Summary
Denne protokol præsenterer en metode til at udføre rheologi karakterisering af slim, der er bosat på gill rakers (GRs) af sølv karper. Viskoelastic egenskaber ved GR-slim, opnået ved måling af viskositet, opbevaring og tab moduli, evalueres for den tilsyneladende udbytte stress til at forstå filter fodring mekanisme i GRs.
Abstract
Sølvkarpen, Hypophthalmichthys molitrix, er en invasiv planktivorøs filterføderfisk, der angreb de naturlige vandveje i det øvre Mississippi-flodbassin på grund af dets meget effektive filterfodringsmekanisme. De karakteristiske organer kaldet gill rakers (GRs), der findes i mange sådanne filterfødere, letter effektiv filtrering af fødevarepartikler som fytoplankton, der er af få mikron i størrelse.
Motivationen til at undersøge RHEology af GR slim stammer fra vores ønske om at forstå sin rolle i medvirken til filter fodring proces i sølv karper. Den slim-rige væske, i en 'tyk og klæbrig' tilstand kan lette vedhæftning af fødevarer partikler. Permeation og transport gennem GR-membranen lettes ved virkningen af eksterne forskydningskræfter, der fremkalder varierende forskydningsbelastningshastigheder. Derfor kan slim rheology give et vigtigt fingerpeg om den enorme udkonkurrerende karakter af sølvkarpen i puljen af filterfodringsfisk. På grundlag af dette blev det fremført, at GR slim kan give en klæbefunktion til fødevarepartikler og fungere som et transportkøretøj for at hjælpe med filterfodringsprocessen.
Hovedformålet med protokollen er at bestemme slimets udbyttebelastning, der tilskrives den minimale forskydningsstress, der kræves for at indlede flow, hvor irreversibel plastdeformation først observeres på tværs af et struktureret viskoelastisk materiale. Derfor blev rheologiske egenskaber af GR slim, dvs viskositet, opbevaring og tab moduli, undersøgt for sin ikke-newtonske, forskydning-udtynding karakter ved hjælp af en roterende rheometer.
En protokol præsenteret her er ansat til at analysere de rheologiske egenskaber af slim udvundet fra gill rakers af en sølv karpe, fisket på Hart Creek placering af Missouri-floden. Protokollen har til formål at udvikle en effektiv strategi for rheologisk testning og materiel karakterisering af slim, der antages at være et struktureret viskoelastict materiale.
Introduction
Sølvkarpen, Hypophthalmichthys molitrix, er en planktivorous filterføder og en invasiv art, der har infiltreret flere naturlige vandveje i USA. Denne art blev oprindeligt indført i det øvre Mississippi-flodbassin for at kontrollere algeopblomstringer1,2,3. Sølvkarpen er en ekstremt effektiv føder. Typisk varierer dens forbrugsstoffer partikelstørrelser fra 4 til 20 μm til større zooplankton, der er omkring 80 μm3,4,5. Denne art har udkonkurreret andre indfødte fisk og kan potentielt forårsage enorme skader på indfødte vandveje ved at begrænse de tilgængelige ressourcer1,2,6. Således udgør filterfodring af fisk som sølvkarpen og bighead karpen en stor trussel mod de store søer1,2,6,7,8.
Filterfodringsfisk har specielle organer kaldet gill rakers (GRs) med et tyndt lag slim, der er bosiddende på deres overflade. Disse organer forbedrer effektiviteten af filtrering og sammenlægning af små partikler fra den indkommende væske. Målet med protokollen præsenteres heri er at karakterisere den ikke-newtonske, forskydning udtynding materiale ejendom og udbytte stress af GR slim erhvervet fra den indre overflade af gill rakers i sølv karpe. Værdien af udbytte stress af GR-slim, konstateret ved hjælp af en roterende rheometer, er af interesse i denne undersøgelse. Den målte udbyttebelastning, der også kaldes "tilsyneladende udbyttestress", afhænger af testmetoderne, såsom stabil forskydningshastighed eller dynamisk oscillatorisk stammetype9,10. Den forskydning-udtynding, 'udbytte-stress væske,' gennemgår en overgang fra fast-lignende til væske-lignende adfærd på en kritisk anvendt stress9,11. Den tilsyneladende udbytte stress er den mindste forskydning stress kræves for at indlede flow eller den, hvor irreversibel plast deformation først observeres, når slim overgange fra en gel-lignende materiale til en væske-lignende materiale. Denne adfærd kan observeres i strukturerede viskoelastiske materialer. Overgangen fra gel-lignende til væske-lignende adfærd GR slim indebærer to funktioner, dvs en klæbende rolle at samle fødevarer partikler og en transport køretøj rolle til at hjælpe med partikel levering og filtrering proces. Slimets udvidede funktion omfatter oprettelse af diffusionsbarrierer i sygdomsresistens og åndedræt, der giver kontrolleret frigivelse af ernæringsmæssige faktorer, giftige komponenter og udskillelse, skaber metaboliske veje til fodring og nesting, hjælper med rovdyrbeskyttelse og producerer grænselagsændringer, der forbedrer bevægelse og fremdriftseffektivitet12,13,14.
I modsætning til simple væsker, komplekse væsker som slim besidder egenskaber, der varierer med flow betingelser og kræver yderligere måling parametre til at definere deres bulk skala fysisk adfærd. For at overvåge gr slims viskositet og udbyttebelastning udføres rheologiske målinger ved hjælp af et rotationsrimeometer. Rotations rheometeret anvender en stabil eller oscillatorisk forskydningsbelastning eller belastning ved hjælp af en roterende disk i kontakt med væskeprøven og måler dens respons. Rationalet bag ved hjælp af dette instrument og teknik er, at rheometeret kan give et sæt målinger til at beskrive de materielle egenskaber af GR slim af sølv karper, som ikke kan defineres ved viskositet alene.
Slim er et viskoelastisk materiale, og dets mekaniske reaktion på en pålagt deformation er mellem en ren fast (styret af Hookes elasticitetslov) og en ren væske (styret af Newtons viskositetslov)15,16. Det komplekse makromolekylære netværk, der er indeholdt i slim, kan strække sig og omlægge som reaktion på eksterne kræfter eller deformation. Et rotationsrimeometer består af en keglegeometri og en Peltier-plade som vist i figur 1 og figur 2 (se tabel 1 for instrumenteringsspecifikationer). Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en protokol til bestemmelse af de rheologiske egenskaber af GR slim. En fordel ved rotationsrimetælleren i forhold til et viskometer er dets evne til at foretage dynamiske målinger ved hjælp af små prøvevolumener. GR slimprøvevolumenet i denne undersøgelse var ca. 1,4 mL. Viskometeret er derimod begrænset til konstante forskydningshastigheder og kræver store prøvemængder.
Slimets rheologiske egenskaber forventes at variere meget inden for sølvkarpeanatomien. For eksempel kan slimets egenskaber, der er bosiddende på GR-overfladerne, være forskellige fra epibranchialorganet. For at tage højde for den potentielle variation af slimegenskaber i forskellige områder af fisken blev den erhvervede GR slimprøve fortyndet, og opløsninger af tre koncentrationer blev skabt og testet ved hjælp af rotationsrometeret. De data og resultater vedrørende slim rheology rapporteret efter udførelse af protokollen demonstreret effekten af måling teknik. De illustrative data, der præsenteres i dette papir, er ikke beregnet til at blive generaliseret på tværs af hele sølvkarpepopulationen. Protokollen præsenteres heri kan udvides til at undersøge slim rheology på tværs af større prøve sæt til at teste andre hypoteser.
Formålet med denne undersøgelse er at påvise variationen af rheologiske egenskaber ved GR slim rheology med tre forskellige slimkoncentrationer (400 mg/mL, 200 mg/mL og 100 mg/mL). Koncentrationen på 400 mg/mL repræsenterer den rå slimprøve, der er høstet fra fiske-GR'erne. Deioniseret vand (DI), blev anvendt til at fortynde den rå slimprøve til 200 mg/mL og 100 mg/mL-koncentrationer. Fortynding af slimprøverne gjorde det muligt at vurdere graden af forskydningsfortyndning og tilsyneladende udbyttestress som funktion af koncentration og bestemmelse af den koncentration, hvor GR slim overgår til ikke-newtonsk adfærd. En shaker blev brugt til at nedbryde eventuelle store klumper af slim i prøverne for at afbøde fejl i de rheologiske data på grund af inhomogeneitet.
I de fleste hvirveldyr, herunder fisk, er de fremherskende slimdannende makromolekyler glycoproteiner (muciner), der har tendens til at svulme op i vand ved sammenfiltring eller kemisk krydsbinding og skabe et gellignende materiale12,13,17,18,19,20. Det højdybste, geldannende makromolekyler og højvandsindholdet afspejler glatheden islimet 13. En høj grad af intermakromolekkulære interaktioner fører til geldannelse , mens lavere niveauer af intermakromolekylære interaktioner eller brudte bindinger resulterer i højviskositetsvæsker21.
