Summary
Burada sunulan, floresan etiketli antikorları iletmek ve mikroglia'yı aktive etmek için kan-beyin bariyerini (BBB) fokal olarak veya bir fare beyni boyunca geçici olarak açmak için bir protokoldür. Ayrıca histoloji ile antikorların ve mikroglia aktivasyonunun verilmesini tespit etmek için bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin tarafından alınır. Fokuslu ultrason, kan-beyin bariyerinin (BBB) geçici olarak açılması yoluyla antikorların alımını ve katılımını arttırma imkanı sunar. Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak BBB boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği, kafatası üzerinden birden fazla noktayı hedef alan odaklanmış ultrason uygulamasıyla eş zamanlı olarak terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz, bu yaklaşıma tarama ultrasonu (SUS) diyoruz. Mikrokabarcıkların ve ultrasonun kan damarları üzerindeki mekanik etkileri, sıkı kavşakları geçici olarak ayırarak BBB boyunca parasellüler transportu arttırır ve vezikül aracılı transsitozu arttırır, antikorların ve terapötik ajanların etkili bir şekilde geçmesine izin verir. Dahası, ultrason ayrıca antikorların interstisyel beyinden, antikorun hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağıldığı nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırır. Çalışmalarımızda floresan etiketli antikorlar hazırlanır, kurum içinde hazırlanan lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırılır ve beyne SUS uygulanmadan hemen önce farelere enjekte edilir. Beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Normal beyin homeostazındaki değişiklikleri açıklamak için, mikroglial fagositoz hücresel bir belirteç olarak kullanılabilir. Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.
Introduction
Terapötik ultrason, kısmen terapötik ajanların beyne erişimini kolaylaştırarak, beyin hastalıklarını invaziv olmayan bir şekilde tedavi etmeyi amaçlayan yeni bir teknolojidir1,2,3. Beyin hastalıklarını hedef alan terapötik antikorların sadece küçük bir kısmı beyin4 tarafından alınıp beyinde tutulduğundan, terapötik ultrason bunların alımını ve hedef katılımını artırma imkanı sunar5,6.
Laboratuvarımızda nörodejeneratif hastalıklar için mikrokabarcıklar kullanılarak kan-beyin bariyeri (BBB) boyunca çeşitli formatlarda bir antikorun verildiği terapötik yaklaşımlar geliştiriyoruz. Bunu başarmak için ultrason, tarama ultrasonu (SUS)7 olarak adlandırdığımız bir tarama modu kullanılarak kafatası yoluyla beyne birden fazla noktada uygulanır. Ultrason enerjisi, intravenöz olarak enjekte edilen mikro kabarcıklar ve beyin vaskülatürü arasındaki mekanik etkileşim, BBB'nin sıkı kavşaklarını belirli bir sonikasyon hacminde geçici olarak ayırır ve antikorların ve terapötik ajanlar da dahil olmak üzere diğer yüklerin bu bariyeri etkili bir şekilde geçmesine izin verir7,8,9 . Dahası, ultrasonun interstisyel beyinden antikorların nöronlar gibi beyin hücrelerine alımını kolaylaştırdığı gösterilmiştir, burada antikor hücre gövdesi boyunca ve hatta nöritik süreçlere dağılır5,10.
Alzheimer hastalığı, amiloid β ve tau patolojisi11 ile karakterizedir ve patojenik mekanizmaları incelemek ve terapötik stratejileri doğrulamak için bir dizi hayvan modeli mevcuttur. Ultrasonun tüm beyinde sıralı bir şekilde uygulandığı bir SUS yaklaşımı, birkaç tedavi seansı boyunca tekrarlandığında, amiloid β biriktiren amiloid öncü protein (APP) mutant farelerin beyinlerindeki amiloid plak patolojisini azaltabilir ve amiloidi alan mikrogliayı aktive ederek bilişsel işlevlerde iyileşmeye yol açabilir7. Ultrason ve mikrokabarcıklarla BBB açıklığı da pR5, K3 ve rTg4510 tau transgenik farelerde tau patolojisini azaltır5,12,13. Önemli olarak, mikroglia hücre dışı protein birikintilerini giderirken, SUS tarafından indüklenen intranöronal patolojiler için altta yatan klirens mekanizmalarından biri nöronal otofajinin aktivasyonudur12.
