Summary
यहां हम मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से इन विट्रो एनएमजे उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह विधि एक ही कुएं में 1 महीने में परिपक्व आकृति विज्ञान और कार्य के साथ एनएमजे को प्रेरित कर सकती है। जिसके परिणामस्वरूप एनएमजेएस संभावित रूप से संबंधित रोगों मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए या चिकित्सा के लिए दवा यौगिकों स्क्रीन करने के लिए ।
Abstract
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक विशेष सिनेप्स है जो यांत्रिक आंदोलन के लिए मोटर न्यूरॉन से कंकाल की मांसपेशी तक कार्रवाई क्षमता पहुंचाता है। एनएमजे संरचना की वास्तुकला न्यूरॉन, मांसपेशियों और आपसी संपर्क के कार्यों को प्रभावित करती है। पिछले अध्ययनों ने जटिल प्रेरण प्रक्रिया और लंबी संस्कृति अवधि के साथ एनपीजे इन विट्रो उत्पन्न करने के लिए मोटर न्यूरॉन्स और मायोट्यूब को सह-रूप करके कई रणनीतियों की सूचना दी है, लेकिन परिपक्व एनएमजे आकृति विज्ञान और कार्य को फिर से काटना संघर्ष किया है। हमारी इन विट्रो एनएमजे इंडक्शन सिस्टम का निर्माण मानव आईपीएससी को एक ही संस्कृति डिश में अंतर करके किया जाता है। इंडक्शन के लिए मायोजेनिक और न्यूरोजेनिक इंडक्शन माध्यम को स्विच करके, परिणामस्वरूप एनएमजे में एक महीने की संस्कृति में मोटर न्यूरॉन्स, कंकाल मांसपेशी और श्वार्न कोशिकाओं सहित पूर्व और बाद के सिनैप्टिक घटक शामिल थे। एनएमजे की कार्यात्मक परख से यह भी पता चला है कि मायोट्यूब संकुचन सीए+ + द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है, फिर क्यूरे, एक एसीटिलकोलिन रिसेप्टर (एसीएचआर) अवरोधक द्वारा बाधित किया जा सकता है, जिसमें उत्तेजक संकेत एनएमजे के माध्यम से प्रेषित किया जाता है। इस सरल और मजबूत दृष्टिकोण ने कार्यात्मक कनेक्टिविटी के साथ एनएमजे की जटिल संरचना को सफलतापूर्वक प्राप्त किया। इस इन विट्रो मानव एनएमजे, अपनी एकीकृत संरचनाओं और समारोह के साथ, रोग तंत्र और यौगिक स्क्रीनिंग का अध्ययन करने के लिए आशाजनक क्षमता है ।
Introduction
न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) एक विशेष सिनेप्स है जो स्वैच्छिक मांसपेशियों के आंदोलन को नियंत्रित करने के लिए मोटर न्यूरॉन्स से कंकाल मांसपेशियों तक संकेतों को प्रसारित करता है1,,2। यह सिनेप्स पूर्व और बाद के सिनैप्टिक भागों से बना है। प्री-सिनेप्टिक पार्ट में मोटर न्यूरॉन एक्सोसाइटोसिस द्वारा सिनेप्टिक वेसिकल्स से एसिटिलकोलिन (एसीएच) जारी करता है। ACh सिनैप्टिक वेसिकल्स से जारी किया जाता है ताकि सिनैप्टिक फांक को पार किया जा सके और मांसपेशियों के संकुचन3, 4,के लिए एक कार्रवाई क्षमता को ट्रिगर करने के लिए सिनैप्टिक भाग पर AChR को बांध दियाजासके। इस नाजुक संरचना में किसी भी खराबी से एनएमजे रोग हो सकते हैं, जिनमें स्पाइनल मस्कुलर शोष (एसएमए), जन्मजात मायस्थेनिक सिंड्रोम (सीएमएस), मायस्थेनिया ग्रेविस (एमजी)5,,6,,7आदि शामिल हैं। ये बीमारियां रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को बहुत नुकसान पहुंचाती हैं और दुर्भाग्य से रोग तंत्र को समझने की कमी के कारण कोई प्रभावी उपचार दृष्टिकोण नहीं है। इस अध्ययन में, हम सटीक रोग मॉडलिंग के लिए मानव आईपीएससी से इन विट्रो मानव एनएमजे उत्पन्न करने के लिए और चिकित्सकीय यौगिकों स्क्रीनिंग के लिए उद्देश्य।
