Summary
여기에 제시된 프로토콜은 대소 또는 마우스 뇌 전체에 걸쳐 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 일시적으로 열어 형광 표지 항체를 전달하고 미세 아교세포를 활성화시키는 프로토콜입니다. 또한 조직학에 의한 항체 전달 및 미세아교세포 활성화를 검출하는 방법이 제시된다.
Abstract
뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 단지 작은 부분만이 뇌에 의해 흡수된다. 집중 초음파는 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 일시적인 개방을 통해 항체의 흡수와 참여를 증가시킬 수있는 가능성을 제공합니다. 우리 실험실에서는 여러 지점을 대상으로 두개골을 통한 집중 초음파 적용과 함께 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 BBB를 통해 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다.이 접근법은 주사 초음파 (SUS)라고 부릅니다. 혈관에 대한 마이크로버블과 초음파의 기계적 효과는 단단한 접합부를 일시적으로 분리함으로써 BBB를 가로지르는 부세포 수송을 증가시키고 소포-매개 트랜스사이토시스를 향상시켜 항체와 치료제가 효과적으로 교차할 수 있게 한다. 또한, 초음파는 또한 항체가 세포체 전체와 심지어 신경 과정으로 분포하는 뉴런과 같은 뇌 세포로 간질성 뇌에서 항체의 흡수를 용이하게합니다. 우리의 연구에서, 형광 표지 된 항체가 준비되고, 사내에서 준비된 지질 기반 마이크로 버블과 혼합되어 SUS가 뇌에 적용되기 직전에 마우스에 주입됩니다. 그런 다음 뇌에서 증가 된 항체 농도가 정량화됩니다. 정상적인 뇌 항상성의 변화를 설명하기 위해, 미세아교세포 식균작용은 세포 마커로 사용될 수 있다. 생성 된 데이터는 항체의 초음파 전달이 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 매력적인 접근법임을 시사합니다.
Introduction
치료 초음파는 부분적으로 뇌에 대한 치료제의 접근을 촉진함으로써 비침습적 인 방식으로 뇌 질환을 치료하기위한 새로운 기술입니다1,2,3. 뇌 질환을 표적으로 하는 치료 항체의 극히 일부만이 뇌에 흡수되어 뇌에 유지되기 때문에4, 치료 초음파는 그들의 흡수와 표적 참여를 증가시킬 수 있는 가능성을 제공한다5,6.
우리 실험실에서는 마이크로 버블을 사용하여 다양한 형식의 항체가 혈액 - 뇌 장벽 (BBB)을 가로 질러 전달되는 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 개발하고 있습니다. 이를 달성하기 위해 초음파는 두개골을 통해 여러 지점에서 뇌에 적용되며 스캔 모드를 사용하여 초음파 (SUS)7라고 부릅니다. 초음파 에너지, 정맥 주사 마이크로 버블 및 뇌 혈관 구조 사이의 기계적 상호 작용은 주어진 초음파 처리 볼륨에서 BBB의 단단한 접합부를 일시적으로 분리하여 항체 및 치료제를 포함한 다른 화물이이 장벽을 효과적으로 통과 할 수있게합니다7,8,9 . 더욱이, 초음파는 간질성 뇌에서 뉴런과 같은 뇌 세포로 항체의 흡수를 촉진하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 항체는 세포체 전체와 심지어 신경질 과정으로 분포한다5,10.
알츠하이머 병은 아밀로이드 β 및 타우 병리학을 특징으로하며11 동물 모델의 호스트는 병원성 메커니즘을 해부하고 치료 전략을 검증 할 수 있습니다. 초음파가 뇌 전체에 순차적 인 패턴으로 적용되어 여러 치료 세션에 걸쳐 반복 될 때 SUS 접근법은 아밀로이드 β 침착 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 돌연변이 마우스의 뇌에서 아밀로이드 플라크 병리를 줄이고 아밀로이드를 흡수하는 미세 아교세포를 활성화하여인지 기능을 향상시킬 수 있습니다7. 초음파 및 마이크로버블을 이용한 BBB 개방은 또한 pR5, K3 및 rTg4510 타우 트랜스제닉 마우스5,12,13에서 타우 병리를 감소시킨다. 중요하게도, 미세아교세포는 세포외 단백질 침착물을 제거하는 반면, SUS에 의해 유도되는 신경내 병리에 대한 근본적인 클리어런스 메커니즘 중 하나는 뉴런 자가포식의 활성화이다12.