Burada, floresan olarak etiketlenmiş antikorların hazırlandığı ve daha sonra kurum içi lipit bazlı mikrokabarcıklarla karıştırıldığı, ardından anestezi uygulanan farelere retroorbital enjeksiyonun yapıldığı deneysel bir süreci özetliyoruz. Retroorbital enjeksiyon, aynı derecede etkili ve tekrar tekrar gerçekleştirilmesi daha kolay olduğunu bulduğumuz kuyruk damarı enjeksiyonuna bir alternatiftir. Bunu hemen beyne SUS uygulayarak takip eder. Terapötik antikor alımını belirlemek için, fareler kurban edilir ve beyindeki artan antikor konsantrasyonu daha sonra ölçülür. Beyin homeostazındaki değişimin bir vekili olarak, mikroglial fagositik aktivite histoloji ve hacimsel 3D rekonstrüksiyon ile belirlenir.
Üretilen veriler, antikorların ultrasonla verilmesinin nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde potansiyel olarak çekici bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Protokol benzer şekilde diğer ilaç adaylarına ve tanımlanmış boyutlarda floresan etiketli dextrans gibi model kargolara da uygulanabilir14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Queensland Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Şirket içi mikrokabarcık hazırlama
- 1,2-distearoil-sn-glycero-3-fosfokolin ve 1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polietilenglikol)-2000] (amonyum tuzu) 9: 1 molar oranını tartın. 1 mL mikrokabarcık çözeltisi başına 0.5 mg lipit karışımı gereklidir. Alternatif olarak, önceden çözünmüş lipitler kullanılarak adım 1.3'e devam edilirse, lipitler zaten kloroformda satın alınabilir.
- Lipiti bir cam beherde küçük bir kloroform hacminde çözün.
- Kloroformu bir evaporatör veya azot akışı ile buharlaştırın.
- Kurutulmuş lipit filmini, 0.22 μm filtreden süzülmüş 10 mL PBS +% 10 gliserol +% 10 propilen glikol çözeltisi ile rehidre edin.
- Rehidrate lipit çözeltisini 55 ° C'ye (lipitlerin erime sıcaklığının üstünde) ayarlanmış bir su banyosu sonikatörüne yerleştirin ve tamamen çözünene kadar sonikat yapın.
- Otoklavlanmış 1.5 mL HPLC şişelerine Aliquot lipit çözeltisi ve septa kapaklarına vida.
- Şişedeki tüm havayı 27 G'lik bir iğne ile donatılmış 5 mL'lik bir şırınga ile aspire edin ve şişede bir vakum oluşturun.
- Birlikte verilen şırınga ile şişeye oktofloropropan ekleyin ve gazı teneke kutudan çekin. Şırıngadaki hacmi okuyarak şişeyi 1-2 mL oktafloropropan ile doldurun.
- Her şişeyi parafin film ile kapatın ve soğutun.
- Deney gününde, şişeyi oda sıcaklığına getirin, şişeye 0,5 mL% 0,9 NaCl çözeltisi ekleyin, ardından şişeyi bir birleştiriciye yerleştirin ve mikrokabarcıkları üretmek için 45 s (önceden ayarlanmış süre) çalkalayın.
2. Bir coulter sayacı kullanarak mikrokabarcık kalite kontrolü
- Mikrokabarcık çözeltisini birleştiriciden çıkarın ve septayı 19 G'lik bir iğneyle delerek gazı şişeden boşaltın.
- 19 G iğneli 1 ml'lik bir şırınga kullanarak 5 mL filtrelenmiş akış çözeltisine 100 μL mikrokabarcık çözeltisi ekleyerek iki adımlı 1:5.000 seri seyreltme gerçekleştirerek mikrokabarcık çözeltisini seyreltin ve ardından 100 μL seyreltilmiş mikrokabarcık çözeltisini alarak ve pipet kullanarak bir küvette 10 mL filtrelenmiş akış çözeltisine pipetleyin.
- Elektrolit tankının yeterli akış çözeltisine sahip olduğunu ve atık tankının boş olduğunu kontrol edin.
- Küvet tezgah platformuna yerleştirin ve yerine kilitleyin. Örnek almak için 30 μm'lik bir açıklık kullanın.
- Yazılımda, standart çalışma yöntemini (SOM) yükleyin ve ardından konsantrasyon | SOM Düzenle'yi seçin. 5000x seyreltme girin.
- Yazılımda, uygun bir dosya adı seçin. Örneğin, microbubble_1_date.
- Küvetleri platforma yükleyin ve sabitleyin.
