Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur

Published: June 23, 2020 doi: 10.3791/61392
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Lombardi Comprehensive Cancer Center, Department of Oncology, Georgetown University

Summary

Den presenterte tilnærmingen evaluerer samtidig kreftcelleinvasjon i 3D-sfæroidanalyser og T-cellecytoktoksisitet. Sfæroider genereres i et stillasfritt agarose multimikrobrønnstøpt. Co-kultur og innebygging i type I kollagen matrise utføres i samme enhet som gjør det mulig å overvåke kreft celle invasjon og T-celle mediert cytotoksisitet.

Abstract

Det er gjort betydelige fremskritt ved behandling av kreft med immunterapi, selv om et stort antall kreftformer fortsatt er resistente mot behandling. Et begrenset antall analyser gir mulighet for direkte overvåking og mekanistisk innsikt i samspillet mellom tumor- og immunceller, blant annet T-celler spiller en betydelig rolle i å utføre det cytotoksiske svaret til det adaptive immunsystemet til kreftceller. De fleste analysene er basert på todimensjonal (2D) co-kultur av celler på grunn av den relative brukervennlighet, men med begrenset representasjon av invasiv vekst fenotype, et av kjennetegnene på kreftceller. Nåværende tredimensjonale (3D) co-kultursystemer krever enten spesialutstyr eller separat overvåking for invasjon av co-kultiverte kreftceller og interagerende T-celler.

Her beskriver vi en tilnærming til samtidig å overvåke den invasive atferden i 3D av kreftcellesfæroider og T-celle cytotoksisitet i co-kultur. Sfæroiddannelse er drevet av forbedrede cellecelleinteraksjoner i stillasfrie agarose mikrobrønnkast med U-formede bunner. Både T-celle co-kultur og kreft celle invasjon i type I kollagen matrise utføres i mikrobrønner av agarose kaster uten behov for å overføre cellene, og dermed opprettholde en intakt 3D co-kultur system gjennom analysen. Kollagenmatrisen kan skilles fra agarose-støpt, noe som åpner for immunofluorescence (IF) farging og for konfokal avbildning av celler. Celler kan også isoleres for videre vekst eller utsettes for analyser som for genuttrykk eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Til slutt kan 3D-cokulturen analyseres av immunohistochemistry (IHC) etter innebygging og snitting. Mulige endringer av analysen inkluderer endrede sammensetninger av den ekstracellulære matrisen (ECM) samt inkludering av forskjellige stromale eller immunceller med kreftcellene.

Introduction

Til tross for betydelige forbedringer i kreftimmunterapi det siste tiåret, er vår mekanistiske forståelse av følsomhet og motstand mot behandlinger fortsatt ganske dårlig1. Det er veletablert at svulster viser betydelig heterogenitet, og at de dynamiske interaksjonene av tumorcellene med mikromiljøet, så vel som med immuncellene, påvirker tumorcelledød, invasiv oppførsel og respons på behandlinger som inkluderer immunterapi1,2,3. Som en arm av det adaptive immunsystemet utfører T-celler cellespesifikk cytotoksisitet. Analysen av T-cellegjenkjenning og respons på kreftceller gir mekanistisk innsikt i resistens og følsomhet for immunmodulerende behandlinger.

In vitro modellering og overvåking interaksjoner mellom kreft og T-celler i et passende miljø har vært utfordrende og så langt, resulterte i begrenset mekanistisk innsikt. De fleste cellebaserte analyser er avhengige av et todimensjonalt (2D)-miljø, som mangler viktige funksjoner som er avgjørende for å rekafulere den tredimensjonale (3D) in vivo fysiologi4,5,6 ,nemligromlige cellecelleinteraksjoner, kontakt med den ekstracellulære matrisen (ECM)7, dynamisk metabolsk etterspørsel, økt hypoksi på grunn avmassevekst 8, og effekter av tumormikromiljøet (TME)9. På den annen side er det fortsatt en rekke mangler med den nåværende brukte tredimensjonale (3D) co-kultur og invasjon analysesystemer: (1) den tidkrevende naturen av sfæroid generasjon oghøste 5,10, (2) mangel på kontroll over sfæroid størrelse, form og celletetthet 11,12, (3) lav gjennomstrømning type analyser, (4) kravet til spesialutstyr13,,14, (5) behovet for å overføre co-kultur til forskjellige miljøer for ulike analyser15,16,17. Spesielt fører overføring av en co-kultur analyse ofte til forstyrrelse av sfæroider og tap av samkulturintegriteten. Dette gjelder spesielt for "løse" sfæroider med redusert cellecelleadhesjon. For eksempel krever de fleste 3D-invasjonsanalyser at sfæroider høstes etter deres første formasjon og deretter brukes på igjen i ECM14,15,16. Dette resuspensjonstrinnet resulterer i tap av kontroll over avstanden mellom sfæroider. Siden avstanden mellom tumorsfæroider påvirker deres invasive oppførsel, introduserer dette tap av kontroll høy interanalysevarians og reduserer reproduserbarheten. Videre er anvendelsen av cellefraksjonsanalyser ved påfølgende sentrifugeringstrinn for vurdering av perifere og tumorsfæroide infiltrerende immunceller begrenset til tumorcellepopulasjoner som genererer mer stabile sfæroider17.

Konsept og tilnærming

Vår tilnærming tar for seg de ovennevnte manglene ved hjelp av en "Alt-i-ett"- 3D sfæroid co-kultur modell, som ikke krever overføring av sfæroider for påfølgende analyser. Vi tilpasset en spheroid formasjonsenhet (se Materialstabell ) for å generere en analyse for samtidig overvåking av invasiv oppførsel av kreftceller og cytotoksisitet av co-kultiverte T-celler. Denne metoden er brukervennlig, billig og gir rask og enkel håndtering i en relativt høy gjennomstrømming 3D-innstilling. Avhengig av hvilken type enhet som brukes, kan opptil 81 store sfæroider genereres i et enkelt pipetteringstrinn med kontroll over den individuelle sfæroidstørrelsen ved å endre antall celler som seedes. Sfæroiddannelse er tvunget av forbedrede cellecelleinteraksjoner i stillasfrie agarose multi-well casts med U-formede bunner. Vi tilpasset dette 3D-systemet for dynamiske cellebaserte funksjonelle studier samt endepunktmolekylære og biokjemiske analyser som inkluderer fluorescensaktivert cellesortering (FACS), immunofluorescens (IF) eller immunohistochemistry (IHC) farging samt genuttrykksanalyse av intakt 3D-co-kultur.

