Summary
Aquí se presenta un protocolo para abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica (BBB) ya sea focalmente o en todo el cerebro de un ratón para administrar anticuerpos marcados fluorescentemente y activar la microglía. También se presenta un método para detectar la administración de anticuerpos y la activación de la microglía por histología.
Abstract
Solo una pequeña fracción de los anticuerpos terapéuticos dirigidos a las enfermedades cerebrales son absorbidos por el cerebro. El ultrasonido enfocado ofrece la posibilidad de aumentar la absorción de anticuerpos y el compromiso a través de la apertura transitoria de la barrera hematoencefálica (BBB). En nuestro laboratorio, estamos desarrollando enfoques terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas en los que se administra un anticuerpo en varios formatos a través del BBB utilizando microburbujas, concomitantemente con la aplicación de ultrasonido enfocado a través del cráneo dirigido a múltiples puntos, un enfoque al que nos referimos como ultrasonido de barrido (SUS). Los efectos mecánicos de las microburbujas y el ultrasonido en los vasos sanguíneos aumentan el transporte paracelular a través del BBB al separar transitoriamente las uniones estrechas y mejoran la transcitosis mediada por vesículas, lo que permite que los anticuerpos y los agentes terapéuticos se crucen de manera efectiva. Además, el ultrasonido también facilita la absorción de anticuerpos del cerebro intersticial en las células cerebrales, como las neuronas, donde el anticuerpo se distribuye por todo el cuerpo celular e incluso en los procesos neuríticos. En nuestros estudios, se preparan anticuerpos marcados fluorescentemente, se mezclan con microburbujas a base de lípidos preparadas internamente y se inyectan en ratones inmediatamente antes de que se aplique SUS al cerebro. El aumento de la concentración de anticuerpos en el cerebro se cuantifica entonces. Para dar cuenta de las alteraciones en la homeostasis cerebral normal, la fagocitosis microglial se puede utilizar como un marcador celular. Los datos generados sugieren que la administración de anticuerpos por ultrasonido es un enfoque atractivo para tratar enfermedades neurodegenerativas.
Introduction
La ecografía terapéutica es una tecnología emergente dirigida a tratar las enfermedades cerebrales de forma no invasiva, en parte facilitando el acceso de agentes terapéuticos al cerebro1,2,3. Dado que solo una pequeña fracción de los anticuerpos terapéuticos dirigidos a las enfermedades cerebrales son absorbidos y retenidos en el cerebro4, el ultrasonido terapéutico ofrece la posibilidad de aumentar su captación y compromiso objetivo5,6.
En nuestro laboratorio, estamos desarrollando enfoques terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas en las que se administra un anticuerpo en varios formatos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) utilizando microburbujas. Para lograr esto, el ultrasonido se aplica a través del cráneo hacia el cerebro en múltiples puntos utilizando un modo de escaneo al que nos referimos como ultrasonido de escaneo (SUS)7. La interacción mecánica entre la energía ecográfica, las microburbujas inyectadas por vía intravenosa y la vasculatura cerebral separa transitoriamente las uniones estrechas del BBB en un volumen de sonicación dado, permitiendo que los anticuerpos y otras cargas, incluidos los agentes terapéuticos, crucen eficazmente esta barrera7,8,9 . Además, se ha demostrado que la ecografía facilita la captación de anticuerpos del cerebro intersticial hacia las células cerebrales, como las neuronas, donde el anticuerpo se distribuye por todo el cuerpo celular e incluso en los procesos neuríticos5,10.
