Summary
Presentert her er en protokoll for å midlertidig åpne blod-hjernebarrieren (BBB) enten brennvidt eller gjennom en musehjerne for å levere fluorescerende merkede antistoffer og aktivere mikroglia. Også presentert er en metode for å oppdage levering av antistoffer og mikroglia aktivering ved histologi.
Abstract
Bare en liten brøkdel av terapeutiske antistoffer rettet mot hjernesykdommer tas opp av hjernen. Fokusert ultralyd gir en mulighet til å øke opptaket av antistoffer og engasjement gjennom forbigående åpning av blod-hjernebarrieren (BBB). I vårt laboratorium utvikler vi terapeutiske tilnærminger for nevrodegenerative sykdommer der et antistoff i ulike formater leveres over BBB ved hjelp av mikrobobler, samtidig med fokusert ultralydapplikasjon gjennom skallen rettet mot flere flekker, en tilnærming vi refererer til som skanning ultralyd (SUS). De mekaniske effektene av mikrobobler og ultralyd på blodkar øker paracellulær transport over BBB ved å skille tette veikryss og forbedrer vesicle-mediert transcytose, slik at antistoffer og terapeutiske midler effektivt kan krysse. Videre letter ultralyd også opptaket av antistoffer fra den interstitielle hjernen til hjerneceller som nevroner der antistoffet fordeler seg gjennom hele cellekroppen og til og med i neuritiske prosesser. I våre studier fremstilles fluorescerende merkede antistoffer, blandet med interne tilberedte lipidbaserte mikrobobler og injiseres i mus umiddelbart før SUS påføres hjernen. Den økte antistoffkonsentrasjonen i hjernen kvantifiseres deretter. For å gjøre rede for endringer i normal hjerne homeostase, kan mikroglial fagocytose brukes som en cellulær markør. De genererte dataene antyder at ultralydlevering av antistoffer er en attraktiv tilnærming for å behandle nevrodegenerative sykdommer.
Introduction
Terapeutisk ultralyd er en fremvoksende teknologi rettet mot behandling av hjernesykdommer på en ikke-invasiv måte, delvis ved å legge til rette for tilgang til terapeutiske midler til hjernen1,2,3. Siden bare en liten brøkdel av terapeutiske antistoffer rettet mot hjernesykdommer tas opp av og beholdes i hjernen4, gir terapeutisk ultralyd muligheten til å øke opptaket og målrette engasjementet5,6.
I vårt laboratorium utvikler vi terapeutiske tilnærminger for nevrodegenerative sykdommer der et antistoff i ulike formater leveres over blod-hjernebarrieren (BBB) ved hjelp av mikrobobler. For å oppnå dette påføres ultralyd gjennom skallen inn i hjernen på flere steder ved hjelp av en skannemodus vi refererer til som skanning ultralyd (SUS)7. Den mekaniske interaksjonen mellom ultralydenergien, de intravenøst injiserte mikroboblene og hjernevaskulaturen skiller forbigående de tette kryssene til BBB i et gitt sonikeringsvolum, slik at antistoffer og andre last, inkludert terapeutiske midler, effektivt kan krysse denne barrieren7,8,9 . Videre har ultralyd vist seg å lette opptaket av antistoffer fra interstitiell hjerne til hjerneceller, for eksempel nevroner, hvor antistoffet fordeler seg gjennom hele cellekroppen og til og med inn i neuritiske prosesser5,10.
Alzheimers sykdom er preget av en amyloid-β og tau patologi11, og en rekke dyremodeller er tilgjengelig for å dissekere patogene mekanismer og validere terapeutiske strategier. En SUS-tilnærming, der ultralyd påføres i et sekvensielt mønster over hele hjernen, når den gjentas over flere behandlingsøkter, kan redusere amyloid plakkpatologi i hjernen til amyloid-β-deponerende amyloidforløperprotein (APP) mutantmus og aktivere mikroglia som tar opp amyloiden, noe som fører til forbedring i kognitiv funksjon7. BBB-åpning med ultralyd og mikrobobler reduserer også tau patologi i pR5, K3 og rTg4510 tau transgene mus5,12,13. Viktig, mens mikroglia fjerner ekstracellulære proteinavsetninger, er en av de underliggende clearancemekanismene for intraneuronale patologier indusert av SUS aktivering av nevronal autofagi12.
