यहां हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से इन विट्रो एनएमजे उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह विधि एक ही कुएं में 1 महीने में परिपक्व आकृति विज्ञान और कार्य के साथ एनएमजे को प्रेरित कर सकती है। जिसके परिणामस्वरूप एनएमजेएस संभावित रूप से संबंधित रोगों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए या चिकित्सा के लिए दवा यौगिकों स्क्रीन करने के लिए ।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक विशेष सिनेप्स है जो यांत्रिक आंदोलन के लिए मोटर न्यूरॉन से कंकाल की मांसपेशी तक कार्रवाई क्षमता पहुंचाता है। एनएमजे संरचना की वास्तुकला न्यूरॉन, मांसपेशियों और आपसी संपर्क के कार्यों को प्रभावित करती है। पिछले अध्ययनों ने जटिल प्रेरण प्रक्रिया और लंबी संस्कृति अवधि के साथ एनपीजे इन विट्रो उत्पन्न करने के लिए मोटर न्यूरॉन्स और मायोट्यूब को सह-रूप करके कई रणनीतियों की सूचना दी है, लेकिन परिपक्व एनएमजे आकृति विज्ञान और कार्य को फिर से काटना संघर्ष किया है। हमारी इन विट्रो एनएमजे इंडक्शन सिस्टम का निर्माण मानव आईपीएससी को एक ही संस्कृति डिश में अंतर करके किया जाता है। इंडक्शन के लिए मायोजेनिक और न्यूरोजेनिक इंडक्शन माध्यम को स्विच करके, परिणामस्वरूप एनएमजे में एक महीने की संस्कृति में मोटर न्यूरॉन्स, कंकाल मांसपेशी और श्वार्न कोशिकाओं सहित पूर्व और बाद के सिनैप्टिक घटक शामिल थे। एनएमजे की कार्यात्मक परख से यह भी पता चला है कि मायोट्यूब संकुचन सीए+ + द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है, फिर क्यूरे, एक एसीटिलकोलिन रिसेप्टर (एसीएचआर) अवरोधक द्वारा बाधित किया जा सकता है, जिसमें उत्तेजक संकेत एनएमजे के माध्यम से प्रेषित किया जाता है। इस सरल और मजबूत दृष्टिकोण ने कार्यात्मक कनेक्टिविटी के साथ एनएमजे की जटिल संरचना को सफलतापूर्वक प्राप्त किया। इस इन विट्रो मानव एनएमजे, अपनी एकीकृत संरचनाओं और समारोह के साथ, रोग तंत्र और यौगिक स्क्रीनिंग का अध्ययन करने के लिए आशाजनक क्षमता है ।
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक विशेष सिनेप्स है जो स्वैच्छिक मांसपेशियों के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए मोटर न्यूरॉन्स से कंकाल मांसपेशियों तक संकेतों को प्रसारित करता है1,,2। यह सिनेप्स पूर्व और बाद के सिनैप्टिक भागों से बना है। प्री-सिनेप्टिक पार्ट में मोटर न्यूरॉन एक्सोसाइटोसिस द्वारा सिनेप्टिक वेसिकल्स से एसिटिलकोलिन (एसीएच) जारी करता है। ACh सिनैप्टिक वेसिकल्स से जारी किया जाता है ताकि सिनैप्टिक फांक को पार किया जा सके और मांसपेशियों के संकुचन3, 4,के लिए एक कार्रवाई क्षमता को ट्रिगर करने के लिए सिनैप्टिक भाग पर AChR को बांध दियाजासके। इस नाजुक संरचना में किसी भी खराबी से एनएमजे रोग हो सकते हैं, जिनमें स्पाइनल मस्कुलर शोष (एसएमए), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी)5,,6,,7आदि शामिल हैं। ये बीमारियां रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को बहुत नुकसान पहुंचाती हैं और दुर्भाग्य से रोग तंत्र को समझने की कमी के कारण कोई प्रभावी उपचार दृष्टिकोण नहीं है। इस अध्ययन में, हम सटीक रोग मॉडलिंग के लिए मानव आईपीएससी से इन विट्रो मानव एनएमजे उत्पन्न करने के लिए और चिकित्सकीय यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए उद्देश्य।