पिछले अध्ययनों ने सह-संस्कृति रणनीतियों द्वारा विट्रो एनएमजे में उत्पादन की संभावना का प्रदर्शन किया है। मोटर न्यूरॉन्स और कंकाल मायोट्यूब क्रमशः उत्पन्न होते हैं। दो सेल प्रकार मानव या माउस प्राथमिक ऊतक संस्कृतियों से उत्पन्न हो सकते हैं या स्टेम,सेल8,9,10, 11से प्रेरित हो सकते हैं और फिर एनएमजेगठन के लिए सह-संस्कारी होते हैं।,, आगे के अनुप्रयोगों में सह- संस्कारी एनएमजे को माइक्रोफ्लुइडिक 3डी उपकरणों में विलय करना और12,13के क्वांटिटेबल कार्यात्मक परख के लिए ऑप्टोजेनेटिक इकाइयों का उपयोग करना शामिल है। हालांकि, इन रणनीतियों में एक लंबी संस्कृति अवधि होती है और एनएमजे के प्राथमिक घटकों को प्राप्त करने के लिए संघर्ष की आवश्यकता होती है, या तो मोटर न्यूरॉन या कंकाल मायोट्यूब एक साथ। फिर भी एनएमजे का एक और महत्वपूर्ण घटक, श्वान सेल, इन संस्कृति प्रणालियों में उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। उन्नत संस्कृति प्रणाली जिसमें मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन और श्वान सेल शामिल है, वांछनीय है क्योंकि यह एनएमजे अध्ययनों के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत मॉडल प्रदान कर सकता है।
मायोजेनिक विभेदन 1 (MYOD1) मायोजेनेसिस14के लिए एक प्रसिद्ध मायोजेनिक नियामक है। आईपीएससी को मायोट्यूब में चलाने के लिए MYOD1 को लागू करने वाली कुशल मायोजेनिक विभेद विधि पिछले अध्ययन15में बनाई गई थी । इसलिए, हमने आईपीएससी15में MYOD1 को अधिकएक्सप्रेस करके मायोट्यूब को प्रेरित किया और मायोजेनिक विभेदन की उच्च दक्षता दिखाई गई। दिलचस्प बात यह है कि 10 दिन के बाद अनायास ही न्यूरॉन कोशिकाएं मायोट्यूब के साथ दिखाई दीं। मायोजेनिक संस्कृति में न्यूरॉन कोशिकाओं की उपस्थिति ने हमें एक ही डिश में विट्रो एनएमजे में पैदा करने की रणनीति विकसित करने के लिए नेतृत्व किया है। यहां हम एक ही संस्कृति पकवान में मायोजेनिक और मोटर न्यूरॉन प्रेरण के लिए मानव आईपीएससी में MYOD1 को ओवरएक्सप्रेस करके एनएमजे को उत्पन्न करने की रणनीति प्रदान करते हैं। मोटर न्यूरॉन्स अनायास कई न्यूरोट्रोफिक कारकों (जीडीएनएफ, बीडीएनएफ, एनटी3, आदि) के साथ प्रेरित होते हैं। 8,और, इस बीच, श्वान कोशिकाओं को भी प्रेरित किया जा सकता है16,,17। मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन्स और श्वान कोशिकाओं के बीच बातचीत के माध्यम से, परिपक्व एनएमजे18का गठन कर रहे हैं। यह विधि कार्यात्मक एनएमजे को कुशलतापूर्वक उत्पन्न कर सकती है, जिससे पैथोलॉजिकल तंत्र और चिकित्सीय यौगिक स्क्रीनिंग के संभावित अध्ययन को सक्षम किया जा सकता है।
Protocol
1. एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटेड प्लेट्स की तैयारी
- तनु ECM (सामग्री की तालिकादेखें) बर्फ ठंड 1x PBS के साथ 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ।
- 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 1x पीबीएस के 49 एमएल में ईसीएम का 1 एमएल जोड़ें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।
- 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 कवरलिप रखें। प्रत्येक कुएं में 2% ईसीएम का 1.5 एमएल जोड़ें।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 2% ईसीएम के साथ अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- अच्छी तरह से थाली से ईसीएम को एस्पिरेट करें और उपयोग से पहले प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