For funksjonellestudier, innebygging spheroider i type I kollagen i agarose kaster resulterer i invasjon av kreftceller fra like langt sfæroider og tillater overvåking av viktige celle linjespesifikke funksjoner, for eksempel enkeltcelle vs. kollektiv celle migrasjon18,,19. Videre er kollagenmatrisen lett atskilt fra agarose-støpt, noe som resulterer i en 1 \\ u20122 mm tykk patch som inneholder flere sfæroider, som kan videre behandles for IF-farging og avbildning ved konfokal mikroskopi. Dette kan avsløre distinkt celleinvasjon og cellematriseinteraksjoner i en screening med høy gjennomstrømming. Celler i kollagenmatrisen kan også isoleres etter kollagenfordøy og encelledissosiasjon for etterfølgende celledyrking eller analyse.

For IHC-analyse av sfæroider, etter fiksering og snitting av agarose cast, er proteiner eller andre molekyler av interesse påviselige samtidig som de geografiske posisjonene til sfæroidene opprettholdes. I tilnærmingen som er beskrevet her, er sfæroider direkte innebygd i Hydroxyetyl agarose behandlingsgel i agarose støpt og gelen fungerer som et "lokk" for å beholde sfæroider på bunnen av mikrobrønnene. Etter parafininnbygging av agarose støpt20,utføres seriell horisontal snitting med bunnen av støpt som utgangspunkt.

Denne tilnærmingen står i kontrast til konvensjonell IHC-snitting av sfæroider som krever høsting av celler før innebygging i Hydroxyethyl agarose behandling gel21 og risikerer forstyrrelse av sfæroider og dermed mister romlig arrangement av celler. Også cellefraksjon ved sentrifugering for å vurdere om immunceller infiltrert eller forble perifere til tumorsfæroider17 unngås ved direkte innebygging.

Videre kan 3D-co-kultur utføres ved å blanding av tumor, stromal eller immunceller, og dermed studere tumorcellekryssstalk eller rekapulere forskjellige tumormikromiljøer for å analysere cellecelleinteraksjoner, inkludert samkulturer med endotelceller16.

Denne 3D-sfæroide samkulturinnstillingen kan brukes til å utføre co-kultur av forskjellige celletyper som finnes i tumormikromiljøet og for å vurdere effekten av endrede ECM-elementer. Foruten type I kollagen, kan andre ECM-komponenter (f.eks matrigel, matrigel / kollagenblandinger, fibronectin), brukes siden tumorcelleinvasjon påvirkes av overflod av forskjellige underlag22. Også mikrobrønnene i agarose støpt er egnet for sfæroid dannelse av primære cellelinjer og for celler med lav cellecelle vedheft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En liste og forklaring av noen ofte brukte ord i hele protokollen finner du i supplerende fil 1.

1. Generasjon av sfæroider

  1. Forbered og autoklav 2% oppsto i 1x PBS (f.eks. 1 g oppsto i 50 ml 1x PBS) og autoklav 35- og 81-mikrobrønngummiformer.
    FORSIKTIG: Unngå å bruke lavtsmeltende agarose for generering av agarosestøpelene for IHC-behandling.
  2. Forbered agarose kaster
    MERK: 35-mikrobrønnstøpebestøpninger brukes til invasjon, immunofluorescence (IF) og cellerolasjonsanalyser. 81-mikrobrønnstøpebestøpninger brukes til cytotoksisitet, immunohistokjemi (IHC), celleisolering og RNA-ekstraksjonsanalyser.
    1. Etter at agarose har blitt autoklavet, la smeltet agarose kjølig til ca 60 \\ u201270 ° C. I en cellekulturhette, bruk aseptisk teknikk og pipette 500 μL smeltet agarose i en 81-mikrobrønn gummiform per brønn eller 330 μL i en 35-mikrobrønn gummiform per brønn.
      FORSIKTIG: Unngå å lage bobler mens du blander eller pipettering. Fjern eventuelle bobler ved å pipettering forsiktig.
    2. Etter at agarose er størknet, bøy forsiktig gummiformen for å fjerne agarosestøpt fra den. Plasser herved hendene over riktig velplate og la agarose kastet falle rett inn i en brønn av brønnplaten.
      MERK: Bøy gummiformen i forskjellige posisjoner for å unngå overbøyning. Det kan være nyttig å bøye gummiformen og skyve forsiktig fra bunnen samtidig.
    3. For å likevekte agarose støpte, legge celle kultur medium, bestående av DMEM supplert med 10% fosterbovin serum (2,5 ml / godt for 12-brønn plate og 1 ml / godt for 24-brønn plate). Sett brønnplaten i en cellekultur inkubator (37 °C, 5 % CO2) og inkuber i 1 time.
  3. I mellomtiden forberede cellekultur for såing.
    MERK: Det totale celleseedetnummeret per agarose cast skal avgjøres av etterforskeren. For murine primære kreftcellelinjer i bukspyttkjertelen er 35 000 celler/35 mikrobrønnstøpt og 81 000 celler/81 mikrobrønnstøpt (i gjennomsnitt 1000 celler/sfæroider) seeded for alle følgende analyser. Den gjennomsnittlige diameteren på en sfæroid er ca 150 \\ u2012200 μm etter 48 h.
  4. Fjern cellekulturmediumet rundt agarosestøpt med en P1000 pipette først ved å vippe godt plate. Fjern deretter forsiktig mediet i såingskammeret.
  5. Seed forsiktig den forberedte tumorcellesuspensjonsdråpevis inn i cellesåekammeret. Sett godt platen tilbake i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2)i 15 min.
    MERK: I løpet av dette trinnet vil cellene bosette seg i mikrobrønnene til agarose-støpt.
  6. Tilsett ekstra medium på utsiden av agarose støpt (2,5 ml / brønn for 12-brønns plate og 1 ml / brønn for 24-brønnplate).
  7. Sett brønnplaten tilbake i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2) i 48 timer.
    MERK: Vanligvis tar det opptil noen timer for cellene å danne sfæroider i mikrobrønnene. Generelt dannes solide tumorcellesfæroider etter 24 timer og er stabile etter 48 timer. Dette kan imidlertid variere mellom ulike cellelinjer. Endre eventuelt cellekulturmedium ved å forsiktig vippe godt platen med agarose kastene og fjerne det omkringliggende cellekulturmediet med en P1000 pipette. Tilsett deretter forsiktig friskt medium ved å pipettere det langs brønnens vegg. Vanligvis er det ikke nødvendig å endre media i kastene på grunn av det lille volumet og risikoen for å fjerne sfæroidene.

