Summary
Qui viene presentato un protocollo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) sia focalmente che attraverso un cervello di topo per fornire anticorpi marcati fluorescentemente e attivare la microglia. Viene inoltre presentato un metodo per rilevare la somministrazione di anticorpi e l'attivazione della microglia mediante istologia.
Abstract
Solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che colpiscono le malattie del cervello sono assorbiti dal cervello. L'ecografia focalizzata offre la possibilità di aumentare l'assorbimento di anticorpi e l'impegno attraverso l'apertura transitoria della barriera emato-encefalica (BBB). Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la BBB utilizzando microbolle, in concomitanza con l'applicazione di ultrasuoni focalizzati attraverso il cranio mirando a più punti, un approccio a cui ci riferiamo come ecografia a scansione (SUS). Gli effetti meccanici delle microbolle e degli ultrasuoni sui vasi sanguigni aumentano il trasporto paracellulare attraverso la BBB separando transitoriamente le giunzioni strette e migliorano la transcitosi mediata dalle vescicole, consentendo agli anticorpi e agli agenti terapeutici di attraversarsi efficacemente. Inoltre, gli ultrasuoni facilitano anche l'assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale in cellule cerebrali come i neuroni in cui l'anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici. Nei nostri studi, vengono preparati anticorpi marcati con fluorescenza, mescolati con microbolle a base lipidica preparate internamente e iniettati nei topi immediatamente prima che la SUS venga applicata al cervello. L'aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Per tenere conto delle alterazioni nella normale omeostasi cerebrale, la fagocitosi microgliale può essere utilizzata come marcatore cellulare. I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio interessante per il trattamento delle malattie neurodegenerative.
Introduction
L'ecografia terapeutica è una tecnologia emergente volta a trattare le malattie del cervello in modo non invasivo, in parte facilitando l'accesso di agenti terapeutici al cervello1,2,3. Poiché solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che prendono di mira le malattie cerebrali viene assorbita e trattenuta nel cervello4, gli ultrasuoni terapeutici offrono la possibilità di aumentarne l'assorbimento e l'impegno target5,6.
Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando microbolle. Per raggiungere questo obiettivo, gli ultrasuoni vengono applicati attraverso il cranio nel cervello in più punti utilizzando una modalità di scansione a cui ci riferiamo come ultrasuoni di scansione (SUS)7. L'interazione meccanica tra l'energia ultrasonica, le microbolle iniettate per via endovenosa e la vascolarizzazione cerebrale separa transitoriamente le giunzioni strette della BBB in un dato volume di sonicazione, consentendo agli anticorpi e ad altri carichi, compresi gli agenti terapeutici, di attraversare efficacemente questa barriera7,8,9 . Inoltre, gli ultrasuoni hanno dimostrato di facilitare l'assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale nelle cellule cerebrali, come i neuroni, dove l'anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici5,10.
La malattia di Alzheimer è caratterizzata da una patologia amiloide-β e tau11 e una serie di modelli animali è disponibile per sezionare meccanismi patogenetici e convalidare strategie terapeutiche. Un approccio SUS, con il quale gli ultrasuoni vengono applicati in un modello sequenziale su tutto il cervello, se ripetuti in diverse sessioni di trattamento, possono ridurre la patologia della placca amiloide nel cervello dei topi mutanti della proteina precursore dell'amiloide-β-depositante l'amiloide (APP) e attivare microglia che assorbono l'amiloide, portando a un miglioramento della funzione cognitiva7. L'apertura BBB con ultrasuoni e microbolle riduce anche la patologia tau nei topi transgenici tau pR5, K3 e rTg4510 tau5,12,13. È importante sottolineare che, mentre la microglia rimuove i depositi proteici extracellulari, uno dei meccanismi di clearance alla base delle patologie intraneuronali indotte dalla SUS è l'attivazione dell'autofagia neuronale12.
