Summary
Här presenteras ett protokoll för att tillfälligt öppna blod-hjärnbarriären (BBB) antingen fokalt eller i hela en mushjärna för att leverera fluorescerande märkta antikroppar och aktivera mikroglia. Dessutom presenteras en metod för att detektera leverans av antikroppar och mikrogliaaktivering genom histologi.
Abstract
Endast en liten del av terapeutiska antikroppar riktade mot hjärnsjukdomar tas upp av hjärnan. Fokuserat ultraljud erbjuder en möjlighet att öka upptaget av antikroppar och engagemang genom övergående öppning av blod-hjärnbarriären (BBB). I vårt laboratorium utvecklar vi terapeutiska metoder för neurodegenerativa sjukdomar där en antikropp i olika format levereras över BBB med hjälp av mikrobubblor, samtidigt med fokuserad ultraljudsapplikation genom skallen som riktar sig mot flera fläckar, ett tillvägagångssätt som vi kallar skanning ultraljud (SUS). De mekaniska effekterna av mikrobubblor och ultraljud på blodkärl ökar paracellulär transport över BBB genom att tillfälligt separera snäva korsningar och förbättrar vesiklarmedierad transcytos, vilket gör att antikroppar och terapeutiska medel effektivt kan korsa. Dessutom underlättar ultraljud också upptaget av antikroppar från den interstitiella hjärnan till hjärnceller som neuroner där antikroppen distribueras genom cellkroppen och till och med i neuritiska processer. I våra studier framställs fluorescerande märkta antikroppar, blandas med egenutverkade lipidbaserade mikrobubblor och injiceras i möss omedelbart innan SUS appliceras på hjärnan. Den ökade antikroppskoncentrationen i hjärnan kvantifieras sedan. För att ta hänsyn till förändringar i normal hjärnhomeostas kan mikrogliafagocytos användas som en cellulär markör. De genererade uppgifterna tyder på att ultraljudsleverans av antikroppar är ett attraktivt tillvägagångssätt för att behandla neurodegenerativa sjukdomar.
Introduction
Terapeutisk ultraljud är en framväxande teknik som syftar till att behandla hjärnsjukdomar på ett icke-invasivt sätt, delvis genom att underlätta tillgången till terapeutiska medel till hjärnan1,2,3. Eftersom endast en liten del av de terapeutiska antikropparna mot hjärnsjukdomar tas upp av och behålls i hjärnan4, erbjuder terapeutiskt ultraljud möjligheten att öka deras upptag och målengagemang5,6.
I vårt laboratorium utvecklar vi terapeutiska metoder för neurodegenerativa sjukdomar där en antikropp i olika format levereras över blod-hjärnbarriären (BBB) med hjälp av mikrobubblor. För att uppnå detta appliceras ultraljud genom skallen in i hjärnan på flera ställen med hjälp av ett skanningsläge som vi kallar skanning ultraljud (SUS)7. Den mekaniska interaktionen mellan ultraljudsenergin, de intravenöst injicerade mikrobubblorna och hjärnkärlen separerar tillfälligt de snäva korsningarna av BBB i en given ultraljudsbehandlingsvolym, vilket gör det möjligt för antikroppar och andra laster inklusive terapeutiska medel att effektivt korsa denna barriär7,8,9 . Dessutom har ultraljud visat sig underlätta upptaget av antikroppar från den interstitiella hjärnan till hjärnceller, såsom neuroner, där antikroppen distribueras genom hela cellkroppen och till och med till neuritiska processer5,10.
Alzheimers sjukdom kännetecknas av en amyloid-β- och taupatologi11, och en mängd djurmodeller finns tillgängliga för att dissekera patogena mekanismer och validera terapeutiska strategier. En SUS-metod, genom vilken ultraljud appliceras i ett sekventiellt mönster över hela hjärnan, när det upprepas under flera behandlingssessioner, kan minska amyloidplackpatologi i hjärnan hos amyloid-β-deponerande amyloidprekursorprotein (APP) mutantmöss och aktivera mikroglia som tar upp amyloiden, vilket leder till förbättring av kognitiv funktion7. BBB-öppning med ultraljud och mikrobubblor minskar också taupatologin i pR5, K3 och rTg4510 tau transgena möss5,12,13. Viktigt är att medan mikroglia tar bort extracellulära proteinavlagringar, är en av de underliggande clearancemekanismerna för intraneuronala patologier inducerade av SUS aktiveringen av neuronal autofagi12.