2. एनएमजे की ओर आईपीएससी का भेदभाव
- सेक्शन 1 में तैयार 6-वेल प्लेट पर आईपीएससी के बीज 4 x 105 कुएं में पूर्व जमा कवरस्लिप पर कोशिकाओं को बीज सुनिश्चित करें।
नोट: इस अध्ययन में, 201B7MYOD आईपीएस सेल लाइन, डॉ सकुराई की प्रयोगशाला से एक उपहार,15इस्तेमाल किया गया था ।- 6 सेमी कल्चर डिश पर आईपीएससी से मीडियम निकालें और 1x पीबीएस के साथ एक बार आईपीएससी को धो लें ।
- डिश में सेल टुकड़ी का 1 एमएल घोल डालें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- डिश में रहनुमा भ्रूणीय स्टेम (ईएस) सेल माध्यम के 3 एमएल जोड़ें और 3 बार धीरे-धीरे पिपेट करें।
- सुपरनैंट को इकट्ठा करें, जिसमें अलग आईपीएसएस शामिल है, 50 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 160 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
- सुपरनैंट को ध्यान से जाता है, 10 μM Y27632 के साथ 3 एमएल रहनुमा ईएस सेल माध्यम में आईपीएससी को फिर से खर्च करें, और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर गिनें।
- रहनुमा ईएस सेल माध्यम और 10 μM Y27632 के साथ आईपीएससी को 2 x 105 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए पतला करें । धारा 1 में वर्णित कुएं में प्री-डिपॉजिट किए गए कवरस्लिप पर आईपीएससी के 2 एमएल जोड़ें।
- एनपीजे में आईपीएससी का शामिल होना
- 1 दिन, 24 घंटे 6-वेल प्लेट में आईपीएससी सीडिंग के बाद, संस्कृति माध्यम को हटा दें और इसे ताजा रहनुमा ईएस सेल माध्यम के 2 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें प्रत्येक अच्छी तरह से 1 μg/ml doxycycline होता है ।
- 1 μg/mL डॉक्सीसाइक्लिन (अंतिम एकाग्रता) युक्त मायोजेनिक विभेदन माध्यम (एमडीएम)(तालिका 1)के 2 एमएल के साथ माध्यम को प्रत्येक कुएं में बदलें। 2 दिन से 10 दिन तक हर दिन माध्यम को ताज़ा करें।
- 11 दिन से, मध्यम को एनएएमजे माध्यम(तालिका 1)के 2 एमएल में प्रत्येक कुएं में स्विच करें। माध्यम हर 3 \ u20124 दिनों के बाद 30 दिन तक ताज़ा करें ।
- 30 दिन पर चरण उल्टे माइक्रोस्कोपी द्वारा विभेदित एनएमजे का निरीक्षण करें। एनएमजे का उपयोग निम्नलिखित विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला
- 30 दिन, 6-अच्छी थाली से संस्कृति माध्यम को आकांक्षी करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के 2 एमएल जोड़कर एनएमजे संस्कृति को ठीक करें।
- प्रत्येक कुएं में 1x पीबीएस के 2 एमएल जोड़कर नमूनों को 3 बार धोएं (प्रत्येक धोने के लिए 3 मिनट)।
- 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन/पीबीएस के साथ नमूनों को पार करें।
- दोहराएं चरण 3.2।
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 0.5% बीएसए के साथ नमूनों को ब्लॉक करें।
- दोहराएं चरण 3.2।
- रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। एंटीबॉडी का कमजोर पड़ना इस प्रकार है: आइलेट 1 (1 μg/mL), मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH) (1/300), न्यूरोफिलामेंट्स (एनएफ) (1 μg /एमएल), एस-१०० (1/300), सिनैप्टिक वेसिकल प्रोटीन 2 (एसवी2) (1 माइक्रोग्राम/एमएल), तुज1 (1/1000) ।
- दोहराएं चरण 3.2।