여기에서는 형광 표지 항체를 제조한 다음 사내 지질 기반 마이크로버블과 혼합한 다음 마취된 마우스에 역궤도 주사를 가하는 실험 과정을 간략하게 설명합니다. 역궤도 주사는 꼬리 정맥 주사의 대안이며, 우리는 똑같이 효과적이고 반복적으로 수행하는 것이 더 간단하다는 것을 발견했습니다. 이것은 즉시 SUS를 뇌에 적용하는 것으로 이어집니다. 치료 항체 흡수를 결정하기 위해, 마우스를 희생시키고 뇌에서 증가 된 항체 농도를 정량화합니다. 뇌 항상성 변화의 대리자로서, 미세아교세포 식세포 활성은 조직학 및 용적 3D 재구성에 의해 결정된다.
생성 된 데이터는 항체의 초음파 전달이 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 잠재적으로 매력적인 접근법임을 시사합니다. 상기 프로토콜은 다른 약물 후보물질뿐만 아니라 정의된 크기의 형광 표지된 덱스트란과 같은 모델 화물에도 유사하게 적용될 수 있다14.
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Protocol
모든 동물 실험은 퀸즐랜드 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었다.
1. 사내 마이크로버블 준비
- 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)의 9:1 몰비를 계량한다. 마이크로버블 용액 1 mL당 0.5 mg의 지질 혼합물이 요구된다. 대안적으로, 지질은 미리 용해된 지질을 사용하여 단계 1.3으로 진행하는 경우 클로로포름에서 이미 구입될 수 있다.
- 지질을 소량의 클로로포름에 유리 비이커에 녹인다.
- 클로로포름을 증발기 또는 질소 스트림으로 증발시킨다.
- 건조된 지질 필름을 0.22 μm 필터를 통해 여과된 PBS + 10% 글리세롤 + 10% 프로필렌 글리콜 용액 10 mL로 재수화시킨다.
- 재수화된 지질 용액을 55°C(지질의 용융 온도 이상)로 설정된 수조 초음파 처리기에 넣고 완전히 용해될 때까지 초음파 처리한다.
- 분취량 지질 용액을 오토클레이브된 1.5 mL HPLC 바이알에 넣고 셉타 캡 위에 나사로 고정시킨다.
- 바이알 내의 모든 공기를 27 G 바늘이 장착된 5 mL 주사기로 흡인하고 바이알에 진공을 생성한다.
- 포함 된 주사기로 바이알에 옥토 플루오로 프로판을 넣고 캐니스터에서 가스를 끌어 올립니다. 바이알을 1-2 mL의 옥타플루오로프로판으로 채우고 주사기 내의 부피를 판독한다.
- 각 바이알을 파라핀 필름으로 밀봉하고 냉장 보관하십시오.
- 실험 당일, 바이알을 실온으로 가져오고, 0.5 mL의 0.9% NaCl 용액을 바이알에 첨가한 다음, 바이알을 합병기에 넣고 45초(미리 설정된 시간) 동안 교반하여 마이크로버블을 생성한다.
2. 쿨터 카운터를 이용한 마이크로버블 품질 관리
- 마이크로 버블 용액을 합병기에서 꺼내어 19G 바늘로 셉타를 관통하여 바이알에서 가스를 배출하십시오.
- 두 단계를 수행하여 마이크로버블 용액을 희석하여 1:5,000 연속 희석액 100 μL를 19 G 바늘이 있는 1 ml 주사기를 이용하여 여과된 유동 용액 5 mL에 넣은 다음, 1:50의 희석된 마이크로버블 용액 100 μL를 취하여 피펫을 이용하여 큐벳에 여과된 유동 용액 10 mL를 넣고 피펫팅한다.
- 전해질 탱크에 충분한 유량 용액이 있고 폐탱크가 비어 있는지 확인하십시오.
- 쿠벳을 쿨터 카운터 플랫폼에 놓고 제자리에 고정하십시오. 시료 수집을 위해 30μm 조리개를 사용하십시오.