2. Samkultur med T-celler

  1. Resuspend det nødvendige antallet T-celler i 75 μL (35-mikrobrønn støpt) eller i 190 μL (81-mikrobrønn cast) av riktig T-celle kultur medium (RPMI supplert med 10% fosterbovin serum og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin).
  2. Fjern cellekulturmediet rundt agarosestøpt med en P1000 pipette først ved å vippe godt plate. Fjern deretter forsiktig mediet i støpt ved å forsiktig målrette mot det ene hjørnet av såkammeret med en P200-pipette samtidig som godt beholder godt plate vippet med den andre hånden.
  3. (Kritisk trinn 1) Siden det er fare for å fjerne sfæroider, kontrollerer du for tap av sfæroider ved å sammenligne antall sfæroider i mikrobrønnene før og etter fjerning av mediet ved å se under mikroskopet ved 10x forstørrelse.
  4. Seed forsiktig T-celle suspensjon drop-wise inn i såing kammeret av agarose kastet ved å holde P200 pipetten ca 0,5 cm over støpt.
  5. (Kritisk trinn 2) Det er fare for å skylle ut sfæroider mens du legger til T-cellene. Derfor er det viktig å legge til T-cellene veldig sakte og ca 0, 5 cm over såingskammeret.
    MERK: En mulighet til å redusere antall spylte sfæroider er ved å peke pipetten til ett hjørne av såingskammeret mens du legger til T-cellene, og dermed bare risikerer sfæroider i dette hjørnet for å bli spylt ut.
  6. Plasser brønnplaten forsiktig tilbake i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2)i 15 min.
  7. Ta godt ut av inkubatoren og tilsett fersk cellekulturmedium (RPMI supplert med 10% fosterbovinserum og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin) rundt agarose kastet ved sakte pipettering det langs veggen av brønnen.
  8. Sett brønnplaten tilbake i cellekulturinkubatoren i 48 timer.

3. Innebygging av 3D-co-kultur i type I kollagenmatrise

  1. Forbered nøytralisert type I kollagen
    1. Fortynn lagerkollagen med serumfritt basemedium (RPMI) til en endelig arbeidskonsentrasjon på 3 mg/ml. For hver 100 μL fortynnet kollagen, tilsett 11 μL 10x PBS og 1,2 μL 1 M natriumhydroksid (NaOH).
    2. Oppbevar is og inkuber (nøytraliser) i 1 time.
  2. Fjern cellekulturmediet rundt agarosestøpt med en P1000 pipette først ved å vippe godt plate. Deretter fjerner du sakte og forsiktig mediet i støpt ved å forsiktig målrette det ene hjørnet av såingskammeret med en P200-pipette samtidig som godt beholder godt plate vippet med den andre hånden.
    MERK: Her er det viktig å fjerne cellekulturmediet rundt agarose-støpt.
  3. Pipette det nøytraliserte kollagen jeg blander dråpevist forsiktig inn i såingskammeret på agarosestøpen ved å holde P200-pipetten ca. 0,5 cm over støpt.
  4. Sett brønnplaten umiddelbart inn i cellekulturinkubatoren i 4 min (35-mikrobrønn støpt) eller 5 min (81-mikrobrønn støpt).
    FORSIKTIG: (Kritisk trinn 3) Det er viktig å holde seg strengt til den gitte inkubasjonstiden. Ellers kan det hende at den invasive virkemåten ikke kan reproduseres.
  5. Inverter brønnplaten og la den vendes i inkubatoren i 1 time.
    MERK: Kastene vil holde seg festet til bunnen av brønnplaten på grunn av overflatespenning. I tilfelle spesielle cellekulturmedium med høy serumkonsentrasjon (f.eks. RPMI supplert med 20% fosterbovinserum) brukes, kan det være nødvendig med et ekstra vasketrinn med 1x PBS etter fjerning av mediet i brønnen for å øke overflatespenningen.
  6. Ta godt ut av inkubatoren og snu den tilbake. Tilsett fersk celle kultur medium (RPMI supplert med 10% fosterbovin serum og 100 enheter / ml penicillin / streptomycin) rundt agarose kastet ved sakte pipettering det langs veggen av brønnen.
  7. Sett brønnplaten tilbake i cellekulturinkubatoren i 48 timer.

4. Cytotoksisitetsanalyse

  1. Forbered 3 ml 1x PBS med 2% føtal storfe serum per agarose støpt.
  2. Etter co-kultur for 4 d, fjerne cellekulturmediet rundt agarose støpt med en P1000 pipette ved å vippe godt plate med den andre hånden.
    MERK: Den totale perioden med medkultur skal avgjøres av etterforskeren.
  3. Fordel 1 ml 1x PBS + 2% FBS med en P1000 pipette inn i såingskammeret for å løsne spheroidene fra mikrobrønnene.
  4. Gjenta trinn 4,3 to ganger med volumet i brønnen og overfør den til et 15 ml rør.
  5. Sentrifuger røret ved 300 x g i 10 s ved romtemperatur (RT).
  6. Fjern forsiktig supernatanten med en P1000 pipette.
  7. Vask cellene ved å tilsette 1 ml 1x PBS med 2% FBS og sentrifuge ved 300 x g i 1 min ved RT.
  8. Gjenta vasketrinnet (trinn 4.7).
  9. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml celledissosiasjonsenzymer løsning (se Materialtabell).
  10. Bruk en P200 pipette og pipette opp og ned for å bryte celleklyngene.
  11. Inkuber cellene i 20 min i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
  12. Gjenta trinn 4.10.
    MERK: Ta ~ 10 μL ut og frø på en cellekulturskål for å observere (under mikroskopet ved 10x forstørrelse) hvor godt spheroidene har dissosiert i enkeltceller. Tilsett eventuelt 5 min videre inkubasjon.
  13. Tilsett 4 ml fullcellekulturmedium (RPMI supplert med 10 % fosterbovinserum og 100 enheter/ml penicillin/streptomycin) og bland ved å invertere røret 3\u20124 ganger.
  14. Sentrifuge ved 400 x g i 4 min ved RT.
  15. Fjern de overnaturante og gjenoppuss cellene i FACS-buffer for Annexin V-farging av apoptotiske celler.
    MERK: Herfra kan eventuelle FACS-flekker og celleanalyse utføres.