Här beskriver vi en experimentell process, genom vilken fluorescerande märkta antikroppar framställs och sedan blandas med interna lipidbaserade mikrobubblor, följt av retroorbital injektion i sövda möss. Retroorbital injektion är ett alternativ till injektion av svansvenen som vi har funnit vara lika effektiv och enklare att utföra upprepade gånger. Detta följs omedelbart av att applicera SUS på hjärnan. För att bestämma det terapeutiska antikroppsupptaget offras möss och den ökade antikroppskoncentrationen i hjärnan kvantifieras sedan. Som en proxy för förändringen i hjärnans homeostas bestäms mikrogliafagocytisk aktivitet av histologi och volymetrisk 3D-rekonstruktion.
De genererade uppgifterna tyder på att ultraljudsleverans av antikroppar är ett potentiellt attraktivt tillvägagångssätt för att behandla neurodegenerativa sjukdomar. Protokollet kan på liknande sätt tillämpas på andra läkemedelskandidater, liksom modelllaster såsom fluorescerande märkt dextrans av definierade storlekar14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes av den djuretiska kommittén vid University of Queensland.
1. Intern förberedelse av mikrobubblor
- Väg ut ett 9: 1 molärt förhållande på 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin och 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[amino (polyetylenglykol) -2000] (ammoniumsalt). 0,5 mg lipidblandning krävs per 1 ml mikrobubbellösning. Alternativt kan lipider köpas redan i kloroform, om användning av förupplösta lipider fortsätter till steg 1.3.
- Lös lipiden i en liten volym kloroform i en glasbägare.
- Avdunsta kloroformen med en förångare eller en kväveström.
- Rehydrera den torkade lipidfilmen med 10 ml PBS + 10% glycerol + 10% propylenglykollösning som har filtrerats genom 0,22 μm filter.
- Placera den rehydrerade lipidlösningen i en vattenbad sonicator inställd på 55 ° C (över smälttemperaturen för lipiderna) och sonicate tills den är helt upplöst.
- Alikvot lipidlösning i autoklaverade 1,5 ml HPLC-injektionsflaskor och skruva på septalocken.
- Aspirera all luft i flaskan med en 5 ml spruta utrustad med en 27 G nål och skapa ett vakuum i flaskan.
- Tillsätt oktofluorpropan i injektionsflaskan med den medföljande sprutan och dra upp gasen från kapseln. Fyll injektionsflaskan med 1-2 ml oktafluorpropan genom att läsa volymen i sprutan.
- Försegla varje injektionsflaska med paraffinfilm och kyl.
- På experimentdagen, sätt injektionsflaskan till rumstemperatur, tillsätt 0,5 ml 0,9% NaCl-lösning till injektionsflaskan, placera sedan injektionsflaskan i en amalgamator och agitera i 45 s (förinställd tid) för att producera mikrobubblorna.
2. Mikrobubbelkvalitetskontroll med hjälp av en coulter-räknare
- Ta ut mikrobubbellösningen ur amalgamatorn och ventilera gasen från injektionsflaskan genom att genomborra septan med en 19 G nål.
- Späd mikrobubbellösningen genom att utföra tvåstegs 1:5 000 seriella utspädningar genom att tillsätta 100 μL mikrobubbellösning i 5 ml filtrerad flödeslösning med en 1 ml spruta med 19 G nål och sedan ta 100 μL 1:50 utspädd mikrobubbellösning och pipettera till 10 ml filtrerad flödeslösning i en kyvett med hjälp av en pipett.
- Kontrollera att elektrolyttanken har tillräcklig flödeslösning och att avfallstanken är tom.
- Placera kyvetten i coulter-diskplattformen och lås den på plats. Använd en bländare på 30 μm för provtagning.
- Ladda standarddriftsmetoden (SOM) i programvaran och välj sedan Redigera SOM | koncentration. Ange 5000x utspädning.
- Välj ett lämpligt filnamn i programvaran. Till exempel microbubble_1_date.
- Ladda och säkra kyvetten i plattformen.
- Välj Kör i programvaran | Förhandsgranska och kontrollera att provkoncentrationen är mindre än 10 %. Om detta tal är högre än 10%, utför en ny utspädning av mikrobubblorna med en högre utspädningsfaktor.
- Välj "Start" för att påbörja ett förvärv av provet för att få den första avläsningen.