- 소프트웨어에서 표준 작동 방법(SOM)을 로드한 다음 SOM | 집중 편집을 선택합니다. 5000x 희석액을 입력합니다.
- 소프트웨어에서 적절한 파일 이름을 선택하십시오. 예를 들어, microbubble_1_date.
- 큐벳을 플랫폼에 로드하고 고정합니다.
- 소프트웨어에서 실행을 선택 합| 표본 농도가 10% 미만인지 미리 보고 확인합니다. 이 수치가 10%보다 높으면, 더 높은 희석 계수를 갖는 마이크로버블의 새로운 희석을 수행한다.
- '시작'을 선택하여 샘플 수집을 시작하여 초기 판독값을 얻습니다.
- 각 측정 후 Coulter 카운터의 조리개를 여과된 유동 용액으로 헹구십시오. 단계 2.2-2.9를 반복하여 3번의 반복실험을 얻습니다.
- 희석 된 마이크로 버블 용액이있는 큐벳을 초음파 처리기 수조에 넣고 30 초 동안 초음파 처리하십시오.
- 초음파 처리 된 마이크로 버블로 용액을 측정하고 공백으로 표시하십시오.
- 소프트웨어에서 초기 판독값에서 최종 판독값을 뺍니다. 이것은 마이크로 버블이 아니며 가스를 포함하지 않는 입자를 뺍니다.
- 소프트웨어에서 결과 표시 를 선택하여 마이크로버블 농도, 크기 분포, 평균 크기 및 부피 농도를 표시합니다.
3. 형광 항체 표지
- 첨가제 없이 PBS에서 마우스 IgG의 1 mg/mL 용액을 수득한다.
- 마우스 IgG 1mg을 0.1 M 중탄산나트륨 완충액에 AlexaFluor 647로 라벨링하여 키트에 위치한 제조업체의 지시에 따라 라벨링합니다. 형광 표지된 IgG의 이 양은 5 mg/kg 용량의 항체가 투여되는 5-7마리의 성인 마우스에서 이 절차를 수행하기에 충분하다.
- 염료를 0.1 M 중탄산나트륨 완충액 중의 IgG 용액에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 항체 용액을 스핀 컬럼에 피펫팅하고 1,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 형광 표지된 항체를 정제한다. 자유 염료는 칼럼 베드에 남아있을 것입니다.
- 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하십시오. 콘쥬게이트 용액의 흡광도를 280 nm 및 650 nm (A280 및 A650)에서 측정하였다. 방정식을 사용하여 샘플에서 단백질의 농도를 계산하십시오.
단백질 농도 (M) = [A280 - (A650 x 0.03)] x 희석 인자 / 203,000. - 분광 광도계를 사용하여 방정식을 사용하여 라벨링 정도를 계산하십시오.
몰 당 염료 단백질 몰 = A650 x 희석 인자 / 239 000 x 단백질 농도 (M).
참고 : 허용 가능한 라벨링 정도는 단백질 몰 당 3-7 몰 염료이며 일반적으로 얻은 라벨링 정도는 약 6입니다.
4. 초음파 설정
- 초점을 맞춘 초음파 시스템을 사용하여 5mm 스페이서를 워터 볼루스에 추가하여 초음파 초점을 물 볼루스 바닥 아래 9mm 아래에 배치하십시오.
- 20 분 동안 인라인 탈기로 탈기 된 약 300 mL의 탈이온수로 물 볼루스를 채 웁니다 (산소 함량은 3ppm 미만이어야합니다). 환형 배열을 채워진 물 볼루스에 넣고 치과 용 거울을 사용하여 표면에 기포가 없는지 확인하십시오. 표면에 있으면 환형 배열을 제거하고 물 볼루스에서 교체하십시오.
- 응용 프로그램 소프트웨어를 시작하십시오. 파형 메뉴에서 파 형 듀티 사이클 설정을 선택합니다. 설정은 PRF (Hz) 10, 듀티 사이클 10 %, 초점 80 mm, 중심 주파수 1 MHz, 진폭 (MPa 피크 음압) 0.65 MPa, 기계적 지수 = 0.65입니다. Set 을 눌러 파형을 정의하고 메모리에 저장합니다.