Her skisserer vi en eksperimentell prosess, hvorved fluorescerende merkede antistoffer fremstilles, og deretter blandes med interne lipidbaserte mikrobobler, etterfulgt av retroorbital injeksjon til bedøvede mus. Retroorbital injeksjon er et alternativ til hale vene injeksjon som vi har funnet å være like effektive og enklere å gjentatte ganger utføre. Dette etterfølges umiddelbart av å bruke SUS på hjernen. For å bestemme det terapeutiske antistoffopptaket ofres mus og den økte antistoffkonsentrasjonen i hjernen kvantifiseres deretter. Som en proxy av endringen i hjernen homeostase, er mikroglial fagocytisk aktivitet bestemt av histologi og volumetrisk 3D-rekonstruksjon.
De genererte dataene tyder på at ultralydlevering av antistoffer er en potensielt attraktiv tilnærming for å behandle nevrodegenerative sykdommer. Protokollen kan også brukes på andre legemiddelkandidater, samt modelllaster som fluorescerende merket dextrans av definerte størrelser14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av dyreetikkkomiteen ved University of Queensland.
1. Intern mikrobubble forberedelse
- Vei ut et 9:1 molarforhold på 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfocholin og 1,2-distearoyl-sn-glysero-3-fosfoetanolamin-N-[amino(polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt). 0,5 mg lipidblanding er nødvendig per 1 ml mikrobubble-løsning. Alternativt kan lipider kjøpes allerede i kloroform, hvis bruk av forløsede lipider fortsetter til trinn 1.3.
- Løs lipiden i et lite volum kloroform i et glassbeger.
- Fordamp kloroformen med en fordamper eller en nitrogenstrøm.
- Rehydrer den tørkede lipidfilmen med 10 ml PBS + 10% glyserol + 10% propylenglykoloppløsning som er filtrert gjennom 0,22 μm filter.
- Plasser den rehydrerte lipidoppløsningen i en vannbadsoniker satt til 55 °C (over smeltetemperaturen på lipidene) og soniker til den er fullstendig oppløst.
- Aliquot lipidoppløsning i autoklavede 1,5 ml HPLC-hetteglass og skru på septa-hettene.
- Aspirer all luften i hetteglasset med en 5 ml sprøyte utstyrt med en 27 G nål og lag et vakuum i hetteglasset.
- Tilsett oktfluoropropan til hetteglasset med den medfølgende sprøyten, og trekk opp gassen fra beholderen. Fyll hetteglasset med 1-2 ml oktafluoropropan ved å lese volumet i sprøyten.
- Forsegle hvert hetteglass med parafinfilm og kjøl.
- På eksperimentets dag, ta hetteglasset til romtemperatur, tilsett 0,5 ml 0,9% NaCl-løsning til hetteglasset, legg deretter hetteglasset i en amalgamator og agitate i 45 s (forhåndsinnstilt tid) for å produsere mikrobobler.
2. Microbubble kvalitetskontroll ved hjelp av en coulter counter
- Ta mikrobubble-løsningen ut av amalgamatoren og luft gassen fra hetteglasset ved å piercing septa med en 19 G nål.
- Fortynn mikrobubble-løsningen ved å utføre totrinns 1:5000 serielle fortynninger ved å tilsette 100 μL mikrobobleoppløsning i 5 ml filtrert strømningsoppløsning ved hjelp av en 1 ml sprøyte med 19 G nål, og deretter ta 100 μL 1:50 fortynnet mikrobubble løsning og pipettering i 10 ml filtrert strømningsløsning i en cuvette ved hjelp av en pipette.