- Skölj bländaren på Coulter-räknaren med filtrerad flödeslösning efter varje mätning. Upprepa steg 2.2–2.9 för att hämta 3 repliker.
- Placera en kyvett med utspädd mikrobubbellösning i ett sonicator vattenbad och sonicate i 30 s.
- Mät lösningen med sonicated mikrobubblor och märka som tom.
- I programvaran subtraherar du den slutliga avläsningen från den första avläsningen. Detta subtraherar alla partiklar som inte är mikrobubblor och inte innehåller gas.
- Välj Visa resultat i programvaran för att visa mikrobubbelkoncentration, storleksfördelning, medelstorlek och volymkoncentration.
3. Fluorescerande antikroppsmärkning
- Få en 1 mg / ml lösning av mus IgG i PBS utan tillsatser.
- Märk 1 mg mus IgG med AlexaFluor 647 i 0,1 M natriumbikarbonatbuffert genom att följa tillverkarens instruktioner i satsen. Denna mängd fluorescerande märkt IgG är tillräcklig för att utföra denna procedur på 5-7 vuxna möss där en dos av antikroppen på 5 mg/kg administreras.
- Tillsätt färgämnet till lösningen av IgG i 0,1 M natriumbikarbonatbuffert och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Rena den fluorescerande märkta antikroppen genom att pipettera antikroppslösningen i en spinnklonn och centrifugera vid 1 000 x g i 5 minuter. Fritt färgämne kommer att förbli i kolonnbädden.
- Använd en spektrofotometer för att mäta proteinkoncentrationen. Mät konjugatlösningens absorbans vid 280 nm och 650 nm (A280 och A650). Beräkna koncentrationen av protein i provet med ekvationen:
Proteinkoncentration (M) = [A280 - (A650 x 0,03)] x utspädningsfaktor / 203 000. - Använd en spektrofotometer för att beräkna graden av märkning med ekvationen:
mol färgämne per molprotein = A650 x utspädningsfaktor / 239 000 x proteinkoncentration (M).
OBS: En acceptabel grad av märkning är 3-7 mol färgämne per molprotein och typiskt erhållen grad av märkning är cirka 6.
4. Ultraljud uppsättning
- Använd det fokuserade ultraljudssystemet, lägg till 5 mm distansen till vattenbolusen för att placera ultraljudsfokus 9 mm under botten av vattenbolusen.
- Fyll vattenbolusen med cirka 300 ml avjoniserat vatten som har avgasats med en inline-avgasare i 20 minuter (syrehalten ska vara under 3 ppm). Placera den ringformiga matrisen i den fyllda vattenbolusen och använd en tandspegel för att kontrollera att det inte finns några luftbubblor på ytan. Om det finns på ytan, ta bort den ringformiga matrisen och ersätt den i vattenbolusen.
- Starta applikationsprogramvaran. I vågformsmenyn väljer du Ange vågformscykel. Inställningarna är PRF (Hz) 10, arbetscykel 10%, fokus 80 mm, centrumfrekvens 1 MHz, amplitud (MPa toppnedfall) 0,65 MPa, mekaniskt index = 0,65. Tryck på Set för att definiera vågformen och lagra den i minnet.
OBS: Det fokuserade ultraljudssystemet är förkalibrerat av tillverkaren från mätningar som gjorts av en kalibrerad hydrofon. - I den fokuserade ultraljudssystemprogramvaran definierar du en behandlingsplan. Detta kräver att man definierar en behandlingsregion som består av flera enskilda behandlingsställen och definierar åtgärder som ska vidtas på vart och ett av dessa behandlingsställen. I detta fall är behandlingszonen en halvklot i mushjärnan.
- I fönstret för rörelsekontroll går du till fliken Skanna och Anger start-, stopp- och inkrementvärde för rörelse i x-dimensionen och start-, stopp- och inkrementvärde för rörelse i y-riktningen. Ange värden för X: start -4, stopp 3.50 och Y: -3.00, stopp 3, steg 1.5, # loopar: 1.
- Definiera åtgärderna för behandlingsställen. I fönstret för rörelsekontroll väljer du knappen Händelse . I fönstret Skriptredigering väljer du en lista över åtgärder som ska utföras i den ordning som valts på varje behandlingsplats. Ställ in Rörelsetyp på rasterrutnät högst upp i skriptfönstret. På fliken händelser väljer du Lägg till åtgärder för att flytta dem till skriptpanelen och lägger till Flytta synkront, Starta utlösare arb, vänta, Stoppa utlösare arb. Klicka på vänteåtgärden och välj en väntetid på 6 000 ms.
OBS: Dessa inställningar gör behandlingen till ett 6 x 5 rutnät av behandlingsfläckar åtskilda 1,5 mm från varandra, där varje plats har en behandlingstid på 6 s. Den totala varaktigheten för att sonicate en mus hjärna är cirka 3 min. Detta storleksbehandlingsnät är lämpligt för vuxna C57 / Bl6-möss som väger cirka 30 g. Storleken på gallret av behandlingsfläckar kan justeras upp eller ner beroende på musens storlek.
5. Beredning av djur
- Väg musen med en balans som är exakt till 0,1 g.
- Bedöva musen med 90 mg/kg ketamin och 6 mg/kg xylazin intraperitonealt. Test för frånvaro av reflexer med en tå nypa. Alternativt kan möss bedövas med isofluran med hjälp av en lämplig inhalationsanestetikapparat med en lämplig ansiktsmask. Om du använder isofluran ska musen placeras på en värmepanna under ultraljudet för att förhindra hypotermi.
- Använd en elektrisk rakhyvel för att raka håret från djurets huvud, applicera sedan hårborttagningskräm med en bomullsknopp, låt stå i 2-3 minuter eller tills håret torkas bort rent med en fuktig bit gasväv. Se till att hårborttagningskrämen inte kommer i musens ögon.
- Markera mitten av musens huvud med en permanent markör. Givaren har ett hål i mitten och givarfokus och brännpunkt kan justeras visuellt.
- Fyll en liten vägbåt som tidigare fått botten avskuren och ersatt med plastfolie limmad på botten av vägbåten med ultraljudsgel. Detta fungerar som en 8 mm distans och ger bra koppling till musens huvud och möjliggör visuell inspektion av givarens fokus i linje med mushuvudet.
6. Förberedelse av mikrobubblor
- Värm en mikrobubbelflaska till rumstemperatur. För att aktivera, tillsätt 0,5 ml 0,9% NaCl-lösning till injektionsflaskan och placera i en amalgamator för att agitera i 45 s för att producera mikrobubblorna.
- Ventilera injektionsflaskan genom att genomborra septan med en 27 G nål.
7. Ultraljudsbehandling
- Invertera injektionsflaskan med mikrobubblor och dra försiktigt upp 1 μL/g kroppsvikt av lösningen. Till detta tillsätt lösning av fluorescerande märkt antikropp och blanda försiktigt i sprutan. Den maximala volymen som injiceras är 150 μL.
OBS: Internt beredda mikrobubblor är ungefär 60 gånger mindre koncentrerade än de kliniskt använda (t.ex. Definity-mikrobubblor). Justera volymen eller koncentrationen så att antalet injicerade mikrobubblor liknar de som används kliniskt (dvs. Definitet 1,2 x 108 mikrobubblor/kg kroppsvikt). - Injicera mikrobubbel- och antikroppslösningen retroorbitalt, var noga med att injicera försiktigt och långsamt. Applicera sedan oftalmisk salva på musens ögon.
- Placera musen i huvudhållaren (se Materialtabell) och fixera musens näsa. Placera sedan den ultraljudsgelfyllda lilla vägbåten ovanpå huvudet.
- Sänk ner vattenbolusen tills den sitter ovanpå ultraljudsgelen i vägbåten.
- Använd joysticken för att flytta givarfokus till mitten av huvudet. Välj Återställ ursprung på fliken Rörelse.
- Steg 7.3-7.6 tar 2 minuter.
- För konsekvens, ställ in en timer för att säkerställa en fördröjning på 2 minuter mellan att injicera mikrobubblor och välja fullständig skanning.
- När behandlingen är klar, applicera oftalmisk salva på ögonen och placera musen i en uppvärmd återhämtningskammare. Om hypotermi observeras under proceduren kan en värmedyna placeras under musen för att ge extra värme under proceduren.
8. Skörd och bearbetning av vävnader
- Vid tidpunkten av intresse efter ultraljudsleverans (minst 1 timme för att upptäcka höga nivåer av antikroppar i hjärnan) djupt bedöva musen med en överdos av Pentobarbitonlösning (100 mg / kg) och transkardiellt perfusera musen med 30 ml PBS. En bra perfusion krävs för att specifikt detektera fluorescerande märkta antikroppar som har levererats till hjärnan.
- Samla hjärnan och fixa genom nedsänkning i 4% PFA i 24 timmar vid 4 ° C, tvätta sedan med PBS.
- Avbilda hjärnan i en infraröd skanner genom att placera hjärnan på facket och genom att skaffa en bild i 700 nm-kanalen.
OBS: Efter fixering avlägsnas hjärnan från PFA, tvättas i PBS och sektioneras. Alternativt kan den placeras i kryoprotektantlösning av etylenglykol i 24 timmar vid 4 °C eller tills den är nedsänkt och sedan flyttas till ett nytt kryoprotektivt medel som innehåller injektionsflaska och placeras vid -20 °C för långvarig lagring. - Sektion hjärnan kall i PBS med hjälp av en vibratome. Limma hjärnan på plattformen och skär 30-40 μm sektioner och samla i PBS.
OBS: Lysosomal autofluorescens (förekommer i sektioner från djur äldre än cirka 12 månader) bör blekas genom över natten belysning av sektionerna i en ljuskammarlåda, vid rumstemperatur och i PBS innehållande azid (0,02%) för att blockera bakterietillväxt.
9. Vävnadsfärgning och bildförvärv
- Överför sektioner till blockerande lösning (5% BSA i 0,2% Triton / PBS) i 2 timmar vid rumstemperatur, tvätta sedan sektionerna 3x genom att ersätta lösningen med 0,2% Triton / PBS.
- Inkubera sektioner vid 4 °C över natten med de primära antikropparna mot Iba1 (spädning 1:1 000) och CD68 (spädning 1:500), i 0,2 % Triton/PBS, följt av 3x tvättar med 0,2 % Triton/PBS.
- Inkubera sektioner i 2 timmar vid rumstemperatur med fluorescerande sekundära antikroppar (utspädning 1:500), följt av 3x tvättar med 0,2% Triton/PBS endast.
OBS: Kärnorna kan också färgas med DAPI-lösning (0,5 μg / ml). - Överför sektionerna till en diabild och täckglas med hårt inställda monteringsmedier. Ge tillräckligt med tid för monteringsmediet att stelna före visualisering och bildförvärv (över natten).
- Med ett konfokalmikroskop får du z-stackbilder (minst 10 μm djup och 0,3 μm stegstorlek, 10 bilder per djur) av ultraljudsinriktade hjärnområdet genom att använda ett konfokalmikroskop och ett mål på minst 40x förstoring.
OBS: Var noga med att ta bilder inom signalens dynamiska omfång och undvik under-/överexponering. Spara bildfilerna i motsvarande mjukvaruformat som används av mikroskopet.
10. Bildanalys
- Konvertera z-stack mikroskopifiler med hjälp av bildanalys programvara fil importör.
- Öppna de konverterade filerna i programvaran och justera intensiteten i Iba1-kanalen för att observera mikrogliaceller.
- Beskär en enda mikrogliacell genom att rita en ruta runt den, välj "beskära" och spara den nya filen.
- Bygg 3D-ytåtergivningen av IBA1-signalen genom att:
- Öppna Imaris-filen med en cell som genererades i föregående steg.
- Lägg till en yta i filen.
- Välj den kanal som motsvarar Iba1-färgningen.