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por una patología de β y tau amiloide11, y se dispone de una gran cantidad de modelos animales para diseccionar los mecanismos patógenos y validar las estrategias terapéuticas. Un enfoque SUS, mediante el cual el ultrasonido se aplica en un patrón secuencial en todo el cerebro, cuando se repite durante varias sesiones de tratamiento, puede reducir la patología de la placa amiloide en los cerebros de ratones mutantes mutantes de proteína precursora amiloide (APP) que depositan β amiloide y activar la microglía que absorbe el amiloide, lo que lleva a una mejora en la función cognitiva7. La apertura BBB con ultrasonido y microburbujas también reduce la patología tau en ratones transgénicos tau pR5, K3 y rTg45105555551085,12,13. Es importante destacar que, si bien la microglía elimina los depósitos de proteínas extracelulares, uno de los mecanismos de aclaramiento subyacentes para las patologías intraneuronales inducidas por el SUS es la activación de la autofagia neuronal12.
Aquí, describimos un proceso experimental, mediante el cual se preparan anticuerpos marcados fluorescentemente y luego se mezclan con microburbujas internas a base de lípidos, seguidas de una inyección retroorbital en ratones anestesiados. La inyección retroorbital es una alternativa a la inyección de la vena de la cola que hemos encontrado que es igualmente eficaz y más simple de realizar repetidamente. Esto es seguido inmediatamente por la aplicación de SUS en el cerebro. Para determinar la absorción de anticuerpos terapéuticos, se sacrifican ratones y luego se cuantifica el aumento de la concentración de anticuerpos en el cerebro. Como un proxy del cambio en la homeostasis cerebral, la actividad fagocítica microglial está determinada por la histología y la reconstrucción volumétrica en 3D.
Los datos generados sugieren que la administración de anticuerpos por ultrasonido es un enfoque potencialmente atractivo para tratar enfermedades neurodegenerativas. El protocolo se puede aplicar de manera similar a otros fármacos candidatos, así como a modelos de dextrans etiquetados fluorescentemente de tamaños definidos14.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Queensland.
1. Preparación interna de microburbujas
- Pesar una proporción molar de 9:1 de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio). Se requiere 0,5 mg de mezcla lipídica por 1 ml de solución de microburbujas. Alternativamente, los lípidos se pueden comprar ya en cloroformo, si se usan lípidos predisueltos se procede al paso 1.3.
- Disuelva el lípido en un pequeño volumen de cloroformo en un vaso de precipitados de vidrio.
- Evaporar el cloroformo con un evaporador o una corriente de nitrógeno.
- Rehidrate la película lipídica seca con 10 ml de PBS + 10% de glicerol + 10% de solución de propilenglicol que se ha filtrado a través de un filtro de 0,22 μm.
- Coloque la solución lipídica rehidratada en un sonicador de baño de agua a 55 °C (por encima de la temperatura de fusión de los lípidos) y sonice hasta que se disuelva por completo.
- Solución lipídica alícuota en viales de HPLC de 1,5 ml en autoclave y atornillar las tapas de los septos.
- Aspire todo el aire en el vial con una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 27 G y cree un vacío en el vial.
- Agregue octofluoropropano al vial con la jeringa incluida, extrayendo el gas del recipiente. Llene el vial con 1-2 ml de octafluoropropano leyendo el volumen en la jeringa.
- Selle cada vial con película de parafina y refrigere.
- El día del experimento, lleve el vial a temperatura ambiente, agregue 0,5 ml de solución de NaCl al 0,9% al vial, luego coloque el vial en un amalgamador y agite durante 45 s (tiempo preestablecido) para producir las microburbujas.
2. Control de calidad de microburbujas utilizando un contador de coulter
- Saque la solución de microburbuja del amalgamador y ventile el gas del vial perforando los septos con una aguja de 19 G.
- Diluya la solución de microburbujas realizando diluciones en serie de dos pasos 1:5.000 agregando 100 μL de solución de microburbujas en 5 ml de solución de flujo filtrado utilizando una jeringa de 1 ml con aguja de 19 G, y luego tomando 100 μL de solución de microburbuja diluida de 1:50 y pipeteando en una solución de flujo filtrado de 10 ml en una cubeta con una pipeta.
- Verifique que el tanque de electrolitos tenga suficiente solución de flujo y que el tanque de desechos esté vacío.