Processerne for filtrering af fødevarepartikler i filterfodringsfisk er hjulpet af GR slim-relaterede egenskaber som samhørighed og viskositet, der bestemmer dets potentiale for vedhæftning og tack22. Styrken af slimbaseret vedhæftning afhænger af specifikke intermolekylære, elektrostatiske eller hydrofobiske interaktioner23. Sanderson et al.24 gennemførte en suspension-fodring undersøgelse i blackfish hvori de fandt beviser for slim-baseret vedhæftning. De anførte, at vedhæftningen af svævestøv med slimhindeoverflade efterfølges af transport af aggregerede klumper af partikler bundet sammen med slim ved styret vandstrøm, der virker på den24. Slim udsat for forskydning stamme satser genereret fra vand-flow letter leveringen af fødevarer partikler til fordøjelsesorganerne. Endoskopiske teknikker blev brugt til at observere filtrerede partikler24.
Litteratur om rækken af forskydning satser og praktiske grænser i den rheological test af GR slim er knappe. Derfor blev vejledning søgt fra rheologiske undersøgelser af mave-, nasal- cervikal- og lunge slim, laks hud slim, hagfish slim, og knogle-fælles overflade smøremiddel, hvori rheological karakterisering og ikke-newtonske attributter blev undersøgt11,12,25,26,27,28,29,30,31. For nylig er effekten af fiskeskind slim på bevægelse og fremdrift effektivitet blevet undersøgt ved hjælp af konstant forskydning sats viscometri. Hud slim rheologi undersøgelser (uden fortynding eller homogenisering) vedrørende havørn, havabbor og mager demonstreret ikke-newtonsk adfærd ved typisk lave forskydningshastigheder14. I en anden relateret undersøgelse, den rå hud slim prøver fra dorsale og ventrale sider af den senegalesiske sål viste sig at udvise ikke-newtonsk adfærd, hvilket indikerer en højere viskositet af ventral slim på alle forskydning satser betragtes32. Andre rheologiske protokoller vedrørende hydrogel stillads udvikling og for stærkt koncentrerede suspensioner ved hjælp af en konstant forskydning sats viskometer er også blevet rapporteret i litteraturen33,34.
I denne undersøgelse blev GR slim egenskaber undersøgt ved hjælp af en stamme sats kontrolleret, roterende rheometer, der har været meget udbredt i rheology eksperimenter på komplekse biologiske væsker25. For newtonske væsker forbliver den tilsyneladende viskositet konstant, er forskydningsdelsafhængig, og forskydningsspændingerne varierer lineært med forskydningsbelastningshastigheder (Figur 3A, B). For ikke-newtonske væsker (f.eks. forskydningsfortyndende væsker) er viskositeten forskydningsafhængig eller deformationshistorisk afhængig (figur 3A, B). Tabsmodulus (G") repræsenterer, i hvilket omfang materialet modstår tendensen til at flyde og er repræsentativ for flydende viskositet (figur 4). Opbevaringsmodulus (G') repræsenterer materialets tendens til at genvinde sin oprindelige form efter stressinduceret deformation og svarer til elasticitet (figur 4). Fasevinklen (δ) eller tab tangent værdi, beregnes ud fra den inverse tangent af G"/G'. Det repræsenterer balancen mellem energitab og opbevaring og er også en fælles parameter for karakterisering af viskoelastiske materialer (δ = 0° for et hookean fast stof; δ = 90° for en tyktflydende væske; δ < 45° for et viskoelastict stof og δ > 45° for en viskoelastic væske) (Figur 4)25. Den tilsyneladende udbytte stress (σy) i strukturerede væsker repræsenterer en ændring af tilstand, der kan observeres i rheological data fra steady state sweep og dynamisk stress-stamme fejer10. Hvis den eksterne anvendte stress er mindre end den tilsyneladende udbytte stress, materialet vil deformere elastisk. Når stressen overstiger den tilsyneladende udbyttebelastning (markeret som "gennemsnitlig stress" i figur 3B), vil materialet skifte fra elastisk til plastisk deformation og begynde at flyde i sin flydende tilstand35. Måling af opbevaringsmodulus (G') og tabsmodulus (G") i slimprøven under oscillatoriske belastningsforhold (eller stamme) kvantificerer ændringen i materialetilstanden fra gellignende til viskoelastic væskelignende adfærd.
De typer rheometertest, der udføres for at overvåge data vedrørende lagermodulus (G'), tabsmodulus (G") og tilsyneladende viskositet (η), er beskrevet her. De dynamiske svingningsprøver (stamme fejer og frekvens fejer) overvåges G 'og G" under kontrolleret svingning af kegle geometri. De dynamiske belastningsundersøgelser målte slimets lineære viskoelastiske region (LVR) ved at overvåge det iboende materialerespons (figur 4). Stamme fejer blev brugt til at bestemme den givende adfærd ved konstant svingning frekvens og temperatur. De dynamiske frekvens sweep tests overvågede materialets reaktion på stigende frekvens (deformationshastighed) ved en konstant amplitud (stamme eller stress) og temperatur. Stamme blev opretholdt i den lineære viskoelastiske region (LVR) for den dynamiske frekvens feje tests. Steady-state forskydning sats tests overvåges den tilsyneladende viskositet (η) under konstant rotation af kegle geometri. GR slim blev udsat for trinvis stress trin og tilsyneladende viskositet (η, Pa's) blev overvåget for varierende forskydning sats (ý, 1 / s).
Protokollen præsenteres i dette papir behandler GR slim som et komplekst struktureret materiale af ukendt viskoeasticitet med en vis lineær viskoelastic respons rækkevidde. Fisken slim blev udvundet fra GRs af sølv karper under en fiskeekspedition på Hart creek placering i Missouri-floden af professor L. Patricia Hernandez (Institut for Biologiske Videnskaber, The George Washington University) 1,2,36. En række GR'er inde i munden på en sølvkarpe er vist i figur 5A, og en skematisk tegning præsenteres i figur 5B. En udskåret GR er vist i figur 5C. Udvindingen af slim fra GR af sølvkarpen præsenteres som et eksempel i de skematiske tegninger, Figur 5D, E. Alle rheometertestene blev udført under en konstant, kontrolleret temperatur på 22 ± 0,002 °C , den temperatur, der blev registreret på fiskestedet1,2,36. Hver slimprøve blev testet tre gange med rheometeret, og de gennemsnitlige resultater præsenteres sammen med de statistiske fejllinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af slimopløsninger i forskellige koncentrationer
BEMÆRK: Der udarbejdes tre koncentrationer af slimopløsningen (henholdsvis 400 mg/mL, 200 mg/mL og 100 mg/mL med omtrentlige mængder, henholdsvis 1 mL, 1 mL og 2 mL) til dette forsøg.
- For at beregne slimmassen måles den gennemsnitlige masse af hætteglassene med (Mmed slim ; mg) og uden slim (Mhætteglas; mg). Træk derefter hætteglassmassen med slim med det uden slim (Mslim = Mmed-slim - Mhætteglas ; mg).
- Slim fortyndes i tre koncentrationer (400, 200, 100 mg/mL) med deioniseret (DI) vand.
- Den første koncentration af slimopløsningen, 400 mg/mL, tilsættes 0,6 mL DI-vand til slimet ved hjælp af en mikropipette.
BEMÆRK: Da den omtrentlige mængde af det ekstraherede slim var 1,4 mL, vil 400 mg/mL-opløsningen have et samlet volumen på ~ 2 mL. - Placer 400 mg/mL slimopløsningsglaseret på en shaker for at sikre, at slimopløsningen er tilstrækkeligt homogeniseret, og at eventuelle slimpartiklers agglomeration afbødes.
- Den anden koncentration af slimopløsningen, 200 mg/mL, fremstilles ved at trække halvdelen af volumenet af slimopløsningen af første koncentration ind i et nyt hætteglas ved hjælp af en mikropipette og tilsættes 1 mL DI-vand i det nye hætteglas.
- Gentag trin 1.2.2 for første og andet hætteglas med slimopløsninger.
- Den tredje koncentration af slimopløsningen, 100 mg/mL, forberedes ved at trække halvdelen af volumen (1 mL) af 200 mg/mL-opløsningen til et nyt hætteglas ved hjælp af en mikropipette og tilsættes DI-vand til det nye hætteglas.
- Gentag trin 1.2.2 for alle tre koncentrationer af slimopløsninger i deres respektive hætteglas (se supplerende figur 1).
- Opbevar slimopløsningsglassene i køleskab, indtil rheometerkalibreringen og testen er udført.
- Den første koncentration af slimopløsningen, 400 mg/mL, tilsættes 0,6 mL DI-vand til slimet ved hjælp af en mikropipette.
2. Målinger og dataindsamling ved hjælp af et rheometer
BEMÆRK: Den software, der anvendes i denne protokol til instrumentkontrol og dataindsamling med rheometer, er noteret i materialetabellen. Denne software vil blive omtalt som 'rheometer instrument control software'.
- Opsætning og kalibrering af rheometerinstrumentet.
- Tænd for tryklufttilførslen til rheometeret, og sørg for, at det pneumatiske bord og rheometeret udjævnes ved hjælp af en boblemåler. Drej beskyttelseshætten af på rheometerakslen, og hold akslen stille, mens du skruer af.