- Kontroller at elektrolytttanken har tilstrekkelig strømningsløsning og at avfallstanken er tom.
- Plasser cuvette i coulter-tellerplattformen og lås den på plass. Bruk en blenderåpning på 30 μm for prøveanskaffelse.
- I programvaren laster du inn standard driftsmetode (SOM), og deretter velger du Rediger SOM | konsentrasjon. Angi 5000x fortynning.
- I programvaren velger du et passende filnavn. For eksempel microbubble_1_date.
- Last og fest cuvette inn i plattformen.
- Velg Kjør i programvaren | Forhåndsvis og kontroller at utvalgskonsentrasjonen er mindre enn 10 %. Hvis dette tallet er høyere enn 10%, utfør en ny fortynning av mikroboblene med en høyere fortynningsfaktor.
- Velg Start for å starte en anskaffelse av eksemplet for å få den første avlesningen.
- Skyll blenderåpningen på Coulter-telleren med filtrert strømningsløsning etter hver måling. Gjenta trinn 2.2-2.9 for å få 3 replikeringer.
- Legg en cuvette med fortynnet mikrobubble løsning i et sonikervannbad og soniker i 30 s.
- Mål løsningen med sonikerte mikrobobler og merk som blank.
- I programvaren trekker du den endelige avlesningen fra den første avlesningen. Dette trekker fra partikler som ikke er mikrobobler og ikke inneholder gass.
- Velg Vis resultater i programvaren for å vise mikroboblekonsentrasjonen, størrelsesfordelingen, gjennomsnittsstørrelsen og volumkonsentrasjonen.
3. Fluorescerende antistoffmerking
- Få en 1 mg/ml oppløsning av mus IgG i PBS uten tilsetningsstoffer.
- Etikett 1 mg mus IgG med AlexaFluor 647 i 0,1 M natriumbikarbonatbuffer ved å følge produsentens instruksjoner i settet. Denne mengden fluorescerende merket IgG er tilstrekkelig til å utføre denne prosedyren på 5-7 voksne mus der en 5 mg / kg dose antistoff administreres.
- Tilsett fargestoffet til løsningen av IgG i 0,1 M natriumbikarbonatbuffer og inkuber i 15 min ved romtemperatur.
- Rens det fluorescerende merkede antistoffet ved å pipettere antistoffløsningen i en spinnkolonne og sentrifugere ved 1000 x g i 5 minutter. Fritt fargestoff forblir i kolonnesengen.
- Bruk et spektrofotometer for å måle proteinkonsentrasjonen. Mål absorbansen av konjugatoppløsningen ved 280 nm og 650 nm (A280 og A650). Beregn konsentrasjonen av protein i prøven ved hjelp av ligningen:
Proteinkonsentrasjon (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x fortynningsfaktor / 203 000. - Bruk et spektrofotometer til å beregne graden av merking ved hjelp av ligningen:
moles fargestoff per mole protein = A650 x fortynningsfaktor / 239 000 x proteinkonsentrasjon (M).
MERK: En akseptabel grad av merking er 3-7 mol fargestoff per mole protein og vanligvis oppnådd grad av merking er rundt 6.
4. Ultralyd oppsett
- Bruk det fokuserte ultralydsystemet, legg til 5 mm avstandsstykke til vannbolusen for å plassere ultralydfokuset 9 mm under bunnen av vannbolusen.
- Fyll vannbolusen med ca. 300 ml avionisert vann som har blitt avgasset med en inline avgasser i 20 min (oksygeninnholdet skal være under 3 ppm). Plasser det ringformede arrayet i den fylte vannbolusen og bruk et tannspeil for å kontrollere at det ikke er luftbobler på overflaten. Hvis det finnes på overflaten, fjern ringtabellen og erstatt den i vannbolusen.
- Start applikasjonsprogramvaren. Velg Angi driftssyklus for bølgeform på bølgeformmenyen. Innstillinger er PRF (Hz) 10, driftssyklus 10%, fokus 80 mm, senterfrekvens 1 MHz, amplitude (MPa topp negativt trykk) 0,65 MPa, mekanisk indeks = 0,65. Trykk Påsett for å definere bølgeformen og lagre den i minnet.
MERK: Det fokuserte ultralydsystemet er forhåndskalibrert av produsenten fra målinger tatt av en kalibrert hydrofon. - I den fokuserte ultralydsystemprogramvaren definerer du en behandlingsplan. Dette krever å definere en behandlingsregion som består av flere individuelle behandlingssteder, og definere tiltak som skal iverksettes på hvert av disse behandlingsstedene. I dette tilfellet er behandlingssonen en halvkule av musehjernen.
- I bevegelseskontrollervinduet går du til Skann-fanen og Angi start-, stopp- og økningsverdi for bevegelse i x-dimensjonen, og starter, stopper og øker verdien for bevegelse i y-retningen. Angi verdier for X: start -4, stopp 3,50 og Y: -3,00, stopp 3, Økning 1,5, # løkker: 1.
- Definer handlingene for behandlingssteder. Velg Hendelse-knappen i bevegelseskontrollervinduet. I skriptredigeringsvinduet velger du en liste over handlinger som skal utføres i den rekkefølgen som er valgt på hvert behandlingssted. Sett Bevegelsestype til rasterrutenett øverst i skriptvinduet. I kategorien Hendelser velger du Legg til handlinger for å flytte dem til skriptpanelet, og legger til Flytt synkront, Start utløser arb, vent, Stopp utløser arb. Klikk på ventehandlingen og velg en ventetid på 6000 ms.
MERK: Disse innstillingene vil gjøre behandlingen til et 6 x 5 rutenett med behandlingssteder fordelt på 1,5 mm fra hverandre, der hvert sted har en behandlingsvarighet på 6 s. Den totale varigheten for å sonikere en musehjerne er ca. 3 min. Dette størrelse behandlingsgitteret er egnet for voksne C57 / Bl6 mus som veier ca 30 g. Størrelsen på rutenettet på behandlingssteder kan justeres opp eller ned avhengig av størrelsen på musen.
5. Dyreforberedelse
- Vei musen med en balanse nøyaktig til 0.1g.
- Bedøv musen med 90 mg/kg ketamin og 6 mg/kg xylazin intraperitonealt. Test for fravær av reflekser med tåklemme. Alternativt kan mus bedøves med isofluran ved hjelp av et passende inhalasjonsbedøvelsesapparat med passende ansiktsmaske. Hvis du bruker isofluran, bør musen plasseres på en varmepute under ultralyd for å forhindre hypotermi.
- Bruk en elektrisk barberhøvel til å barbere håret fra dyrets hode, og påfør deretter hårfjerningskrem med en bomullspinne, la det stå i 2-3 min eller til håret tørkes bort rent med et fuktig stykke gasbind. Pass på at hårfjerningskremen ikke kommer i musens øyne.
- Merk midten av musens hode med en permanent markør. Svingeren har et hull i midten, og svingerfokuset og fokuspunktet kan justeres visuelt.
- Fyll en liten veiebåt som tidligere har fått bunnen kuttet av og erstattet med plastfolie limt til bunnen av veiebåten med ultralydgel. Dette fungerer som en 8 mm avstandsstykke og gir god kobling til musens hode og tillater visuell inspeksjon av fokuset på svingeren på linje med musens hode.
6. Microbubble forberedelse
- Varm et mikrobubble hetteglass til romtemperatur. For å aktivere, legg til 0,5 ml 0,9% NaCl-løsning til hetteglasset og legg i en amalgamator for å agitere i 45 s for å produsere mikroboblene.
- Luft hetteglasset ved å piercing septa med en 27 G nål.