참고: 집중된 초음파 시스템은 제조업체가 보정된 수중 전화에서 수행한 측정으로부터 사전 보정합니다. - 집중된 초음파 시스템 소프트웨어에서 치료 계획을 정의하십시오. 이를 위해서는 다수의 개별 치료 부위로 구성된 치료 영역을 정의하고, 이들 각각의 치료 부위에서 취해야 할 조치를 정의해야 한다. 이 경우, 치료 구역은 마우스 뇌의 한 반구이다.
- 모션 컨트롤러 창에서 스캔 탭으로 이동하여 시작, x 차원의 동작 값을 중지 및 증가시키고 y 방향의 동작에 대한 값을 시작, 중지 및 증가시킵니다. X: 시작 -4, 중지 3.50 및 Y: -3.00, 중지 3, 증분 1.5, # 루프: 1의 값을 입력합니다.
- 치료 부위에 대한 조치를 정의합니다. 모션 컨트롤러 창에서 이벤트 단추를 선택합니다. 스크립트 편집 창에서 각 처리 사이트에서 선택한 순서대로 실행될 작업 목록을 선택합니다. 이동 유형을 스크립트 창 위쪽의 래스터 격자로 설정합니다. 이벤트 탭에서 작업 추가 를 선택하여 스크립트 패널로 이동하고 동기적으로 이동, 트리거 arb 시작 , 대기, 트리거 arb 중지를 추가합니다. 대기 작업을 클릭하고 6, 000ms의 대기 시간을 선택하십시오.
참고: 이러한 설정은 치료를 1.5mm 간격으로 이격된 치료 스폿의 6 x 5 그리드로 만들고, 각 스폿은 6초의 치료 기간을 갖습니다. 마우스 뇌를 초음파 처리하는 총 지속 시간은 약 3 분입니다. 이 크기 처리 격자는 대략 30 g의 성인 C57/Bl6 쥐를 위해 적당하다. 치료 스팟의 그리드의 크기는 마우스의 크기에 따라 위 또는 아래로 조정할 수 있습니다.
5. 동물 준비
- 0.1g까지 정확한 저울로 마우스의 무게를 재십시오.
- 90 mg / kg 케타민과 6 mg / kg 자일라진으로 마우스를 복강 내로 마취하십시오. 발가락 꼬집음으로 반사 신경이 없는지 테스트하십시오. 대안적으로, 마우스는 적절한 안면 마스크와 함께 적절한 흡입 마취 장치를 사용하여 이소플루란으로 마취될 수 있다. 이소플루란을 사용하는 경우, 저체온증을 예방하기 위해 초음파 중에 마우스를 열 패드에 올려 놓아야합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 동물의 머리에서 머리카락을 면도 한 다음 면봉으로 제모 크림을 바르고 2-3 분 동안 그대로 두거나 젖은 거즈 조각으로 머리카락을 깨끗하게 닦을 때까지 그대로 두십시오. 제모 크림이 마우스의 눈에 들어 가지 않도록주의하십시오.
- 마우스 머리의 중심을 영구 마커로 표시하십시오. 트랜스듀서는 중앙에 구멍이 있으며 트랜스듀서 초점과 초점 스폿을 시각적으로 정렬할 수 있습니다.
- 이전에 바닥이 잘린 작은 무게 보트를 채우고 초음파 젤로 계량 보트의 바닥에 붙어있는 플라스틱 랩으로 교체하십시오. 이것은 8mm 스페이서 역할을하며 마우스 머리에 좋은 결합을 제공하며 마우스 머리와 정렬 된 트랜스 듀서의 초점을 육안으로 검사 할 수 있습니다.
6. 마이크로버블 준비
- 마이크로버블 바이알을 실온으로 따뜻하게 합니다. 활성화하려면 0.5 mL의 0.9 % NaCl 용액을 바이알에 넣고 합병기에 넣고 45 초 동안 교반하여 마이크로 버블을 생성합니다.
- 27G 바늘로 셉타를 관통하여 바이알을 환기시킵니다.
7. 초음파 치료
- 마이크로버블의 바이알을 반전시키고 용액의 1μL/g 중량을 부드럽게 그립니다. 여기에 형광 표지된 항체의 용액을 첨가하고 주사기에 부드럽게 혼합한다. 주입된 최대 부피는 150 μL이다.