- 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता इस प्रकार है: एंटी-माउस आईजीजी 488 संयुग्मित (0.1 μg/mL), एंटी-खरगोश आईजीजी 488 संयुग्म (0.1 माइक्रोग्राम/एमएल)।
- दोहराएं चरण 3.2।
- AChR धुंधला के लिए aBTX-647 (0.5 μg/mL) के साथ नमूनों को इनक्यूबेट और नाभिक धुंधला के लिए DAPI (1 μg/mL) के साथ ।
- दोहराएं चरण 3.2।
- 6-वेल प्लेट से संदंश की एक जोड़ी के साथ कवरस्लिप उठाओ और यह एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ५०% ग्लाइसरोल/PBS समाधान में माउंट ।
4. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM)
- 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 0.1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर में तैयार 4% पैराफॉर्मलडिहाइड और 1% ग्लूटारल्डिहाइड के साथ एनएमजे संस्कृति को ठीक करें।
- नमूनों को 3 बार कमरे के तापमान पर 0.1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर (प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट) में विसर्जित करके धोएं।
- इथेनॉल (50%, 70%, 90%, 95% और 100% दो बार) की आरोही सांद्रता के साथ नमूनों को निर्जलित करें।) 10 मिनट के लिए इथेनॉल की प्रत्येक एकाग्रता में नमूनों को विसर्जित करें।
- नमूनों को एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (-30 डिग्री सेल्सियस, 0.1 टोर) द्वारा सुखाएं।
- कोट पं (प्लैटिनम) आयन कोटर (3 मिनट के लिए 30 एमए; पीटी की मोटाई लगभग 20 एनएम) के साथ नमूने।
- एसईएम द्वारा 5 केवी पर नमूनों का निरीक्षण करें।
5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM)
- एनएमजे कल्चर प्लेट से टिश्यू को हार्वेस्ट करने के लिए सेल स्क्रैपर का इस्तेमाल करें। एक जेल-लिपटे टुकड़े बनाने के लिए जेलेशन द्वारा एक रेजर ब्लेड और गोंद के साथ एक छोटे से गोली(3 मिमी 3)में ऊतक को आकार दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर में तैयार 2% पैराफॉर्मलडिहाइड और 2% ग्लूटारल्डिहाइड के साथ जेल से लिपटे टुकड़े को रात भर ठीक करें।
- नमूनों को 3 बार कमरे के तापमान पर 0.1 मीटर पोटेशियम फॉस्फेट बफर (प्रत्येक धोने के लिए 15 मिनट) में विसर्जित करके धोएं।
- कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए डबल आसुत एच2ओ में तैयार 1% ऑस्मियम टेट्रोऑक्साइड के साथ नमूनों को पोस्टफिक्स करें।
सावधानी: यह कदम रासायनिक हुड में किया जाना चाहिए। - दोहराएं चरण 5.2।
- इथेनॉल (50%, 70%, 90%, 95% और 100% दो बार) की आरोही सांद्रता के साथ नमूनों को निर्जलित करें।) 10 मिनट के लिए इथेनॉल की प्रत्येक एकाग्रता में नमूनों को विसर्जित करें।
- 100% इथेनॉल को एस्पिरेट करें। 100% इथेनॉल मिश्रण (1:3, 1:1 और 3:1) के लिए एपॉक्सी राल के आरोही मात्रा अनुपात के साथ नमूनों में घुसपैठ करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 10 आरपीएम पर प्रत्येक मिश्रण धीरे से उत्तेजित करें।
- एपॉक्सी-इथेनॉल मिश्रण को शुद्ध एपॉक्सी राल से बदलें और कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए 10 आरपीएम पर धीरे-धीरे उत्तेजित करें।
- 4 घंटे के बाद, एपॉक्सी राल को ताजा एपॉक्सी राल के साथ ताज़ा करें और कमरे के तापमान पर रात भर 10 आरपीएम पर धीरे-धीरे उत्तेजित करें।
- ताजा एपॉक्सी राल के साथ कैप्सूल एम्बेड में नमूनों को एम्बेड करें और रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में नमूनों का इलाज करें।