7. Ultralydbehandling
- Snu hetteglasset med mikrobobler og tegn forsiktig opp 1 μL/g kroppsvekt av oppløsningen. Til dette tilsett løsning av fluorescerende merket antistoff og bland forsiktig i sprøyten. Maksimalt volum som injiseres er 150 μL.
MERK: Interne tilberedte mikrobobler er ca. 60 ganger mindre konsentrert enn de klinisk brukte (f.eks. definitetsmikrobobler). Juster volumet eller konsentrasjonen slik at antall mikrobobler som injiseres, ligner de som er klinisk brukt (dvs. Definitet 1,2 x 108 mikrobobler/kg kroppsvekt). - Injiser mikrobubble og antistoffoppløsning retroorbitt, pass på å injisere forsiktig og sakte. Påfør deretter oftalmisk salve på musens øyne.
- Plasser musen i hodeholderen (se Materialbord) og fest musens nese. Plasser deretter den ultralydgelfylte lille veiebåten på toppen av hodet.
- Senk vannbolusen til den sitter på toppen av ultralydgelen i veiebåten.
- Bruk styrespaken til å flytte svingerfokuset til midten av hodet. Velg Tilbakestill opprinnelse på bevegelsesfanen.
- Velg fullstendig skanning. Trinn 7.3-7.6 tar 2 min.
- For konsistens, still inn en tidtaker for å sikre en 2 minutters forsinkelse mellom å injisere mikrobobler og velge fullstendig skanning.
- Etter at behandlingen er fullført, bruk oftalmisk salve på øynene og plasser musen i et oppvarmet gjenopprettingskammer. Hvis hypotermi observeres under prosedyren, kan en oppvarmingspute plasseres under musen for å gi ekstra varme under prosedyren.
8. Vevshøsting og bearbeiding
- På tidspunktet for interesse etter ultralyd levering (minst 1 h for å oppdage høye nivåer av antistoff i hjernen) dypt bedøve musen med en overdose av Pentobarbitone løsning (100 mg / kg) og transkardielt parfyme musen med 30 ml PBS. En god perfusjon er nødvendig for å spesifikt oppdage fluorescerende merkede antistoffer som er levert til hjernen.
- Samle hjernen og fikse ved nedsenking i 4% PFA i 24 timer ved 4 °C, og vask deretter med PBS.
- Se for deg hjernen i en infrarød skanner ved å plassere hjernen på brettet og ved å skaffe et bilde i 700 nm-kanalen.
MERK: Etter fiksering fjernes hjernen fra PFA, vaskes i PBS og seksjoneres. Alternativt kan den plasseres i etylenglykolkryoprotektant oppløsning i 24 timer ved 4 °C eller til den er nedsenket, og deretter flyttes til et nytt kryoprektiv som inneholder hetteglass og plasseres ved -20 °C for langtidslagring. - Del hjernekulden i PBS ved hjelp av en vibratom. Lim hjernen til plattformen og kutt 30-40 μm seksjoner og samle inn i PBS.
MERK: Lysosomal autofluorescens (utbredt i seksjoner fra dyr eldre enn ca. 12 måneder) bør blekes ved nattbelysning av seksjonene i en lyskammerboks, ved romtemperatur og i PBS som inneholder azide (0,02%) for å blokkere bakterievekst.
9. Vevsfarging og bildeanskaffelse
- Overfør seksjoner til blokkeringsløsning (5% BSA i 0,2% Triton / PBS) i 2 timer ved romtemperatur, vask deretter seksjonene 3x ved å erstatte løsningen med 0,2% Triton / PBS.
- Inkuber seksjoner ved 4 °C over natten med de primære antistoffene mot Iba1 (fortynning 1:1000) og CD68 (fortynning 1:500), i 0,2 % Triton/PBS, etterfulgt av 3x vasker med 0,2 % Triton/PBS.