5. Hydroksyetyl agarose behandling gel innebygging for IHC snitting

MERK: Her er det viktig å unngå å bruke lavtsmeltende agarose for å generere agarose kastene.

  1. På slutten av co-kulturen fjerner du cellekulturmediet rundt agarosestøpt med en P1000 pipette først ved å vippe godt plate. Fjern deretter forsiktig mediet i støpt ved å forsiktig målrette mot det ene hjørnet av såkammeret med en P200-pipette samtidig som godt beholder godt plate vippet med den andre hånden.
  2. Pipette 10% formalin sakte først i såingskammeret ved å forsiktig målrette det ene hjørnet av såingskammeret med en P200 pipette. Deretter legger du til 10% formalin til utsiden av agarose cast til den er helt dekket. Fiks agarose støpt i 10% formalin for 1 d.
  3. Fjern formalin neste dag.
  4. Pipette 210 μL (81 mikrobrønnstøpt) eller 100 μL (35 mikrobrønn støpt) av forvarmet og flytende hydroksyetyl agarose behandlingsgel (se Table of Materials) drop-wise inn i såingskammeret av agarose støpt ved å holde P200 pipetten ca 0,5 cm over støpt.
  5. La hydroksyetyl agarose behandling gel stivne i 10 min ved RT.
  6. Overfør agarose støpt til 1x PBS.
    MERK: For lengre lagring, legg inn støpt i 70 % etanol for å forhindre kontaminering.
  7. Dehydrere gelseksjonene gjennom en etanolserie (1 time hver: 70% etanol, 80% etanol, 95% etanol, 100% etanol [3x endres hver]). Fjern deretter i en klaringsløsning 3x i 1 time hver (f.eks. alifatiske hydrokarboner [f.eks. Clearite] eller xylens), og infiltrere med smeltet parafin (3x for 1 time hver), enten manuelt eller i en vevsprosesser. Bygg inn støpt i parafinvoks for påfølgende snitting ved 5 μm per seksjon.
  8. Fjern voks ved å sette lysbilder i xylens, 3x i 3 min hver, og rehydrere vevseksjoner gjennom en gradert alkoholserie: 100% etanol i 2 min, 95% etanol i 1 min, 80% etanol i 30 s og 70% etanol i 30 s, og legg deretter i vann.
  9. Utfør varmeindusert epitophenting i en vegetabilsk dampbåt ved 100 °C i 20 min, etterfulgt av 20 min kjøling i en 10 mM natriumsitrat pH 6.0-løsning og blokkogene peroksidaser med H2O2.
  10. Blokker seksjonene med normalt målserum og utsett dem for anti-CD8-antistoff (fortynning 1/25) over natten.
  11. Påfør anti-kanin-HRP konjugerte sekundære antistoffer (se Materialtabell) og utvikle fargingen ved hjelp av 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) kromoagen. Motvirke kjerner med en 11% Harris hematoksylinløsning (se Materialtabell).

6. Overvåking og analyse av sfæroid invasjon i co-kultur

MERK: Tidspunktet for bildespærinvasjonen i kollagen I matrisen skal avgjøres av etterforskeren. Tilegne cellekulturbilder ved hjelp av et omvendt mikroskop med 10x forstørrelse. Det ideelle tidspunktet er avhengig av at cellelinjen testes, samt ECM-komponenten. Mer invasive cellelinjer vil begynne å spre seg inn i kollagen innen få timer etter å ha lagt til kollagen. Siden T-cellene i co-kulturen kan forhindre full visning på utgående fra sfæroider på svært tidlig tidspunkt, generelt bilder er tatt på 0 h (som referanse), 24 h og 48 h etter å ha lagt kollagen.

  1. Kvantate invasivitet ved å telle antall "pigger" som kommer ut fra sfæroid og / eller ved hjelp av bildeanalyseprogramvare, for eksempel Bilde J.
    1. Analyser invasjon som antall "pigger" fra sfæroid ved å telle antall "pigger" av en sfæroid manuelt.
      MERK: Det skal avgjøres av utprøver som fremspring fra spheroidene anses som "pigger". Et beslutningskriterium kan være lengden på "piggen" målt fra kanten av sfæroiden.
    2. Analyser invasjon som invasjonsområdet i forhold til størrelsen på sfæroid.
      1. Bruk Freehand Draw Tool (Bilde J) til å spore grensen til det totale området (invasjon + sfæroid område).
      2. Klikk Analyser på den øverste menyen, og klikk deretter Mål for å vise områdemålingen.
      3. Spor grensen til det totale sfæroidområdet.
      4. Klikk Analyser på den øverste menyen, og klikk deretter Mål for å vise områdemålingen.
      5. Kopier listen over målte resultater til et regneark og beregn den totale invasjonen/sfæroiden ved hjelp av formelen: total invasjon = totalt areal/sfæroidområde.