- Applicera ett tröskelvärde som bör överlappa Iba1-färgningen
- Välj endast den intressanta strukturen som bildar den mikrogliacell av intresse
- Slutför processen
- Skaffa och registrera volymen på Iba1-färgningen
- Bygg 3D-ytåtergivningen av CD68-färgningen
- Inuti IBA1-ytunderfilen maskerar du CD68-kanalen och tar bort voxlarna utanför IBA1-färgningen
- Lägga till en ny yta i filen
- Välj den kanal som motsvarar CD68-färgningen
- Applicera ett tröskelvärde som ska överlappa CD68-färgningen och matchar så nära färgningsvolymerna som möjligt
- Slutför processen, eftersom endast de intramikrogliala CD68-strukturerna kommer att finnas i den här filen och därmed kräver de inte ett annat tröskelfiltreringssteg
- Skaffa och registrera antalet och den genomsnittliga volymen av CD68-positiva strukturer
- Beräkna den relativa volymen av CD68-strukturer per dess motsvarande IBA1-strukturer som ett mått på mikrogliaaktivering i fagocytiskt tillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll levereras fluorescerande märkta antikroppar till hjärnan och kan detekteras, tillsammans med mikrogliaaktivering. Slutsatsen som kan dras är användningen av fokuserat ultraljud och mikrobubblor ökar markant hjärnans upptag av antikroppar och kan leverera antikroppar till hela hjärnan eller halvklotet hos en mus när den används i ett skanningsläge. Figur 1 visar TIPS ultraljud applikationsenhet (olika komponenter märkta) som används för att öppna BBB. Figur 2 visar de representativa resultaten från Coulter-räknarens mätningar av storlek och koncentration som bör erhållas när mikrobubblorna produceras korrekt. För att enkelt visualisera leveransen märktes antikropparna med ett långrött fluorescerande färgämne. Hjärnans antikroppsupptag kan enkelt visualiseras i hela hjärnan eller sektioner med hjälp av en infraröd skanner eller med hjälp av fluorescerande mikroskopi på hjärnsektioner. Hjärnsektioner visar placeringen av den fluorescerande märkta antikroppen på mikroskopisk nivå. Representativa resultat för skanning av ultraljudsleverans till hippocampus av fluorescerande märkt anti-tau-antikropp RN2N visas i figur 3. För att observera någon förändring av normal hjärnhomeostas som en följd av SUS och antikroppsleverans var en avläsning det mikrogliala lysosomala innehållet i förhållande till fagocytos. Figur 4 visar representativ färgning för mikroglia med Iba1 och den mikroglialelysosomerspecifika markören CD68 för att avgöra om mikroglia blir mer fagocytiska efter leverans av antikroppen.
Figur 1: Det fokuserade ultraljudssystemet som används för att leverera ultraljud med kritiska komponenter som märks. (A) Den hemmagjorda gelhållaren som fungerar som en 8 mm distans. (B) Visa genom givaren som visar hur målet är i linje med fokus visuellt (C). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kvalitetskontrollmätningar av internt beredda mikrobubblor. (A) Coulter-räknarutrustning som används för att erhålla sammanfattande statistik (B) och storleksfördelning av mikrobubblor i antal (C) och volymfördelning (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Leverans av fluorescerande märkt antikropp i hjärnan med hjälp av SUS. (A) Ett fluorescerande märkt antikroppsfragment specifikt för en tau-isoform som levereras på egen hand, SUS på egen hand, och en kombinationsbehandling avslöjade ökat upptag av antikroppen av en sonicated halvklot i kombination med SUS med hjälp av nära infraröd fluorescerande avbildning av en halvklot i hjärnan. En uppslagstabell (LUT) tillämpades, med högre fluorescensintensitet i godtyckliga enheter som visas i varmare färger. (B) Kvantifiering av fluorescens gjordes utan att subtrahera SUS-kontrollnivåerna för bakgrundsfluorescens. Medelvärde ± SEM visas. (C) Ökat upptag av den fluorescerande märkta antikroppen av hippocampala neuroner som visas i låg- och högförstoringsbilder av hjärnsektioner. I kombinationsbehandlingen distribueras antikroppen till cellkroppar och till och med dendriter som visas för hippocampala neuroner. Blå = DAPI, magenta = antikroppsfragment. Skala bar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ immunofluorescensmärkning för mikroglia, som visar den förväntade morfologin hos mikroglia och återges i 3D med bildanalysprogramvaran. Microglia morfologi observeras i grönt och nivåer och fördelning av CD68 observeras i rött. Skala bar 10 μm. Grön = Iba1, röd = CD68. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fluorescerande märkta antikroppar kan levereras till hjärnan med hjälp av fokuserat ultraljud tillsammans med mikrobubblor applicerade i skanningsläge. Antikroppsleverans, mikrogliamorfologi och lysosomal förstoring kan detekteras genom fluorescensmikroskopi efter skanning ultraljud. Mikroglia kan i sina lysosomer ta upp antikroppar och antigener som antikropparna har bundit till i en Fc-receptormedierad process4.
Det finns ett antal kritiska steg för att uppnå repeterbar BBB-öppning och antikroppsleverans med denna metod. Det är viktigt att säkerställa god koppling mellan ultraljudsgivaren och musens huvud. Ta bort allt hår på musens huvud och se till att det inte finns några luftbubblor i kopplingen. Egenskaperna hos de internt beredda mikrobubblorna är avgörande för framgång. Mikrobubblor måste ha en tillräcklig koncentration på 108 mikrobubblor/ml och en storleksfördelning så att över 90 % av mikrobubblorna är under 10 μm i diameter. Detta beror på att större mikrobubblor är kända för att filtreras bort från cirkulationen av lungorna. En acceptabel medianstorlek är mellan 1 -3 μm. Mikrobubblor måste hanteras och injiceras försiktigt för att undvika att förstöra dem i sprutan. Det är viktigt att ultraljudet appliceras senast 2 minuter efter injektionen av mikrobubblorna som kan uppnås med övning. Inriktning på en hel hjärna eller hela halvklotet uppnås enkelt med SUS-tillvägagångssättet och noggrannheten i inriktningen är osannolikt att vara ett problem när man riktar sig till stora regioner. En mindre hjärnregion som hippocampus eller striatum kan också framgångsrikt riktas men i detta fall är det viktigt att fokus överlappar den riktade regionen. Höjden på en mushjärna liknar den axiella längden på den fokuserade ultraljudsstrålen vid 1 MHz med hjälp av en typisk ultraljudsgivare, så att givaren bara behöver flyttas i x- och y-dimensionen och inte z-dimensionen. Detta kan bestämmas av kunskapen om stereotaxiska koordinater för en viss hjärnstruktur och genom att titta på lambdoid- och sagittalsuturerna genom musens depilerade hud.
Här demonstrerar vi en teknik som använder retroorbitala injektioner för att leverera mikrobubblor och antikroppar. Ett alternativ till retroorbitala injektioner är injektioner av svansvener som också är en effektiv teknik för att leverera mikrobubblor och antikroppar. Fördelarna med retroorbital injektion är att det är tekniskt mindre utmanande än injektioner av svansvenen och kan upprepas flera gånger (alternerande injektionsöga) med mycket minimal risk för vävnadsskador.
Om ingen fluorescerande märkt antikropp detekteras i hjärnan är det troligt att BBB inte öppnades. Felsökning bör fokusera på att erhålla en koncentrerad mikrobubbellösning och injicera den för att inte förstöra mikrobubblorna och leverera ultraljudet inom två minuter efter injektionstiden. Om ingen BBB-öppning inträffar kan toppnedertrycksinställningen ökas, med förbehållet att högre toppnedertryck ökar risken för att orsaka mikrohemorrager som vi inte upptäcker vid en högsta undertrycksinställning på 0,65 MPa med hjälp av de beskrivna inställningarna. Beroende på antikroppens antigenspecificitet kommer färgningsmönstret att vara annorlunda. Färgningsmönstret som erhålls vid injektion av en anti-tau-antikropp visas i figur 2.
Denna teknik kan tillämpas på en rad antikroppar och så länge som konsekvent BBB-öppning erhålls kan bindning av antikroppen till ett mål i hjärnan bedömas. Skanningsultraljudsmetoden uppnår öppning av BBB över en hel mushjärna på ett reproducerbart sätt.
En begränsning av denna teknik är att förekomsten och omfattningen av BBB-öppningen inte observeras medan musen lever. Denna begränsning kan övervinnas genom att inkludera MR-avbildning med gadoliniumkontrastmedel till proceduren, men detta ökar avsevärt tiden och kostnaden för proceduren.
Beskrivs här är en enda ultraljudsbehandling och enda administrering av antikroppsprotokoll som kan användas för att bestämma hur mycket ökat upptag av antikroppar kan uppnås, liksom var de är belägna i hjärnan efter leverans. Protokollet kan också användas i en longitudinell studie för att bedöma terapeutiska effekter av antikroppsleverans. I en behandlingsstudie kan protokollet upprepas med ett interbehandlingsintervall på en vecka eller längre för att utvärdera den terapeutiska potentialen hos en antikropp som levereras till hjärnan. Den terapeutiska potentialen hos antikroppen som levereras av ultraljud kan bedömas i transgena musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar. Avläsningar av terapeutisk effekt kan innefatta beteendetester och histologi och biokemi för nivåerna av patologiska proteiner till exempel tau, amyloid-β eller synuklein.
Sammanfattningsvis har vi skisserat en metod för att öppna blod-hjärnbarriären hos möss för att leverera fluorescerande märkta antikroppar. Denna metod kommer att vara av intresse för forskare som utvärderar terapeutiska metoder för neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner stöd från Estate of Dr Clem Jones AO, National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], Metal Foundation och State Government of Queensland (DSITI, Department of Science, Information Technology and Innovation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M.
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