- Inkuber seksjoner i 2 timer ved romtemperatur med fluorescerende sekundære antistoffer (fortynning 1:500), etterfulgt av 3x vasker med 0,2% Triton / PBS bare.
MERK: Kjernene kan også farges ved hjelp av DAPI-oppløsning (0,5 μg/ml). - Overfør seksjonene til et lysbilde og deksler med hardt innstilte monteringsmedier. Gi tilstrekkelig tid til at monteringsmediet kan størkne før visualisering og bildeanskaffelse (over natten).
- Med et konfokalt mikroskop få z-stack bilder (minst 10 μm dybde og 0,3 μm trinnstørrelse, 10 bilder per dyr) av ultralyd målrettet hjerneområdet ved hjelp av et konfokalt mikroskop og et mål om minst 40x forstørrelse.
MERK: Vær forsiktig med å skaffe bilder innenfor det dynamiske signalområdet, og unngå under-/overeksponering. Lagre bildefilene i det tilsvarende programvareformatet som brukes av mikroskopet.
10. Bildeanalyse
- Konverter z-stack mikroskopifilene ved hjelp av filimportøren for bildeanalyseprogramvare.
- Åpne de konverterte filene i programvaren og juster intensiteten til Iba1-kanalen for å observere mikrogliale celler.
- Beskjær en enkelt mikroglial celle ved å tegne en boks rundt den, velg 'beskjær' og lagre den nye filen.
- Bygg gjengivelsen av 3D-overflaten av IBA1-signalet ved å:
- Åpne Imaris-filen med én celle som ble generert i forrige trinn.
- Legg til en overflate i filen.
- Velg kanalen som tilsvarer Iba1-fargingen.
- Bruke en terskel som skal overlappe Iba1-fargingen
- Velg bare strukturen av interesse som danner den mikrogliale cellen av interesse
- Fullføre prosessen
- Få og registrer volumet av Iba1-fargingen
- Bygge gjengivelsen av 3D-overflaten på CD68-fargebanen
- Inne i IBA1-overflateunderfilen maskerer du CD68-kanalen og fjerner voxels utenfor IBA1-fargingen
- Legge til en ny overflate i filen
- Velg kanalen som tilsvarer CD68-fargingen
- Påfør en terskel som skal overlappe CD68-fargingen og er så nært som mulig å matche fargevolumene
- Fullfør prosessen, da bare de intramikrogliale CD68-strukturene vil være til stede i denne filen, og dermed krever de ikke et annet terskelfiltreringstrinn.
- Få tak i og registrer antallet og gjennomsnittsvolumet til de positive CD68-strukturene
- Beregn det relative volumet av CD68-strukturer i henhold til de tilsvarende IBA1-strukturene som et mål på mikroglial aktivering i fagocytisk tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen leveres fluorescerende merkede antistoffer til hjernen og kan påvises, sammen med mikrogliaaktivering. Konklusjonen som kan trekkes er bruk av fokusert ultralyd og mikrobobler forbedrer markert hjerneopptaket av antistoffer og kan levere antistoffer til hele hjernen eller halvkule av en mus når den brukes i skannemodus. Figur 1 viser TIPS ultralydapplikasjonsenheten (forskjellige komponenter merket) som brukes til å åpne BBB. Figur 2 viser de representative resultatene fra Coulter-tellermålinger av størrelse og konsentrasjon som bør oppnås når mikroboblene produseres riktig. For enkelt å visualisere leveransen ble antistoffene merket med et fjernt rødt fluorescerende fargestoff. Antistoffopptak av hjernen kan enkelt visualiseres i hele hjernen eller seksjoner ved hjelp av en infrarød skanner eller ved hjelp av fluorescerende mikroskopi på hjerneseksjoner. Hjerneseksjoner viser plasseringen av det fluorescerende merkede antistoffet på et mikroskopisk nivå. Representative resultater for skanning av ultralydlevering til hippocampus av fluorescerende merket anti-tau antistoff RN2N er vist i figur 3. For å observere enhver endring av normal hjerne homeostase som følge av SUS og antistoff levering, en avlesning var mikroglial lysosomalt innhold i forhold til fagocytose. Figur 4 viser representativ farging for mikroglia ved hjelp av Iba1 og den mikrogliale lysosomets spesifikke markør CD68 for å avgjøre om mikroglia blir mer fagocytisk etter fødselen av antistoffet.