7. Immunofluorescence flekker

  1. Forbered følgende.
    1. Forbered 5,4 % formalin (5 ml) ved hjelp av 2,3 ml 1x PBS og 2,7 ml 10 % formalin.
    2. Forbered 0,5 % oktoksynol (50 ml) ved hjelp av 50 ml 1x PBS og 2,5 ml 10 % oktoksynol (oppbevares ved RT).
    3. Klargjør IF Buffer (200 ml) ved hjelp av 200 ml 1x PBS, 200 mg storfe serumalbumin (BSA), 4 ml 10 % oktoksynol, 1 ml 10 % polysorbat 20 (varm opp til RT før bruk, filtrer og oppbevar ved 4 °C).
    4. Klargjør blokkeringsløsning (5 ml) ved hjelp av 5 ml IF Buffer og 500 μL geiteserum (varm opp til RT før bruk).
    5. Hold 8-brønns kammersklier, glassdeksler og monteringsmedier klare.
  2. Dag 0
    1. Fest hele agarose støpt, inkludert sfæroider, over natten i 5,4% formalin ved RT i et fuktet kammer.
  3. Dag 1
    1. Fjern cellekulturmediet rundt agarosestøpt med en P1000 pipette ved å vippe godt platen.
    2. Overfør kollagenpatchen til et 8-brønns kammersklie ved å gripe et hjørne av kollagenmatrisen i såingskammeret til agarose støpt med slanke spisse tetninger og skrelle den av agarose kastet i en enkelt, trygg bevegelse.
      MERK: Kollagenplasteret skal lett skilles fra agarose-støpt. Ellers kan du bruke en P1000 pipette til å forsiktig legge til kulturmedium i området av såingskammeret eller invertere agarose støpt og forsiktig riste godt plate for å løsne kollagen matrisen.
    3. Tilsett 250 μL på 0,5 % oktoksynol (se materialtabell)per brønn. Inkuber i 1 time ved RT.
    4. Aspirer Octoxynol og tilsett 250 μL blokkeringsløsning per brønn. Blokk i 1 t ved RT.
    5. I mellomtiden fortynner du det primære antistoffet (fortynning for anti-keratin 8: 1/500; Postboksoidin 546: 1/200; Hoechst: 1/1000) i blokkeringsløsningen, beregne for 250 μL per brønn.
    6. Tilsett det primære antistoffet i blokkeringsløsning og plasser kammersklien i et fuktet kammer for inkubasjon over natten ved RT.
  4. Dag 2 (dag 2)
    1. Fjern det primære antistoffet i blokkeringsløsningen ved å aspirere.
    2. Vask 3 ganger ved å tilsette 300 μL IF Buffer og la den sitte i 5 min ved RT.
      MERK: Bare la det sitte, det er ikke nødvendig å sette den på en shaker.
    3. Fortynn det sekundære antistoffet i blokkeringsoppløsning (for anti-keratin 8: anti-rotte, fortynning 1/500).
    4. Tilsett 250 μL sekundært antistoff i blokkeringsløsning til hver brønn og inkuber i 1 time ved RT. Herfra beskytter du prøvene mot lys.
    5. Fjern det sekundære antistoffet i blokkeringsløsning ved å aspirere.
    6. Vask 3 ganger med 300 μL IF Buffer ved å legge til og la den sitte i 5 min ved RT.
    7. Skyll prøvene med 1x PBS og aspirer den.
    8. Fjern forsiktig veggene i kammeret lysbilde slik at bare glasset glir nederst forblir.
    9. Tilsett minst 200 μL monteringsmedier til en glassdeksleglass og slipp dekkslippen langsomt over prøven.
      MERK: Unngå å lage bobler, da dette vil påvirke bildekvaliteten. Bobler kan forhindres ved å forsiktig plassere dekselet slip på langsiden av lysbildet i en 45 ° vinkel eller sakte senke dekselet slip på lysbildet.
    10. Sett de monterte prøvene på et mørkt og tørt sted og la den sitte over natten. Bildebehandling kan utføres neste dag.
      MERK: Dekkslippen kan i utgangspunktet skifte litt når den er plassert over kolllagenplasteret. La glasset gli på et jevnt område i noen minutter. Dekkslippen flater ut prøven slik at det ikke blir noe mellomrom mellom glasssklie og dekkglass over tid.

8. Isolering av celler fra kollagenmatrisen

  1. Forbered følgende.
    1. Forbered 1 mg/ml kollagenase 4 i serumholdig cellekulturmedium (lagre alisiterte kollagenase 4 fortynninger ved -20 °C)
    2. Forbered 2,5 % BSA i 1x PBS og belegg alle rør og pipettespisser med den (filter BSA-løsning før bruk).
    3. Førvarm BSA-løsningen og cellekulturmediet før bruk.
  2. Forbered 2 ml kollagnase 4-oppløsning (1 mg/ml) for å fordøye maksimalt tre kollagenmatriser fra 35-mikrobrønns agarosestøpeler.
  3. Overfør opptil tre 75 μL kollagenmatriser fra 35-mikrobrønnasjesprose kaster inn i et 2,5% BSA pre-belagt 15 ml rør. Ta tak i et hjørne av kollagenmatrisen i såingskammeret på agarose støpt med slanke spisse tetninger og skrell den av agarose kastet i en enkelt, trygg bevegelse.
  4. Skråsnår spissen av en P1000-spiss med saks. Pre-coat den gjenværende spissen med 2,5% BSA og bryte ned kollagen matrisen så mye som mulig ved pipetting opp og ned. Inkuber røret i 15 min ved 37 °C.
  5. (Kritisk trinn 4) Ved hver 5 min, sjekk om kollagenmatrisen er oppløst. Pipette opp og ned igjen før du tar 10 μL av prøven ut og frø den på en celle kultur parabolen for å observere under mikroskopet ved 10x forstørrelse. Legg til ytterligere 5 min om nødvendig.
  6. Fyll opp røret med 10 ml prewarmed cellekultur medium (DMEM supplert med 10% fosterbovin serum). Bland forsiktig ved å snu røret 3\u20124 ganger.
  7. Sentrifuger røret ved 400 x g i 4 min ved RT.
  8. Fjern forsiktig det overnaturlige og la det være 2 ml volum.
  9. (Kritisk trinn 5) La 2 ml etter det første sentrifugeringstrinnet, da det fortsatt kan være uløst kollagen nederst på røret som bærer celler langs dem.
  10. Utfør to vasketrinn ved å legge til 10 ml serumholdig cellekulturmedium hver gang. Sentrifuge hver gang ved 400 x g i 4 min ved RT.
  11. Etter det siste vasketrinnet, fjern så mye medium som mulig og la bare cellepellet.
  12. Resuspend cellepellet i 1 ml celledissosiasjonsenzymer oppløsning (se Materialtabell).
  13. Bruk en P200 pipette og pipette opp og ned for å bryte celleklyngene.
  14. Inkuber cellene i 20 min i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2).
  15. Gjenta trinn 8.13.
    MERK: Ta ~ 10 μL ut og frø på en cellekulturskål for å observere under mikroskopet ved 10x forstørrelse for å se hvor godt sfæroidene har dissosiert i enkeltceller. Tilsett eventuelt 5 min videre inkubasjon.
  16. Tilsett 4 ml cellekulturmedium (DMEM supplert med 10% fosterbovinserum) og bland ved å invertere røret 3\u20124 ganger.
  17. Sentrifuge ved 400 x g i 4 min ved RT.
  18. Fjern det overnaturlige. Herfra og utover kan FACS farging eller cellekultur utføres.