- Yazılımda Çalıştır'ı seçin| Numune konsantrasyonunun% 10'dan az olduğunu önizleyin ve doğrulayın. Bu sayı% 10'dan yüksekse, mikro kabarcıkların daha yüksek bir seyreltme faktörü ile yeni bir seyreltme işlemini gerçekleştirin.
- İlk okumayı elde etmek üzere numuneyi almaya başlamak için 'Başlat'ı seçin.
- Her ölçümden sonra Coulter sayacının açıklığını filtrelenmiş akış çözeltisi ile durulayın. 3 çoğaltma elde etmek için 2.2-2.9 arasındaki adımları yineleyin.
- Seyreltilmiş mikrokabarcık çözeltisi içeren bir küveti bir sonicator su banyosuna yerleştirin ve 30 s boyunca sonikat yapın.
- Çözümü sonikleştirilmiş mikro kabarcıklarla ölçün ve boş olarak etiketleyin.
- Yazılımda, son okumayı ilk okumadan çıkarın. Bu, mikro kabarcık olmayan ve gaz içermeyen parçacıkları çıkarır.
- Mikro kabarcık konsantrasyonunu, boyut dağılımını, ortalama boyutu ve hacim konsantrasyonunu görüntülemek için yazılımda Sonuçları Görüntüle'yi seçin.
3. Floresan antikor etiketleme
- Herhangi bir katkı maddesi olmadan PBS'de 1 mg/mL'lik bir fare IgG çözeltisi elde edin.
- Kitte bulunan üreticilerin talimatlarını izleyerek AlexaFluor 647 ile 0,1 M sodyum bikarbonat tamponunda 1 mg fare IgG etiketleyin. Bu floresan olarak etiketlenmiş IgG miktarı, 5 mg / kg antikor dozunun uygulandığı 5-7 yetişkin farede bu prosedürü gerçekleştirmek için yeterlidir.
- Boyayı 0,1 M sodyum bikarbonat tamponunda IgG çözeltisine ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
- Antikor çözeltisini bir spin kolonuna pipetleyerek ve 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yaparak floresan etiketli antikoru saflaştırın. Serbest boya sütun yatağında kalacaktır.
- Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Konjugat çözeltinin emiciliğini 280 nm ve 650 nm'de (A280 ve A650) ölçün. Denklemi kullanarak numunedeki protein konsantrasyonunu hesaplayın:
Protein konsantrasyonu (M) = [A280 - (A650 x 0.03)] x seyreltme faktörü / 203.000. - Denklemi kullanarak etiketleme derecesini hesaplamak için bir spektrofotometre kullanın:
mol proteini başına mol boyası = A650 x seyreltme faktörü / 239 000 x protein konsantrasyonu (M).
NOT: Kabul edilebilir bir etiketleme derecesi, mol proteini başına 3-7 mol boyadır ve tipik olarak elde edilen etiketleme derecesi yaklaşık 6'dır.
4. Ultrason kurulumu
- Fokuslu ultrason sistemini kullanarak, ultrason odağını su bolusunun tabanının 9 mm altına konumlandırmak için 5 mm'lik ara parçayı su bolusuna ekleyin.
- Su bolusunu, 20 dakika boyunca bir inline degazör ile gazdan arındırılmış yaklaşık 300 mL deiyonize su ile doldurun (oksijen içeriği 3 ppm'nin altında olmalıdır). Dairesel diziyi doldurulmuş su bolusuna yerleştirin ve yüzeyde hava kabarcığı olup olmadığını kontrol etmek için bir diş aynası kullanın. Yüzeyde varsa, dairesel diziyi çıkarın ve su bolusunda değiştirin.
- Uygulama yazılımını başlatın. Dalga formu menüsünde, Dalga formu görev döngüsünü ayarla'yı seçin. Ayarlar PRF (Hz) 10, görev döngüsü% 10, odak 80 mm, merkez frekansı 1 MHz, genlik (MPa tepe negatif basıncı) 0.65 MPa, mekanik indeks = 0.65'tir. Dalga formunu tanımlamak ve bellekte saklamak için Set tuşuna basın.
NOT: Fokuslu ultrason sistemi, kalibre edilmiş bir hidrofon tarafından alınan ölçümlerden üretici tarafından önceden kalibre edilir. - Fokuslu ultrason sistemi yazılımında, bir tedavi planı tanımlayın. Bu, birden fazla bireysel tedavi bölgesinden oluşan bir tedavi bölgesi tanımlamayı ve bu tedavi bölgelerinin her birinde alınacak eylemleri tanımlamayı gerektirir. Bu durumda, tedavi bölgesi fare beyninin bir yarımküresidir.
- Hareket denetleyicisi penceresinde, Tara sekmesine gidin ve x boyutunda hareket için başlat, durdur ve artır değerini girin ve y yönünde hareket için değeri başlatın, durdurun ve artırın. X: start -4, stop 3.50 ve Y: -3.00, stop 3, Increment 1.5, # loops: 1 değerlerini girin.
- Tedavi bölgeleri için eylemleri tanımlayın. Hareket denetleyicisi penceresinde, Olay düğmesini seçin. Komut Dosyası Düzenleme Penceresinde, her tedavi yerinde seçilen sırada yürütülecek eylemlerin bir listesini seçin. Hareket Türü'nü komut dosyası penceresinin üst kısmındaki raster ızgarası olarak ayarlayın. Olaylar sekmesinde, bunları komut dosyası paneline taşımak için Eylemler Ekle'yi seçin ve Senkron Olarak Taşı, Tetikleyici arb'yi başlat , bekle, Tetikleyici arb'yi durdur'u ekleyin. Bekle eylemine tıklayın ve 6.000 ms'lik bir bekleme süresi seçin.
NOT: Bu ayarlar, tedaviyi 1,5 mm aralıklı 6 x 5 ızgaralı bir tedavi noktası ızgarası haline getirecek ve her bir noktanın tedavi süresi 6 sn'dir. Bir fare beynini sonikleştirmek için toplam süre yaklaşık 3 dakikadır. Bu boyuttaki arıtma ızgarası, yaklaşık 30 g ağırlığındaki yetişkin C57/Bl6 fareler için uygundur. Tedavi noktaları ızgarasının boyutu, farenin boyutuna bağlı olarak yukarı veya aşağı ayarlanabilir.
5. Hayvan hazırlığı
- Fareyi 0,1 g'a kadar hassas bir teraziyle tartın.
- Fareyi intraperitoneal olarak 90 mg/kg ketamin ve 6 mg/kg ksilazin ile anestezi altına alın. Bir ayak parmağı sıkışması ile reflekslerin yokluğunu test edin. Alternatif olarak, fareler uygun bir yüz maskesi ile uygun bir inhalasyonel anestezik aparat kullanılarak izofluran ile uyuşturulabilir. İzofluran kullanılıyorsa, hipotermiyi önlemek için ultrason sırasında fare bir ısı yastığına yerleştirilmelidir.
- Saçları hayvanın kafasından tıraş etmek için elektrikli bir tıraş bıçağı kullanın, ardından pamuklu bir tomurcukla epilasyon kremi uygulayın, 2-3 dakika veya saçlar nemli bir gazlı bezle temizlenene kadar bırakın. Epilasyon kreminin farenin gözüne girmemesine dikkat edin.
- Farenin kafasının merkezini kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin. Dönüştürücünün merkezinde bir delik vardır ve dönüştürücü odağı ve odak noktası görsel olarak hizalanabilir.
- Daha önce tabanı kesilmiş ve yerine tartım teknesinin tabanına yapıştırılmış plastik bir ambalajla ultrason jeli ile değiştirilmiş küçük bir tartım teknesini doldurun. Bu, 8 mm'lik bir ara parça görevi görür ve farenin kafasına iyi bir bağlantı sağlar ve farenin kafasıyla hizalanmış dönüştürücünün odağının görsel olarak incelenmesini sağlar.
6. Mikrokabarcık hazırlama
- Bir mikrokabarcık şişesini oda sıcaklığına ısıtın. Etkinleştirmek için, şişeye 0,5 mL% 0,9 NaCl çözeltisi ekleyin ve mikro kabarcıkları üretmek için 45 s çalkalamak için bir birleştiriciye yerleştirin.
- Septayı 27 G'lik bir iğneyle delerek şişeyi havalandırın.
7. Ultrason tedavisi
- Mikrokabarcıkların şişesini ters çevirin ve çözeltinin 1 μL / g vücut ağırlığını yavaşça çekin. Buna floresan olarak etiketlenmiş antikor çözeltisi ekleyin ve şırıngada hafifçe karıştırın. Enjekte edilen maksimum hacim 150 μL'dir.
NOT: Şirket içinde hazırlanan mikro kabarcıklar, klinik olarak kullanılandan yaklaşık 60 kat daha az konsantredir (örneğin, Definity mikrokabarcıkları). Ses seviyesini veya konsantrasyonu, enjekte edilen mikrokabarcıkların sayısı klinik olarak kullanılanlara benzer olacak şekilde ayarlayın (örn. Belirlilik 1.2 x 108 mikrokabarcıklar / kg vücut ağırlığı). - Mikrokabarcık ve antikor çözeltisini retroorbital olarak enjekte edin, nazikçe ve yavaşça enjekte etmeye özen gösterin. Ardından, farenin gözlerine oftalmik merhem uygulayın.
- Fareyi baş tutucuya yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve farenin burnunu sabitleyin. Ardından ultrason jeli dolu küçük tartım teknesini başın üstüne yerleştirin.
- Su bolusunu, tartım teknesindeki ultrason jelinin üzerine oturana kadar indirin.
- Dönüştürücü odağını başın merkezine taşımak için joystick'i kullanın. Hareket sekmesinde Kaynağı Sıfırla'yı seçin.
- 7.3-7.6 arası adımlar 2 dakika sürecektir.
- Tutarlılık için, mikro kabarcıkların enjekte edilmesi ile tam taramanın seçilmesi arasında 2 dakikalık bir gecikme olmasını sağlamak için bir zamanlayıcı ayarlayın.
- Tedavi tamamlandıktan sonra, gözlere oftalmik merhem uygulayın ve fareyi ısıtılmış bir iyileşme odasına yerleştirin. İşlem sırasında hipotermi gözlenirse, işlem sırasında ek ısı sağlamak için farenin altına bir ısıtma yastığı yerleştirilebilir.
8. Doku toplama ve işleme
- Ultrason uygulamasından sonra ilgilenilen zaman noktasında (beyindeki yüksek antikor seviyelerini tespit etmek için en az 1 saat), fareyi aşırı dozda Pentobarbiton çözeltisi (100 mg / kg) ile derinlemesine anestezi altına alın ve fareyi 30 mL PBS ile transkardiyal olarak perfüze edin. Beyne verilen floresan etiketli antikorları spesifik olarak tespit etmek için iyi bir perfüzyon gereklidir.
- Beyni toplayın ve 4 ° C'de 24 saat boyunca% 4 PFA'ya daldırarak sabitleyin, ardından PBS ile yıkayın.
- Beyni tepsiye yerleştirerek ve 700 nm kanalda bir görüntü elde ederek beyni kızılötesi bir tarayıcıda görüntüleyin.
NOT: Fiksasyondan sonra, beyin PFA'dan çıkarılır, PBS'de yıkanır ve bölümlere ayrılır. Alternatif olarak, 4 ° C'de veya suya batırılana kadar 24 saat boyunca etilen glikol kriyoprotektan çözeltisine yerleştirilebilir ve daha sonra şişe içeren yeni bir kriyoprotektana taşınabilir ve uzun süreli depolama için -20 ° C'ye yerleştirilebilir. - PBS'de beyin soğuğunu bir vibratom kullanarak kesitleyin. Beyni platforma yapıştırın ve 30-40 μm kesitleri kesin ve PBS'ye toplayın.
NOT: Lizozomal otofloresan (yaklaşık 12 aydan daha eski hayvanlardan alınan bölümlerde yaygındır), bakteri üremesini engellemek için bölümlerin bir ışık odası kutusunda, oda sıcaklığında ve azid içeren PBS'de (% 0.02) gece boyunca aydınlatılmasıyla ağartılmalıdır.
9. Doku boyama ve görüntü alma
- Kesitleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke çözeltisine (%0,2 Triton/PBS'de %5 BSA) aktarın, ardından çözeltiyi %0,2 Triton/PBS ile değiştirerek bölümleri 3x yıkayın.
- Iba1 (seyreltme 1:1,000) ve CD68'e (seyreltme 1:500) karşı birincil antikorlarla gece boyunca 4 °C'de kesitleri inkübe edin,% 0.2 Triton / PBS'de, ardından% 0.2 Triton / PBS ile 3x yıkama.
- Floresan sekonder antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat boyunca bölümleri inkübe edin (seyreltme 1:500), ardından sadece% 0.2 Triton / PBS ile 3x yıkama yapın.
NOT: Çekirdekler DAPI çözeltisi (0,5 μg/mL) kullanılarak da boyanabilir. - Bölümleri, sert ayarlı montaj ortamına sahip bir kızağa ve kapak kaymasına aktarın. Görselleştirme ve görüntü alımından önce (gece boyunca) montaj ortamının katılaşması için yeterli zaman tanıyın.
- Konfokal mikroskop ile ultrason hedefli beyin bölgesinin z-yığın görüntülerini (en az 10 μm derinlik ve 0.3 μm adım boyutu, hayvan başına 10 görüntü) konfokal mikroskop ve en az 40x büyütme hedefi kullanarak elde edin.
NOT: Sinyal dinamik aralığında görüntü elde etmeye dikkat edin, alt/aşırı pozlamayı önleyin. Görüntü dosyalarını mikroskop tarafından kullanılan ilgili yazılım biçiminde kaydedin.
10. Görüntü analizi
- Görüntü analiz yazılımı dosya içe aktarıcısını kullanarak z-stack mikroskopi dosyalarını dönüştürün.
- Dönüştürülen dosyaları yazılıma açın ve mikroglial hücreleri gözlemlemek için Iba1 kanalının yoğunluğunu ayarlayın.
- Etrafına bir kutu çizerek tek bir mikroglial hücreyi kırpın, 'kırp'ı seçin ve yeni dosyayı kaydedin.
- IBA1 sinyalinin 3B yüzey işlemesini şu şekilde oluşturun:
- Önceki adımda oluşturulan tek hücreli Imaris dosyasını açın.
- Dosyaya bir yüzey ekleyin.
- Iba1 boyamasına karşılık gelen kanalı seçin.
- Iba1 boyamasıyla örtüşmesi gereken bir eşik uygulayın
- Yalnızca ilgilenilen mikroglial hücreyi oluşturan ilgi yapısını seçin
- İşlemi sonlandırma
- Iba1 boyama hacmini elde edin ve kaydedin
- CD68 boyamasının 3B yüzey işlemesini oluşturun
- IBA1 yüzey alt dosyasının içinde, CD68 kanalını maskeleyin ve IBA1 lekelemesinin dışındaki vokselleri çıkarın
- Dosyaya yeni bir yüzey ekleme
- CD68 boyamasına karşılık gelen kanalı seçin
- CD68 boyama ile örtüşmesi gereken ve boyama hacimleriyle mümkün olduğunca yakından eşleşen bir eşik uygulayın
- Bu dosyada yalnızca intra-mikroglial CD68 yapıları bulunacağından ve bu nedenle başka bir eşik filtreleme adımı gerektirmediğinden işlemi sonlandırın.
- CD68 pozitif yapılarının sayısını ve ortalama hacmini elde edin ve kaydedin
- CD68 yapılarının karşılık gelen IBA1 yapılarına göre göreceli hacmini, fagositik bir durumda mikroglial aktivasyonun bir ölçüsü olarak hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak floresan olarak etiketlenmiş antikorlar beyne verilir ve mikroglia aktivasyonu ile birlikte tespit edilebilir. Çıkarılabilecek sonuç, odaklanmış ultrason ve mikrokabarcıkların kullanılması, antikorların beyin alımını belirgin şekilde arttırır ve tarama modunda kullanıldığında bir farenin tüm beynine veya yarımküresine antikorlar verebilir. Şekil 1 , BBB'yi açmak için kullanılan TIPS ultrason uygulama cihazını (etiketli farklı bileşenler) göstermektedir. Şekil 2 , mikro kabarcıklar doğru üretildiğinde elde edilmesi gereken boyut ve konsantrasyondaki Coulter karşı ölçümlerinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Dağıtımı kolayca görselleştirmek için, antikorlar çok kırmızı bir floresan boya ile etiketlendi. Beyin tarafından antikor alımı, kızılötesi tarayıcı kullanılarak veya beyin bölümlerinde floresan mikroskopi kullanılarak tüm beyinde veya bölümlerde kolayca görselleştirilebilir. Beyin bölümleri, floresan olarak etiketlenmiş antikorun yerini mikroskobik düzeyde gösterir. Floresan olarak etiketlenmiş anti-tau antikoru RN2N'nin hipokampusuna taramalı ultrason dağıtımı için temsili sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir. SUS ve antikor iletiminin bir sonucu olarak normal beyin homeostazındaki herhangi bir değişikliği gözlemlemek için, bir okuma fagositoz ile ilişkili olarak mikroglial lizozomal içerikti. Şekil 4, antikorun verilmesinden sonra mikroglianın daha fagositik hale gelip gelmediğini belirlemek için Iba1 ve mikroglial lizozom spesifik belirteci CD68 kullanılarak mikroglia için temsili boyama göstermektedir.
Şekil 1: Kritik bileşenler etiketlenmiş ultrason dağıtımı için kullanılan odaklanmış ultrason sistemi. (A) 8 mm'lik bir ara parça görevi gören ev yapımı jel tutucu. (B) Hedefin görsel olarak odakla nasıl hizalandığını gösteren dönüştürücüyü görüntüleyin (C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kurum içi hazırlanan mikrokabarcıkların kalite kontrol ölçümleri. (A) Özet istatistikleri (B) ve mikrokabarcıkların sayı (C) ve hacim dağılımı (D) olarak boyut dağılımını elde etmek için kullanılan Coulter sayaç ekipmanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Floresan etiketli antikorun SUS kullanılarak beyne verilmesi. (A) Kendi başına verilen bir tau izoformuna özgü floresan olarak etiketlenmiş bir antikor fragmanı, SUS kendi başına ve bir kombinasyon tedavisi, beynin bir yarımküresinin yakın kızılötesi floresan görüntülemesi kullanılarak SUS ile birleştirildiğinde sonikasyonlu bir yarımküre tarafından antikorun alımının arttığını ortaya koymuştur. Daha sıcak renklerde görüntülenen rastgele birimlerde daha yüksek floresan yoğunluğuna sahip bir arama tablosu (LUT) uygulandı. (B) Floresan miktarının ölçülmesi, arka plan floresansının yalnızca SUS kontrol seviyeleri çıkarılmadan yapılmıştır. Gösterilen ortalama ± SEM. (C) Hipokampal nöronlar tarafından floresan olarak etiketlenmiş antikorun alımının artması, beyin bölümlerinin düşük ve yüksek büyütme görüntülerinde gösterilmiştir. Kombinasyon tedavisinde, antikor, hipokampal nöronlar için gösterildiği gibi hücre gövdelerine ve hatta dendritlere dağılır. Mavi = DAPI, macenta = antikor fragmanı. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroglia için temsili immünofloresan etiketleme, mikroglia'nın beklenen morfolojisini gösteren ve görüntü analiz yazılımı ile 3D olarak işlenen. Mikroglia morfolojisi yeşil, CD68 düzeyleri ve dağılımı kırmızı renkte gözlenir. Ölçek çubuğu 10 μm. Yeşil=İba1, kırmızı=CD68. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Floresan etiketli antikorlar, tarama modunda uygulanan mikrokabarcıklarla birlikte odaklanmış ultrason kullanılarak beyne iletilebilir. Antikor iletimi, mikroglial morfoloji ve lizozomal genişleme, taramalı ultrason sonrası floresan mikroskobu ile saptanabilir. Mikroglia, Fc-reseptör aracılı bir süreçte antikorların bağlandığı lizozom antikorlarını ve antijenlerini alabilir4.
Bu yöntemi kullanarak tekrarlanabilir BBB açıklığı ve antikor iletimi elde etmek için bir dizi kritik adım vardır. Ultrason dönüştürücü ile farenin başı arasında iyi bir bağlantı sağlamak çok önemlidir. Farenin başındaki tüm tüyleri çıkarın ve kaplinde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Şirket içinde hazırlanan mikro kabarcıkların özellikleri başarı için kritik öneme sahiptir. Mikrokabarcıklar, 108 mikrokabarcık / mL'lik yeterli bir konsantrasyona ve mikrokabarcıkların% 90'ından fazlasının çapının 10 μm'nin altında olacağı şekilde bir boyut dağılımına sahip olmalıdır. Bunun nedeni, daha büyük mikro kabarcıkların akciğerler tarafından dolaşımdan filtrelendiği bilinmektedir. Kabul edilebilir bir medyan boyut 1 -3 μm arasındadır. Şırıngada tahrip olmalarını önlemek için mikrokabarcıklar nazikçe kullanılmalı ve enjekte edilmelidir. Ultrasonun, pratikle elde edilebilecek mikrokabarcıkların enjeksiyonunu takiben en geç 2 dakika içinde uygulanması önemlidir. SUS yaklaşımı ile tüm beynin veya tüm yarımkürenin hedeflenmesi kolayca elde edilir ve büyük bölgeleri hedeflerken hedeflemenin doğruluğunun bir sorun olması muhtemel değildir. Hipokampus veya striatum gibi daha küçük bir beyin bölgesi de başarılı bir şekilde hedeflenebilir, ancak bu durumda odağın hedeflenen bölgeyle örtüşmesi önemlidir. Bir fare beyninin yüksekliği, tipik bir ultrason dönüştürücü kullanılarak 1 MHz'de odaklanmış ultrason ışınının eksenel uzunluğuna benzer, böylece dönüştürücünün z boyutunda değil, yalnızca x ve y boyutunda hareket ettirilmesi gerekir. Bu, belirli bir beyin yapısı için stereotaksik koordinatların bilgisi ve lambdoid ve sagital sütürlerin farenin epilasyona uğramış derisinden görüntülenmesiyle belirlenebilir.
Burada mikrokabarcıklar ve antikor vermek için retroorbital enjeksiyonları kullanan bir teknik gösteriliyor. Retroorbital enjeksiyonlara bir alternatif, aynı zamanda mikrokabarcıklar ve antikorlar vermek için etkili bir teknik olan kuyruk damarı enjeksiyonlarıdır. Retroorbital enjeksiyonun avantajları, kuyruk damarı enjeksiyonlarından teknik olarak daha az zorlayıcı olması ve çok az doku hasarı riski ile birden fazla kez (alternatif enjeksiyon gözü) tekrarlanabilmesidir.
Beyinde floresan etiketli bir antikor tespit edilmezse, BBB'nin açılmamış olması muhtemeldir. Sorun giderme, konsantre bir mikrokabarcık çözeltisi elde etmeye ve mikrokabarcıkları tahrip etmeyecek şekilde enjekte etmeye ve enjeksiyon süresinden sonraki iki dakika içinde ultrasonu vermeye odaklanmalıdır. BBB açıklığı olmazsa, pik negatif basınç ayarı arttırılabilir, daha yüksek pik negatif basınçların, açıklanan ayarları kullanarak 0.65 MPa'lık bir pik negatif basınç ayarında tespit edemediğimiz mikrokanamalara neden olma şansını arttırdığı uyarısıyla. Antikorun antijen özgüllüğüne bağlı olarak boyama paterni farklı olacaktır. Bir anti-tau antikoru enjekte edilirken elde edilen boyama paterni Şekil 2'de gösterilmiştir.
Bu teknik bir dizi antikora uygulanabilir ve tutarlı BBB açıklığı elde edildiği sürece, antikorun beyindeki bir hedefe bağlanması değerlendirilebilir. Taramalı ultrason yaklaşımı, BBB'nin tüm fare beyninde tekrarlanabilir bir şekilde açılmasını sağlar.
Bu tekniğin bir sınırlaması, fare canlıyken BBB açıklığının oluşumunun ve kapsamının gözlenmemesidir. Bu sınırlama, gadolinyum kontrast madde ile MRG görüntülemenin prosedüre dahil edilmesiyle aşılabilir, ancak bu işlemin süresini ve maliyetini önemli ölçüde artırır.
Burada açıklanan, antikorların ne kadar artabileceğini ve doğumdan sonra beyinde nerede bulunduklarını belirlemek için kullanılabilecek tek bir sonikasyon ve tek bir antikor protokolü uygulamasıdır. Protokol, antikor dağıtımının terapötik etkilerini değerlendirmek için uzunlamasına bir çalışmada da kullanılabilir. Bir tedavi çalışmasında, protokol, beyne verilen bir antikorun terapötik potansiyelini değerlendirmek için bir hafta veya daha uzun bir tedavi aralığı ile tekrarlanabilir. Ultrason ile verilen antikorun terapötik potansiyeli, nörodejeneratif hastalıkların transgenik fare modellerinde değerlendirilebilir. Terapötik etkinin okunması, davranışsal testleri ve tau, amiloid-β veya sinüklein gibi patolojik proteinlerin seviyeleri için histoloji ve biyokimyayı içerebilir.
Sonuç olarak, floresan etiketli antikorları vermek için farelerde kan beyin bariyerini açmak için bir yöntem belirledik. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklar için terapötik yaklaşımları değerlendiren araştırmacıların ilgisini çekecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.
Acknowledgments
Dr. Clem Jones AO'nun Mülkünün, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nin [GNT1145580, GNT1176326], Metal Vakfı'nın ve Queensland Eyalet Hükümeti'nin (DSITI, Bilim, Bilgi Teknolojisi ve İnovasyon Bakanlığı) desteğini kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
References
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer's disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer's disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases - current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M.
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