पिछले अध्ययनों ने सह-संस्कृति रणनीतियों द्वारा विट्रो एनएमजे में उत्पादन की संभावना का प्रदर्शन किया है। मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल मायोट्यूब क्रमशः उत्पन्न होते हैं। दो सेल प्रकार मानव या माउस प्राथमिक ऊतक संस्कृतियों से उत्पन्न हो सकते हैं या स्टेम,सेल8,9,10, 11से प्रेरित हो सकते हैं और फिर एनएमजेगठन के लिए सह-संस्कारी होते हैं।,, आगे के अनुप्रयोगों में सह- संस्कारी एनएमजे को माइक्रोफ्लुइडिक 3डी उपकरणों में विलय करना और12,13के क्वांटिटेबल कार्यात्मक परख के लिए ऑप्टोजेनेटिक इकाइयों का उपयोग करना शामिल है। हालांकि, इन रणनीतियों में एक लंबी संस्कृति अवधि होती है और एनएमजे के प्राथमिक घटकों को प्राप्त करने के लिए संघर्ष की आवश्यकता होती है, या तो मोटर न्यूरॉन या कंकाल मायोट्यूब एक साथ। फिर भी एनएमजे का एक और महत्वपूर्ण घटक, श्वान सेल, इन संस्कृति प्रणालियों में उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। उन्नत संस्कृति प्रणाली जिसमें मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन और श्वान सेल शामिल है, वांछनीय है क्योंकि यह एनएमजे अध्ययनों के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत मॉडल प्रदान कर सकता है।
मायोजेनिक विभेदन 1 (MYOD1) मायोजेनेसिस14के लिए एक प्रसिद्ध मायोजेनिक नियामक है। आईपीएससी को मायोट्यूब में चलाने के लिए MYOD1 को लागू करने वाली कुशल मायोजेनिक विभेद विधि पिछले अध्ययन15में बनाई गई थी । इसलिए, हमने आईपीएससी15में MYOD1 को अधिकएक्सप्रेस करके मायोट्यूब को प्रेरित किया और मायोजेनिक विभेदन की उच्च दक्षता दिखाई गई। दिलचस्प बात यह है कि 10 दिन के बाद अनायास ही न्यूरॉन कोशिकाएं मायोट्यूब के साथ दिखाई दीं। मायोजेनिक संस्कृति में न्यूरॉन कोशिकाओं की उपस्थिति ने हमें एक ही डिश में विट्रो एनएमजे में पैदा करने की रणनीति विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है। यहां हम एक ही संस्कृति पकवान में मायोजेनिक और मोटर न्यूरॉन प्रेरण के लिए मानव आईपीएससी में MYOD1 को ओवरएक्सप्रेस करके एनएमजे को उत्पन्न करने की रणनीति प्रदान करते हैं। मोटर न्यूरॉन्स अनायास कई न्यूरोट्रोफिक कारकों (जीडीएनएफ, बीडीएनएफ, एनटी3, आदि) के साथ प्रेरित होते हैं। 8,और, इस बीच, श्वान कोशिकाओं को भी प्रेरित किया जा सकता है16,,17। मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन्स और श्वान कोशिकाओं के बीच बातचीत के माध्यम से, परिपक्व एनएमजे18का गठन कर रहे हैं। यह विधि कार्यात्मक एनएमजे को कुशलतापूर्वक उत्पन्न कर सकती है, जिससे पैथोलॉजिकल तंत्र और चिकित्सीय यौगिक स्क्रीनिंग के संभावित अध्ययन को सक्षम किया जा सकता है।
पिछले अध्ययनों में अत्याधुनिक तरीकों के साथ विट्रो में एनएमजे गठन के तरीकों की सूचना दी गई है, जिनके लिए लंबे समय से कहा जाने वाला संस्कृति8,,10,12,13,,20की आवश्यकता होती है।,, ये उपलब्धियां इन विट्रो एनएमजे की प्रगति का नेतृत्व करते हैं । हालांकि, जटिल तरीकों ने एनएमजे अध्ययनों की पहुंच में रुकावट पैदा की । हमारा प्रोटोकॉल एनएमजेएस को एक ही कुएं में कुशलतापूर्वक और मजबूती से उत्पन्न करने के लिए सह-संस्कृति से बचता है। हमारे प्रेरण प्रणाली में एनएमजे में तीन सेल प्रकार देखे गए, जिनमें मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन्स और श्वान कोशिकाएं18शामिल हैं। इसके अलावा, परिपक्व आकृति विज्ञान और समारोह सत्यापित किया गया।
हमारे पिछले अध्ययन के आधार पर, प्रारंभिक सेल घनत्व एनएमजे गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, और विभिन्न सेल घनत्व संस्कृति18में एनएमजे की विभिन्न संख्याओं को प्रेरित करते हैं। एक कम सेल घनत्व (< 1 x 104/सेमी2)ने न्यूरॉन्स की कम संख्या को प्रेरित किया, जो एनएमजे गठन के लिए प्रतिकूल है । यद्यपि कोशिकाओं का अधिक घनत्व (> 1 x 105/सेमी2)तैयार करने में बहुत अधिक समय और संसाधन लगेंगे, हम अनुशंसा करते हैं कि कोशिका घनत्व हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1.5 x10 4/सेमी2 और 5 x 104/सेमी2 के बीच हो । इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न एनएमजे कई सेल प्रकारों के साथ एक विषम ऊतक है जो शारीरिक स्थितियों की नकल करने के करीब है। मायोट्यूब एक संस्कृति पकवान पर समान रूप से वितरित करने के लिए पाए जाते हैं, लेकिन मोटर न्यूरॉन्स बेतरतीब ढंग से दिखाई देते हैं, जिनमें से घटना के परिणामस्वरूप संस्कृति में एनएमजेएस का असमान वितरण होता है। यह एनएमजे सजातीय संस्कृति प्रणालियों की आवश्यकता वाले विश्लेषण के बजाय गुणात्मक अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। हमने इस प्रोटोकॉल द्वारा एनएमजे उत्पन्न करने के लिए अन्य सेल लाइनों, eq., H9 (ES सेल लाइन)18 और A11 (आईपीएस सेल लाइन, डेटा नहीं दिखाया गया) का भी उपयोग किया। एनएमएसजी को आकृति विज्ञान और कार्य में सफलतापूर्वक उत्पन्न किया जा सकता है। संस्कृति की स्थिति, फिर भी, विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
रासायनिक रूप से ट्रिगर मायोट्यूब संकुचन और क्यूरे-निर्भर अवरोध ने पुष्टि की कि हमारे इन विट्रो एनएमजे कार्यात्मक थे और संभावित रूप से व्यावहारिक परख के लिए लागू किया जा सकता है। संस्कृति के 3 \u20124 सप्ताह में सहज मांसपेशियों के संकुचन बेतरतीब ढंग से मनाए गए थे, लेकिन संस्कृति के समय को दो महीने18तक बढ़ाकर इससे बचा जा सकता है।
विभिन्न परिपक्वता चरणों के विट्रो एनएमजे में उत्पन्न करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को प्रकाशित किया गया है, लेकिन हमारी प्रणाली में उत्पन्न इन विट्रो एनएमजे ने महत्वपूर्ण परिपक्वता दिखाई, क्योंकि हम संस्कृति18के दौरान AChR के एप्सिलॉन सबयूनिट में गामा के संक्रमण का निरीक्षण कर सकते हैं। इन विट्रो एनएमजे21के साथ रोग मॉडलिंग के लिए परिपक्वता एक महत्वपूर्ण विचार है। अंत में, एकीकृत संरचनात्मक घटकों, परिपक्वता और कार्य के साथ एक इन विट्रो एनएमजे चिकित्सीय विकास के लिए संभावित उपयोग का है।
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ सकुराई को 201B7 MYOD प्रदान करने के लिए धन्यवाददेतेहैं । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन को कीको ओकामोटो-फुरुटा और हरुयासु कोहडा (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक अध्ययन का विभाजन, सेंटर फॉर एनाटॉमिकल स्टडीज, ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया था। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी HHMI/कोलंबिया विश्वविद्यालय द्वारा विकसित किया गया था, विकास अध्ययन Hybridoma बैंक से प्राप्त, राष्ट्रीय संस्थान बाल स्वास्थ्य और NIH के मानव विकास द्वारा बनाई गई है, और जीव विज्ञान विभाग, आयोवा विश्वविद्यालय में बनाए रखा । हम मोशन वेक्टर विश्लेषण के लिए शिओरी ओशिमा, काज़ुहिरो नाकागावा और एरिको मात्सुई को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेनही, ग्रांट नंबर 16H05352 और 20H03642 (एमकेएस) से फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था; आईपीएस सेल रिसर्च फंड (सीवाईएल और एमकेएस के लिए); चिकित्सा और औषधि अनुसंधान के लिए Mochida मेमोरियल फाउंडेशन (एमकेएस के लिए); टेकडा साइंस फाउंडेशन (एमकेएस के लिए); और रोग-विशिष्ट आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करने वाले असभ्य रोग अनुसंधान के लिए कार्यक्रम से अनुदान, जिसे जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (17 9 35400 से सीवाईएल और एमकेएस और 17 9 35423 से एमकेएस) द्वारा सहायता प्रदान की गई थी।
Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
Doxycycline | Takara | 631311 | |
ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
SEM | Hitachi | S-4700 | |
TEM | Hitachi | H7650 | |
Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |