhalter (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie die Nase der Maus. Legen Sie dann das mit Ultraschallgel gefüllte kleine Wägeboot auf den Kopf.
- Senken Sie den Wasserbolus, bis er auf dem Ultraschallgel im Wiegeboot sitzt.
- Verwenden Sie den Joystick, um den Fokus des Wandlers in die Mitte des Kopfes zu bewegen. Wählen Sie auf der Registerkarte " Bewegung" die Option "Ursprung zurücksetzen ".
- Wählen Sie Scan abschließen aus. Die Schritte 7.3-7.6 dauern 2 Minuten.
- Stellen Sie aus Konsistenzgründen einen Timer ein, um eine Verzögerung von 2 Minuten zwischen dem Einspritzen von Mikroblasen und der Auswahl des vollständigen Scans zu gewährleisten.
- Nachdem die Behandlung abgeschlossen ist, tragen Sie die Augensalbe auf die Augen auf und legen Sie die Maus in eine erwärmte Erholungskammer. Wenn während des Eingriffs eine Unterkühlung beobachtet wird, kann ein Wärmekissen unter die Maus gelegt werden, um während des Eingriffs zusätzliche Wärme bereitzustellen.
8. Gewebegewinnung und -verarbeitung
- Zum Zeitpunkt des Interesses nach Ultraschallabgabe (mindestens 1 h zum Nachweis hoher Antikörperspiegel im Gehirn) die Maus mit einer Überdosierung von Pentobarbiton-Lösung (100 mg/kg) tief betäuben und die Maus mit 30 ml PBS transkardial durchbluten. Eine gute Perfusion ist erforderlich, um spezifisch fluoreszenzmarkierte Antikörper nachzuweisen, die an das Gehirn abgegeben wurden.
- Sammeln Sie das Gehirn und fixieren Sie es durch Eintauchen in 4% PFA für 24 h bei 4 ° C, dann waschen Sie es mit PBS.
- Stellen Sie sich das Gehirn in einem Infrarotscanner vor, indem Sie das Gehirn auf das Fach legen und ein Bild im 700-nm-Kanal aufnehmen.
HINWEIS: Nach der Fixierung wird das Gehirn aus der PFA entfernt, in PBS gewaschen und geschnitten. Alternativ kann es in Ethylenglykol-Kryoprotektionslösung für 24 h bei 4 °C oder bis zum Untertauchen gegeben und dann in eine neue Kryoprotektionsmittel-enthaltende Durchstechflasche gegeben und bei -20 °C zur Langzeitlagerung platziert werden. - Schneiden Sie die Gehirnerkältung in PBS mit einem Vibratom ab. Kleben Sie das Gehirn auf die Plattform und schneiden Sie 30-40 μm-Abschnitte und sammeln Sie sie in PBS.
HINWEIS: Lysosomale Autofluoreszenz (vorherrschend in Abschnitten von Tieren, die älter als etwa 12 Monate sind) sollte durch Nachtbeleuchtung der Abschnitte in einer Lichtkammerbox, bei Raumtemperatur und in PBS, das Azid (0,02%) enthält, gebleicht werden, um das Bakterienwachstum zu blockieren.
9. Gewebefärbung und Bildaufnahme
- Übertragen Sie Abschnitte für 2 h bei Raumtemperatur auf Blocklösung (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) und waschen Sie dann die Abschnitte 3x, indem Sie die Lösung durch 0,2% Triton/PBS ersetzen.
- Inkubieren Sie Abschnitte bei 4 °C über Nacht mit den primären Antikörpern gegen Iba1 (Verdünnung 1:1.000) und CD68 (Verdünnung 1:500), in 0,2% Triton/PBS, gefolgt von 3x Waschungen mit 0,2% Triton/PBS.
- Inkubationsabschnitte für 2 h bei Raumtemperatur mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:500), gefolgt von 3x Wäschen mit nur 0,2% Triton/PBS.
HINWEIS: Die Kerne können auch mit DAPI-Lösung (0,5 μg/ml) gefärbt werden. - Übertragen Sie die Abschnitte mit fest eingestellten Montagemedien auf einen Schlitten und ein Deckglas. Lassen Sie dem Montagemedium ausreichend Zeit, um sich vor der Visualisierung und Bildaufnahme (über Nacht) zu verfestigen.
- Mit einem konfokalen Mikroskop erhalten Z-Stack-Bilder (mindestens 10 μm Tiefe und 0,3 μm Schrittgröße, 10 Bilder pro Tier) des Ultraschall-Zielhirnbereichs unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops und eines Objektivs von mindestens 40-facher Vergrößerung.