- Tænd rheometer hovedafbryderne for at aktivere de magnetiske lejer på rheometeret.
- Tænd rheometer control computer med rheometer instrument kontrol software installeret i det og lancere rheometer instrument kontrol software (se supplerende figur 2).
- Udfør instrumentkalibrering ved at vælge fanerne 'Kalibrering | instrument' fra softwarevinduet. Vælg indstillingen' Instrument'. Klik på 'Kalibrer' under 'Inerti'. Optag kalibreringsværdien for instrumentet inerti i μN.m.s2 og gentag kalibrering mindst 3x for at sikre, at kalibreringsværdierne ligger inden for 10 % af hinanden (se supplerende figur 3).
- Installer rheometergeometrien på rheometerets aksel.
- Klik på fanen' Geometrier' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren.
- Rengør keglen med den ønskede geometri (40 mm diameter, 1◦ 0' 11'' kegle) og Peltier plade med isopropanol (se tabel 1, Tabel over materialer, Figur 1og Figur 2).
BEMÆRK: Peltier-pladen kommer installeret på rheometeret; det kan rengøres med isopropanol, mens det er direkte fastgjort til rheometeret. - Sørg for, at Peltier pladearmaturet er fri for synligt støv og rengør om nødvendigt med isopropanol. Installer Peltier-pladen, hvis den ikke er forudinstalleret i rheometeret, og tilslut køleprofilforbindelserne.
- Tryk på 'Lås-knappen' på rheometeret til låseakslen, der er forbundet med keglegeometrien. Dette anholder placeringen af akslen, men det kan rotere frit på positionen.
- Klik på 'Smart Swap | Aktiveret' under fanen Rheometer instrument control software til at tillade automatisk registrering af geometrien (se supplerende figur 4).
- Drej akslen oven på rheometeret for at skrue på geometrien. Softwaren registrerer 40 mm diameter, 1◦ 0' 11'' kegle vinkel geometri på dette stadium (se tabel 1 og tabel af materialer).
- Gentag trin 2.2.5 – 2.2.6 for at sikre, at geometrien registreres.
- Vælg 'Gap' under 'Kontrolpanel' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren, klik på ikonet 'Indstillinger' og vælg 'Axial Force'. Sæt aksial kraft til '1 Newton'; dette er for at sikre, at keggeometrien berører Peltier-pladen for initialisering af nul mellemrum (se supplerende figur 5).
- Udfør kalibreringen af rheometergeometrien.
- Vælg fanen 'Geometri' i softwarevinduet. Klik på 'Kalibrer' under 'Inerti'. Optag geometri inerti kalibreringsværdien i μN.m,s2 og gentag dette 2-3 gange for at sikre kalibreringsværdier er inden for 10% af hinanden.
- Klik på 'Kalibrer' under 'Friktion' i softwarevinduet. Optag geometrifriktionskalibreringsværdien i μN.m/(rad/s), og gentag denne 2-3 gange for at sikre, at kalibreringsværdierne ligger inden for 10 % af hinanden (se supplerende figur 6).
- Udføre initialiseringen af nul mellemrum
BEMÆRK: Da geometrien ikke kan hæves nøjagtigt over Peltier-pladen for at udføre målinger uden en reference "nul"-position, udføres nulgab initialisering. Til måleformål har geometrien et indbygget geometrigab på 24 μm og et trimgab på 28 μm. Trimgabet er indstillet til effektivt at rense den overskydende væske, der kan spilde uden for geometriens overflade. Disse huller er afgørende for nøjagtig måling af data ved hjælp af prøven og rheometeret. Trin 2.4.1 er absolut påkrævet for at sikre, at geometrien er indstillet til nul mellemrum for at opnå geometri og trim huller på 24 μm og 28 μm, henholdsvis.- Klik på ikonet 'Nul mellemrum' under fanen'Gap'i 'Kontrolpanel' i softwarevinduet. Initialiseringen er fuldført, når den aksiale kraft, geometrien oplever, er større end eller lig med 1 N, da den berører Peltier-pladen. Sørg for, at rheometergabet nulstilles, så referencepositionen er nøjagtig (se supplerende figur 7 og supplerende figur 8).
- Tryk på 'pil op og pil 'på rheometerinstrumentet eller ' geometri hæve ogsænk' ikoner under fanen 'Gap' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren for at hæve geometrien til vilkårlig højde. Kontrolskærmen på rheometerinstrumentet og kontrolpanelet på rheometerinstrumentkontrolsoftwaren viser den (samme) mellemrumshøjde.
- Konfigurer forsøgsproceduren i rheometerinstrumentstyringssoftwaren. Udfør karakteriseringen af rheologiske egenskaber ved hjælp af en kegle-on-Peltier pladegeometri ved 22 °C.
BEMÆRK: US Geological Survey hjemmeside blev brugt til at fastslå floden vandtemperatur River september 20, 2018, da sølv karper, der anvendes til GR slim eksperimenter blev fisket på Hart Creek placering36. Slimets temperatur kan påvirke de rheologiske egenskaber. Betydningen af at justere værdierne til flodtemperaturen er at omtrent matche den temperatur, hvorunder slim egenskaber kan realistisk vurderes.- Vælg fanen 'Eksperimenter' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren, og udfyld de relevante oplysninger som'Navn',Operator', 'Projekt' osv. (se supplerende figur 9)
- Vælg fanen 'Geometri', og sørg for, at oplysningerne stemmer overens med trin 2.2.5. - 2.2.7. (se supplerende figur 10).
- Vælg fanen 'Procedure', og brug den opsætning af piletasterne '1: Svingning amplitude'." (se supplerende figur 11).
- Initialisere indstillinger formiljøkontrolsom følgende: »Temperatur = 22 °C«; »Sugetid = 120 s« og markér afkrydsningsfeltet 'Vent på temperatur' (se supplerende figur 11).
- Initialisere indstillinger fortestparametresom følgende: 'Frekvens = 1 Hz'; sæt 'Logaritmisk feje'; »Moment = 10 til 10000 μN.m« »Point pr. årti = 5« (se supplerende figur 11).
- Konfigurer eksperimentet for at bestemme det lineære viskoelastiske område (LVR) for slim af kendt koncentration (100 mg/mL)
- Ved hjælp af en passende mikropipette og pipettespids tegner ca. 0,3 mL fiskeslimopløsning med koncentration 100 mg/mL (se trin 1.2, Materialetabel).
- Slimopløsningen indføres på Peltier-pladen ved hjælp af mikropipetten (se figur 2).
- Tryk på 'Trim Gap' på rheometeret for at sænke geometrien på Peltier-pladen. Alternativt kan du klikke på ikonet'Trim Gap'under fanen'Gap'i indstillingen'Kontrolpanel'i rheometerinstrumentstyringssoftwaren (se supplerende figur 12).
- Brug mikropipetten sammen med pipettespidsen til at fjerne overskydende slimopløsning og sikre, at væsken er under geometrien uden spild i nærheden af geometriens periferi.
BEMÆRK: Forkert belastning af væsken vil føre til fejl i målingerne. Under fyldt prøve vil sænke drejningsmoment fordeling og over fyldt prøve vil føre fejlagtige stress fordelinger på grund af spild langs kanterne. - Vælg faner af'Motor'og 'Hastighed' til 5 rad/s og 0 rad/s skiftevis, indtil der er minimal inerti og hastighed i prøven under geometrien. Kontrolskærmen på rheometerinstrumentet og kontrolpanelet i rheometerinstrumentkontrolsoftwaren viser hastigheden (se supplerende figur 13).
- Tryk på knappen'Geometri Gap'på rheometeret for at sænke geometrien til det forudindstillede passende mellemrum pr. bestemt geometri. Alternativt kan du klikke på ikonet'Geometry Gap'under fanen'Gap'i indstillingen'Kontrolpanel'i rheometerinstrumentkontrolsoftwaren (se supplerende figur 14).
- Kør forsøget for at bestemme det lineære viskoelasticområde (LVR) af slimet i den kendte koncentration (100 mg/mL).
- Klik på ikonet 'Start'på rheometerinstrumentstyringssoftwaren (se supplerende figur 15).
BEMÆRK: Rheometeret udfører automatiske målinger; Når der trykkes på knappen 'Start',tager det ca. 20 minutter at gennemføre testen. Indstillingen 'Point per årti' i trin 2.5.5 bestemmer, hvor meget tid rheometeret skal bruge til at gennemføre målinger. - Kør eksperimentet ved at klikke på 'Ja' på pop op-boksen, der vises, og foreslår, at geometrigabet sænkes til den korrekte afstand for at starte eksperimentet, hvis det ikke allerede er sænket.
- Overhold det realtidsplot, der genereres af rheometeret, der rapporterer opbevaringsmodulet (G'), og tab (G'').