- Coloque la cubeta en la plataforma del contador de coulter y enciérrela en su lugar. Utilice una apertura de 30 μm para la adquisición de muestras.
- En el software, cargue el método operativo estándar (SOM) y, a continuación, seleccione Editar SOM | concentración. Introduzca la dilución 5000x.
- En el software, elija un nombre de archivo adecuado. Por ejemplo, microbubble_1_date.
- Cargue y asegure la cubeta en la plataforma.
- En el software, seleccione Ejecutar| Obtenga una vista previa y verifique que la concentración de la muestra sea inferior al 10%. Si este número es superior al 10%, realice una nueva dilución de las microburbujas con un factor de dilución más alto.
- Seleccione 'Inicio' para comenzar una adquisición de la muestra para obtener la lectura inicial.
- Enjuague la abertura del contador Coulter con una solución de flujo filtrado después de cada medición. Repita los pasos 2.2 a 2.9 para obtener 3 réplicas.
- Coloque una cubeta con solución diluida de microburbujas en un baño de agua sonicador y sonicar durante 30 s.
- Mida la solución con microburbujas sonicadas y etiquete como en blanco.
- En el software, reste la lectura final de la lectura inicial. Esto resta cualquier partícula que no sean microburbujas y no contengan gas.
- Seleccione Mostrar resultados en el software para mostrar la concentración de microburbujas, la distribución de tamaño, el tamaño promedio y la concentración de volumen.
3. Etiquetado de anticuerpos fluorescentes
- Obtener una solución de 1 mg/ml de IgG de ratón en PBS sin aditivos.
- Etiquete 1 mg de IgG de ratón con AlexaFluor 647 en tampón de bicarbonato de sodio de 0,1 M siguiendo las instrucciones del fabricante que se encuentran en el kit. Esta cantidad de IgG marcada fluorescentemente es suficiente para realizar este procedimiento en 5-7 ratones adultos donde se administra una dosis de 5 mg / kg de anticuerpos.
- Añadir el colorante a la solución de IgG en tampón de bicarbonato de sodio de 0,1 M e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Purifique el anticuerpo marcado fluorescentemente pipeteando la solución de anticuerpos en una columna de espín y centrifugando a 1.000 x g durante 5 min. El tinte libre permanecerá en el lecho de la columna.
- Use un espectrofotómetro para medir la concentración de proteínas. Mida la absorbancia de la solución conjugada a 280 nm y 650 nm (A280 y A650). Calcule la concentración de proteína en la muestra utilizando la ecuación:
Concentración de proteína (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x factor de dilución / 203.000. - Utilice un espectrofotómetro para calcular el grado de etiquetado utilizando la ecuación:
mols colorantes por mol proteína = A650 x factor de dilución / 239 000 x concentración de proteína (M).
NOTA: Un grado aceptable de etiquetado es de 3-7 moles de colorante por proteína de mol y el grado de etiquetado típicamente obtenido es de alrededor de 6.
4. Configuración de ultrasonido
- Usando el sistema de ultrasonido enfocado, agregue el espaciador de 5 mm al bolo de agua para colocar el foco de ultrasonido 9 mm por debajo de la parte inferior del bolo de agua.
- Llene el bolo de agua con aproximadamente 300 ml de agua desionizada que se haya desgasificado con un desgasificador en línea durante 20 minutos (el contenido de oxígeno debe ser inferior a 3 ppm). Coloque la matriz anular en el bolo de agua lleno y use un espejo dental para verificar que no haya burbujas de aire en la superficie. Si está presente en la superficie, retire la matriz anular y reemplácela en el bolo de agua.
- Inicie el software de la aplicación. En el menú forma de onda, seleccione Establecer ciclo de trabajo de forma de onda. Los ajustes son PRF (Hz) 10, ciclo de trabajo 10%, enfoque 80 mm, frecuencia central 1 MHz, amplitud (presión negativa máxima MPa) 0.65 MPa, índice mecánico = 0.65. Pulse Set para definir la forma de onda y almacenarla en la memoria.
NOTA: El sistema de ultrasonido enfocado está precalibrado por el fabricante a partir de mediciones tomadas por un hidrófono calibrado. - En el software del sistema de ultrasonido enfocado, defina un plan de tratamiento. Esto requiere definir una región de tratamiento que consista en múltiples sitios de tratamiento individuales y definir las acciones que se deben tomar en cada uno de esos sitios de tratamiento. En este caso, la zona de tratamiento es un hemisferio del cerebro del ratón.
- En la ventana del controlador de movimiento, vaya a la pestaña Escanear e introduzca el valor de inicio, parada e incremento para el movimiento en la dimensión x, y el valor de inicio, parada e incremento para el movimiento en la dirección y. Introduzca los valores para X: start -4, stop 3.50 e Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1.
- Definir las acciones para los sitios de tratamiento. En la ventana del controlador de movimiento, seleccione el botón Evento . En la ventana Edición de scripts, seleccione una lista de acciones que se ejecutarán en el orden seleccionado en cada sitio de tratamiento. Establezca Tipo de movimiento en cuadrícula ráster en la parte superior de la ventana de script. En la pestaña de eventos, seleccione Agregar acciones para moverlas al panel de script y agregue Mover sincrónicamente, Iniciar árbol de activación, esperar, Detener arb de activación. Haga clic en la acción de espera y seleccione un tiempo de espera de 6, 000 ms.
NOTA: Estos ajustes harán que el tratamiento sea una cuadrícula de 6 x 5 puntos de tratamiento espaciados a 1,5 mm de distancia, y cada punto tendrá una duración de tratamiento de 6 s. La duración total para sonicar el cerebro de un ratón es de aproximadamente 3 min. Esta rejilla de tratamiento de tamaño es adecuada para ratones adultos C57 / Bl6 que pesan aproximadamente 30 g. El tamaño de la cuadrícula de puntos de tratamiento se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo dependiendo del tamaño del ratón.
5. Preparación animal
- Pesa el ratón con una balanza de hasta 0,1 g.
- Anestesiar al ratón con 90 mg/kg de ketamina y 6 mg/kg de xilazina por vía intraperitoneal. Prueba de ausencia de reflejos con un pellizco en el dedo del pie. Alternativamente, los ratones pueden ser anestesiados con isoflurano utilizando un aparato anestésico inhalatorio apropiado con una máscara facial apropiada. Si usa isoflurano, el ratón debe colocarse en una almohadilla térmica durante el ultrasonido para prevenir la hipotermia.
- Use una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el pelo de la cabeza del animal, luego aplique crema depilación con un bastoncillo de algodón, déjelo actuar durante 2-3 minutos o hasta que el pelo se limpie limpio con un trozo húmedo de gasa. Tenga cuidado de que la crema de depilación no entre en los ojos del ratón.
- Marque el centro de la cabeza del ratón con un marcador permanente. El transductor tiene un orificio en su centro y el foco del transductor y el punto focal se pueden alinear visualmente.
- Llene un bote de pesaje pequeño al que previamente se le haya cortado el fondo y lo haya reemplazado con una envoltura de plástico pegada al fondo del bote de pesaje con gel de ultrasonido. Esto sirve como un espaciador de 8 mm y proporciona un buen acoplamiento a la cabeza del mouse y permite la inspección visual del enfoque del transductor alineado con la cabeza del mouse.
6. Preparación de microburbujas
- Caliente un vial de microburbujas a temperatura ambiente. Para activarlo, agregue 0,5 ml de solución de NaCl al 0,9% al vial y colóquelo en un amalgamador para agitar durante 45 s para producir las microburbujas.
- Ventile el vial perforando los septos con una aguja de 27 G.
7. Tratamiento ecográfico
- Invierta el vial de microburbujas y extraiga suavemente 1 μL/g de peso corporal de la solución. A esto agregue una solución de anticuerpos marcados fluorescentemente y mezcle suavemente en la jeringa. El volumen máximo inyectado es de 150 μL.