Figur 1: Det fokuserte ultralydsystemet som brukes til å levere ultralyd med kritiske komponenter som merkes. (A) Den hjemmelagde gelholderen som fungerer som en avstandsstykke på 8 mm. (B) Se gjennom svingeren som viser hvordan målet er på linje med fokus visuelt (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kvalitetskontrollmålinger av interne tilberedte mikrobobler. (A) Coulter-tellerutstyr som brukes til å innhente sammendragsstatistikk (B) og størrelsesfordeling av mikrobobler i antall (C) og volumfordeling (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Levering av fluorescerende merket antistoff i hjernen ved hjelp av SUS. (A) Et fluorescerende merket antistofffragment som er spesifikt for en tau isoform levert på egen hånd, SUS alene, og en kombinasjonsbehandling avslørte økt opptak av antistoffet av en sonikert halvkule når den kombineres med SUS ved hjelp av nær infrarød fluorescerende avbildning av en halvkule av hjernen. En oppslagstabell (LUT) ble påført, med høyere fluorescensintensitet i vilkårlige enheter vist i varmere farger. (B) Kvantifisering av fluorescens ble gjort uten å trekke fra SUS-eneste kontrollnivåer av bakgrunnsfluorescens. Gjennomsnittlig ± SEM vist. (C) Økt opptak av det fluorescerende merkede antistoffet av hippocampale nevroner vist i lave og høye forstørrelsesbilder av hjerneseksjoner. I kombinasjonsbehandlingen distribuerer antistoffet til cellelegemer og til og med dendritter som vist for hippocampale nevroner. Blue=DAPI, magenta=antistofffragment. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativ immunfluorescensmerking for mikroglia, som viser forventet morfologi av mikroglia og gjengitt i 3D med bildeanalyseprogramvaren. Mikrogliamorfologi observeres i grønt og nivåer og distribusjon av CD68 observeres i rødt. Skalalinje 10 μm. Grønn=Iba1, rød=CD68. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorescerende merkede antistoffer kan leveres til hjernen ved hjelp av fokusert ultralyd sammen med mikrobobler påført i skannemodus. Antistofftilførsel, mikroglial morfologi og lysosomal forstørrelse kan påvises ved fluorescensmikroskopi etter skanning av ultralyd. Mikroglia kan ta opp i sine lysosomer antistoffer og antigener som antistoffene har bundet til i en Fc-reseptor-mediert prosess4.
Det er en rekke kritiske trinn for å oppnå repeterbar BBB-åpning og antistofflevering ved hjelp av denne metoden. Det er viktig å sikre god kobling mellom ultralydtransduseren og musens hode. Fjern alt håret på musens hode og sørg for at det ikke er luftbobler i koblingen. Egenskapene til de interne forberedte mikrobubbles er avgjørende for suksess. Mikrobobler må ha en tilstrekkelig konsentrasjon på 108 mikrobobler/ml og en størrelsesfordeling slik at over 90% av mikroboblene er under 10 μm i diameter. Dette skyldes at større mikrobobler er kjent for å bli filtrert ut av sirkulasjonen av lungene. En akseptabel median størrelse er mellom 1 -3 μm. Mikrobobler må håndteres og injiseres forsiktig for å unngå å ødelegge dem i sprøyten. Det er viktig at ultralydet påføres senest 2 min etter injeksjon av mikrobubbles som kan oppnås med praksis. Målretting av en hel hjerne eller hele halvkule oppnås lett med SUS-tilnærmingen, og nøyaktighet av målretting er usannsynlig å være et problem når du målretter mot store regioner. En mindre hjerneregion som hippocampus eller striatum kan også målrettes, men i dette tilfellet er det viktig at fokuset overlapper den målrettede regionen. Høyden på en musehjerne ligner den aksiale lengden på den fokuserte ultralydstrålen ved 1 MHz ved hjelp av en typisk ultralydtransduser, slik at svingeren bare trenger å flyttes i x- og y-dimensjonen og ikke z-dimensjonen. Dette kan bestemmes av kunnskapen om stereotaksiske koordinater for en bestemt hjernestruktur og ved visning av lambdoid og sagittal suturer gjennom musens depilerte hud.