- अल्ट्रामाइक्रोटॉमी
- मोटे सही अभिविन्यास के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नमूना ब्लॉक ट्रिम।
- चिकनी सतहों को प्राप्त करने के लिए अल्ट्रामाइक्रोटोम पर एक ग्लास चाकू के साथ मोटे छंटनी किए गए ब्लॉकों को बारीक ट्रिम करें।
- हीरे के चाकू के साथ अच्छी तरह से छंटनी किए गए ब्लॉकों से 70 एनएम अल्ट्राथिन सेक्शन तैयार करें। 200 जाल कार्बन-फॉर्मवर-लेपित कॉपर ग्रिड के साथ अल्ट्राथिन वर्गों को पुनः प्राप्त करें।
- 30 मिनट के लिए डबल आसुत एच2ओ में तैयार संतृप्त यूरैनिल एसीटेट के साथ ग्रिड युक्त अल्ट्राथिन वर्गों को दाग दें और ग्रिड को डबल आसुत एच 2 ओ (प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट) के साथ3बार धोएं।
- इसके अलावा, रेनॉल्ड के लीड साइट्रेट19 (2.5%) के साथ अल्ट्राथिन वर्गों के विपरीत 5 मिनट के लिए और उबले हुए एच2ओ के साथ धोएं कमरे के तापमान को 3 बार (प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट) के तापमान पर पूर्व-ठंडा किया जाता है। वर्गों पर सीओ2 वर्षा को रोकने के लिए धुंधला क्षेत्र के आसपास कई सोडियम हाइड्रोक्साइड छर्रों रखो।
- 70 केवी पर TEM द्वारा अल्ट्राथिन वर्गों का निरीक्षण करें।
6. मांसपेशियों में संकुचन और curare उपचार
- मायोट्यूब संकुचन को ट्रिगर करने के लिए, स्टेप2.3 में संस्कृति माध्यम में 25 एमएमएल सीएसीएल 2 जोड़ें। मायोट्यूब का आंदोलन 1\u20122 मिनट में देखा जा सकता है।
- 6-अच्छी प्लेट को उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। लाइव सेल माइक्रोस्कोपी द्वारा मायोट्यूब संकुचन की एक फिल्म रिकॉर्ड करें।
- मायोट्यूब संकुचन को रोकने के लिए, संस्कृति माध्यम (300 एनजी/एमएल) में क्यूरे जोड़ें। फिर चरण 6.2 के रूप में फिल्म रिकॉर्ड।
- मोशन वेक्टर एनालिसिस सॉफ्टवेयर के साथ मूवी फाइल खोलें फिर फिल्म का विश्लेषण करने के लिए मोशन एनालिसिस बटन पर क्लिक करें ।
नोट: मायोट्यूब संकुचन को टाइम-मोशन ग्राफिक के रूप में दिखाया गया है। फिल्में मायोट्यूब की आंदोलन गति दिखाने के लिए रंग-कोडित हैं। रंग-कोडित स्पार्कली सिग्नल मायोट्यूब के आंदोलनों को इंगित करते हैं जहां लाल रंग सबसे तेज आंदोलन गति दिखाता है और नीला रंग सबसे धीमी गति की गति दिखाता है।
Representative Results
हमारी भेदभाव रणनीति का उपयोग करते हुए, संस्कृति ने 30 दिन में एनएमजे के पूर्व और बाद के सिनैप्टिक घटकों को दिखाया। एनएमजे घटकों को एक ही कुएं में प्रेरित और अच्छी तरह से विकसित किया गया था, और एनएमजे में उनके आकृति विज्ञान और स्थानों को यदि माइक्रोस्कोपी(चित्रा 1)द्वारा प्रदर्शित किया गया था। चित्रा 1A में प्रवाह चार्ट एनएमजे भेदभाव प्रगति के समय पाठ्यक्रम का सारांश देता है। न्यूरोफिलमेंट्स (एनएफ), सिनैप्टिक वेसिकल्स (एसवी 2) और एएचआर(चित्रा 1बी, सी)का धुंधला न्यूरॉन्स को इंगित करता है। एनएफ और एसवी 2 की एकल धुंधला छवियां अनुपूरक चित्र 1में दिखाई गई हैं । अल्फा-बुंगरोटॉक्सिन स्टेनिंग AChR(चित्रा 1C) इंगितकरता है । विलय छवि NMJ(चित्रा 1डी, ई)में एक मोटर न्यूरॉन और AChR के सापेक्ष स्थानों से पता चलता है । आईएफ धुंधला का दूसरा सेट तुज 1 और आइलेट 1 (चित्रा 1जी, एच)और मायोसिन भारी श्रृंखला(चित्रा 1I)द्वारा पोस्ट-सिनैप्टिक मायोट्यूब द्वारा मोटर न्यूरॉन को इंगित करताहै। श्वान कोशिकाओं को एनएमजे संस्कृति(अनुपूरक चित्रा 2)में एस-100 एंटीबॉडी द्वारा भी लेबल किया गया था।
एनएमजे घटकों की पहचान की पुष्टि करने के लिए, हमने विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण के लिए एसईएम का उपयोग किया। विस्तारित एक्सॉन टर्मिनल, एक्सॉन और मांसपेशी फाइबर के साथ परिपक्व एनएमजे आकृति विज्ञान चित्रा 2 ए,बीमें दिखाया गया है। TEM को एनएमजे घटकों के परिपक्व अल्ट्रास्ट्रक्चर को प्रकट करने के लिए किया गया था जिसमें सिनैप्टिक वेसिकल्स और पोस्ट-सिनैप्टिक भाग के साथ प्री-सिनेप्टिक एक्सॉन टर्मिनल शामिल है, जो सिनैप्टिक फांक(चित्रा 2सी\u2012E)से अलग है। जंक्शनल सिलवटों को पीले धराशायी-रेखा द्वारा इंगित किया जाता है, जो न्यूरॉन और मांसपेशी फाइबर(चित्रा 2 सी)के जंक्शन को चिह्नित करता है। सिनैप्टिक वेसिकल्स वाले परिपक्व एक्सोन टर्मिनलों को चित्र 2डी,ई (पीले तीर) में दिखाया गया है। रूपात्मक परिणाम बताते हैं कि एनएमजे घटक अच्छी तरह से प्रेरित और परिपक्व थे।
इन विट्रो एनएमजे के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए, हमने मायोट्यूब संकुचन को ट्रिगर करने के लिए सीएसीएल2 के साथ मोटर न्यूरॉन को उत्तेजित करके गति विश्लेषण किया। परिणामों से पता चला है कि Ca2 + मांसपेशियों के संकुचन को ट्रिगर कर सकते हैं । संकुचन curare द्वारा बाधित किया जा सकता है । एनएमजे ने प्रमुख गति संकेत दिखाए जो क्यूरे उपचार(चित्र 3)के साथ गायब हो गए । यह प्रभाव इस बात की पुष्टि करता है कि मांसपेशियों के संकुचन को ट्रिगर करने के लिए एनएमजे के माध्यम से मोटर न्यूरॉन सिग्नल प्रेषित किए गए थे। एक साथ लिया गया, यदि माइक्रोस्कोपी, एसईएम और तेम डेटा ने ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न इन विट्रो एनएमजे में एनएमजे घटकों के स्थानिक वितरण, आकृति विज्ञान और परिपक्वता का प्रदर्शन किया। मोशन एनालिसिस ने इन विट्रो एनएमजे के कार्य को मान्य किया, जिसका तात्पर्य चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने के लिए इसके संभावित अनुप्रयोग से है।
चित्रा 1: एनएमजे प्रेरण के लिए फ्लो चार्ट और एनएमजे संस्कृति की छवियां। (A)एनएमजे भेदभाव प्रगति के लिए एक प्रवाह चार्ट । (B\u2012F) एनएमजे घटकों, न्यूरोफिलामेंट्स (एनएफ), सिनैप्टिक वेसिकल्स (एसवी 2) और एएचआर का पता लगाना। पैनल डी में सफेद तीर एनएमजे का संकेत देते हैं। (G\u2012K) एनएमजे के पूर्व और बाद के सिनैप्टिक घटक। Tuj1 और Islet1 मोटर न्यूरॉन से संकेत मिलता है, और मायोसिन भारी श्रृंखला (MYH) मायोट्यूब इंगित करता है। ए-बीटीएक्स, अल्फा-बंगारोटॉक्सिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: परिपक्व एनएमजे की एसईएम और TEM छवियां। (क)एनएमजे घटकों का स्थानिक वितरण मांसपेशियों के फाइबर (एमएफ) की सतह पर लंगर डाले हुए अक्षतंतरा टर्मिनल को दर्शाता है । (ख)एनएमजे का एक उच्च आवर्धन अक्षतं टर्मिनलों को दिखाता है । (ग)प्री-सिनैप्टिक एक्सॉन टर्मिनल (लाल एरोहेड) और सिनैप्टिक वेसिकल्स (एसवी), सिनैप्टिक फांक (एससी) और पोस्ट-सिनेप्टिक पार्ट्स (लाल तीर) के साथ परिपक्व एनएमजे का अल्ट्रास्ट्रक्चर । जंक्शनल सिलवटों (जेएफ) पीले धराशायी रेखा से संकेत दिया जाता है। एक्स, अक्षतंता। (घ, ई) उच्च आवर्धन छवियां अक्षतंपीय टर्मिनलों (पीले तीर) में सिनैप्टिक वेसिकल्स दिखाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: इन विट्रो एनएमजे का मायोट्यूब संकुचन विश्लेषण। मायोट्यूब संकुचन 25 mM CaCl2 समाधान (ग्रीन लाइन) के साथ शुरू किया गया था। संकुचन को क्यूरे (येलो लाइन) के साथ इलाज के बाद संकोच किया गया था। कृपया अनुपूरक फिल्म 1 और अनुपूरक फिल्म 2भी देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक मूवी 1: Ca+ +द्वारा शुरू हुआ मायोट्यूब संकुचन। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक मूवी 2: क्यूरे उपचार के बाद मायोट्यूब का बहुत कमजोर संकुचन दिखाया गया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 1: एनएमजे संस्कृति में न्यूरोफिलमेंट्स (एनएफ, सफेद तीर) की एकल धुंधला छवियां। एनएमजे संस्कृति में सिनैप्टिक वेसिकल्स (एसवी 2, सफेद तीर) की एकल धुंधला छवियां। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक चित्रा 2: एनएमजे संस्कृति में एस-100 एंटीबॉडी द्वारा लेबल की गई श्वान कोशिकाएं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
| मायोजेनिक विभेदन माध्यम (एमडीएम) | एमईएम-अल्फा | 500mL |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| डॉक्सीसाइक्लिन | 1μg/एमएल | |
| केएसआर | 56mL (अंतिम 10%) | |
| पेन/स्ट्रेप | 2.5mL | |
| कुल | 560mL | |
| 100mM 2-मर्केप्टोथेनॉल | 2-मर्केप्टोथेनॉल | 7μL |
| d.d. पानी | 993μL | |
| कुल | 1000μL | |
| एनएमजे माध्यम | न्यूरोबेसल माध्यम (एनबी) | 500mL |
| B27 | 1x (50x में स्टॉक) | |
| बीडीएनएफ | 10ng/एमएल | |
| जीडीएनएफ | 10ng/एमएल | |
| N2 | 1x (100x में स्टॉक) | |
| एनटी3 | 10ng/एमएल | |
| पेन/स्ट्रेप | 2.5mL | |
तालिका 1: मध्यम का फार्मूला।
Discussion
पिछले अध्ययनों में अत्याधुनिक तरीकों के साथ विट्रो में एनएमजे गठन के तरीकों की सूचना दी गई है, जिनके लिए लंबे समय से कहा जाने वाला संस्कृति8,,10,12,13,,20की आवश्यकता होती है।,, ये उपलब्धियां इन विट्रो एनएमजे की प्रगति का नेतृत्व करते हैं । हालांकि, जटिल तरीकों ने एनएमजे अध्ययनों की पहुंच में रुकावट पैदा की । हमारा प्रोटोकॉल एनएमजेएस को एक ही कुएं में कुशलतापूर्वक और मजबूती से उत्पन्न करने के लिए सह-संस्कृति से बचता है। हमारे प्रेरण प्रणाली में एनएमजे में तीन सेल प्रकार देखे गए, जिनमें मायोट्यूब, मोटर न्यूरॉन्स और श्वान कोशिकाएं18शामिल हैं। इसके अलावा, परिपक्व आकृति विज्ञान और समारोह सत्यापित किया गया।
हमारे पिछले अध्ययन के आधार पर, प्रारंभिक सेल घनत्व एनएमजे गठन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, और विभिन्न सेल घनत्व संस्कृति18में एनएमजे की विभिन्न संख्याओं को प्रेरित करते हैं। एक कम सेल घनत्व (< 1 x 104/सेमी2)ने न्यूरॉन्स की कम संख्या को प्रेरित किया, जो एनएमजे गठन के लिए प्रतिकूल है । यद्यपि कोशिकाओं का अधिक घनत्व (> 1 x 105/सेमी2)तैयार करने में बहुत अधिक समय और संसाधन लगेंगे, हम अनुशंसा करते हैं कि कोशिका घनत्व हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके 1.5 x10 4/सेमी2 और 5 x 104/सेमी2 के बीच हो । इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न एनएमजे कई सेल प्रकारों के साथ एक विषम ऊतक है जो शारीरिक स्थितियों की नकल करने के करीब है। मायोट्यूब एक संस्कृति पकवान पर समान रूप से वितरित करने के लिए पाए जाते हैं, लेकिन मोटर न्यूरॉन्स बेतरतीब ढंग से दिखाई देते हैं, जिनमें से घटना के परिणामस्वरूप संस्कृति में एनएमजेएस का असमान वितरण होता है। यह एनएमजे सजातीय संस्कृति प्रणालियों की आवश्यकता वाले विश्लेषण के बजाय गुणात्मक अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। हमने इस प्रोटोकॉल द्वारा एनएमजे उत्पन्न करने के लिए अन्य सेल लाइनों, eq., H9 (ES सेल लाइन)18 और A11 (आईपीएस सेल लाइन, डेटा नहीं दिखाया गया) का भी उपयोग किया। एनएमएसजी को आकृति विज्ञान और कार्य में सफलतापूर्वक उत्पन्न किया जा सकता है। संस्कृति की स्थिति, फिर भी, विभिन्न सेल लाइनों के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है।
रासायनिक रूप से ट्रिगर मायोट्यूब संकुचन और क्यूरे-निर्भर अवरोध ने पुष्टि की कि हमारे इन विट्रो एनएमजे कार्यात्मक थे और संभावित रूप से व्यावहारिक परख के लिए लागू किया जा सकता है। संस्कृति के 3 \u20124 सप्ताह में सहज मांसपेशियों के संकुचन बेतरतीब ढंग से मनाए गए थे, लेकिन संस्कृति के समय को दो महीने18तक बढ़ाकर इससे बचा जा सकता है।
विभिन्न परिपक्वता चरणों के विट्रो एनएमजे में उत्पन्न करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को प्रकाशित किया गया है, लेकिन हमारी प्रणाली में उत्पन्न इन विट्रो एनएमजे ने महत्वपूर्ण परिपक्वता दिखाई, क्योंकि हम संस्कृति18के दौरान AChR के एप्सिलॉन सबयूनिट में गामा के संक्रमण का निरीक्षण कर सकते हैं। इन विट्रो एनएमजे21के साथ रोग मॉडलिंग के लिए परिपक्वता एक महत्वपूर्ण विचार है। अंत में, एकीकृत संरचनात्मक घटकों, परिपक्वता और कार्य के साथ एक इन विट्रो एनएमजे चिकित्सीय विकास के लिए संभावित उपयोग का है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम डॉ सकुराई को 201B7 MYOD प्रदान करने के लिए धन्यवाददेतेहैं । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन को कीको ओकामोटो-फुरुटा और हरुयासु कोहडा (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक अध्ययन का विभाजन, सेंटर फॉर एनाटॉमिकल स्टडीज, ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, क्योटो विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया था। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी HHMI/कोलंबिया विश्वविद्यालय द्वारा विकसित किया गया था, विकास अध्ययन Hybridoma बैंक से प्राप्त, राष्ट्रीय संस्थान बाल स्वास्थ्य और NIH के मानव विकास द्वारा बनाई गई है, और जीव विज्ञान विभाग, आयोवा विश्वविद्यालय में बनाए रखा । हम मोशन वेक्टर विश्लेषण के लिए शिओरी ओशिमा, काज़ुहिरो नाकागावा और एरिको मात्सुई को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेनही, ग्रांट नंबर 16H05352 और 20H03642 (एमकेएस) से फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था; आईपीएस सेल रिसर्च फंड (सीवाईएल और एमकेएस के लिए); चिकित्सा और औषधि अनुसंधान के लिए Mochida मेमोरियल फाउंडेशन (एमकेएस के लिए); टेकडा साइंस फाउंडेशन (एमकेएस के लिए); और रोग-विशिष्ट आईपीएस कोशिकाओं का उपयोग करने वाले असभ्य रोग अनुसंधान के लिए कार्यक्रम से अनुदान, जिसे जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (17 9 35400 से सीवाईएल और एमकेएस और 17 9 35423 से एमकेएस) द्वारा सहायता प्रदान की गई थी।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
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