9. RNA ekstraksjon fra kollagen matrisen

  1. Forbered guanidiniumthiocyanat med Table of Materialsfenol (se Materialseksjonstabell), 100 % kloroform, 70 % RNasefri etanol, RNA-ekstraksjonssett (se Materialtabell),RNase-frie 1,5 ml rør, RNase-frie 15 ml rør og RNase-frie ddH2O.
  2. Overfør opptil tolv 190 μL kollagenmatriser fra 81-mikrobrønns agarose støpt til et 15 ml rør. Ta tak i et hjørne av kollagenmatrisen i såingskammeret på agarose støpt med slanke spisse tetninger og skrell den av agarose kastet i en enkelt, trygg bevegelse.
    MERK: Matrisene kan også fryses ved -80 °C til de er klare for RNA-ekstraksjon.
  3. Tilsett 1 ml guanidiniumthiocyanat med fenol (se Materialtabell) på kollagenmatrisene i 15 ml-røret.
    MERK: Guanidinium tiocyanat med fenol må dekke kollagenmatrisene helt.
  4. Vortex rørene for 10 \\ u201220 s.
  5. Homogeniser matrisene med 20 G kanyler og 5 ml sprøyter til de er fullstendig oppløst.
  6. La matrisene sitte i 5 min ved RT.
  7. Tilsett 200 μL ren kloroform til matrisene og rist røret kraftig i 15 s.
  8. Overfør blandingen umiddelbart til 1,5 ml rør.
  9. La blandingen sitte i minst 5 min ved RT til fasene er skilt.
  10. Sentrifuge 1,5 ml rørene ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C.
  11. Fyll et nytt 1,5 ml rør med 500 μL på 70 % etanol.
    MERK: Avhengig av volumet i vandig fase etter sentrifugering (se trinn 9.12. Dette kan ikke være 500 μL. Mengden 70% etanol bør være lik volumet av vandig fase.
  12. Overfør forsiktig den øvre vandige fasen av sentrifugerte prøver til 70% etanolfylt rør og bland godt ved å pipetter opp og ned.
  13. (Kritisk trinn 6) Vær forsiktig så du ikke forstyrrer lagene på bunnen av guanidiniumthiocyanatet med fenolseparasjon mens du fjerner den øvre fasen, da dette vil forurense RNA.
  14. Legg til prøven i en RNA-ekstraksjonskolonne (inkludert i RNA-ekstraksjonssettet, se Materialtabell). Herfra følger du produsentens protokoll for RNA-rensing fra celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D-kokulturmodellen muliggjør ulike analyser vist i figur 1A, som kan kombineres eller endres etter behov. I vårt etablerte eksperimentelle oppsett er tumor- og T-celler co-kultivert i 2 dager etterfulgt av initiering av invasjonsanalysen for valg av invasive og / eller resistente tumorceller (figur 1B). På dag 4 utføres mengden invasjon og "overlevende" celler er isolert fra kollagenmatrisen eller behandles direkte for RNA23 eller DNA-ekstraksjon fra matrise (figur 1B). Innebygging av 3D-kulturen i type I kollagen i mikrobrønnene i agarose cast tillater overvåking og analyse av invasjon ved hjelp av Bilde J for først å avgrense det totale området ved hjelp av programvarens frihåndstrekkverktøy og deretter beregne forholdet over det avgrensede sfæroidområdet (figur 2A), og / eller ved å telle antall "pigger" forlater spheroid. Ved hjelp av to primære murine kreftcellelinjer (cellelinje 1 og cellelinje 2), ble forskjellige sfæroidformer og invasiv atferd observert og kvantifisert tilsvarende (figur 2B). Cellelinje 1 viser en mer kompakt sfæroid formasjon og "piggete" invasjon, sammenlignbar med encelleinvasjon, mens cellelinje 2 danner mer løse sfæroider og viser et kollektivt invasjonsmønster (figur 2C). Co-kultur ble utført med to forskjellige tumorklonale cellelinjer seeded samtidig (Figur 3A \ u2012E) for å følge deres interaksjoner under påfølgende analyser, og med tumorceller og T-celler på tumor sfæroid dannelse (Figur 3F \ u2012J). For detaljert vurdering av invasiv atferd ble det utført immunofluorescerende flekker (figur 4). Etter separasjon av kollagenmatrisen fra agarose-støpt, IF farging, og overføring til et glass lysbilde (Figur 4A \ u2012B),confocal imaging ble utført på en høy gjennomstrømning måte ( Figur4C \ u2012J). Størrelsen og konsistensen av agarose cast tillate innebygging av hele 3D kultursystemet i parafin for seriell snitting og immunohistochemistry (IHC) farging for kvantifisering av romlig relasjon mellom svulst og T-celler (Figur 5). T-celler som finnes i avsnittet kan identifiseres og ytterligere karakteriseres av celleoverflatemarkørfarging eksemplifisert her for CD8 (Figur 5D, E). T-celler som har infiltrert svulsten sfæroid kan telles i forhold til de som forble i periferien av spheroid. Figur 5D,E viser eksempler på distinkt infiltrasjon av T-celler i tumorsfæroider dyrket fra tumorcellelinje 1 (D) og cellelinje 2 (E). Tabell 1 viser typiske eksperimentelle oppsett for analysene, og utbyttet av representative og analysebare prøver på slutten av eksperimentet for hver protokoll.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt, analyser og tidslinje for eksperimenter. (A)En 81-mikrobrønn og 35-mikrobrønn gummiform er fylt med 2% agarose i 1x PBS for å generere en agarose støpt med flere mikrobrønner. Diameteren på en gummiform er 3, 5 cm. Størrelsen på 35-mikrobrønnen agarose støpt er 13 mm x 8 mm, og av 81-mikrobrønn støpt er 13 mm x 13 mm. Sfæroider dannes ved cellesåing i kamrene i agarose støpt i et enkelt pipetteringstrinn. Samkultur med T-celler utføres i samme støpt. Funksjonell overvåking og potensielle analyser vises. (B) Tidslinje for eksperimenter. Tumorceller er co-kultivert med autologE T-celler i 2 dager slik at for en maksimal interaksjon mellom begge celletyper. Invasjonsanalysen er initiert etter to dager. Endepunktanalyser utføres etter ytterligere to dager for å overvåke invasiv og overlevelse fenotype av tumorceller, samt spredning og overlevelse av T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvantifisering av invasjon. Invasjon kan kvantifiseres ved bildeanalyse, for eksempel ved hjelp av Image J-programvare og telle antall "pigger" per sfæroid. (A) Beregning av det totale invasjonsområdet som et forhold mellom totalt areal og sfæroidområdet. Vektstangen: 300 μm. (B) Eksempler på to forskjellige primære murine kreftcellelinjer (cellelinje 1 og 2) i sfæroid formasjon ved ulike forstørrelser og invasjon i type I kollagen. (C) Analyse av invasjon utføres ved å telle antall pigger per sfæroid (venstre diagram; feilfelt: 2,63 for cellelinje 1, 1,47 for cellelinje 2) og beregne invasjonsområdet som beskrevet (høyre diagram; feilfelt: 0,36 for cellelinje 1, 1,28 for cellelinje 2). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Samkultur med fargestoffmerket svulst og T-celler. (A\u2012E) Blanding av to forskjellig fargestoff-merket primær murine kreft klonnalcellelinjer (grønn og rød) og forstørret visning av en representativ mikrobrønn (B \ u2012E). (F\u2012J) Co-kultur av pre-merket svulst (grønn) og T-celler (rød). (G\u2012J) Forstørret syn på en representativ mikrobrønn viser en svulst-T-celle co-kultur på tumor sfæroid dannelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Immunofluorescence farging. Immunofluorescence (IF) farging ble utført etter å ha skilt kollagen matrisen fra agarose støpt. (A\u2012B) Etter IF farging overføres kollagenpatchene til et glasssklie og dekket med glassdeksler. (C\u2012F) Eksempel på et IF-farget kollagenplaster, inkludert tumorsfæroider med (C) Hoechst, (D) keratin 8, (E) falloidin og (F) overlegg. Paneler (G\u2012J) Vis den respektive forstørrede visningen av en enkelt sfæroid. Skala bar = 300 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Immunohistochemistry snitting. Agarose støpt med 3D-kulturen nedsenket i hydroksyetyl agarose behandling gel, ble innebygd i parafin, seksjonert og behandlet for immunohistochemistry (IHC) farging. (A)Parafin blokk som brukes til horisontal snitting som starter fra bunnen av agarose støpt for å få serielle deler av flere tumorcelle / T-celle co-kulturer i en enkelt støpt; skala bar = 5 mm. (B) Hematoksylin og eosin-farget delen av en agarose støpt som inneholder 3D co-kultur av svulst og T-celler. Vektstang: 1 mm. (C) Forstørret visning av en H&E-farget co-kultur innenfor agarose støpt. CD8 farging av T-celler co-kultivert med cellelinje 1 (D) og cellelinje 2 (E). Skaler barer i C\u2012E = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protokollen typisk oppsett celler seeded (per støpt) typisk utbytte
cytotoksisitet analyse 2x 81-mikrobrønn kaster 81,000 100 000 celler
IHC-analyse 1x 81-mikrobrønn støpt 81,000 40 sfæroider
Invasjon analyse 2x 35-mikrobrønn kaster 35,000 50 sfæroider
Hvis analyse 2x 35-mikrobrønn kaster 35,000 50 sfæroider
Celleisolasjon fra kollagen I 2x 35-mikrobrønn kaster 35,000 50 000 celler
RNA ekstraksjon fra kollagen I 12x 81-mikrobrønn kaster 243,000 400-600 ng/μl