Qui, delineiamo un processo sperimentale, mediante il quale vengono preparati anticorpi marcati fluorescentemente e quindi miscelati con microbolle a base lipidica interne, seguite da iniezione retroorbitale in topi anestetizzati. L'iniezione retroorbitale è un'alternativa all'iniezione della vena della coda che abbiamo trovato ugualmente efficace e più semplice da eseguire ripetutamente. Questo è immediatamente seguito dall'applicazione di SUS al cervello. Per determinare l'assorbimento terapeutico degli anticorpi, i topi vengono sacrificati e l'aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Come proxy del cambiamento nell'omeostasi cerebrale, l'attività fagocitica microgliale è determinata dall'istologia e dalla ricostruzione volumetrica 3D.
I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio potenzialmente attraente per il trattamento delle malattie neurodegenerative. Il protocollo può essere applicato in modo simile ad altri farmaci candidati, nonché a carichi modello come dextrans etichettati fluorescentemente di dimensioni definite14.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale dell'Università del Queensland.
1. Preparazione di microbolle interne
- Pesare un rapporto molare 9:1 di 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[ammino (polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio). Sono necessari 0,5 mg di miscela lipidica per 1 mL di soluzione di microbolle. In alternativa, i lipidi possono essere acquistati già nel cloroformio, se si utilizzano lipidi pre-disciolti si procede al passaggio 1.3.
- Sciogliere il lipide in un piccolo volume di cloroformio in un becher di vetro.
- Evaporare il cloroformio con un evaporatore o un flusso di azoto.
- Reidratare il film lipidico essiccato con 10 ml di PBS + 10% di glicerolo + 10% di soluzione di glicole propilenico che è stata filtrata attraverso un filtro da 0,22 μm.
- Posizionare la soluzione lipidica reidratata in un sonicatore a bagnomaria impostato a 55 °C (al di sopra della temperatura di fusione dei lipidi) e sonicare fino a completa dissoluzione.
- Soluzione lipidica aliquota in flaconcini HPLC autoclavati da 1,5 mL e avvitare i tappi dei setti.
- Aspirare tutta l'aria nel flaconcino con una siringa da 5 mL dotata di un ago da 27 G e creare un vuoto nel flaconcino.
- Aggiungere l'octofluoropropano al flaconcino con la siringa inclusa, prelevando il gas dal contenitore. Riempire il flaconcino con 1-2 mL di ottafluoropropano leggendo il volume nella siringa.
- Sigillare ogni flaconcino con pellicola di paraffina e conservare in frigorifero.
- Il giorno dell'esperimento, portare il flaconcino a temperatura ambiente, aggiungere 0,5 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% al flaconcino, quindi posizionare il flaconcino in un amalgamatore e agitare per 45 s (tempo preimpostato) per produrre le microbolle.
2. Controllo di qualità delle microbolle utilizzando un contatore coulter
- Estrarre la soluzione di microbolle dall'amalgamatore e sfiatare il gas dal flaconcino perforando i setti con un ago da 19 G.
- Diluire la soluzione di microbolle eseguendo diluizioni seriali 1:5.000 in due fasi aggiungendo 100 μL di soluzione di microbolle in 5 mL di soluzione a flusso filtrato utilizzando una siringa da 1 ml con ago da 19 G, quindi prendendo 100 μL di soluzione di microbolle diluita 1:50 e pipettando in 10 mL di soluzione a flusso filtrato in una cuvetta utilizzando una pipetta.
- Controllare che il serbatoio dell'elettrolita abbia una soluzione di flusso sufficiente e che il serbatoio dei rifiuti sia vuoto.
- Posizionare la cuvetta nella contropiattaforma coulter e bloccarla in posizione. Utilizzare un'apertura di 30 μm per l'acquisizione del campione.
- Nel software, caricare il metodo operativo standard (SOM), quindi selezionare Modifica SOM | concentrazione. Immettere la diluizione 5000x.
- Nel software, scegli un nome di file adatto. Ad esempio, microbubble_1_date.
- Caricare e fissare la cuvetta nella piattaforma.
- Nel software selezionare Esegui| Visualizzare in anteprima e verificare che la concentrazione del campione sia inferiore al 10%. Se questo numero è superiore al 10%, eseguire una nuova diluizione delle microbolle con un fattore di diluizione più elevato.
- Selezionare 'Start' per iniziare un'acquisizione del campione per ottenere la lettura iniziale.
- Risciacquare l'apertura del contatore Coulter con una soluzione di flusso filtrata dopo ogni misurazione. Ripetere i passaggi 2.2-2.9 per ottenere 3 repliche.
- Posizionare una cuvetta con soluzione di microbolle diluita in un bagno d'acqua sonicatore e sonicare per 30 s.
- Misurare la soluzione con microbolle sonicate ed etichettarla come vuota.
- Nel software, sottrarre la lettura finale dalla lettura iniziale. Questo sottrae tutte le particelle che non sono microbolle e non contengono gas.
- Selezionare Visualizza risultati nel software per visualizzare la concentrazione di microbolle, la distribuzione dimensionale, la dimensione media e la concentrazione di volume.
3. Etichettatura degli anticorpi fluorescenti
- Ottenere una soluzione da 1 mg/mL di IgG di topo in PBS senza additivi.
- Etichettare 1 mg di IgG del mouse con AlexaFluor 647 in tampone di bicarbonato di sodio 0,1 M seguendo le istruzioni del produttore presenti nel kit. Questa quantità di IgG marcate fluorescentemente è sufficiente per eseguire questa procedura su 5-7 topi adulti in cui viene somministrata una dose di anticorpi di 5 mg/kg.
- Aggiungere il colorante alla soluzione di IgG in tampone di bicarbonato di sodio 0,1 M e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Purificare l'anticorpo marcato fluorescente pipettando la soluzione anticorpale in una colonna di spin e centrifugando a 1.000 x g per 5 minuti. La tintura libera rimarrà nel letto della colonna.
- Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione proteica. Misurare l'assorbanza della soluzione coniugata a 280 nm e 650 nm (A280 e A650). Calcola la concentrazione di proteine nel campione usando l'equazione:
Concentrazione proteica (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x fattore di diluizione / 203.000. - Utilizzare uno spettrofotometro per calcolare il grado di etichettatura utilizzando l'equazione:
colorante per mole proteina = A650 x fattore di diluizione / 239 000 x concentrazione proteica (M).
NOTA: un grado accettabile di etichettatura è di 3-7 moli colorante per proteina talpa e il grado di etichettatura tipicamente ottenuto è di circa 6.
4. Configurazione ad ultrasuoni
- Utilizzando il sistema ad ultrasuoni focalizzato, aggiungere il distanziatore da 5 mm al bolo d'acqua per posizionare il fuoco ad ultrasuoni 9 mm sotto il fondo del bolo d'acqua.
- Riempire il bolo d'acqua con circa 300 ml di acqua deionizzata che è stata degassata con un degasatore in linea per 20 minuti (il contenuto di ossigeno deve essere inferiore a 3 ppm). Posizionare l'array anulare nel bolo d'acqua riempito e utilizzare uno specchio dentale per verificare che non ci siano bolle d'aria sulla superficie. Se presente sulla superficie, rimuovere l'array anulare e sostituirlo nel bolo d'acqua.
- Avviare il software applicativo. Nel menu forma d'onda, selezionate Imposta ciclo di lavoro della forma d'onda. Le impostazioni sono PRF (Hz) 10, duty cycle 10%, messa a fuoco 80 mm, frequenza centrale 1 MHz, ampiezza (pressione negativa di picco MPa) 0,65 MPa, indice meccanico = 0,65. Premere Imposta per definire la forma d'onda e memorizzarla in memoria.
NOTA: il sistema a ultrasuoni focalizzato è pre-calibrato dal produttore da misurazioni effettuate da un idrofono calibrato. - Nel software del sistema a ultrasuoni focalizzato, definire un piano di trattamento. Ciò richiede la definizione di una regione di trattamento composta da più siti di trattamento individuali e la definizione di azioni da intraprendere in ciascuno di tali siti di trattamento. In questo caso, la zona di trattamento è un emisfero del cervello del topo.
- Nella finestra del controller di movimento, accedete alla scheda Scansione e immettete il valore di avvio, arresto e incremento per il movimento nella quota x e il valore di avvio, arresto e incremento per il movimento nella direzione y. Immettere i valori per X: start -4, stop 3.50 e Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
- Definire le azioni per i siti di trattamento. Nella finestra del controller di movimento, selezionare il pulsante Evento . Nella finestra di modifica degli script, selezionare un elenco di azioni che verranno eseguite nell'ordine selezionato in ciascun sito di trattamento. Impostare Tipo di movimento sulla griglia raster nella parte superiore della finestra dello script. Nella scheda eventi selezionare Aggiungi azioni per spostarle nel pannello script e aggiungere Sposta in modo sincrono, Avvia trigger arb, attendi, Interrompi trigger arb. Fare clic sull'azione di attesa e selezionare un tempo di attesa di 6.000 ms.
NOTA: Queste impostazioni renderanno il trattamento una griglia 6 x 5 di punti di trattamento distanziati di 1,5 mm l'uno dall'altro, con ogni punto che ha una durata del trattamento di 6 s. La durata totale per sonicare un cervello di topo è di circa 3 minuti. Questa griglia di trattamento è adatta per topi adulti C57/Bl6 di peso di circa 30 g. La dimensione della griglia dei punti di trattamento può essere regolata verso l'alto o verso il basso a seconda delle dimensioni del mouse.
5. Preparazione degli animali
- Pesare il mouse con una bilancia accurata a 0,1 g.
- Anestetizzare il topo con 90 mg/kg di ketamina e 6 mg/kg di xilazina per via intraperitoneale. Test per l'assenza di riflessi con un pizzico della punta. In alternativa, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano utilizzando un appropriato apparato anestetico inalatorio con una maschera facciale appropriata. Se si utilizza isoflurano, il mouse deve essere posizionato su un cuscinetto di calore durante l'ecografia per prevenire l'ipotermia.
- Utilizzare un rasoio elettrico per radere i capelli dalla testa dell'animale, quindi applicare la crema per la depilazione con un batuffolo di cotone, lasciare in posa per 2-3 minuti o fino a quando i capelli non vengono puliti con un pezzo di garza umida. Fai attenzione che la crema per la depilazione non penetri negli occhi del topo.
- Segna il centro della testa del mouse con un pennarello permanente. Il trasduttore ha un foro al centro e la messa a fuoco e il punto focale del trasduttore possono essere allineati visivamente.
- Riempire una piccola barca di pesatura che in precedenza ha avuto il fondo tagliato e sostituito con un involucro di plastica incollato sul fondo della barca di pesatura con gel ad ultrasuoni. Questo funge da distanziatore da 8 mm e fornisce un buon accoppiamento alla testa del mouse e consente l'ispezione visiva della messa a fuoco del trasduttore allineato con la testa del mouse.
6. Preparazione di microbolle
- Riscaldare un flaconcino di microbolle a temperatura ambiente. Per attivare, aggiungere 0,5 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% al flaconcino e mettere in un amalgamatore per agitare per 45 s per produrre le microbolle.
- Sfogare il flaconcino perforando i setti con un ago da 27 G.
7. Trattamento ad ultrasuoni
- Invertire il flaconcino delle microbolle e prelevare delicatamente 1 μL/g di peso corporeo della soluzione. A questo aggiungere la soluzione di anticorpi marcati fluorescentemente e mescolare delicatamente nella siringa. Il volume massimo iniettato è di 150 μL.
NOTA: le microbolle preparate internamente sono circa 60 volte meno concentrate rispetto a quelle clinicamente utilizzate (ad esempio, le microbolle Definity). Regolare il volume o la concentrazione in modo tale che il numero di microbolle iniettate sia simile a quelli clinicamente utilizzati (es. Definizione 1,2 x 108 microbolle/kg di peso corporeo). - Iniettare retroorbitalmente la microbolla e la soluzione anticorpale, avendo cura di iniettare delicatamente e lentamente. Quindi, applicare un unguento oftalmico agli occhi del topo.
- Posizionare il mouse nel supporto della testa (vedere Tabella dei materiali) e fissare il naso del mouse. Quindi posizionare la piccola barca di pesatura piena di gel ad ultrasuoni sulla parte superiore della testa.
- Abbassare il bolo d'acqua fino a quando non si trova sopra il gel ad ultrasuoni nella barca di pesatura.
- Utilizzare il joystick per spostare la messa a fuoco del trasduttore al centro della testa. Selezionate Reimposta origine (Reset Origin ) nella scheda Movimento (Motion).
- Selezionare la scansione completa. I passaggi 7.3-7.6 richiederanno 2 minuti.
- Per coerenza, impostare un timer per garantire un ritardo di 2 minuti tra l'iniezione di microbolle e la selezione della scansione completa.
- Al termine del trattamento, applicare un unguento oftalmico agli occhi e posizionare il topo in una camera di recupero riscaldata. Se si osserva ipotermia durante la procedura, un cuscinetto riscaldante può essere posizionato sotto il mouse per fornire calore supplementare durante la procedura.
8. Raccolta e lavorazione dei tessuti
- Nel momento di interesse dopo la somministrazione dell'ecografia (almeno 1 ora per rilevare alti livelli di anticorpi nel cervello) anestetizzare profondamente il topo con un sovradosaggio di soluzione di Pentobarbitone (100 mg/kg) e perfondere transcardialmente il topo con 30 ml di PBS. È necessaria una buona perfusione per rilevare specificamente gli anticorpi marcati con fluorescenza che sono stati consegnati al cervello.
- Raccogliere il cervello e fissare per immersione in PFA al 4% per 24 ore a 4 °C, quindi lavare con PBS.
- Immagina il cervello in uno scanner a infrarossi posizionando il cervello sul vassoio e acquisendo un'immagine nel canale a 700 nm.
NOTA: Dopo la fissazione, il cervello viene rimosso dal PFA, lavato in PBS e sezionato. In alternativa, può essere posto in soluzione crioprotettiva di glicole etilenico per 24 ore a 4 °C o fino a quando non è immerso, quindi spostato in un nuovo flaconcino contenente crioprotettore e posto a -20 °C per la conservazione a lungo termine. - Sezionare il freddo cerebrale in PBS usando un vibratoma. Incollare il cervello alla piattaforma e tagliare sezioni di 30-40 μm e raccogliere in PBS.
NOTA: L'autofluorescenza lisosomiale (prevalente in sezioni di animali di età superiore a circa 12 mesi) deve essere sbiancata mediante illuminazione notturna delle sezioni in una scatola a camera luminosa, a temperatura ambiente e in PBS contenente azide (0,02%) per bloccare la crescita batterica.
9. Colorazione dei tessuti e acquisizione delle immagini
- Trasferire le sezioni alla soluzione bloccante (5% BSA in 0,2% Triton/PBS) per 2 ore a temperatura ambiente, quindi lavare le sezioni 3x sostituendo la soluzione con 0,2% Triton/PBS.
- Incubare sezioni a 4 °C durante la notte con gli anticorpi primari contro Iba1 (diluizione 1:1.000) e CD68 (diluizione 1:500), in Triton/PBS allo 0,2%, seguiti da 3x lavaggi con 0,2% Triton/PBS.
- Incubare sezioni per 2 ore a temperatura ambiente con anticorpi secondari fluorescenti (diluizione 1:500), seguite da 3x lavaggi con solo Triton/PBS allo 0,2%.
NOTA: I nuclei possono anche essere colorati utilizzando la soluzione DAPI (0,5 μg/mL). - Trasferire le sezioni su una slitta e coprire il coperchio con un supporto di montaggio rigido. Concedere tempo sufficiente affinché il supporto di montaggio si solidifichi prima della visualizzazione e dell'acquisizione dell'immagine (durante la notte).
- Con un microscopio confocale ottenere immagini z-stack (almeno 10 μm di profondità e 0,3 μm di dimensione del passo, 10 immagini per animale) dell'area cerebrale mirata agli ultrasuoni utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo di almeno 40x di ingrandimento.
NOTA: Fare attenzione ad acquisire immagini all'interno della gamma dinamica del segnale, evitando sotto/sovraesposizione. Salvare i file di immagine nel formato software corrispondente utilizzato dal microscopio.
10. Analisi delle immagini
- Convertire i file di microscopia z-stack utilizzando l'importatore di file del software di analisi delle immagini.
- Aprire i file convertiti nel software e regolare l'intensità del canale Iba1 per osservare le cellule microgliali.
- Ritaglia una singola cella microgliale disegnando una casella intorno ad essa, seleziona "ritaglia" e salva il nuovo file.
- Costruisci il rendering della superficie 3D del segnale IBA1 tramite:
- Aprire il file Imaris a cella singola generato nel passaggio precedente.
- Aggiungere un'area al file.
- Selezionare il canale corrispondente alla colorazione Iba1.
- Applicare una soglia che dovrebbe sovrapporsi alla colorazione Iba1
- Selezionare solo la struttura di interesse che sta formando la cellula microgliale di interesse
- Finalizzare il processo
- Ottenere e registrare il volume della colorazione Iba1
- Costruisci il rendering della superficie 3D della colorazione CD68
- All'interno del sottofile di superficie IBA1, mascherare il canale CD68 e rimuovere i voxel all'esterno della colorazione IBA1
- Aggiungere una nuova superficie al file
- Selezionare il canale corrispondente alla colorazione CD68
- Applicare una soglia che dovrebbe sovrapporsi alla colorazione CD68 e che corrisponda il più possibile ai volumi di colorazione
- Finalizzare il processo, poiché solo le strutture CD68 intra-microgliali saranno presenti in questo file e, quindi, non richiedono un altro passaggio di filtraggio della soglia
- Ottenere e registrare il numero e il volume medio delle strutture positive CD68
- Calcolare il volume relativo delle strutture CD68 per le corrispondenti strutture IBA1 come misura dell'attivazione microgliale in uno stato fagocitico.
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo, gli anticorpi marcati con fluorescenza vengono consegnati al cervello e possono essere rilevati, insieme all'attivazione della microglia. La conclusione che si può trarre è che l'uso di ultrasuoni focalizzati e microbolle migliora notevolmente l'assorbimento cerebrale degli anticorpi e può fornire anticorpi a tutto il cervello o all'emisfero di un topo se usato in modalità di scansione. La Figura 1 mostra il dispositivo di applicazione a ultrasuoni TIPS (diversi componenti etichettati) utilizzato per aprire la BBB. La Figura 2 mostra i risultati rappresentativi delle contromisure di Coulter di dimensioni e concentrazione che dovrebbero essere ottenute quando le microbolle sono prodotte correttamente. Per visualizzare facilmente la consegna, gli anticorpi sono stati etichettati con un colorante fluorescente rosso lontano. L'assorbimento di anticorpi da parte del cervello può essere facilmente visualizzato in tutto il cervello o sezioni utilizzando uno scanner a infrarossi o utilizzando la microscopia fluorescente su sezioni cerebrali. Le sezioni cerebrali mostrano la posizione dell'anticorpo marcato fluorescentemente a livello microscopico. I risultati rappresentativi per la somministrazione di ultrasuoni di scansione all'ippocampo dell'anticorpo anti-tau marcato fluorescentemente RN2N sono mostrati nella Figura 3. Per osservare qualsiasi alterazione della normale omeostasi cerebrale come conseguenza della SUS e della consegna di anticorpi, una lettura è stata il contenuto lisosomiale microgliale in relazione alla fagocitosi. La Figura 4 mostra la colorazione rappresentativa per la microglia utilizzando Iba1 e il marcatore specifico del lisosoma microgliale CD68 per determinare se le microglia diventano più fagocitiche dopo la consegna dell'anticorpo.
Figura 1: Il sistema a ultrasuoni focalizzato utilizzato per fornire ultrasuoni con componenti critici etichettati. (A) Il supporto in gel fatto in casa che funge da distanziatore da 8 mm. (B) Visualizza attraverso il trasduttore mostrando come il target è allineato visivamente con la messa a fuoco (C). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misure di controllo qualità di microbolle preparate internamente. (A) Apparecchiature di contatore Coulter utilizzate per ottenere statistiche riassuntive (B) e distribuzione dimensionale delle microbolle in numero (C) e distribuzione in volume (D). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Somministrazione di anticorpi marcati fluorescenti nel cervello utilizzando SUS. (A) Un frammento di anticorpo marcato fluorescente specifico per un'isoforma tau consegnato da solo, SUS da solo, e un trattamento combinato hanno rivelato un aumento dell'assorbimento dell'anticorpo da parte di un emisfero sonicato quando combinato con SUS utilizzando l'imaging fluorescente nel vicino infrarosso di un emisfero del cervello. È stata applicata una tabella di ricerca (LUT), con maggiore intensità di fluorescenza in unità arbitrarie visualizzate in colori più caldi. (B) La quantificazione della fluorescenza è stata effettuata senza sottrarre i livelli di controllo solo SUS della fluorescenza di fondo. Media ± SEM mostrata. (C) Aumento dell'assorbimento dell'anticorpo marcato fluorescentemente da parte dei neuroni dell'ippocampo mostrato in immagini a basso e alto ingrandimento di sezioni cerebrali. Nel trattamento combinato, l'anticorpo si distribuisce nei corpi cellulari e persino nei dendriti come mostrato per i neuroni dell'ippocampo. Blu=DAPI, magenta=frammento anticorpale. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Etichettatura rappresentativa dell'immunofluorescenza per la microglia, che mostra la morfologia prevista della microglia e resa in 3D con il software di analisi delle immagini. La morfologia della microglia è osservata in verde e i livelli e la distribuzione di CD68 sono osservati in rosso. Scala bar 10 μm. Verde=Iba1, rosso=CD68. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono essere consegnati al cervello utilizzando ultrasuoni focalizzati insieme a microbolle applicate in modalità di scansione. La somministrazione di anticorpi, la morfologia microgliale e l'allargamento lisosomiale possono essere rilevati al microscopio a fluorescenza dopo l'ecografia a scansione. Le microglia possono assorbire nei loro lisosomi anticorpi e antigeni a cui gli anticorpi si sono legati in un processo mediato dal recettore Fc4.
Ci sono una serie di passaggi critici per ottenere l'apertura BBB ripetibile e la consegna di anticorpi utilizzando questo metodo. È fondamentale garantire un buon accoppiamento tra il trasduttore ad ultrasuoni e la testa del mouse. Rimuovere tutti i peli sulla testa del mouse e assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'accoppiamento. Le caratteristiche delle microbolle preparate internamente sono fondamentali per il successo. Le microbolle devono avere una concentrazione sufficiente di 108 microbolle/ml e una distribuzione dimensionale tale che oltre il 90% delle microbolle abbia un diametro inferiore a 10 μm. Questo perché le microbolle più grandi sono note per essere filtrate dalla circolazione dai polmoni. Una dimensione mediana accettabile è compresa tra 1 -3 μm. Le microbolle devono essere maneggiate e iniettate delicatamente per evitare di distruggerle nella siringa. È importante che l'ecografia venga applicata entro e non oltre 2 minuti dall'iniezione delle microbolle che può essere ottenuta con la pratica. Il targeting di un intero cervello o di un intero emisfero è facilmente raggiungibile con l'approccio SUS e l'accuratezza del targeting è improbabile che sia un problema quando si prendono di mira grandi regioni. Una regione del cervello più piccola come l'ippocampo o lo striato può anche essere presa di mira con successo, ma in questo caso è importante che l'attenzione si sovrapponga alla regione mirata. L'altezza del cervello di un topo è simile alla lunghezza assiale del fascio di ultrasuoni focalizzato a 1 MHz utilizzando un tipico trasduttore ad ultrasuoni, in modo che il trasduttore debba essere spostato solo nella dimensione x e y e non nella dimensione z. Questo può essere determinato dalla conoscenza delle coordinate stereotassiche per una particolare struttura cerebrale e dalla visualizzazione delle suture lambdoide e sagittale attraverso la pelle depilata del topo.
Qui dimostriamo una tecnica che utilizza iniezioni retroorbitali per fornire microbolle e anticorpi. Un'alternativa alle iniezioni retroorbitali sono le iniezioni della vena della coda, che è anche una tecnica efficace per fornire microbolle e anticorpi. I vantaggi dell'iniezione retroorbitale è che è tecnicamente meno impegnativa delle iniezioni della vena della coda e può essere ripetuta più volte (alternando occhio di iniezione) con un rischio minimo di danni ai tessuti.
Se nel cervello non viene rilevato alcun anticorpo marcato fluorescente, è probabile che la BBB non si sia aperta. La risoluzione dei problemi dovrebbe concentrarsi sull'ottenimento di una soluzione concentrata di microbolle e sull'iniezione in modo da non distruggere le microbolle e fornire gli ultrasuoni entro due minuti dal tempo di iniezione. Se non si verifica alcuna apertura BBB, l'impostazione della pressione negativa di picco può essere aumentata, con l'avvertenza che pressioni negative di picco più elevate aumentano la possibilità di causare microemorragie che non rileviamo a un'impostazione di pressione negativa di picco di 0,65 MPa utilizzando le impostazioni descritte. A seconda della specificità dell'antigene dell'anticorpo, il modello di colorazione sarà diverso. Il modello di colorazione ottenuto quando si inietta un anticorpo anti-tau è mostrato nella Figura 2.
Questa tecnica può essere applicata a una serie di anticorpi e finché si ottiene un'apertura BBB coerente, è possibile valutare il legame dell'anticorpo a un bersaglio nel cervello. L'approccio ecografico a scansione raggiunge l'apertura della BBB su un intero cervello di topo in modo riproducibile.
Una limitazione di questa tecnica è che il verificarsi e l'estensione dell'apertura BBB non viene osservata mentre il topo è vivo. Questa limitazione potrebbe essere superata includendo l'imaging MRI con agente di contrasto al gadolinio nella procedura, ma questo aumenta significativamente il tempo e il costo della procedura.
Qui è descritta una singola sonicazione e una singola somministrazione di protocollo anticorpale che può essere utilizzata per determinare quanto aumento dell'assorbimento di anticorpi può essere raggiunto, così come dove si trovano nel cervello dopo il parto. Il protocollo può anche essere utilizzato in uno studio longitudinale per valutare gli effetti terapeutici della somministrazione di anticorpi. In uno studio di trattamento il protocollo può essere ripetuto con un intervallo inter-trattamento di una settimana o più al fine di valutare il potenziale terapeutico di un anticorpo consegnato al cervello. Il potenziale terapeutico dell'anticorpo erogato dagli ultrasuoni può essere valutato in modelli murini transgenici di malattie neurodegenerative. Le letture dell'effetto terapeutico potrebbero includere test comportamentali e istologia e biochimica per i livelli di proteine patologiche, ad esempio tau, amiloide-β o sinucleina.
In conclusione, abbiamo delineato un metodo per aprire la barriera emato-encefalica nei topi per fornire anticorpi marcati fluorescentemente. Questo metodo sarà di interesse per i ricercatori che valutano gli approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo il sostegno della tenuta del Dr Clem Jones AO, del National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], della Metal Foundation e del governo statale del Queensland (DSITI, Dipartimento di Scienza, Information Technology e Innovazione).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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