BEMÆRK: G' og G" er henholdsvis opbevarings- og tabsmoduli. Opbevaringsmodulus repræsenterer tendensen til, at materialet genvinder sin oprindelige form efter stressinduceret deformation og svarer til elasticitet. Tabsmodulus repræsenterer, i hvilket omfang materialet modstår tendensen til at flyde og er repræsentativ for flydende viskositet (se figur 4). - Indstil afbildningens X-akse til 'Svingningsstammeprocent'. Det kan du gøre ved at højreklikke på den viste graf og vælgefanen 'Diagramvariabler' (se supplerende figur 16).
- Registrer svingninger stamme procent interval fra plottet, før materialet kommer ind i ikke-lineær viskoelastic område, når testen er færdig.
- Tryk på 'pil op og pil 'på rheometerinstrumentet eller ' geometri hæve ogsænk' ikoner under fanen 'Gap' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren for at hæve geometrien til enhver vilkårlig højde over Peltier-pladen.
- Gem den fil, der indeholder både den eksperimentelle procedure og resultater i den oprindelige filformat rheometer instrument kontrol software til at fastslå den lineære viskoelastiske region (LVR) af slim prøve.
BEMÆRK: Dette kan gøres ved at indstille afbildningens X-akse til at belaste amplitud (%) og/eller
svingningsstress, før dataene kommer ind i det ikke-lineære viskoelastiske område (NLVR) (se supplerende figur 16).
- Klik på ikonet 'Start'på rheometerinstrumentstyringssoftwaren (se supplerende figur 15).
- Kør de dynamiske sweeps og steady state forskydningsstrømningstestforsøg i Linear Viscoelastic Range (LVR) for slim af kendt koncentration 100, mg/mL for at generere resultater fra tre uafhængige slimprøver på 100 mg/mL. Udfør disse trin på de tilgængelige slimkoncentrationsprøver individuelt.
- Gentag trin 2.5.1 – 2.5.4.
- Initialisere indstillinger fortestparametresom følgende: 'Frekvens = 1 Hz'; sæt 'Logaritmisk feje'; »Stamme % = 100-10000 %; »Point pr. årti = 10«.
- Vælg fanen'Procedure',og brug piletasterne,der er konfigureret '2: Svingfrekvens'.
- Initialisere indstillinger formiljøkontrolsom følgende: »Temperatur = 22 °C«; 'Soak Time = 0,0 s'.
- Initialisere indstillinger fortestparametresom følgende: »Stamme % = 1 %«; sæt 'Logaritmisk feje'; »Frekvens = 20 til 1 Hz«. »Point pr. årti = 10«.
- Vælg fanen'Procedure',og brug piletasterne,der er konfigureret '3: Flow Sweep'-proceduren.
- Initialisere indstillinger formiljøkontrolsom følgende: »Temperatur = 22 °C«; 'Soak Time = 0,0 s'.
- Initialisere indstillinger fortestparametresom følgende: 'Forskydningshastighed = 1 til 10000 1/s'; »Point pr. årti = 10«; afkrydsningsfeltet 'Stabil tilstandsmåling'.
- Gentag trin 2.7.1 – 2.7.2, og vent, indtil eksperimentet er færdigt, ca. 45 minutter.
- Tryk på'pil op og pil ned'på rheometerinstrumentet eller ikonerne 'geometri raise and lower' under fanen 'Gap' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren for at hæve geometrien til vilkårlig højde.
- Brug engangsservietter og handsker til at fjerne og rense slimet på Peltier-pladen med isopropanolopløsning (se Materialetabel).
- Gem den fil, der indeholder både den eksperimentelle procedure og resultater i det oprindelige filformat af rheometer instrument kontrol software.
3. Gentag protokollen for andre koncentrationer af slimopløsninger på 200 mg/mL og 400 mg/mL.
- Udfør trin 2.5 – 2.8, herunder alle de deltrin, der er anført deri for de resterende to koncentrationer af slimopløsninger, 200 mg/mL og 400 mg/mL.
4. Grafisk repræsentation og dataanalyse
BEMÆRK: Den kode, der er angivet i den supplerende kodefil, udfører data i gennemsnit og genererer repeterbarhedsfejl, overlejrer dataene fra alle eksperimenter. Standardafvigelsesberegningsfunktionerne er ikke tilgængelige i rheometerinstrumentstyringssoftwaren. Koden er skrevet i et programmeringssprog til dataanalyse, efterbehandling og grafisk repræsentation (se Materialetabel for detaljer).
- Eksportdata genereret fra trin 2.8 vedrørende 100 mg/mL GR slimkoncentrationen og trin 3.1 vedrørende 200 mg/mL og 400 mg/mL GR slimkoncentrationer i regnearksformat ved at klikke på fanen 'Fil | Eksporter | Excel' i rheometerinstrumentstyringssoftwaren (se supplerende figur 17).
- Kør supplerende koder for at generere parceller af tilsyneladende viskositet (η) for varierende forskydningsbelastningshastigheder (
) og tabsmodulus (G"), lagermodulus (G') og fasevinkel (δ) for varierende svingningsstress ( ) og generere repræsentative resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette afsnit præsenterer vi resultaterne af forsøgene på GR slim ved hjælp af et roterende rheometer med en keglegeometri (40 mm diameter, 1° 0' 11'') og en Peltier plade. Forsøgene hjalp med at karakterisere den ikke-newtonske, forskydningsfortyndende adfærd GR slim og den tilsyneladende udbytte stress skildrer slim overgang fra en gel-lignende materiale til en væske-lignende materiale. De repræsentative resultater indebærer kvantitative beskrivelser af lavmomentgrænser og sekundære strømningseffekter af rotationstrometerinstrumenteringen. Instrumenteringsgrænserne og steady-state og dynamiske stammehastighedsmålinger hjalp med nøjagtigt at fastslå de viskoelastic adfærdsmæssige tendenser og tilsyneladende udbytte stress af GR slim. De tilsyneladende udbytte stress målinger forudsat et middel til at observere den minimale stress, der kræves for irreversibel plast deformation af GR slim og til at indlede strømmen. Flowinitieringstendensen for GR-slimet kan tilskrives fødevarepartiklernes vedhæftning og transportfunktioner. Vedhæftnings- og transportfunktionerne i GR slim var makroskopiske materialeattributter, der blev informeret af de rheologiske målinger i protokolforsøgene. Derfor blev makro-rheologi karakterisering af GR slim udført med denne protokol.
Slim, der anvendes i eksperimentet blev erhvervet fra flere gill rakers på op til tre sølv karper og havde ikke nogen synlige spor af blod1,2. Den erhvervede prøve blev fortyndet til yderligere to prøver som beskrevet i protokollen. Alle målinger blev foretaget ved den kontrollerede temperatur på 22 ± 0,002 °C36. Denne temperatur blev opretholdt på Rheometerets Peltier-plade. Keglegeometrien blev valgt for sin alsidighed i målingen af en bred vifte af viskositeter i biologiske materialer som GR slim. Det mindste drejningsmoment under stabile tilstandsforhold (10 x 10-9 Nm), minimumsmoment under oscillatoriske forhold (2 x 10-9 Nm) sammen med keglevinklen (1° 0' 11") og resuméet af rheometerspecifikationer, der kræves til vurdering af lavmoment- og sekundære flowregimer, er præsenteret i tabel 1. Vi rapporterer kopier af de sidste tre prøver til karakterisering og sammenligning af ikke-newtonsk og forskydning udtynding adfærd.
Brede slutninger efter vellykket udførelse af protokollen
Den vellykkede udførelse af protokollen og analysen resulterede i karakterisering af (makro) rheologiske egenskaber, der medfører ikke-newtonsk, forskydning udtynding adfærd slim udvundet fra gill rakers af sølv karpe, Hypophthalmichthys molitrix. Især blev udbyttefænomenet løst, og der blev konstateret en tilsyneladende udbyttestress af slimet (400 mg/mL-koncentration, tættest på den faktiske udvundne slimkonsistens) (σy = 0,2736 Pa). Protokollen var velegnet til målinger, der omfattede meget lille prøvevolumen (ca. 1,4 mL) slim. På grund af knaphed på litteratur vedrørende GR slim karakterisering, disse data vil støtte i analytisk modellering og udvidet rheometriske undersøgelser.
Resultater af dynamiske feje eksperimenter
Resultaterne af de dynamiske frekvens- og amplituds sweep eksperimenter præsenteres i dette afsnit. Det er resultaterne af de procedurer, der er oprettet i trin 2.8.2 - 2.8.5. De lave momentgrænser for oscillatorisk frekvens sweep og amplitud feje af GR slim med 400 mg /mL koncentration er markeret i figur 6A, B.