HINWEIS: Achten Sie darauf, Bilder innerhalb des Signaldynamikbereichs aufzunehmen, um Unter-/Überbelichtung zu vermeiden. Speichern Sie die Bilddateien im entsprechenden Softwareformat, das vom Mikroskop verwendet wird.
10. Bildanalyse
- Konvertieren Sie die z-stack-Mikroskopiedateien mit dem Bildanalyse-Software-Dateiimporter.
- Öffnen Sie die konvertierten Dateien in der Software und passen Sie die Intensität des Iba1-Kanals an, um Mikrogliazellen zu beobachten.
- Schneiden Sie eine einzelne Mikrogliazelle zu, indem Sie eine Box um sie herum zeichnen, wählen Sie "Zuschneiden" und speichern Sie die neue Datei.
- Erstellen Sie das 3D-Oberflächenrendering des IBA1-Signals durch:
- Öffnen Sie die im vorherigen Schritt generierte Imaris-Datei mit einer einzelnen Zelle.
- Fügen Sie der Datei eine Oberfläche hinzu.
- Wählen Sie den Kanal aus, der der Iba1-Färbung entspricht.
- Anwenden eines Schwellenwerts, der die Iba1-Färbung überlappen sollte
- Wählen Sie nur die Struktur von Interesse, die die interessierende Mikrogliazelle bildet
- Abschließen des Prozesses
- Abrufen und Aufzeichnen des Volumens der Iba1-Färbung
- Erstellen des 3D-Oberflächen-Renderings der CD68-Färbung
- Maskieren Sie innerhalb der IBA1-Oberflächenunterdatei den CD68-Kanal und entfernen Sie die Voxel außerhalb der IBA1-Färbung
- Hinzufügen einer neuen Oberfläche zur Datei
- Wählen Sie den Kanal, der der CD68-Färbung entspricht
- Wenden Sie einen Schwellenwert an, der die CD68-Färbung überlappen sollte und so genau wie möglich mit den Färbevolumina übereinstimmt.
- Schließen Sie den Prozess ab, da nur die intramikroglialen CD68-Strukturen in dieser Datei vorhanden sind und daher kein weiterer Schwellenwertfilterschritt erforderlich ist
- Ermitteln und Aufzeichnen der Anzahl und des durchschnittlichen Volumens der CD68-Positivstrukturen
- Berechnen Sie das relative Volumen von CD68-Strukturen gemäß den entsprechenden IBA1-Strukturen als Maß für die Mikrogliaaktivierung in einem phagozytischen Zustand.
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Representative Results
Mit diesem Protokoll werden fluoreszenzmarkierte Antikörper an das Gehirn abgegeben und können zusammen mit der Mikroglia-Aktivierung nachgewiesen werden. Die Schlussfolgerung, die gezogen werden kann, ist, dass die Verwendung von fokussiertem Ultraschall und Mikroblasen die Aufnahme von Antikörpern im Gehirn deutlich verbessert und Antikörper an das gesamte Gehirn oder die Hemisphäre einer Maus abgeben kann, wenn sie in einem Scanning-Modus verwendet wird. Abbildung 1 zeigt das TIPS-Ultraschallgerät (verschiedene Komponenten beschriftet), das zum Öffnen der BHS verwendet wird. Abbildung 2 zeigt die repräsentativen Ergebnisse von Coulter-Zählermessungen von Größe und Konzentration, die bei korrekter Erzeugung der Mikrobläschen erzielt werden sollten. Um die Abgabe leicht sichtbar zu machen, wurden die Antikörper mit einem far-red fluoreszierenden Farbstoff markiert. Die Antikörperaufnahme durch das Gehirn kann leicht im ganzen Gehirn oder in Abschnitten mit einem Infrarotscanner oder mit Fluoreszenzmikroskopie an Hirnschnitten sichtbar gemacht werden. Hirnschnitte zeigen die Position des fluoreszierend markierten Antikörpers auf mikroskopischer Ebene. Repräsentative Ergebnisse für die Scanning-Ultraschallabgabe an den Hippocampus des fluoreszenzmarkierten Anti-Tau-Antikörpers RN2N sind in Abbildung 3 dargestellt. Um eine Veränderung der normalen Hirnhomöostase als Folge von SUS und Antikörperabgabe zu beobachten, war ein Auslesewert der mikrogliale lysosomale Gehalt in Bezug auf die Phagozytose. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Färbung für Mikroglia unter Verwendung von Iba1 und dem mikroglialen Lysosom-spezifischen Marker CD68, um zu bestimmen, ob Mikroglia nach der Abgabe des Antikörpers phagozytärer werden.
Abbildung 1: Das fokussierte Ultraschallsystem, das für die Ultraschalluntersuchung mit kritischen gekennzeichneten Komponenten verwendet wird. (A) Der selbstgebaute Gelhalter dient als 8 mm Abstandshalter. (B) Ansicht durch den Wandler, die zeigt, wie das Ziel visuell mit dem Fokus ausgerichtet ist (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Qualitätskontrollmessungen von selbst hergestellten Mikroblasen. (A) Scharzählerausrüstung, die zur Gewinnung zusammenfassender Statistiken (B) und Größenverteilung von Mikroblasen in Anzahl (C) und Volumenverteilung (D) verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Abgabe von fluoreszenzmarkierten Antikörpern in das Gehirn mittels SUS. (A) Ein fluoreszenzmarkiertes Antikörperfragment, das spezifisch für eine Tau-Isoform ist, die für sich selbst, SUS für sich selbst geliefert wird, und eine Kombinationsbehandlung zeigten eine erhöhte Aufnahme des Antikörpers durch eine beschallte Hemisphäre, wenn sie mit SUS kombiniert wurde, wobei die Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung einer Hemisphäre des Gehirns verwendet wurde. Es wurde eine Nachschlagetabelle (LUT) angewendet, wobei eine höhere Fluoreszenzintensität in beliebigen Einheiten in wärmeren Farben angezeigt wurde. (B) Die Quantifizierung der Fluoreszenz erfolgte, ohne die reinen SUS-Kontrollwerte der Hintergrundfluoreszenz zu subtrahieren. Mean ± SEM angezeigt. (C) Erhöhte Aufnahme des fluoreszierend markierten Antikörpers durch Hippocampus-Neuronen, die in Bildern mit niedriger und hoher Vergrößerung von Hirnschnitten gezeigt werden. Bei der Kombinationsbehandlung verteilt sich der Antikörper in Zellkörper und sogar Dendriten, wie für Hippocampus-Neuronen gezeigt. Blau=DAPI, Magenta=Antikörperfragment. Maßstabsbalken: 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Immunfluoreszenzmarkierung für Mikroglia, die die erwartete Morphologie von Mikroglia zeigt und mit der Bildanalysesoftware in 3D gerendert wird. Die Mikrogliamorphologie wird in Grün und Konzentrationen beobachtet und die Verteilung von CD68 wird in Rot beobachtet. Maßstabsleiste 10 μm. Grün=Iba1, rot=CD68. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Fluoreszenzmarkierte Antikörper können mit fokussiertem Ultraschall zusammen mit Mikrobläschen, die in einem Scanning-Modus angewendet werden, an das Gehirn abgegeben werden. Antikörperabgabe, Mikrogliamorphologie und lysosomale Vergrößerung können durch Fluoreszenzmikroskopie nach Rasterultraschall nachgewiesen werden. Mikroglia können in ihren Lysosomen Antikörper und Antigene aufnehmen, an die die Antikörper in einem Fc-Rezeptor-vermittelten Prozess gebunden sind4.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritten, um mit dieser Methode eine wiederholbare BHS-Öffnung und Antikörperabgabe zu erreichen. Es ist wichtig, eine gute Kopplung zwischen dem Ultraschallwandler und dem Kopf der Maus zu gewährleisten. Entfernen Sie alle Haare auf dem Kopf der Maus und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Kupplung befinden. Die Eigenschaften der selbst hergestellten Mikrobläschen sind erfolgskritisch. Mikroblasen müssen eine ausreichende Konzentration von 108 Mikrobläschen/ml und eine Größenverteilung aufweisen, so dass über 90% der Mikroblasen einen Durchmesser von weniger als 10 μm haben. Dies liegt daran, dass bekannt ist, dass größere Mikroblasen von der Lunge aus dem Kreislauf gefiltert werden. Eine akzeptable Mediangröße liegt zwischen 1 -3 μm. Mikroblasen müssen vorsichtig gehandhabt und injiziert werden, um zu vermeiden, dass sie in der Spritze zerstört werden. Es ist wichtig, dass der Ultraschall spätestens 2 Minuten nach der Injektion der Mikrobläschen angewendet wird, was mit Übung erreicht werden kann. Das Targeting eines ganzen Gehirns oder einer ganzen Hemisphäre ist mit dem SUS-Ansatz leicht zu erreichen, und die Genauigkeit des Targetings ist wahrscheinlich kein Problem, wenn große Regionen anvisiert werden. Eine kleinere Hirnregion wie der Hippocampus oder das Striatum kann ebenfalls erfolgreich anvisiert werden, aber in diesem Fall ist es wichtig, dass der Fokus die Zielregion überlappt. Die Höhe eines Mausgehirns ähnelt der axialen Länge des fokussierten Ultraschallstrahls bei 1 MHz mit einem typischen Ultraschallwandler, so dass der Wandler nur in der x- und y-Dimension und nicht in der z-Dimension bewegt werden muss. Dies kann durch die Kenntnis der stereotaktischen Koordinaten für eine bestimmte Hirnstruktur und durch die Betrachtung der Lambdoid- und Sagittalnähte durch die enthaarte Haut der Maus bestimmt werden.