NOTA: Las microburbujas preparadas internamente están aproximadamente 60 veces menos concentradas que las utilizadas clínicamente (por ejemplo, microburbujas Definity). Ajustar el volumen o la concentración de tal manera que el número de microburbujas inyectadas sea similar a las utilizadas clínicamente (es decir. Definity 1.2 x 108 microburbujas/kg de peso corporal). - Inyecte la microburbuja y la solución de anticuerpos retroorbitalmente, teniendo cuidado de inyectar suave y lentamente. Luego, aplique ungüento oftálmico en los ojos del ratón.
- Coloque el ratón en el soporte de la cabeza (consulte la Tabla de materiales) y fije la nariz del ratón. Luego coloque el bote de pesaje pequeño lleno de gel de ultrasonido en la parte superior de la cabeza.
- Baje el bolo de agua hasta que se asiente sobre el gel de ultrasonido en el bote de pesaje.
- Use el joystick para mover el foco del transductor al centro de la cabeza. Selecciona Restablecer origen en la pestaña movimiento.
- Seleccione el escaneo completo. Los pasos 7.3-7.6 tardarán 2 minutos.
- Para mayor coherencia, configure un temporizador para garantizar un retraso de 2 minutos entre la inyección de microburbujas y la selección del escaneo completo.
- Después de completar el tratamiento, aplique ungüento oftálmico en los ojos y coloque el ratón en una cámara de recuperación calentada. Si se observa hipotermia durante el procedimiento, se puede colocar una almohadilla de calentamiento debajo del ratón para proporcionar calor suplementario durante el procedimiento.
8. Recolección y procesamiento de tejidos
- En el punto de tiempo de interés después de la administración de ultrasonido (al menos 1 h para detectar altos niveles de anticuerpos en el cerebro) anestesiar profundamente al ratón con una sobredosis de solución de pentobarbitona (100 mg / kg) y perfundir transcárdicamente al ratón con 30 ml de PBS. Se requiere una buena perfusión para detectar específicamente los anticuerpos marcados con fluorescencia que se han administrado al cerebro.
- Recoger el cerebro y fijar por inmersión en PFA al 4% durante 24 h a 4 °C, luego lavar con PBS.
- Imagine el cerebro en un escáner infrarrojo colocando el cerebro en la bandeja y adquiriendo una imagen en el canal de 700 nm.
NOTA: Después de la fijación, el cerebro se retira de la PFA, se lava en PBS y se secciona. Alternativamente, se puede colocar en solución crioprotectora de etilenglicol durante 24 h a 4 °C o hasta que se sumerja, y luego se puede mover a un nuevo vial que contiene crioprotector y colocarse a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. - Seccione el cerebro frío en PBS usando un vibratome. Pegue el cerebro a la plataforma y corte secciones de 30-40 μm y recójalas en PBS.
NOTA: La autofluorescencia lisosomal (prevalente en secciones de animales mayores de aproximadamente 12 meses) debe blanquearse mediante la iluminación nocturna de las secciones en una caja de cámara de luz, a temperatura ambiente y en PBS que contenga azida (0.02%) para bloquear el crecimiento bacteriano.
9. Tinción de tejidos y adquisición de imágenes
- Transfiera las secciones a la solución de bloqueo (5% de BSA en Tritón/PBS al 0,2%) durante 2 h a temperatura ambiente, luego lave las secciones 3x reemplazando la solución con Tritón/PBS al 0,2%.
- Incubar secciones a 4 °C durante la noche con los anticuerpos primarios contra Iba1 (dilución 1:1.000) y CD68 (dilución 1:500), en Tritón/PBS al 0,2%, seguido de 3x lavados con Tritón/PBS al 0,2%.
- Incubar secciones durante 2 h a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios fluorescentes (dilución 1:500), seguido de 3x lavados con Triton/PBS al 0,2% solamente.