참고: 사내에서 제조된 마이크로버블은 임상적으로 사용되는 마이크로버블(예를 들어, Definity 마이크로버블)보다 약 60배 덜 농축된다. 주입된 마이크로버블의 수가 임상적으로 사용되는 것과 유사하도록 부피 또는 농도를 조정한다 (즉. 신정 1.2 x 108 마이크로 버블 / kg 체중). - 마이크로버블과 항체 용액을 소궤도로 주입하고, 부드럽고 천천히 주입하도록 주의한다. 그런 다음 안과 용 연고를 마우스의 눈에 바르십시오.
- 마우스를 헤드 홀더(자료 표 참조)에 놓고 마우스의 코를 고정시킵니다. 그런 다음 초음파 젤로 채워진 작은 계량 보트를 머리 위에 놓습니다.
- 무게 보트의 초음파 젤 위에 앉을 때까지 물 볼루스를 낮추십시오.
- 조이스틱을 사용하여 트랜스듀서 초점을 헤드 중앙으로 이동합니다. 동작 탭에서 원점 재설정 을 선택합니다.
- 스캔 완료를 선택합니다. 단계 7.3-7.6은 2분 정도 걸립니다.
- 일관성을 유지하려면 타이머를 설정하여 마이크로버블 주입과 전체 스캔 선택 사이에 2분 지연이 되도록 하십시오.
- 치료가 완료되면 안과 연고를 눈에 바르고 마우스를 따뜻한 회복 챔버에 넣으십시오. 절차 중에 저체온증이 관찰되면 온난 패드를 마우스 아래에 두어 절차 중에 보충 열을 제공 할 수 있습니다.
8. 조직 수확 및 가공
- 초음파 전달 후 관심있는 시점 (뇌에서 높은 수준의 항체를 검출하기 위해 적어도 1 시간)은 펜토바르비톤 용액 (100 mg / kg)의 과다 복용으로 마우스를 깊이 마취시키고 30 mL PBS로 마우스를 심폐 관류시킵니다. 뇌에 전달 된 형광 표지 항체를 특이적으로 검출하기 위해서는 좋은 관류가 필요합니다.
- 뇌를 수집하고 4°C에서 24시간 동안 4% PFA에 침지시켜 고정시킨 다음, PBS로 세척한다.
- 트레이에 뇌를 놓고 700nm 채널에서 이미지를 획득하여 적외선 스캐너에서 뇌를 이미지화합니다.
참고: 고정 후, 뇌는 PFA로부터 제거되고, PBS로 세척되고, 절편화된다. 대안적으로, 에틸렌 글리콜 동결보호제 용액을 4°C에서 24시간 동안 또는 침수될 때까지 배치하고, 이어서 바이알을 함유하는 새로운 냉동 보호제로 이동시키고, 장기간 보관을 위해 -20°C에 두어질 수 있다. - 비브라톰을 사용하여 PBS에서 뇌를 감기에 절편한다. 뇌를 플랫폼에 붙이고 30-40 μm 절편을 절단하고 PBS로 수집하십시오.
참고: 리소좀 자가형광(약 12개월 이상 된 동물의 절편에서 널리 퍼짐)은 박테리아 성장을 차단하기 위해 라이트 챔버 박스, 실온 및 아지드(0.02%)를 함유하는 PBS에서 절편의 야간 조명에 의해 표백되어야 합니다.
9. 조직 염색 및 이미지 획득
- 절편을 실온에서 2시간 동안 블로킹 용액(0.2% 트리톤/PBS 중 5% BSA)으로 옮긴 다음, 용액을 0.2% 트리톤/PBS로 교체하여 절편을 3배 세척한다.
- 절편을 0.2% 트리톤/PBS에서 Iba1 (희석 1:1,000) 및 CD68 (희석 1:500)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 동안 4°C에서 인큐베이션하고, 이어서 0.2% 트리톤/PBS로 3x 세척하였다.
- 절편을 형광 이차 항체 (희석 1:500)로 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.2% 트리톤/PBS로만 3x 세척한다.
참고: 핵은 DAPI 용액(0.5μg/mL)을 사용하여 염색할 수도 있습니다. - 섹션을 슬라이드로 옮기고 하드 세트 장착 미디어로 커버슬립을 만듭니다. 시각화 및 이미지 획득 전에(하룻밤) 장착 매체가 고형화되기에 충분한 시간을 허용하십시오.
- 공초점 현미경으로 공초점 현미경을 이용하여 초음파 표적화된 뇌 영역의 z-스택 이미지(최소 10 μm 깊이 및 0.3 μm 스텝 크기, 동물당 10 이미지)를 획득하고 적어도 40x 배율의 목표를 달성한다.
참고: 신호 다이나믹 레인지 내에서 이미지를 획득할 수 있도록 주의하여 언더/오버 노출을 피하십시오. 이미지 파일을 현미경에서 사용하는 해당 소프트웨어 형식으로 저장합니다.
10. 이미지 분석
- 이미지 분석 소프트웨어 파일 임포터를 사용하여 z-stack 현미경 파일을 변환합니다.
- 변환 된 파일을 소프트웨어로 열고 Iba1 채널의 강도를 조정하여 미세 아교 세포를 관찰하십시오.
- 그 주위에 상자를 그려 단일 미세 아교 세포를 자르고 '자르기'를 선택한 다음 새 파일을 저장하십시오.
- 다음을 통해 IBA1 신호의 3D 표면 렌더링을 빌드합니다.
- 이전 단계에서 생성된 단일 셀 Imaris 파일을 엽니다.
- 파일에 서피스를 추가합니다.
- Iba1 염색에 해당하는 채널을 선택하십시오.
- Iba1 염색과 겹쳐야 하는 역치를 적용하십시오.
- 관심있는 미세아교세포를 형성하는 관심 구조만을 선택하라.
- 프로세스 마무리
- Iba1 염색의 부피를 구하고 기록하십시오.
- CD68 염색의 3D 표면 렌더링 구축
- IBA1 표면 서브파일 내부에서, CD68 채널을 마스킹하고 IBA1 염색의 외부 복셀을 제거한다.
- 파일에 새 서피스 추가
- CD68 염색에 해당하는 채널을 선택하십시오.
- CD68 염색과 겹쳐야 하는 역치를 적용하고 염색 부피와 가능한 한 가깝게 일치시킨다.
- 미세아교세포 내 CD68 구조만 이 파일에 존재하므로 다른 임계값 필터링 단계가 필요하지 않으므로 프로세스를 마무리합니다.
- CD68 양성 구조체의 수 및 평균 부피를 획득하고 기록한다.
- 식세포 상태에서의 미세아교세포 활성화의 척도로서 그의 상응하는 IBA1 구조체 당 CD68 구조물의 상대적 부피를 계산한다.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 형광 표지 된 항체가 뇌로 전달되고 미세 아교세포 활성화와 함께 검출 될 수 있습니다. 도출 될 수있는 결론은 집중 초음파와 마이크로 버블을 사용하면 항체의 뇌 흡수를 현저하게 향상시키고 주사 모드에서 사용할 때 마우스의 전체 뇌 또는 반구에 항체를 전달할 수 있다는 것입니다. 그림 1은 BBB를 여는 데 사용되는 TIPS 초음파 응용 장치(레이블이 지정된 여러 구성 요소)를 보여 줍니다. 도 2는 마이크로버블이 올바르게 생성될 때 얻어져야 하는 크기 및 농도의 쿨터 카운터 측정으로부터의 대표적인 결과를 보여준다. 전달을 쉽게 시각화하기 위해, 항체를 원거리 적색 형광 염료로 표지하였다. 뇌에 의한 항체 흡수는 적외선 스캐너를 사용하거나 뇌 절편의 형광 현미경을 사용하여 뇌 전체 또는 절편에서 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 뇌 절편은 형광 표지된 항체의 위치를 현미경 수준에서 보여준다. 형광 표지된 항-타우 항체 RN2N의 해마로의 주사 초음파 전달을 위한 대표적인 결과는 도 3에 도시되어 있다. SUS 및 항체 전달의 결과로서 정상적인 뇌 항상성의 임의의 변화를 관찰하기 위해, 한 가지 판독은 식작용과 관련하여 미세아교세포 리소좀 함량이었다. 도 4 는 항체의 전달 후 미세아교세포가 더 식균화되는지를 확인하기 위해 Iba1 및 미세아교세포 특이적 마커 CD68을 이용한 미세아교세포에 대한 대표적인 염색을 보여준다.
그림 1: 중요한 구성 요소에 라벨이 부착된 상태에서 초음파를 전달하는 데 사용되는 집중 초음파 시스템. (A) 8mm 스페이서 역할을 하는 집에서 만든 젤 홀더. (B) 트랜스듀서를 통해 타겟이 초점과 시각적으로 어떻게 정렬되는지를 보여주는 뷰(C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 사내에서 준비된 마이크로버블의 품질 관리 측정. (A) 요약 통계 (B) 및 수 (C) 및 부피 분포 (D)의 마이크로 버블의 크기 분포를 얻는 데 사용되는 쿨터 카운터 장비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SUS를 사용하여 형광 표지된 항체를 뇌로 전달함. (A) 타우 이소형에 특이적인 형광 표지된 항체 단편이 자체적으로 전달되고, SUS가 자체적으로 전달되고, 조합 처리는 뇌의 한 반구의 근적외선 형광 이미징을 사용하여 SUS와 결합할 때 초음파 처리된 반구에 의한 항체의 흡수 증가를 나타냈다. 룩업 테이블(LUT)이 적용되었고, 임의의 단위에서 더 높은 형광 강도가 더 따뜻한 색상으로 표시되었다. (b) 형광의 정량화는 배경 형광의 SUS 전용 대조군 수준을 뺀 채 이루어졌다. 평균 ± SEM을 나타내었다. (c) 뇌 절편의 저배율 및 고배율 이미지에서 나타나는 해마 뉴런에 의한 형광 표지된 항체의 증가된 흡수. 조합 치료에서, 항체는 해마 뉴런에 대해 나타낸 바와 같이 세포체 및 심지어 수상 돌기 내로 분포한다. 파란색 = DAPI, 자홍색 = 항체 단편. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 미세아교세포에 대한 대표적인 면역형광 표지, 미세아교세포의 예상 형태를 보여주고, 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3D로 렌더링. 미세아교세포 형태학은 녹색에서 관찰되고 CD68의 수준과 분포는 적색으로 관찰된다. 스케일 바 10 μm. 녹색 = Iba1, 빨간색 = CD68. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
형광 표지된 항체는 주사 모드에서 적용된 마이크로버블과 함께 집중된 초음파를 사용하여 뇌에 전달될 수 있다. 항체 전달, 미세아교세포 형태학 및 리소좀 확대는 초음파 주사 후 형광 현미경에 의해 검출될 수 있다. 미세아교세포는 Fc-수용체-매개 과정4에서 항체가 결합한 그들의 리소좀 항체 및 항원을 흡수할 수 있다.
이 방법을 사용하여 반복가능한 BBB 개방 및 항체 전달을 달성하기 위한 다수의 중요한 단계가 있다. 초음파 변환기와 마우스 머리 사이의 양호한 결합을 보장하는 것이 중요합니다. 마우스 머리의 머리카락을 모두 제거하고 커플링에 기포가 없는지 확인하십시오. 사내에서 준비된 마이크로버블의 특성은 성공에 매우 중요합니다. 마이크로버블은 108마이크로 버블/mL의 충분한 농도와 마이크로버블의 90% 이상이 직경이 10μm 미만이 되도록 크기 분포를 가져야 합니다. 이는 더 큰 마이크로버블이 폐에 의해 순환 밖으로 걸러지는 것으로 알려져 있기 때문이다. 허용 가능한 중간 크기는 1-3 μm 사이입니다. 마이크로버블은 주사기에서 파괴되지 않도록 부드럽게 처리하고 주입해야 합니다. 연습으로 달성 할 수있는 마이크로 버블의 주사 후 2 분 이내에 초음파를 적용하는 것이 중요합니다. 전체 뇌 또는 전체 반구의 타겟팅은 SUS 접근법으로 쉽게 달성되며 타겟팅의 정확성은 큰 영역을 타겟팅 할 때 문제가되지 않을 것입니다. 해마 또는 선조체와 같은 더 작은 뇌 영역도 성공적으로 타겟팅 될 수 있지만이 경우 초점이 표적 영역과 겹치는 것이 중요합니다. 마우스 뇌의 높이는 일반적인 초음파 변환기를 사용하여 1MHz에서 집중된 초음파 빔의 축 길이와 유사하므로 트랜스듀서는 z 차원이 아닌 x 및 y 차원에서만 이동하면됩니다. 이것은 특정 뇌 구조에 대한 입체 택시 좌표에 대한 지식과 마우스의 탈모 된 피부를 통해 람도이드 및 시상 봉합사를 보면서 결정할 수 있습니다.
여기서 우리는 역궤도 주사를 사용하여 마이크로버블과 항체를 전달하는 기술을 시연한다. 역궤도 주사의 대안은 꼬리 정맥 주사이며, 이는 또한 마이크로 버블과 항체를 전달하는 효과적인 기술입니다. 역궤도 주사의 장점은 꼬리 정맥 주사보다 기술적으로 덜 도전적이며 조직 손상의 위험을 최소화하면서 여러 번 반복 될 수 있다는 것입니다 (주사의 번갈아 가며 눈).
뇌에서 형광 표지 항체가 검출되지 않으면 BBB가 열리지 않았을 가능성이 있습니다. 문제 해결은 농축 된 마이크로 버블 용액을 얻고 마이크로 버블을 파괴하지 않도록 주입하고 주입 시간의 두 분 이내에 초음파를 전달하는 데 중점을 두어야합니다. BBB 개방이 발생하지 않으면 피크 음압 설정을 증가시킬 수 있으며, 피크 음압이 높을수록 설명 된 설정을 사용하여 0.65MPa의 피크 음압 설정에서 감지하지 못하는 미세 출혈을 일으킬 가능성이 증가한다는 경고와 함께 피크 음압 설정이 증가 할 수 있습니다. 항체의 항원 특이성에 따라 염색 패턴이 상이할 것이다. 항타우 항체를 주입할 때 얻어진 염색 패턴을 도 2에 나타내었다.
이 기술은 다양한 항체에 적용될 수 있으며 일관된 BBB 개방이 얻어지는 한, 뇌의 표적에 대한 항체의 결합을 평가할 수 있습니다. 스캐닝 초음파 접근법은 재현 가능한 방식으로 전체 마우스 뇌에 걸쳐 BBB를 열 수 있습니다.
이 기술의 한계는 마우스가 살아있는 동안 BBB 개구부의 발생 및 범위가 관찰되지 않는다는 것입니다. 이러한 제한은 가돌리늄 조영제를 사용한 MRI 이미징을 절차에 포함시킴으로써 극복 될 수 있지만, 이는 절차의 시간과 비용을 크게 증가시킵니다.
여기에 기재된 것은 항체의 얼마나 증가된 흡수가 달성될 수 있는지, 뿐만 아니라 전달 후 뇌에 위치하는 위치를 결정하는데 사용될 수 있는 항체 프로토콜의 단일 초음파 처리 및 단일 투여이다. 이 프로토콜은 또한 항체 전달의 치료 효과를 평가하기 위해 종단 연구에 사용될 수 있다. 치료 연구에서 프로토콜은 뇌에 전달되는 항체의 치료 잠재력을 평가하기 위해 일주일 또는 그 이상의 치료 간격으로 반복 될 수 있습니다. 초음파에 의해 전달되는 항체의 치료 잠재력은 신경퇴행성 질환의 트랜스제닉 마우스 모델에서 평가될 수 있다. 치료 효과의 판독은 행동 테스트, 및 병리학 단백질의 수준에 대한 조직학 및 생화학, 예를 들어 타우, 아밀로이드-β 또는 시누클레인을 포함할 수 있다.
결론적으로, 우리는 형광 표지 된 항체를 전달하기 위해 마우스에서 혈액 뇌 장벽을 여는 방법을 개략적으로 설명했습니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에 대한 치료 접근법을 평가하는 연구자들에게 흥미로울 것입니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Clem Jones AO 박사, 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 [GNT1145580, GNT1176326], 금속 재단 및 퀸즐랜드 주 정부 (DSITI, 과학, 정보 기술 및 혁신부)의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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