Frekvens sweep data (Figur 6A) blev erhvervet for et vinkelfrekvensområde, 6,28 ≤ ω ≤ 125,66 rad s-1 ved en konstant oscillatorisk stamme amplitude på 0,01. Den kantede frekvensværdi, 6,28 rad/s (1 Hz), blev valgt som en omtrentlig bevægelsesfrekvens af palatale folder i gill rakers interstices og markeret i figur 6A. Valget af stamme amplitud værdi blev afledt af den lineære viskoelastiske region fastslået i protokol trin 2.7. I figur 6Ablev der beregnet to potentielle nedre grænser for lavmomentregimet ved hjælp af stamme amplituder på henholdsvis 0,01 og 0,001 (γ0) og minimumsmomenter på henholdsvis 2x10-9 Nm og 10 x 10-9 Nm (Tmin. se tabel 1. ). De data, der præsenteres i figur 6A, starter ved den omtrentlige frekvens af palatal fold bevægelse (1 Hz eller 6,28 rad/s) og øges til højere vinkelfrekvenser, der ligger uden for rammerne for fysisk fortolkning i denne undersøgelse. Derfor blev disse data ikke analyseret yderligere, da de kræver en mere detaljeret parametrisk undersøgelse af stamme amplitud og palatal fold bevægelsesfrekvens.
Amplituden sweep data (Figur 6B) blev erhvervet med en fast vinkel frekvens (ω) på 6,28 rad /s (1 Hz). Det skal bemærkes, at amplituds sweep-dataene ikke blev påvirket af instrumenteringens lave drejningsmoment (figur 6B). Derfor blev disse data yderligere analyseret for alle tre slimkoncentrationer (100 mg/mL, 200 mg/mL og 400 mg/mL) for at bestemme omfanget af viskoelasticitet og givende adfærd.
Den grafiske fremstilling, der er vist i figur 4, blev anvendt som retningslinje for udvidet analyse af amplitud sweep eksperimenter. Resultaterne af tre slimopløsninger med koncentrationer 100 mg/mL, 200 mg/mL og 400 mg/mL er beskrevet nedenfor.
Resultatet for 100 mg/mL slimkoncentration (figur 7A) viser, at ved lav svingning (0,01 ≤ 
≤ 0,1 Pa) overlappede lager- og lossmoduli (G' og G") betydeligt. Ved svingning understreger mere end 0,1 Pa, opbevaring modulus falder, hvilket indikerer lavere elasticitet. Tab modulus, repræsentativ for viskositet, forbliver konstant i hele spektret af svingning stress (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). Dette fænomen kan tilskrives en newtonsk væskelignende adfærd og er i overensstemmelse med den konstante tilsyneladende viskositet af 100 mg/ mL slimkoncentration (Figur 7A og figur 8A,B). De tilsvarende fasevinkeldata (δ) viser, at ved moderate og høje svingningsbelastninger (0,05 ≤ ≤ 0,3 Pa)varierer værdierne mellem 55° og 70 ° (Figur 7D). Det kan derfor udledes, at 100 mg/mL slimopløsningen demonstrerer væskelignende adfærd med ubetydelig tilsyneladende udbyttestress.
Som observeret i figur 7Bfalder 200 mg/mL-koncentrationen ved lav svingningsbelastning (0,02 ≤ ≤ 0,04 Pa), lagermodulus (G') men er stadig større end tabsmodulus (G"). Inden for svingningerne stressområde (0,04 ≤ ≤ 0,07 Pa),var der en "crossover" region, hvori G 'og G" værdier forbliver omtrent lige. Denne region er markeret i figur 7B med stiplede linjer og tilsvarende svingninger stress værdier blev noteret (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Ud over denne region opnåede G" en højere værdi end G', hvilket tyder på en overgang til en væskelignende adfærd. G" (der repræsenterer viskositet) forblev dog konstant inden for hele spektret af svingningsstress (0,01 ≤ ≤ 0,5 Pa). De fasevinkeldata, der præsenteres i figur 7E, viser en højere grad af varians, især i svingningernes stressområde (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Fra figur 7B,E kan man udlede, at der var midlertidig adfærd væsken fra lineær viskoelastisk til ikke-lineær viskoelastic region. Endvidere repræsenterede 200 mg/mL slimkoncentrationen ikke-newtonske egenskaber og tilbøjelighed til at give efter i svingningsstressområdet (0,04193 ≤ ≤ 0,06467 Pa). Den ikke-newtonske, forskydningsfortyndende væskelignende adfærd var enig i de tilsyneladende viskositetsdata, der blev præsenteret i figur 8A og tilsvarende stressvariationer i figur 8B.
Dataene for 400 mg/mL-slimhindekoncentrationen præsenteres i figur 7C,F. G' og G"-tendenserne i figur 7C viser tydeligt et udbyttefænomen med et krydspunkt mellem G" og G«. Den tilsyneladende udbytte stress (σy)værdi blev registreret som 0,2736 Pa angiver en klar ændring i tilstanden af slim fra gel-lignende til en ikke-newtonsk væske-lignende tilstand. De fasevinkeldata, der præsenteres i figur 7F, viser en kraftig stigning ved den tilsyneladende udbyttebelastning (σy = 0,2736 Pa) fra ca. 20° til 65°. En sådan kraftig stigning i fasevinklen kan forekomme, når materialet undergår udbytte og begynder at flyde som en væske. Den ikke-newtonske væskelignende adfærd kan understøttes yderligere med resultaterne af steady state forskydningstest rapporteret i figur 8A,8B. Den tilsyneladende udbytte stress som rapporteret i steady state forskydning tests var 0,2272 Pa (Figur 8B).
Resultater af stabil tilstand forskydning sats eksperimenter
Resultaterne af de steady state shear rate-forsøg præsenteres for tre slimopløsninger med koncentrationer 100 mg/mL, 200 mg/mL og 400 mg/mL i dette afsnit ved hjælp af grafiske repræsentationer som retningslinje (Figur 3A,B). Disse resultater svarer til den procedure, der er initialiseret i protokoltrin 2.8.6-2.8.8.
I figur 8A for 100 mg/mL slimkoncentrationen vises de tilsyneladende viskositetsdata med høj varians ved lave forskydningshastigheder (1 ≤ 
≤ 4 s-1) sammen med hældningen -1,4. Placeringen af lavmoment regime er også markeret. Den høje varians på 100 mg/mL-data inden for dette interval (1 ≤ ≤ 4 s-1) antagesat være en effekt af det (skraverede) lavmomentregime. I figur 8Bangav den tilsvarende stressvariation med forskydningsdata et lille interval af forskydningshastigheder, hvor prøven opnåede et »stress-plateau« (eller det flade område). Denne region forsømmes for udbytte stress skøn som de tilsvarende viskositet data er underlagt lav-drejningsmoment effekter. Inden for det høje forskydningsinterval (2500 ≤ ≤ 10000 s-1)blev de tilsyneladende viskositetsdata påvirket af den sekundære flowordning. Den 100 mg / mL slim løsning, derfor opfører sig som en newtonsk væske, der er uafhængig af forskydningen uden for lav-drejningsmoment og sekundære flow regimer, og med en konstant tilsyneladende viskositet på 0,00088 Pa s (±1.656 x10-5 Pas).
Som det fremgår af figur 8A, forblev 200 mg/mL-koncentrationen af slim upåvirket af grænseværdier med lavt drejningsmoment og påviste en forskydningsfortyndende virkning i forskydningshastigheden, 1 ≤ ≤ 15 s-1. Nul-forskydning stamme sats viskositet (ηo) blev noteret som 0,032 Pas (±0,024 Pa s) og uendelig-forskydning stamme sats viskositet (η∞) med forskydningshastighed ( ), 1995 s-1, blev noteret som 0,00085 Pa s (±2.495 x 10-5Pas). Forskydningsfortyndende effekt af væsken blev demonstreret med en hældning på -1,8 inden for forskydningshastigheden, 1 ≤ ≤ 4 s-1. Den tilsvarende stressvariation i figur 8Bviser et »stress-plateau«, der repræsenterer et udbyttefænomen med den gennemsnitlige udbyttestress på 0,1446 Pa (±0,0037 Pa).
400 mg/mL koncentrationen af slim er den mindst fortyndede og dermed den nærmeste i materialekonsistens til det faktiske udvundne GR slim. Bemærk i figur 8A, at forskydningsfortyndende er veldefineret for 400 mg/mL slimkoncentration sammenlignet med 200 mg/mL slimkoncentrationen. Nul-forskydning (ηo) og uendelig-forskydning stamme sats viskositeter (η∞)ved forskydningshastighed ( ), 1995 s-1, var 0,137 Pas (±0,032 Pa s) og 0,00099 Pa s (± 9,323 x 10-5Pas),henholdsvis. Derudover blev hældningen af forskydningsfortyndende region etableret som -0,91 inden for forskydningshastigheden, 1 ≤ ≤ 32 s-1. Det tilsvarende »stress-plateau« fra stressvariationerne med forskydningshastigheden i figur 8Brepræsenterer en tilsyneladende udbyttestress på 0,2272 Pa (±0,0948 Pa).