Her demonstrerer vi en teknikk som bruker retroorbitale injeksjoner for å levere mikrobobler og antistoff. Et alternativ til retroorbitale injeksjoner er hale vene injeksjoner som også er en effektiv teknikk for å levere mikrobobler og antistoffer. Fordelene med retroorbital injeksjon er det teknisk mindre utfordrende enn hale vene injeksjoner, og kan gjentas flere ganger (vekslende øye av injeksjon) med svært minimal risiko for vev skade.
Hvis det ikke oppdages noe fluorescerende merket antistoff i hjernen, er det sannsynlig at BBB ikke åpnet. Feilsøking bør fokusere på å oppnå en konsentrert mikrobobleløsning og injisere den for ikke å ødelegge mikroboblene og levere ultralyd innen to minutter etter injeksjonstiden. Hvis ingen BBB-åpning oppstår, kan topp negativ trykkinnstilling økes, med forbehold om at høyere topp negativt trykk øker sjansen for å forårsake mikrohemorrhager som vi ikke oppdager med en topp negativ trykkinnstilling på 0,65 MPa ved hjelp av de beskrevne innstillingene. Avhengig av antigensp spesifisiteten til antistoffet, vil fargemønsteret være annerledes. Fargemønsteret som oppnås ved injeksjon av et anti-tau-antistoff, er vist i figur 2.
Denne teknikken kan brukes på en rekke antistoffer, og så lenge konsekvent BBB-åpning oppnås, kan binding av antistoffet til et mål i hjernen vurderes. Skanning ultralyd tilnærming oppnår åpning av BBB over en hel musehjerne på en reproduserbar måte.
En begrensning av denne teknikken er at forekomsten og omfanget av BBB-åpningen ikke observeres mens musen er i live. Denne begrensningen kan overvinnes ved å inkludere MR-avbildning med gadoliniumkontrastmiddel til prosedyren, men dette øker tiden og kostnaden for prosedyren betydelig.
Beskrevet her er en enkelt sonikering og enkelt administrering av antistoffprotokoll som kan brukes til å bestemme hvor mye økt opptak av antistoffer som kan oppnås, samt hvor de ligger i hjernen etter levering. Protokollen kan også brukes i en langsgående studie for å vurdere terapeutiske effekter av antistofftilførsel. I en behandlingsstudie kan protokollen gjentas med et mellombehandlingsintervall på en uke eller lenger for å evaluere det terapeutiske potensialet til et antistoff levert til hjernen. Det terapeutiske potensialet til antistoffet levert av ultralyd kan vurderes i transgene musemodeller av nevrodegenerative sykdommer. Avlesninger av terapeutisk effekt kan omfatte atferdstester, og histologi og biokjemi for nivåene av patologiske proteiner, for eksempel tau, amyloid-β eller synuclein.
Til slutt har vi skissert en metode for å åpne blodhjernebarrieren hos mus for å levere fluorescerende merkede antistoffer. Denne metoden vil være av interesse for forskere som evaluerer terapeutiske tilnærminger for nevrodegenerative sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner støtte fra Estate of Dr Clem Jones AO, National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], Metal Foundation og staten Queensland (DSITI, Institutt for vitenskap, informasjonsteknologi og innovasjon).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M.
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