Hier demonstrieren wir eine Technik, die retroorbitale Injektionen verwendet, um Mikroblasen und Antikörper zu liefern. Eine Alternative zu retroorbitalen Injektionen sind Schwanzveneninjektionen, die auch eine wirksame Technik zur Abgabe von Mikrobläschen und Antikörpern sind. Der Vorteil der retroorbitalen Injektion ist, dass sie technisch weniger anspruchsvoll ist als die Injektion von Heckvenen und mehrmals wiederholt werden kann (abwechselndes Injektionsauge) mit einem sehr geringen Risiko einer Gewebeschädigung.
Wenn kein fluoreszierend markierter Antikörper im Gehirn nachgewiesen wird, ist es wahrscheinlich, dass sich die BHS nicht geöffnet hat. Die Fehlerbehebung sollte sich darauf konzentrieren, eine konzentrierte Mikroblasenlösung zu erhalten und zu injizieren, um die Mikrobläschen nicht zu zerstören und den Ultraschall innerhalb von zwei Minuten nach der Injektionszeit abzugeben. Wenn keine BHS-Öffnung auftritt, kann die maximale Unterdruckeinstellung erhöht werden, mit dem Vorbehalt, dass höhere Spitzenunterdrücke die Wahrscheinlichkeit erhöhen, Mikroblutungen zu verursachen, die wir bei einer maximalen Unterdruckeinstellung von 0,65 MPa mit den beschriebenen Einstellungen nicht erkennen. Abhängig von der Antigenspezifität des Antikörpers ist das Färbemuster unterschiedlich. Das Färbemuster, das bei der Injektion eines Anti-Tau-Antikörpers erhalten wird, ist in Abbildung 2 dargestellt.
Diese Technik kann auf eine Reihe von Antikörpern angewendet werden, und solange eine konsistente BBB-Öffnung erreicht wird, kann die Bindung des Antikörpers an ein Ziel im Gehirn beurteilt werden. Der scannende Ultraschallansatz erreicht eine reproduzierbare Öffnung der BHS über ein gesamtes Mausgehirn.
Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass das Auftreten und das Ausmaß der BBB-Öffnung nicht beobachtet wird, während die Maus am Leben ist. Diese Einschränkung könnte überwunden werden, indem MRT-Bildgebung mit Gadoliniumkontrastmittel in das Verfahren einbezogen wird, aber dies erhöht den Zeit- und Kostenaufwand des Verfahrens erheblich.
Beschrieben wird hier ein Protokoll zur einmaligen Beschallung und einmaligen Verabreichung von Antikörpern, mit dem bestimmt werden kann, wie viel erhöhte Aufnahme von Antikörpern erreicht werden kann und wo sie sich nach der Entbindung im Gehirn befinden. Das Protokoll kann auch in einer Längsschnittstudie verwendet werden, um die therapeutischen Wirkungen der Antikörperabgabe zu bewerten. In einer Behandlungsstudie kann das Protokoll mit einem Interbehandlungsintervall von einer Woche oder länger wiederholt werden, um das therapeutische Potenzial eines Antikörpers zu bewerten, der an das Gehirn abgegeben wird. Das therapeutische Potenzial des durch Ultraschall abgegebenen Antikörpers kann in transgenen Mausmodellen neurodegenerativer Erkrankungen beurteilt werden. Die Auswertung der therapeutischen Wirkung könnte Verhaltenstests sowie Histologie und Biochemie für die Spiegel pathologischer Proteine wie Tau, Amyloid-β oder Synuclein umfassen.
Abschließend haben wir eine Methode beschrieben, um die Blut-Hirn-Schranke bei Mäusen zu öffnen, um fluoreszenzmarkierte Antikörper zu liefern. Diese Methode wird für Forscher von Interesse sein, die therapeutische Ansätze für neurodegenerative Erkrankungen evaluieren.
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Disclosures
Wir haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken der Unterstützung durch den Nachlass von Dr. Clem Jones AO, dem National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], der Metal Foundation und der Regierung des Bundesstaates Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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