| Komponent | Model/delnr./Version | Beskrivelse af parametre | Specifikationer |
| Rheometer | DHR-2 | Frekvensområde | 1 x 10−7 - 100 Hz |
| Maksimal vinkelhastighed | 300 rad/s | ||
| Mindste drejningsmoment under konstant forskydning | 10 nN.m | ||
| Mindste drejningsmoment under svingning | 2 nN.m | ||
| Maksimalt drejningsmoment | 200 μN *m | ||
| Opløsning af moment | 0,1 nN.m | ||
| Forskydningssatsområde | 5,73 x 10−6 til 1,72 x 104 [1/s] | ||
| Maksimal normal kraft | 50 N | ||
| Normal kraftopløsning | 0,5 mN | ||
| Geometri | 513404.905 | Dimensioner | 40 mm diameter |
| 1° 0' 11" Keglevinkel | |||
| Peltier plade | 533210.901 | Temperaturområde | -40 °C til 200 °C ± 0,1 °C |
Tabel 1: Specifikationer for rheometer
Figur 1: CAD-gengivelse af rheometerkomponenter. (A) 40 mm 1° keglegeometri,(B)Peltier Pladetilbehør. Keglegeometrien skal fastgøres til rheometerets aksel, og Peltier-pladen skal forbindes til bunden af rotationsrometeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Placering af væske på Peltier-pladen. Væskeprøven skal placeres i midten af Peltier-pladen for at sikre en jævn spredning af væske i hele pladen, når geometrien sænkes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Grafisk repræsentation af stabile rheologiske egenskaber. Variation af (A) Tilsyneladende viskositet (η) og(B)Forskydningsstress () med forskydningsbelastningshastighed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Grafisk repræsentation af dynamiske rheologiske egenskaber. Variation af opbevaring (G') og Tab (G") Modulii og fasevinkel (δ) med svingningsstress. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative billeder og skemategninger af gill rakers (GR). (A) Udsigt over gill raker array og palatal folder (B) Skematisk tegning af gill raker array og palatal folder (C) Excised gill raker (D) Sketisk tegning af gill raker med fremtrædende funktioner (E) Placering af slim udvinding i gill raker. Billeder 5A og 5C blev taget under en dissektion udført af professor L. Patricia Hernandez fra Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Lavmoment effekt. Lager- og tabsmodulusvariation for 400 mg/mL, slimkoncentration med (A) Frekvens sweeps ved belastnings amplitud = 0,01 og (B) Amplitud fejer med svingningsfrekvens = 1 Hz (eller 6,28 rad/s). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Amplitude fejer for tre koncentrationer af Silver Karpe slim. Prøverne blev udført ved f = 1 Hz eller ω = 6,28 rad/s (A) Lager- og tabsmodulusvariation for slimhindekoncentration, 100 mg/mL (B) Variation i lager- og tabsmodulus for slimhindekoncentration, 200 mg/mL (C) Ændring af opbevarings- og tabsmodulus for GR-slimhindekoncentration, 400 mg/mL (D) Fasevinkelvariation for GR-slimhindekoncentration 100 mg/mL (E) Fasevinkelvariation for slimkoncentration, 200 mg/mL (F) Fasevinkelvariation for slimkoncentration, 400 mg/mL. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Variation af tilsyneladende viskositet (η) og stress (σ) med forskydningshastighed ( ) for alle tre koncentrationer af fiskeslim. (A) Tilsyneladende viskositetsvariation med forskydningshastighed for slimhindekoncentrationer, 400 mg/mL, 200 mg/mL og 100 mg/mL sammen med regimer med lavmomentseffekter og sekundære strømningseffekter (B) Stressvariation med forskydningshastighed for GR-slimhindekoncentrationer 400 mg/mL, 200 mg/mL og 100 mg/mL, hvilket markerer »stressplateauerne« (eller det flade område) med stiplede linjer. Stiplede linjer repræsenterer de gennemsnitlige tilsyneladende udbytte stress værdier for de tre GR slim koncentrationer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Tre koncentrationer af sølvkarpe GR slim. Fra venstre mod højre: 400 mg/mL, 200 mg/mL, 100 mg/mL. Den oprindelige koncentration på 400 mg/mL blev valgt ud fra de kriterier, der, når den først var fortyndet, ville indeholde en rimelig mængde fiskeslim, samtidig med at der blev givet et tilstrækkeligt stort volumen til at køre flere test. De to efterfølgende koncentrationer blev fortyndet med 50% DI vand i volumen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Lancering af rheometer instrument kontrol software. Denne software må først startes, når maskinen er tændt. Ellers kan instrumentet ikke kalibreres korrekt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Kalibrering af instrumentet. Inertialkalibrering er den eneste kalibrering, der er nødvendig for instrumentet. Der udføres andre kalibreringer, når geometrien er installeret. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Smart swap-til/fra-til-knap. Denne indstilling er til aktivering eller deaktivering af smart swap. Smart swap er en rheometer instrument control software funktion, der automatisk registrerer en geometri, når den er installeret på rheometer aksel. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 5: Muligheder for målegab Der blev adgang til "Gap"-faneindstillingerne for at angive betingelserne for nul-gap-tilstand og travershastighed af målehovedet. En aksial kontaktkraft mellem geometrien og Peltier-pladen blev indstillet til 1 N for at sikre nul-gap reference, dvs. kontakten mellem keglegeometri og overfladen af Peltier-pladen. Målehovedet blev derefter lavet til præcist at krydse til målegabet på 24 μm mellem 40 mm 1 ° keglegeometri og Peltier-pladen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 6: Kalibrering af geometritilbehør. Ved installationen af 40 mm 1° keglegeometrien og dens påvisning af rheometerinstrumentstyringssoftwaren blev geometrien kalibreret på samme måde som instrumentkalibreringen for at sikre nøjagtige målinger under et eksperiment. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 7: Zero Gap-ikon. Initialisering af nul mellemrum udføres ved hjælp af dette ikon. Når nul-gap initialisering er færdig, kan rheometeret præcist henvise til placeringen af akslen, med geometri knyttet til det, da det er hævet eller sænket. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 8: CAD-gengivelse af keglegeometri og Peltier-pladen, efter at der er etableret nulgabreference. Geometrien er indstillet til at etablere nul-hul, når en aksial kontakt kraft på 1 N er genereret, da det gør kontakt med Peltier plade. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 9: Protokoltrappe 2.5.1. Figuren repræsenterer den måde, eksempel navngivning og fil- og dataoutput er angivet på. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 10: Protokoltrappe 2.5.2. Figuren repræsenterer, hvordan geometriindstillinger, f.eks. For nogle geometrier, nemlig den kegle, der anvendes i dette eksperiment, er disse indstillinger uforanderlige og defineret baseret på geometrien. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 11: Protokoltrappe 2.5.3. Figuren repræsenterer, hvordan testindstilling og konditionering angives i dette proceduretrin. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 12: Trim gap-ikonet. Trimgabet blev sat, så geometrien kunne sænkes nok til at trimme overskydende væske, der lækker ud af området mellem Peltier-pladen og keglegeometrien. Kløften afhænger af den geometri, der er i brug. For 40mm, 1 ° kegle geometri, der anvendes i protokollen, trim hul var 28 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 13: Motorhastighedsikon. Motorindstillingerne blev brugt til at justere akselens rotationshastighed og minimere geometri inerti. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 14: Geometriskløftikon. Geometrigabet sænker geometrien til en bestemt afstand over Peltier-pladen som angivet af keglepladegeometrien. For 40 mm, 1 ° kegle geometri, der anvendes i protokollen, geometri hul er 24 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 15: Startikon. Startknappen starter hele sekvensen af procedurer, der blev konfigureret tidligere. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 16: Ændring af grafvariablerne. Figuren repræsenterer de variabler, der kan defineres til datapræsentation, når procedurerne kører. Især oscillation stamme og svingning stress er af betydning under den dynamiske feje eksperimenter i protokollen. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 17: Eksport af rheometer instrument kontrol softwarefiler til et regneark software. Efter at filerne er eksporteret som regneark, blev dataanalysen gjort mulig ved hjælp af anden programmeringssoftware. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende kodefil: Efterbehandling af datafiler ved hjælp af dataanalyseprogram. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et af hovedformålene med udviklingen af denne protokol er at fastslå, at den er velegnet til den teologiske karakterisering af GR slim, når der foreligger meget små prøvemængder. Vi anerkender, at flere prøver fra en skole af sølv karper er nødvendige for fuldt ud at karakterisere de rheologiske egenskaber af GR slim og de data, der præsenteres heri er ikke en generalisering på tværs af hele sølv karpe befolkning. Vores teknik er berettiget på grund af dens effektivitet med rheologisk karakterisering af små prøvemængder og med udvidede undersøgelser, der involverer større ensembler af slimprøver.
De kritiske trin i protokollen er udarbejdelse af slimløsninger af forskellige koncentrationer, målinger og dataindsamling ved hjælp af et rotationsrimeometer og grafisk repræsentation og dataanalyse for fysisk indsigt.
Fysisk indsigt i GR slimdata hentes fra grafiske repræsentationer vist i figur 3 og figur 4, der kommenteres med attributter for den forventede materialeadfærd. Nul-forskydning stamme sats viskositet (ηo) værdier kan observeres ved lav-forskydning stammehastigheder, hvor mobiliteten af materialet molekyler dominerer (Figur 3A og figur 8A). Uendelig-forskydning stamme viskositet (η∞)værdier i ikke-newtonske væsker er størrelsesordener lavere end nul-forskydning stamme sats viskositet. Disse data kan bemærkes ved høje forskydningshastigheder, hvor der kun er ringe eller slet ingen afhængighed af intermolekylær interaktion (figur 3A og figur 8A). For ikke-newtonske væsker falder tilsyneladende viskositeter gradvist, efterhånden som forskydningsraterne stiger og opnår en konstant lav værdi (figur 3A og figur 8A). Givende adfærd i GR slim under steady state målinger kan repræsenteres med hældning som vist i figur 3A og præsenteret i ligning 1., hvor ηa repræsenterer den tilsyneladende viskositet, σy er den (konstante) udbytte stress og er forskydning stamme sats.
Figur 3A og figur 8B præsenteres på en log-log skala og derfor, Ligning 1 opnår følgende form:
hvor k – repræsenterer den tilsyneladende udbytte stress. På en bjælkeskala falder den tilsyneladende viskositet med en hældning på »-1« angiver materialeudbyttet som vist i figur 3A10. De 200 mg/mL og 400 mg/mL slim koncentrationer besad skråninger på -1,8 og -0,91, og demonstrere udbytte adfærd (Figur 8A). Under dynamiske svingningsmålinger er de viskoelasticiske egenskaber uafhængige af stamme amplituden i det lineære viskoelasticområde (LVR) (Figur 4). Den givende adfærd i GR slim under dynamisk svingning målinger kan observeres som viskoelastisk materiale (GR slim) kommer ind i den ikke-lineære viskoelastisk region (NLVR) som opbevaring modulus (G') falder (Figur 4). I NLVR-regimet vil viskoelasticmaterialet demonstrere solid-gel-lignende adfærd, hvis opbevaringsmodulus er større end tabsmodulus (G' > G"). Når tabsmodulus overstiger lagermodulus (G' < G"), opstår der en "crossover" mellem G' og G-data. Som vist i figur 7B, C, de 200 mg/mL og 400 mg/mL GR slim koncentrationer demonstreret væske-lignende adfærd præget af "crossover" mellem G 'og G" data. Den tilsyneladende udbyttestress under steady state-målinger repræsenteres som den gennemsnitlige værdi af stress, indtil et bøjningspunkt er nået (Figur 3B). Derefter begynder stressen at stige kraftigt med en stigning i forskydningsbelastningen som vist i figur 3B og figur 8B. GR slim-dataene (200 mg/mL og 400 mg/mL koncentrationer) viste forskydningsfortyndende væskeadfærd, indtil materialet begynder at give (Figur 8A,B). Den tilsyneladende udbyttestress blev tydeligt observeret i 200 mg/mL og 400 mg/mL slimkoncentrationer på grund af deres ikke-newtonske egenskaber (figur 8B). Den tilsyneladende udbyttestress under dynamiske svingningsmålinger er vist i figur 4 og figur 7B,C som "crossover"-regionen mellem G' og G"-data efterfulgt af G-værdier, der overstiger G'. De 400 mg/mL GR slim data viste forskydning-udtynding, ikke-newtonsk adfærd. Ved begyndelsen af materialeudbyttet blev observeret med en tilsyneladende udbyttebelastning på ca. 0,2736 Pa (figur 7C). Hydrogel-til-væske-lignende overgang med fasevinkel (δ = tan-1 (G"/G')) ændringer præsenteres i figur 4 og 7D-F. Extrema i fasevinklen er forbundet med et hookean fast stof ved 0° og tyktflydende væske ved 90° som vist i figur 4. Fasevinkelværdierne omkring 45° blev tilskrevet overgangen af gellignende opførsel af materialet til en væskelignende adfærd. Den 400 mg / ML slim koncentration viste tydeligt en ændring i materialet karakteristisk fra hydrogel til væskelignende adfærd gennem processen med at give med en tilsyneladende udbytte stress på ~ 0,2736 Pa (Figur 7F).
Forståelse af målebegrænsningerne og undgå data, der er uegnede til fysisk fortolkning, er en udfordring med komplekse og bløde biologiske væsker, især i undersøgelser, der involverer små stikprøvemængder11. De data, der genereres under lavmoment og sekundære floweffekter, er uegnede til fysisk fortolkning og afhænger af den geometri, der anvendes i rheometeret (såsom kegle og plade i denne undersøgelse). Disse regimer blev identificeret for at undgå enhver vildledning af eksperimentelle data, der lider af instrumentopløsning og måleartefakter på grund af momentumspredning. Grænser med lavt moment (Figur 6A og figur 8A) er geometri- og mindstemomentfunktioner, der genereres af instrumentet (tabel 1). Under konstante forskydningsmålingsforhold er kriteriet for afvisning af data, der er påvirket af den lave momentgrænse for en keglepladegeometri af radius (R) med et minimummoment (Tmin = 10 x 10-9 Nm, tabel 1),blevet drøftet af Ewoldt et al. og præsenteres nedenfor11:
hvor er forskydningsbelastningen. I modsætning til 100 mg/ML GR slim koncentrationer, 200 mg/ml og 400 mg/ML GR slim koncentrationer var upåvirket af lav-drejningsmoment effekter klart demonstrere ikke-newtonsk, forskydning udtynding adfærd med høj nul-forskydning stamme sats viskositeter ved lav forskydning stamme satser. Kriteriet for minimum målbar viskoelastisk moduli under dynamiske svingningsmålinger er blevet drøftet af Ewoldt et al. og præsenteret nedenfor (ligning 4)11. I Ligning 4, for en kegle-plade geometri af radius (R) det mindste drejningsmoment under oscillatoriske forskydning (Tmin = 2 x 10-9 Nm, tabel 1).
hvor Gmin er opbevaringsmodulus (G') eller loss modulus (G") og er forskydningsstammehastigheden. Instrumenteringsbegrænsningen, der er styret af virkninger med lavt drejningsmoment , er markeret i figur 6A og 6B. Det sekundære flowregime under steady state-målinger styres af en indadgående fremdriftsdiffusion af væsken ved hjælp af en eddy, der er bosiddende inden for rotationskoglen og pladegeometrien11. Det sekundære flowmønster øger drejningsmomentet forkert, hvilket gør væsken synes at være forskydning-fortykkelse (Figur 8A). Den sekundære strømningsgrænse, foreslået af Ewoldt et al. i figur 8A, blev trukket på følgendemåde:
hvor L = βR, β er keglevinklen, R er kegleradius, ρ = 1000 kg m-3, Recrit = 4 og er forskydningshastigheden. Dette regime hjalp med at estimere den uendelige-forskydning stamme viskositet (η∞)værdier i GR slim prøver.
En ændring af protokollen kan foretages ved hjælp af en flad plade geometri i stedet for kegle-plade geometri som vist i protokollen præsenteres heri. Fladpladetestene skal udføres med en parametrisk variation af målegabet i rotationsrometeret for at afsløre, at der tilsyneladende er tegn på udbyttestress på målegabet og geometrien. De foreslåede forbedringer af protokollen, der præsenteres i dette dokument, er beskrevet nedenfor. Der bør udføres en parametrisk variation af stamme amplituden i det lineære viskoelastiske regime (LVR) og svingningsfrekvensen. 'Tack and peel' rheology tests bør udføres for at udvikle en fuld forståelse af biphæsiviteten af GR slim. Rheologi egenskaber GR slim bør udføres på større prøve volumen ensembler sammen med undersøgelser for at måle eventuelle spor af blodlegemer til at tage højde for dens virkning på den samlede GR rheological egenskaber.
Begrænsningerne i protokollen er beskrevet nedenfor. Snørklede GR slim ekstraktion-procedurer og tilstedeværelsen af blodlegemer eller væv fragmenter i slim prøver kan påvirke rheology af slim. Det skal dog bemærkes, at slim, der blev brugt i protokollen, ikke havde nogen synlige spor af blod. GR slimprøven er et heterogent materiale og kan have forskellige rheologiske egenskaber på grund af variansen i placering af og betingelserne efter udvinding. Denne begrænsning blev behandlet ved tilstrækkeligt homogenisering af GR slim ved hjælp af en shaker til at nedbryde eventuelle store klumper af slim og væv tilstedeværelse. En anden vigtig begrænsning er de meget små GR slim prøvemængder (ca. 1,4 mL), høstet til analyser, der begrænser en generalisering af GR slim egenskaber.
Betydningen af denne protokol er, at det giver mulighed for en nøjagtig rheologisk karakterisering af ikke-newtonske, biologiske væsker som slim. Protokollen, der præsenteres heri, baner vejen for at undersøge andre lignende biologiske væsker forbundet med menneskes-, dyre- og plantesekretioner. Derudover kan syntetiske væsker eller polymerbaserede løsninger, der er analoger af biologiske væsker, teste ved hjælp af denne protokol for at forstå materialeegenskaber under varierende belastninger, svingningsfrekvenser og temperatur. Protokollen er velegnet til rheologisk karakterisering af biologiske væsker, når meget små prøvemængder stilles til rådighed.
Det udvidede resultat af protokollen er, at den tilsyneladende viskositet og tilsyneladende udbytte stress af GR slim vil lette oprettelsen af analytiske modeller til at fortolke resultater fra grundlæggende hydrodynamisk undersøgelse af filter fodring og forhånd teknologier, der kræver og involverer krydsning og membran filtrering.
Den makro-rheologiske undersøgelse viser, at slim i kontakt med fødevarepartikler er i første omgang, i en gel-lignende tilstand, der tjener som et klæbemiddel. Ved indledningen af flow og forskydning styrker slim opnår en tilsyneladende udbytte stress og gennemgår plastisk deformation. Protokollen udførelse ved hjælp af en roterende rheometer hjulpet i karakterisering af overgangen af slim fra gel-lignende til væske-lignende adfærd. Denne overgang blev eksperimentelt observeret, og den tilsyneladende udbytte stress blev registreret på 0,2736 Pa i roterende rheometer eksperimenter. Når de ydre belastninger på slim er mindre end den tilsyneladende udbytte stress, slim vil demonstrere gel-lignende adfærd for at lette vedhæftning af fødevarer partikler. Når de ydre belastninger overstiger den tilsyneladende udbytte stress, slim vil demonstrere forskydning-udtynding adfærd, der vil lette transport af agglomererede fødevarer partikler til fordøjelsesorganerne i sølv karper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke erklæret interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte og finansiering fra GW Center for Biomimetics og Bioinspired Engineering. Vi takker professor L. Patricia Hernandez fra Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University for at inspirere undersøgelsen og det igangværende samarbejde, give biologisk ekspertise om sølvkarpens fysiologi og levere slimprøverne. Vi takker de studerende, Mr. David Palumbo, Ms Carly Cohen, Mr. Isaac Finberg, Mr. Dominick Petrosino, Mr. Alexis Renderos, Ms Priscilla Varghese, Mr. Carter Tegen og Mr. Raghav Pajjur for hjælp i laboratoriet og Mr. Thomas Evans og Mr. James Thomas af TA Instruments, New Castle, DE for støtte med uddannelse og vedligeholdelse af rheometer. Billeder til figur 5A, C blev taget under en dissektion udført af professor L. Patricia Hernandez fra Institut for Biologiske Videnskaber ved George Washington University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Kim Wipes | VWR | 470224-038 | To clean Sample from plate |
| Gloves | VWR | 89428-750 | To prevent contamination of sample |
| Pipette | VWR | 89079-974 | To transport sample from vial to rheometer |
| Pipette Tips | Thermo Scientific | 72830-042 | To transport sample from vial to rheometer |
| Shaker | VWR | 89032-094 | To homogenously mix sample of mucus |
| Vials | VWR | 66008-710 | Contains measured sample volumes |
| Weigh Scale | Ohaus | Scout –SPX Balances | To weigh mass of mucus samples |
| Chemical Reagents | |||
| De-Ionized Water (H20) | - | - | Liquid |
| Sterile 70% Isopropanol (C3H8O) | VWR | 89108-162 | Liquid |
| GR Mucus | |||
| 100 mg/mL concentration, 2mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 400 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| 200 mg/mL concentration, 1mL | - | - | Viscoelastic Material |
| Software | |||
| MATLAB | Mathworks | R2017a | Data analysis, post-processing and graphical representation |
| Trios | TA Instruments | v4.5.042498 | Rheometer instrument control and analysis software |
References
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. The complex trophic anatomy of silver carp, Hypophthalmichthys molitrix, highlighting a novel type of epibranchial organ. Journal of Morphology. 279, 1615-1628 (2018).
- Cohen, K. E., Hernandez, L. P. Making a master filterer: Ontogeny of specialized filtering plates in silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Morphology. 279, 925-935 (2018).
- Cremer, M., Smitherman, R. Food habits and growth of silver and bighead carp in cages and ponds. Aquaculture. 20 (1), 57-64 (1980).
- Battonyai, I., et al. Relationship between gill raker morphology and feeding habits of hybrid bigheaded carps (Hypophthalmichthys spp.). Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems. 416, 36 (2015).
- Zhou, Q., Xie, P., Xu, J., Ke, Z., Guo, L. Growth and food availability of silver and bighead carps: Evidence from stable isotope and gut content analysis. Aquaculture Research. 40 (14), 1616-1625 (2009).
- Freedman, J. A., Butler, S. E., Wahl, D. H. Impacts of invasive Asian carps on native food webs (Final Report). , University of Illinois, Kaskaskia Biological Station. Urbana-Champaign, IL. (2012).
- Nico, L., Fuller, P., Li, J. Silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)-FactSheet. , (2017).
- Walleser, L., Howard, D., Sandheinrich, M., Gaikowski, M., Amberg, J. Confocal microscopy as a useful approach to describe gill rakers of Asian species of carp and native filter-feeding fishes of the upper Mississippi River system. Journal of Fish Biology. 85 (5), 1777-1784 (2014).
- Nelson, A. Z., Ewoldt, R. H. Design of yield-stress fluids: a rheology-to-structure inverse problem. Soft Matter. 13, 7578-7594 (2017).
- Chen, T. Rheological Techniques for Yield Stress Analysis. TA Instruments Applications Note, RH025. , (2020).
- Ewoldt, R. H., Johnston, M. T., Caretta, L. M. Experimental challenges of shear rheology: how to avoid bad data. Complex Fluids in Biological Systems. Spagnolie, S. , Springer. (2015).
- Thornton, D. J., Sheehan, J. K. From Mucins to Mucus: Toward a more coherent understanding of this essential barrier. Proceedings of the American Thoracic Society. 1, 54-61 (2004).
- Shepard, K. L.
- Fernández-Alacid, L., et al. Skin mucus metabolites in response to physiological challenges: A valuable non-invasive method to study teleost marine species. Science of the Total Environment. 644, 1323-1335 (2018).
- Wagner, C. E., Wheeler, K. M., Ribbeck, K. Mucins and Their Role in Shaping the Functions of Mucus Barriers. Annual Reviews in Cell and Developmental Biology. 34, 189-215 (2018).
- Bird, R. B., Armstrong, R. C., Hassager, O. Dynamics of Polymeric Liquids, Volume 1: Fluid Mechanics. , Wiley. New York. 1255-1284 (1987).
- Mantle, M., Allen, A. Isolation and characterisation of the native glycoprotein from pig small intestinal mucus. Biochemical Journal. 195, 267-275 (1981).
- Allen, A., Hutton, D. A., Pearson, J. P., Sellers, L. A. Mucus glycoprotein structure, gel formation and gastrointestinal mucus function. Mucus and Mucosa (Ciba Foundation Symposium). Nugent, J., O'Conner, M. , Pitman. London. 137-156 (1984).
- Asakawa, M. Histochemical studies of the mucus on the epidermis of eel, Anguillajaponica. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries. 36, 83-87 (1970).
- Fletcher, T. C., Jones, R., Reid, L. Identification of glycoproteins in goblet cells of epidermis and gill of plaice (Pleuroneces platessa L.), flounder (Platichthys flesus (L.)) and rainbow trout (Salmo gairdneri Richardson). Histochemical Journal. 8, 597-608 (1976).
- Silberberg, A. Mucus glycoprotein, its biophysical and gel forming properties. Symposia of the Society for Experimental Biology. 43, 43-64 (1989).
- Hills, B. The Biology of Surfactants. , Cambridge Univ. Press. Cambridge. 408 (1988).
- Aubert, H., Brook, A. J., Shephard, K. L. Measurement of the adhesion of a desmid to a substrate. British Phycology Journal. 24, 293-295 (1989).
- Sanderson, S. L., Cech, J. J., Patterson, M. R. Fluid dynamics in suspension feeding black fish. Science. 251, 1346-1348 (1991).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J.
- Chaudhary, G., Ewoldt, R. H., Thiffeault, J. L.
- Downing, S., Salo, W., Spitzer, R., Koch, E. The hagfish slime gland: a model system for studying the biology of mucus. Science. 214, 1143-1145 (1981).
- Hwang, S. H., Litt, M., Forsman, W. C.
- Litt, M.
- Quarishi, M. S., Jones, N. S., Mason, J. The rheology of nasal mucus: a review. Clinical Otolaryngology. 23, 403-413 (1998).
- Nordgård, C. T., Draget, K. I., Seternes, T.
- Fernández-Alacid, L., et al. Comparison between properties of dorsal and ventral skin mucus in Senegalese sole: Response to an acute stress. Aquaculture. 513, 734410 (2019).
- Yüce, C., Willenbacher, N. Challenges in Rheological Characterization of Highly Concentrated Suspensions - Case Study for Screen-printing Silver Pastes. Journal of Visualized Experiments. (122), e55377 (2017).
- Sultan, S., Mathew, A. P. 3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds. J. Vis. Exp. (146), (2019).
- Barnes, H. A., Hutton, J. F., Walters, K. An Introduction to Rheology. , Elsevier. Amsterdam. (1989).
- National Water Information System. USGS Current Conditions for USGS 06910450 Missouri River at Jefferson City, MO. U.S. Geological Survey. , Available from: https://nwis.waterdata.usgs.gov/usa/nwis/uv/?cb_00010=on&cb_00060=on&cb_00065=on&format=gif_default&site_no=0691045&p09-19&end_date=2018-09-21 (2020).