NOTA: Los núcleos también se pueden teñir con solución DAPI (0,5 μg/ml). - Transfiera las secciones a una diapositiva y una cubierta con medios de montaje ajustados. Deje suficiente tiempo para que el medio de montaje se solidifique antes de la visualización y la adquisición de imágenes (durante la noche).
- Con un microscopio confocal, obtenga imágenes de pila z (al menos 10 μm de profundidad y 0,3 μm de tamaño de paso, 10 imágenes por animal) del área cerebral dirigida por ultrasonido mediante el uso de un microscopio confocal y un objetivo de al menos 40x de aumento.
NOTA: Tenga cuidado de adquirir imágenes dentro del rango dinámico de la señal, evitando la subexposición / sobreexposición. Guarde los archivos de imagen en el formato de software correspondiente utilizado por el microscopio.
10. Análisis de imágenes
- Convierta los archivos de microscopía z-stack utilizando el importador de archivos de software de análisis de imágenes.
- Abra los archivos convertidos en el software y ajuste la intensidad del canal Iba1 para observar las células microgliales.
- Recorte una sola celda microglial dibujando un cuadro a su alrededor, seleccione 'recortar' y guarde el nuevo archivo.
- Construya la representación de superficie 3D de la señal IBA1 mediante:
- Abra el archivo Imaris de una sola celda generado en el paso anterior.
- Agregue una superficie al archivo.
- Seleccione el canal correspondiente a la tinción Iba1.
- Aplicar un umbral que debe superponerse a la tinción Iba1
- Seleccione solo la estructura de interés que está formando la célula microglial de interés
- Finalizar el proceso
- Obtener y registrar el volumen de la tinción Iba1
- Construir la representación de superficie 3D de la tinción CD68
- Dentro del subarchivo de superficie IBA1, enmascara el canal CD68 y elimina los vóxeles fuera de la tinción IBA1
- Agregar una nueva superficie al archivo
- Seleccione el canal correspondiente a la tinción CD68
- Aplique un umbral que se superponga a la tinción de CD68 y que coincida lo más posible con los volúmenes de tinción
- Finalice el proceso, ya que solo las estructuras intramicrogliales de CD68 estarán presentes en este archivo y, por lo tanto, no requieren otro paso de filtrado de umbral.
- Obtener y registrar el número y el volumen medio de las estructuras positivas CD68
- Calcular el volumen relativo de las estructuras CD68 según sus correspondientes estructuras IBA1 como medida de la activación microglial en estado fagocítico.
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Representative Results
Usando este protocolo, los anticuerpos marcados fluorescentemente se administran al cerebro y se pueden detectar, junto con la activación de la microglía. La conclusión que se puede extraer es que el uso de ultrasonido enfocado y microburbujas mejora notablemente la absorción cerebral de anticuerpos y puede administrar anticuerpos a todo el cerebro o hemisferio de un ratón cuando se usa en un modo de escaneo. La Figura 1 muestra el dispositivo de aplicación de ultrasonido TIPS (diferentes componentes etiquetados) que se utiliza para abrir el BBB. La Figura 2 muestra los resultados representativos de las contramedidas de tamaño y concentración de Coulter que deben obtenerse cuando las microburbujas se producen correctamente. Para visualizar fácilmente la entrega, los anticuerpos se etiquetaron con un tinte fluorescente de color rojo lejano. La absorción de anticuerpos por el cerebro se puede visualizar fácilmente en todo el cerebro o secciones utilizando un escáner infrarrojo o utilizando microscopía fluorescente en secciones cerebrales. Las secciones cerebrales muestran la ubicación del anticuerpo marcado fluorescentemente a nivel microscópico. En la Figura 3 se muestran los resultados representativos para la administración de ultrasonido de escaneo al hipocampo de anticuerpos anti-tau RN2N marcados fluorescentemente. Para observar cualquier alteración de la homeostasis cerebral normal como consecuencia del SUS y la administración de anticuerpos, una lectura fue el contenido lisosomal microglial en relación con la fagocitosis. La Figura 4 muestra una tinción representativa para la microglía utilizando Iba1 y el marcador específico del lisosoma microglial CD68 para determinar si la microglía se vuelve más fagocítica después de la administración del anticuerpo.
Figura 1: El sistema de ultrasonido enfocado utilizado para administrar ultrasonido con componentes críticos etiquetados. (A) El soporte de gel casero que sirve como espaciador de 8 mm. (B) Vista a través del transductor que muestra cómo el objetivo está alineado con el enfoque visualmente (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mediciones de control de calidad de microburbujas preparadas internamente. (A) Equipo de contador Coulter utilizado para obtener estadísticas resumidas (B) y distribución de tamaño de microburbujas en número (C) y distribución de volumen (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Administración de anticuerpos marcados fluorescentemente en el cerebro utilizando SUS. (A) Un fragmento de anticuerpo marcado fluorescentemente específico para una isoforma tau administrada por sí sola, SUS por sí sola y un tratamiento combinado reveló una mayor absorción del anticuerpo por un hemisferio sonicado cuando se combinó con SUS utilizando imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano de un hemisferio del cerebro. Se aplicó una tabla de búsqueda (LUT), con mayor intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias mostradas en colores más cálidos. (B) La cuantificación de la fluorescencia se realizó sin restar los niveles de control de fluorescencia de fondo solo para el SUS. Se muestra el SEM de ± media. (C) Aumento de la captación del anticuerpo marcado fluorescentemente por las neuronas del hipocampo que se muestra en imágenes de aumento bajo y alto de las secciones cerebrales. En el tratamiento combinado, el anticuerpo se distribuye en los cuerpos celulares e incluso en las dendritas como se muestra para las neuronas del hipocampo. Azul=DAPI, magenta=fragmento de anticuerpo. Barra de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Etiquetado de inmunofluorescencia representativo para microglía, mostrando la morfología esperada de microglia y renderizado en 3D con el software de análisis de imágenes. La morfología de la microglía se observa en verde y los niveles y la distribución de CD68 se observan en rojo. Barra de escala 10 μm. Verde=Iba1, rojo=CD68. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los anticuerpos marcados fluorescentemente se pueden administrar al cerebro mediante ultrasonido enfocado junto con microburbujas aplicadas en modo de escaneo. La administración de anticuerpos, la morfología microglial y el agrandamiento lisosomal se pueden detectar mediante microscopía de fluorescencia después de la ecografía de barrido. La microglía puede absorber en sus lisosomas anticuerpos y antígenos a los que los anticuerpos se han unido en un proceso mediado por el receptor Fc4.
Hay una serie de pasos críticos para lograr la apertura repetible de BBB y la administración de anticuerpos utilizando este método. Es fundamental garantizar un buen acoplamiento entre el transductor de ultrasonido y la cabeza del ratón. Retire todo el vello de la cabeza del ratón y asegúrese de que no haya burbujas de aire en el acoplamiento. Las características de las microburbujas preparadas internamente son fundamentales para el éxito. Las microburbujas deben tener una concentración suficiente de 108 microburbujas/ml y una distribución de tamaño tal que más del 90% de las microburbujas tengan un diámetro inferior a 10 μm. Esto se debe a que se sabe que las microburbujas más grandes se filtran fuera de la circulación por los pulmones. Un tamaño medio aceptable está entre 1 -3 μm. Las microburbujas deben manipularse e inyectarse suavemente para evitar destruirlas en la jeringa. Es importante que el ultrasonido se aplique a más tardar 2 minutos después de la inyección de las microburbujas, lo que se puede lograr con la práctica. La focalización de todo un cerebro o hemisferio entero se logra fácilmente con el enfoque SUS y es poco probable que la precisión de la orientación sea un problema cuando se apunta a grandes regiones. Una región cerebral más pequeña, como el hipocampo o el cuerpo estriado, también puede ser atacada con éxito, pero en este caso es importante que el enfoque se superponga a la región objetivo. La altura del cerebro de un ratón es similar a la longitud axial del haz de ultrasonido enfocado a 1 MHz utilizando un transductor de ultrasonido típico, de modo que el transductor solo necesita moverse en la dimensión x e y y y no en la dimensión z. Esto puede determinarse mediante el conocimiento de las coordenadas estereotáxicas para una estructura cerebral particular y mediante la visualización de las suturas lambdoides y sagitales a través de la piel depilada del ratón.
Aquí demostramos una técnica que utiliza inyecciones retroorbitales para administrar microburbujas y anticuerpos. Una alternativa a las inyecciones retroorbitales son las inyecciones en las venas de la cola, que también es una técnica efectiva para administrar microburbujas y anticuerpos. Las ventajas de la inyección retroorbital es que es técnicamente menos desafiante que las inyecciones de la vena de la cola, y se puede repetir varias veces (ojo alterno de inyección) con un riesgo muy mínimo de daño tisular.
Si no se detecta ningún anticuerpo marcado fluorescentemente en el cerebro, es probable que el BBB no se haya abierto. La solución de problemas debe centrarse en obtener una solución concentrada de microburbujas e inyectarla para no destruir las microburbujas y administrar el ultrasonido dentro de los dos minutos posteriores al tiempo de inyección. Si no se produce una apertura de BBB, se puede aumentar el ajuste de presión negativa máxima, con la advertencia de que las presiones negativas máximas más altas aumentan la posibilidad de causar microhemorragias que no detectamos en un ajuste de presión negativa máxima de 0,65 MPa utilizando los ajustes descritos. Dependiendo de la especificidad del antígeno del anticuerpo, el patrón de tinción será diferente. El patrón de tinción obtenido al inyectar un anticuerpo anti-tau se muestra en la Figura 2.
Esta técnica se puede aplicar a una variedad de anticuerpos y siempre que se obtenga una apertura consistente de BBB, se puede evaluar la unión del anticuerpo a un objetivo en el cerebro. El enfoque de ultrasonido de escaneo logra la apertura del BBB a través de todo el cerebro de un ratón de una manera reproducible.
Una limitación de esta técnica es que la ocurrencia y el alcance de la abertura BBB no se observan mientras el ratón está vivo. Esta limitación podría superarse mediante la inclusión de imágenes de resonancia magnética con agente de contraste de gadolinio en el procedimiento, pero esto aumenta significativamente el tiempo y el costo del procedimiento.
Aquí se describe un protocolo de sonicación única y administración única de anticuerpos que se puede utilizar para determinar cuánto aumento de la absorción de anticuerpos se puede lograr, así como dónde se encuentran en el cerebro después del parto. El protocolo también se puede utilizar en un estudio longitudinal para evaluar los efectos terapéuticos de la administración de anticuerpos. En un estudio de tratamiento, el protocolo se puede repetir con un intervalo entre tratamientos de una semana o más para evaluar el potencial terapéutico de un anticuerpo administrado al cerebro. El potencial terapéutico del anticuerpo administrado por ultrasonido se puede evaluar en modelos de ratón transgénicos de enfermedades neurodegenerativas. Las lecturas del efecto terapéutico podrían incluir pruebas de comportamiento e histología y bioquímica para los niveles de proteínas patológicas, por ejemplo, tau, β amiloide o sinucleína.
En conclusión, hemos esbozado un método para abrir la barrera hematoencefálica en ratones para administrar anticuerpos marcados con fluorescencia. Este método será de interés para los investigadores que evalúan enfoques terapéuticos para enfermedades neurodegenerativas.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Reconocemos el apoyo del Patrimonio del Dr. Clem Jones AO, el Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica de Australia [GNT1145580, GNT1176326], la Fundación Metal y el Gobierno del Estado de Queensland (DSITI, Departamento de Ciencia, Tecnología de la Información e Innovación).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
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- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
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- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
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