Tabell 1: Typisk eksperimentelt oppsett og utbytte for protokollene. Tabellen viser det typiske eksperimentelle oppsettet for hver protokoll og det typiske utbyttet av analysebare prøver (antall celler, sfæroider eller RNA-konsentrasjon) på henholdsvis slutten av eksperimentet. IHC = immunohistochemistry; IF = immunofluorescence.

Tilleggsfil 1. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteres her beskriver 3D tumor sfæroid generasjon, som tillater co-kultur med T-celler, cellebaserte funksjonelle og molekylære analyser, samt en rekke overvåking og analyse muligheter ved hjelp av en enkelt enhet. Den største fordelen med vår tilnærming er at den ikke nødvendiggjør overføring av 3D-kulturen til en egen analyse og opprettholder integriteten til 3D-kulturen gjennom analysene.

Arbeidsflyten som presenteres her, kan endres etter behov. Inkubasjonstidene for sfæroiddannelse, T-cellekokultur eller cytotoksisitetsanalyse, må kanskje endres for ulike eksperimentelle forhold eller cellelinjer.

Det er noen få trinn gjennom analysene, som krever nøye overholdelse av protokollen. Disse er generelt: fjerne cellekulturmediet før du legger til en annen cellelinje for co-kultur, samt å bygge inn 3D-kulturen i ECM eller hydroksyetyl agarose behandling gel innenfor agarose kaster. Det er helt avgjørende å sakte og forsiktig fjerne mediet i såingskammeret ved å vippe godt plate og målrette det ene hjørnet av kammeret med en mikropipette. Så lenge agarosestøpene inneholder celler, anbefaler vi å alltid fjerne ethvert medium i brønnen med en mikropipette, i stedet for å bruke en pipettor. Legge til en annen celle linje og innebygging i ECM eller hydroxyethyl agarose behandling gel må utføres sakte og drop-wise for å hindre flushing ut cellene i mikrobrønner. Det mest kritiske trinnet i kollageninvasjonsanalysen er inkubasjonstiden før de inverterer kastene i brønnplaten med brønnene. Redusere tiden kan føre til kollagen å falle ut fra støpt, og overskrider tiden kan føre til at kulturen trykkes ned til bunnen av mikrobrønner, noe som resulterer i ujevnt fordelt sfæroid invasjon. Hvis du inverterer cast gjør det mulig for celler i mikrobrønnene å helt nedsenke i det flytende kollagen før det polymeriserer og stivner. Overflatespenningen mellom agarose støpt og plast bunnen av brønnplaten, genererer en "hengende-slipp"15,24 under 3D sfæroid invasjon.

Det er viktig å merke seg at inkubasjonstiden før invertering av støpte er etablert for innebygging i type I kollagen. Med andre ECM-komponenter må dette trinnet justeres tilsvarende. Vær oppmerksom på at fullstendig fjerning av gjenværende medier ikke bør forsøkes å unngå utilsiktet tap av celler tilstede i mikrobrønnene. Dette gjenværende mediet resulterer i en liten fortynning av den tilsatt ECM. Dette må tas i betraktning for analyse og tilpasning fra andre analysesystemer.

Co-kulturen beskrevet her gir mulighet for en maksimal tumor / T-celle interaksjon før invasjonen av tumorceller analyseres: Tumor og T-celler er co-dyrket i 2 dager før innebygging i type I kollagen og deretter identifisere overlevende og invasive tumorceller i løpet av de neste to dagene (Figur 1B). Merk, da co-kulturen ble initiert mens T-celler ble resuspended i kollagen I, T-celler klarte ikke å vise en innvirkning på tumorcelleinvasjon og cytotoksisitet. Denne effekten kan skyldes at T-cellene blir mer fordelt i kollagen og dermed mindre konsentrert rundt spheroidene. Dette tyder på at den direkte interaksjonen mellom tumor- og T-celler i løpet av de to dagene med co-kultur før invasjonsanalysen er avgjørende for vurdering av T-cellemedierte effekter på tumorcellene.

Likevel kommer noen av fordelene med denne 3D-modellen med ulemper. Denne innstillingen med høy gjennomstrømming gjør det enkelt og raskt å så celler inn i agarosestøpt i ett pipetteringstrinn, noe som resulterer i generering av en rekke ensartede sfæroider i en støpt. Men siden spheroidene er alle plassert i samme støpt, kan de også enkelt fjernes, for eksempel under fjerning av cellekulturmediet i såingskammeret og mens du legger til T-celler for co-kultur. Derfor er mengden utbytte for hver protokoll sterkt avhengig av den tekniske ferdighetene og erfaringen til undersøkeren, men også på typen analyse som utføres. Som tabell 1 antyder, må et mulig tap av sfæroider på ca. 50% på slutten av et eksperiment tas i betraktning. Videre, under såing trinn, celler kan ikke like distribuere over området av seeding kammeret, noe som resulterer i mer eller mindre representative sfæroider i agarose kastet. Fra vår erfaring øker denne effekten med størrelsen på agarose-støpt. Derfor må replikeringer vurderes mens du planlegger ut eksperimentet.

Den spatiotemporale interaksjonen av celler i 3D-systemet kan vurderes etter tidsforløp, som presenterer et annet overvåkingsalternativ i denne modellen. Videre er mikrobrønnenes lille diameter og enkeltpipetteringstrinnet til frøceller egnet for å utføre enkeltcellekloning. Til slutt kan pasientens prøver (f.eks. fra biopsier) analyseres i analysen på grunn av det lille antallet celler som kreves for mikrobrønnene og 3D-systemets høy gjennomstrømming. Inkluderingen av stimulerende eller blokkerende legemidler (f.eks. anti-PD-1 eller anti-PD-L1) for å undersøke tumorcellen / T-celleinteraksjonen er en logisk forlengelse av analysen.

Til slutt gir 3D-sfæroidkokulturmodellen som presenteres her, et fleksibelt rammeverk for overvåking av kreftcelleinvasjon og cytotoksisitet av co-kultiverte T-celler i en biologisk relevant setting. Den resulterende crosstalk kan visualiseres samtidig opprettholde integriteten til 3D-kulturen og dermed gi mekanistisk innsikt i tumorcelle – T-celle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Virginie Ory, PhD for nyttige diskusjoner og råd om tilnærmingen til 3D-co-kulturmodellen. Vi takker også Elizabeth Jones for utmerket teknisk assistanse med IHC-seksjoneringen. Denne studien ble støttet av tilskudd fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) til YL (LI 2547/4-1) og National Institutes of Health til AW (R01 CA23 1291), til ATR (R01 CA205632), til GWP (R01 CA218670) og Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Petri Dishes Microtissues Inc Z764019 & Z764051 referred to as "rubber molds" in the protocols; 81-microwell & 35-microwell molds
8-well Chamber Slides Lab-Tek 154534
Agarose Type I, low EEO Sigma-Aldrich A6013
anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody Agilent K4003 ready to use
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg Millipore 08-115
Collagenase Type 4, 1 g Worthington LS004188
DMEM, fetal bovine serum ThermoFisher 11965092, 16000044 referred to as "cell culture medium" in the protocols
Harris hematoxylin ThermoFisher SH30-500D
HistoGel ThermoFisher HG-4000-012 referred to as "Hydroxyethyl agarose processing gel" in the protocols
Hoechst Life Technologies H1399 1/1000 dilution
Phalloidin 546 Invitrogen 486624 1/200 dilution
rabbit anti-CD8 antibody Cell Signaling 98941 1/25 dilution
rat anti-keratin 8 DSHB TROMA-I AB_531826 1/500 dilution
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 referred to as "RNA extraction kit" in the protocols
RPMI ThermoFisher 11875093 for T-cell culture medium
Triton X-100 BioRad 1610407 referred to as "Octoxynol" in the protocols
Trizol ThermoFisher 15596026 referred to as "guanidinium thiocyanate with phenol" in the protocols
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379 referred to as "polysorbate 20" in the protocols
TypLE ThermoFisher 12604013 referred to as "cell dissociation enzymes solution" in the protocols

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point. Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).
  2. Sharma, P., Allison, J. P. Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).
  3. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).
  4. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. xu, x, Farach-Carson, M. C., Jia, x Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
  7. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).
  8. Klimkiewicz, K., et al. A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection. Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).
  9. Cavo, M., et al. Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model. Scientific Reports. 6, 35367 (2016).
  10. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).
  11. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).
  12. Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture. Methods. 1 (128), 139-149 (2017).
  13. Puls, T. J., et al. Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening. Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).
  14. Jenkins, R. W., et al. Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids. Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).
  15. Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting. Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).
  16. Shoval, H., et al. Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).
  17. Giannattasio, A., et al. Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids. BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).
  18. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  19. McLennan, R., et al. Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front. Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).
  20. Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
  21. Histonet Mail Archive, "re: [Histonet] Histogel". , Available from: http://lists.utsouthwestern.edu/pipermail/histonet/2014-January/069494.html (2014).
  22. Brenner, W., et al. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).
  23. Farhat, Y. RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit. The Protocol Place. 2012, http://protocol-place.com (2019).
  24. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).

Tags

Kreftforskning Utgave 160 3D-cellekultur kreftceller co-kultur kollagen cytotoksisitet invasjon immunofluorescence immunohistochemistry t-celler tumorsfæroid
Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S.,… More

Lin, Y. N., Nasir, A., Camacho, S., Berry, D. L., Schmidt, M. O., Pearson, G. W., Riegel, A. T., Wellstein, A. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (160), e61392, doi:10.3791/61392 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter