Summary
כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי ליצור במבחנה NMJs מתאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs). שיטה זו יכולה לגרום NMJs עם מורפולוגיה בוגרת ולתפקד בחודש אחד בבאר אחת. NMJs וכתוצאה מכך יכול לשמש פוטנציאל מודל מחלות הקשורות, ללמוד מנגנונים פתולוגיים או לסנן תרכובות סמים לטיפול.
Abstract
צומת עצבי-שרירי (NMJ) הוא סינפסה מיוחדת המשדרת פוטנציאל פעולה מהנוירון המוטורי לשריר השלד לתנועה מכנית. הארכיטקטורה של מבנה NMJ משפיעה על הפונקציות של הנוירון, השריר והאינטראקציה ההדדית. מחקרים קודמים דיווחו על אסטרטגיות רבות על ידי שיתוף culturing הנוירונים המוטוריים myotubes כדי ליצור NMJ במבחנה עם תהליך אינדוקציה מורכבת ותקופת תרבות ארוכה, אבל נאבקו כדי להפיק מחדש מורפולוגיה NMJ בוגר ותפקוד. מערכת האינדוקציה שלנו במבחנה NMJ בנויה על ידי בידוק iPSC אנושי בצלחת תרבות אחת. על ידי החלפת מדיום אינדוקציה מיוגנית ונוירוגנית עבור אינדוקציה, NMJ וכתוצאה מכך הכיל רכיבים לפני פוסט סינפטי, כולל נוירונים מוטוריים, שריר השלד ותאי Schwann בתרבות חודש אחד. ההסתה הפונקציונלית של NMJ גם הראה כי התכווצות myotubes יכול להיות מופעל על ידי Ca++ אז מעוכב על ידי curare, מעכב קולטן אצטילכולין (AChR), שבו האות מגרה מועבר דרך NMJ. גישה פשוטה וחזקה זו הפיקה בהצלחה את המבנה המורכב של NMJ עם קישוריות פונקציונלית. זה במבחנה אנושית NMJ, עם המבנים המשולבים שלה ותפקוד, יש פוטנציאל מבטיח ללימוד מנגנונים פתולוגיים הקרנה מורכבת.
Introduction
צומת neuromuscular (NMJ) הוא סינפסה מיוחדת המשדרת אותות מנוירונים מוטוריים לשרירי השלד כדי לשלוט בתנועתשרירים מרצון 1,,2. סינפסה זו מורכבת מחלקים לפני ופוסט-סינפטיים. בחלק טרום סינפטי, נוירון מוטורי משחרר אצטילכולין (ACh) מ שללים סינפטיים על ידי אקסוציטוזיס. ACh הוא שוחרר של שלוק סינפטי לחצות את שסוע סינפטי ולאגד AChR על החלק שלאחר סינפטי כדי להפעיל פוטנציאל פעולה להתכווצותשרירים 3,4. כל תקלה במבנה עדין זה יכולה לגרום למחלות NMJ, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה (SMA), תסמונות מיאסתניק מולדות (CMS), myasthenia gravis (MG)5,6,,7,וכו '. מחלות אלה פוגעות מאוד באיכות חייהם של החולים ולמרבה הצער אין גישות טיפול יעילות בשל חוסר הבנת המנגנון הפתולוגי. במחקר זה, אנו מכוונים לייצר במבחנה NMJ אנושי מ iPSCs אנושי עבור מידול מחלות מדויקות עבור הקרנת תרכובות טיפוליות.
מחקרים קודמים הראו את האפשרות של יצירת במבחנה NMJ על ידי אסטרטגיות תרבות שותף. הנוירונים המוטוריים ומיוטובים השלד נוצרים בהתאמה. שני סוגי התאים יכולים להיווצר מתרביות רקמה ראשית של בני אדם או עכבר אולהיות מושרה מתאי גזע 8,9,10,11 ולאחר מכן שיתוף תרבות עבור היווצרות NMJ. היישומים נוספים כוללים מיזוג NMJ שיתוף תרבות לתוך התקני 3D microfluidic ולהשתמש יחידות optogenetic עבור תאגיד פונקציונלי כימות12,13. עם זאת, אסטרטגיות אלה לקחת תקופת תרבות ארוכה ודורשים מאבק כדי להשיג את הרכיבים העיקריים של NMJ, או נוירון מוטורי או myotube השלד בו זמנית. מרכיב חשוב נוסף של NMJ, תא Schwann, לא ניתן ליצור במערכות תרבות אלה. מערכת התרבות המתקדמת המכילה את מיוטוב, נוירון מוטורי ותא Schwann הוא רצוי כפי שהוא יכול להציע מודל אמין וחזק עבור מחקרים NMJ.
בידול מיוגנית 1 (MYOD1) הוא ווסת מיוגנית ידוע עבור מיוגנזה14. שיטת בידול מיוגניים יעיל אשר יישם MYOD1 לנהוג iPSC לתוך myotubes נבנה במחקרקודם 15. לכן, ההשרנו את myotubes על ידי overexpressing MYOD1 ב iPSCs15, ויעילות גבוהה של בידול myogenic הוצגה. מעניין, תאי נוירון הופיעו יחד עם myotubes באופן ספונטני אחרי היום 10. המראה של תאי נוירון בתרבות המיוגנית הוביל אותנו לפתח את האסטרטגיה ליצירת במבחנה NMJ בצלחת אחת. כאן אנו מספקים אסטרטגיה כדי ליצור NMJs על ידי דיכוי יתר של MYOD1 ב iPSCs אנושי עבור אינדוקציה מיוגנית ונוירון מוטורי באותה צלחת תרבות. הנוירונים המוטוריים מושרה באופן ספונטני עם מספר גורמים נוירוטרופיים (GDNF, BDNF, NT3, וכו ') 8, ובינתיים, התאים Schwann יכול להיות גם מושרה16,17. באמצעות האינטראקציות בין myotubes, נוירונים מוטוריים ותאי Schwann, NMJ הבוגרנוצרים 18. שיטה זו יכולה ליצור NMJ פונקציונלי ביעילות, המאפשר את המחקר הפוטנציאלי של מנגנונים פתולוגיים והקרנה מורכבת טיפולית.
Protocol
1. הכנת לוחות מצופה מטריצה חוץ-תאית (ECM)
- דילו ECM (ראה טבלת חומרים)עם קרח קר 1x PBS לריכוז סופי של 2%.
- הוסף 1 מ"ל של ECM ל 49 מ"ל של PBS 1x בצינור פלסטיק 50 מ"ל. מערבבים היטב על ידי התפתלות למעלה ומטה מספר פעמים.
- מניחים 1 כיסויים לתוך כל באר של צלחת 6-באר. להוסיף 1.5 מ"ל של 2% ECM לכל באר.
- דגירה את צלחת הבאר עם 2% ECM עבור 2 שעות ב 37 ° C.
- שאפף ECM מצלחת הבאר ולאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
2. בידול של iPSCs לכיוון NMJ
- זרע 4 x 105 של iPSCs לכל באר על צלחת 6-באר מוכן בסעיף 1. הקפד לזרוע את התאים על כיסוי שהופקד מראש בבאר.
הערה: במחקר זה, 201B7MYOD iPS קו התא, מתנה מהמעבדה של ד"ר Sakurai,שימש 15.- הסר את המדיום מה- iPSCs בצלחת התרבות בגודל 6 ס"מ ושטוף את ה- iPSCs פעם אחת עם PBS אחד.
- מוסיפים 1 מ"ל של תמיסת נתק תאים לצלחת ותדגירה במשך 10 דקות ב-37°C.
- מוסיפים 3 מ"ל של תא גזע עוברי יונק (ES) לצלחת ופיפטה 3 פעמים בעדינות.
- אספו את הסופרנטנט, המכיל iPSCs מנותק, לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 160 x g ב 4 ° C במשך 5 דקות.
- בזהירות לשאוף את supernatant, להשתמש מחדש iPSCs ב 3 mL יונק ES תא בינוני עם 10 μM Y27632, ולספור את מספר התא באמצעות hemocytometer.
- לדלל את iPSCs עם תא ES יונק בינוני ו 10 μM Y27632 לריכוז של 2 x 105 תאים / מ"ל. הוסף 2 מ"ל של iPSCs על מכסה שהופקד מראש בבאר המתוארת בסעיף 1.
- אינדוקציה של iPSCs ל- NMJ
- ביום 1, 24 שעות לאחר זריעת iPSCs לצלחת 6-well, להסיר את מדיום התרבות ולהחליף אותו עם 2 מ"ל של טרי יונק ES תא בינוני המכיל 1 μg / מ"ל דוקסיציקלין לכל באר.
- שנה את המדיום עם 2 מ"ל של מדיום בידול myogenic (MDM) (טבלה 1) המכיל 1 μg / מ"ל דוקסיציקלין (ריכוז סופי) לכל באר. רענן את המדיום מדי יום מיום 2 עד יום 10.
- מהיום ה-11, החלף את המדיום ל-2 מ"ל של NMJ בינוני(טבלה 1)לכל באר. רענן את המדיום כל 3\u20124 ימים לאחר מכן עד היום ה-30.
- שימו לב ל-NMJ המבדיל לפי שלב של מיקרוסקופיה הפוכה ביום ה-30. ניתן להשתמש ב- NMJ עבור הניתוח הבא.
3. כתמים חיסוניים (IF)
- ביום ה-30, לשאוף למדיום התרבות מצלחת 6-באר. לתקן את תרבות NMJ על ידי הוספת 2 מ"ל של 4% paraformaldehyde לכל באר במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי הוספת 2 מ"ל של 1x PBS לכל באר (3 דקות עבור כל שטיפה).
- לחלחל את הדגימות עם 0.1% Triton / PBS במשך 10 דקות.
- חזור על שלב 3.2.
- חסמו את הדגימות עם 0.5% BSA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- חזור על שלב 3.2.
- דגירה הדגימות עם הנוגדנים העיקריים ב 4 ° C לילה. דילול הנוגדנים הוא כדלקמן: איילט 1 (1 μg/mL), שרשרת כבדה מיוסין (MYH) (1/300), neurofilaments (NF) (1 μg /mL), S-100 (1/300), חלבון שלל הסינטי 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj1 (1/1000).
- חזור על שלב 3.2.
- דגירה הדגימות עם הנוגדנים המשניים בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה. הריכוז של הנוגדנים המשניים המשמשים הוא כדלקמן: אנטי-עכבר IgG 488 ביחיד (0.1 μg/mL), אנטי ארנב IgG 488 בהתוות (0.1 μg/ mL).
- חזור על שלב 3.2.
- דגירה הדגימות עם aBTX-647 (0.5 μg / מ"ל) עבור כתמי AChR עם DAPI (1 μg / מ"ל) עבור כתמים גרעין.
- חזור על שלב 3.2.
- להרים את כיסוי עם זוג מפסים מצלחת 6-באר ולהר אותו ב50% גליטרול / PBS פתרון על שקופית מיקרוסקופ.
4. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
- לתקן את תרבות NMJ עם 4% paraformaldehyde ו 1% גלוטראלדהייד מוכן 0.1 M אשלגן פוספט מאגר בטמפרטורת החדר עבור 1 שעות.
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי טבילה אותם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר בטמפרטורת החדר (10 דקות עבור כל שטיפה).
- מייבשים את הדגימות עם ריכוזים עולים של אתנול (50%, 70%, 90%, 95% ו-100% פעמיים). לטבול את הדגימות בכל ריכוז של אתנול במשך 10 דקות.
- יבש את הדגימות על ידי מייבש נקודה קריטית (-30 °C, 0.1 טור).
- ציפוי הדגימות עם Pt (פלטינה) מעיל יון (30 mA במשך 3 דקות; עובי Pt הוא כ 20 נה"מ).
- שים לב לדגימות על ידי SEM ב 5 kV.
5. מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM)
- השתמש במגרד תאים כדי לקצור את הרקמה מצלחת התרבות של NMJ. מעצבים את הרקמה לגלולה קטנה (3 מ"מ3)עם סכין גילוח ודבק על ידי gelation כדי ליצור חתיכה עטופה בג'ל. תקן את החתיכה עטופה בג'ל עם 2% paraformaldehyde ו 2% גלוטראלדהייד מוכן 0.1 M אשלגן פוספט מאגר ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים על ידי טבילה אותם 0.1 M אשלגן פוספט מאגר (15 דקות לכל שטיפה) בטמפרטורת החדר.
- לאחר תקיד את הדגימות עם 1% tetroxide osmium מוכן Hמזוקקכפול 2 O עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
התראה: צעד זה חייב להיעשות במכסה מנוע כימי. - חזור על שלב 5.2.
- מייבשים את הדגימות עם ריכוזים עולים של אתנול (50%, 70%, 90%, 95% ו-100% פעמיים). לטבול את הדגימות בכל ריכוז של אתנול במשך 10 דקות.
- תאטפי את ה-100% אתנול. לחדור את הדגימות עם יחסי נפח עולה של שרף אפוקסי 100% תערובות אתנול (1:3, 1:1 ו 3:1). מסיתים כל תערובת בעדינות ב-10 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- החליפו את תערובת האפוקסי-אתנול עם שרף אפוקסי טהור ועצבני בעדינות ב-10 סל"ד למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
- לאחר 4 שעות, לרענן את שרף אפוקסי עם שרף אפוקסי טרי ולהתסיס בעדינות ב 10 סל"ד לילה בטמפרטורת החדר.
- להטביע את הדגימות בהטבעת כמוסות עם שרף אפוקסי טרי ולרפא את הדגימות בתנור ב 65 מעלות צלזיוס לילה.
- אולטרה מיקרוטומיה
- חותכים גס את בלוקי הדגימה תחת מיקרוסקופ לנתח את הכיוון הנכון.
- חותכים דק את הקוביות הקצוצות ב גסות עם סכין זכוכית על אולטרה מיקרוטומה כדי להשיג משטחים חלקים.
- הכן קטעים דקים במיוחד של 70 ננ"מ מהבלוקים הקצוצים היטב עם סכין יהלום. אחזר את החלקים האולטרה-דקים עם רשתות נחושת עם 200 רשתות נחושת מצופה פחמן.
- מכתים את החלקים האולטרה דקים המכילים רשתות עם אצטט אורניל רווי שהוכן ב-H 2 Oמזוקקכפול במשך 30 דקות ושטוף את הרשתות 3 פעמים עם H2O מזוקק כפול (10 דקות לכל שטיפה).
- יתר על כן, בניגוד לסעיפים האולטרה דקים עם ציטראט עופרת של ריינולד19 (2.5%) במשך 5 דקות ולשטוף עם Hמבושל 2O מקורר מראש לטמפרטורת החדר 3 פעמים (10 דקות עבור כל שטיפה). לשים כמה כדורי נתרן הידרוקסיד סביב אזור ההכתמה כדי למנועמשקעים CO 2 על המקטעים.
- שים לב לחלקים האולטרה-דקים של TEM ב-70 kV.
6. התכווצות שרירים וטיפול בקורה
- כדי להפעיל את התכווצות myotube, להוסיף 25 mM CaCl2 במדיום תרבות בשלב 2.3. התנועה של myotubes ניתן לצפות ב 1\u20122 דקות.
- מניחים את צלחת 6-באר על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. להקליט סרט של התכווצות myotube על ידי מיקרוסקופיה תא חי.
- כדי לעצור את התכווצות myotube, להוסיף curare למדיום התרבות (300 ng/mL). לאחר מכן להקליט את הסרט כצעד 6.2.
- פתח את קובץ הסרט באמצעות תוכנת ניתוח וקטור תנועה ולאחר מכן לחץ על לחצן ניתוח תנועה כדי לנתח את הסרט.
הערה: התכווצות myotubes מוצגת כגרפיקת תנועת זמן. הסרטים מקודדים בצבע כדי להראות את מהירות התנועה של myotubes. האותות הנצנוץ המקודדים בצבע מצביעים על התנועות של מיוטובים שבהם הצבע האדום מציג את מהירות התנועה המהירה ביותר והצבע הכחול מציג את מהירות התנועה האיטית ביותר.
Representative Results
באמצעות אסטרטגיית הבידול שלנו, התרבות הראתה רכיבים לפני ופוסט-סינפטיים של ה-NMJ ביום ה-30. רכיבי NMJ היו מושרה ומפותחים היטב בבאר אחת, ומורפולוגיה שלהם ומיקומים בNMJ הפגינו על ידי מיקרוסקופ IF(איור 1). תרשים הזרימה באיון 1A מסכם את מסלול הזמן של התקדמות הבידול של NMJ. הכתמים של neurofilaments (NF), שלוק סינפטי (SV2) ו AChR(איור 1B,C) מצביעיםעל הנוירונים. תמונות הכתמים יחיד של NF ו- SV2 מוצגים דמות משלימה 1. כתמי אלפא-bungarotoxin מציין AChR(איור 1C). התמונה הממוזגת מציגה את המיקומים היחסיים של נוירון מוטורי ו- AChR ב- NMJ (איור 1D,E). הסט השני של כתמי IF מציין את הנוירון המוטורי על ידי Tuj1 ואיון 1 (איור 1G,H) ו myotubes פוסט סינפטי על ידי שרשרת מיויסין כבד(איור 1I). תאי Schwann סומנו גם על ידי נוגדן S-100 בתרבות NMJ(דמות משלימה 2).
כדי לאשר עוד יותר את זהות רכיבי NMJ, השתמשנו ב- SEM לניתוח מורפולוגי מפורט. מורפולוגיה בוגרת של NMJ עם מסופי אקסון מורחבים, אקסונים וסיבי שריר מוצגים באות 2A,B. TEM בוצע כדי לחשוף את ultrastructure הבוגר של רכיבי NMJ כולל מסוף האקסון טרום סינפטי עם שלוק סינפטי ואת החלק שלאחר סינפטי, אשר מופרד על ידי שסוע סינפטי (איור 2C \u2012E). קפלים צומתיים מצוינים על ידי הקו המקוומק הצהוב, אשר מסמן את הצומת של הנוירון וסיבי שריר(איור 2C). מסופי האקסון הבוגרים המכילים שלוק סינפטי מוצגים באיור 2D,E (חצים צהובים). התוצאות המורפולוגיות מראות שרכיבי NMJ היו מושרה היטב והבשיל.
כדי להעריך את הפונקציה של המבחנה NMJ, ביצענו ניתוח תנועה על ידי גירוי הנוירון המוטורי עם CaCl2 כדי לעורר התכווצויות myotube. התוצאות הראו כי Ca2+ יכול לעורר התכווצויות שרירים. הצירים יכולים להיות מופרעים על ידי curare. ה-NMJ הראה אותות תנועה בולטים שנעלמו עם טיפול בקורה (איור 3). אפקט זה מאשר כי אותות נוירון מוטוריים שודרו דרך NMJ כדי לעורר התכווצות שרירים. יחד, נתוני IF, SEM ו- TEM הדגימו את ההתפלגות המרחבית, המורפולוגיה והבגרות של רכיבי NMJ במבחנה NMJ שנוצרה על-ידי הפרוטוקול המתואר לעיל. ניתוח תנועה אימת את הפונקציה של המבחנה NMJ, אשר מרמז על היישום הפוטנציאלי שלה לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
איור 1: תרשים זרימה עבור אינדוקציה NMJ ותמונות IF של תרבות NMJ. (A) תרשים זרימה עבור התקדמות הבידול של NMJ. אני לא יודע אםאני יכול לעשות את זה. זיהוי רכיבי NMJ, neurofilaments (NF), שלוק סינפטי (SV2) ו- AChR. החצים הלבנים בלוח ד' מציינים את ה-NMJ. אני לא יודע אם אני יכול לעשותאת זה. רכיבים טרום-פוסט-סינפטיים של ה-NMJ. Tuj1 ו Islet1 מצביעים על הנוירון המוטורי, ושרשרת מיוסין כבדה (MYH) מציין myotube. איי-בי-טי-אקס, אלפא-בונגארוטוקסין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות SEM ו- TEM של NMJ בוגר. (א)ההתפלגות המרחבית של רכיבי NMJ מראה את מסוף האקסון המעוגן על פני השטח של סיבי השריר (Mf). (ב)הגדלה גבוהה יותר של NMJ מראה את מסופי האקסון. (ג)מבנה האולטרה של NMJ בוגר עם מסוף אקסון טרום סינפטי (ראשי חץ אדומים) וספסיות סינפטיות (Sv), שסוה סינפטית (Sc) וחלקים פוסט-סינפטיים (חצים אדומים). קפלים צומתיים (jf) מצוינים על ידי הקו המקוומק הצהוב. אקס, אקסון. (D, E) אני לא יודע אם אני יכול לעשות אתזה. תמונות ההגדלה הגבוהות מציגות את שלוק הסינטי במסופי axon (חצים צהובים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ניתוח התכווצות מיוטוב של במבחנה NMJ. התכווצות Myotubes הופעלו עם 25 mM CaCl2 פתרון (קו ירוק). הצירים היו מעוכבים לאחר שטופלו בקורה (קו צהוב). נא גם לראות סרט משלים 1 וסרט משלים 2. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
סרט משלים 1: התכווצות myotubes מופעל על ידי Ca++. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
סרט משלים 2: ההתכווצות החלשה הרבה יותר של myotubes לאחר טיפול curare מוצג. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
דמות משלימה 1: תמונות כתמים יחיד של neurofilaments (NF, חצים לבנים) בתרבות NMJ. תמונות מכתימות יחיד של שלל סינפטי (SV2, חצים לבנים) בתרבות NMJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
איור משלים 2: תאי Schwann המסויגים על ידי נוגדן S-100 בתרבות NMJ. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
| מדיום בינוי מיוגנית (MDM) | מ.מ.מ.אלפא | 500 מ"ל |
| 100 מ' 2-ME | 1117μL | |
| דוקסיציקלין | 1μg/ מ"ל | |
| קסם KSR | 56 מ"ל (סופי עד 10%) | |
| עט/סטרפטוקוקוס | 2.5 מיליון דולר | |
| הכולל | 560 מ"ל | |
| 100 מ' 2-מרקפטואתנול | 2-מרקפטואתנול | 7μL |
| ד.ד. מים | בת אל-דר-מן | |
| הכולל | 1000μL | |
| NMJ בינוני | מדיום נוירו-בסל (NB) | 500 מ"ל |
| B27 (100) | 1x (מלאי ב 50x) | |
| BDNF (1199) | 10ng/מ"ל | |
| ג'י.די.אף.אף | 10ng/מ"ל | |
| N2 (10) | 1x (מלאי ב 100x) | |
| NT3 (NT3) | 10ng/מ"ל | |
| עט/סטרפטוקוקוס | 2.5 מיליון דולר | |
טבלה 1: נוסחה של מדיום.
Discussion
מחקרים קודמים דיווחו על שיטות להיווצרות NMJ במבחנה עם שיטות מתוחכמות הדורשות תרבותארוכת טווח 8,10,12,13,20. הישגים אלה מובילים את ההתקדמות של המבחנה NMJ. עם זאת, המתודולוגיות המסובכות הפריעו לגישה של מחקרי NMJ. הפרוטוקול שלנו מונע מתרבות מפעולה כדי ליצור NMJs ביעילות ובחזקה בבאר אחת. שלושה סוגי תאים בNMJ נצפו במערכת האינדוקציה שלנו, כולל myotubes, נוירונים מוטוריים ותאי Schwann18. בנוסף, מורפולוגיה בוגרת ותפקוד אומתו.
בהתבסס על המחקר הקודם שלנו, צפיפות התא הראשונית היא גורם קריטי להיווצרות NMJ, צפיפויות תאים שונות לגרום למספרים שונים של NMJsבתרבות 18. צפיפות תאים נמוכה (< 1 x 104/cm2) גרמהלמספר נמוך של נוירונים, דבר שלילי להיווצרות NMJ. למרות שזה ייקח הרבה יותר זמן ומשאבים כדי להכין צפיפות גבוהה יותר של תאים (> 1 x 105/cm2),אנו ממליצים כי צפיפות התא תהיה בין 1.5 x 104/cm2 ו 5 x 104/cm2 באמצעות הפרוטוקול שלנו. NMJ שנוצר על ידי פרוטוקול זה היא רקמה הטרוגנית עם סוגי תאים מרובים אשר קרוב יותר לחקות תנאים פיזיולוגיים. myotubes נמצאים להפיץ באופן שווה על צלחת תרבות אבל הנוירונים המוטוריים מופיעים באופן אקראי, אשר התופעה גורמת להפצה לא אחידה של NMJs בתרבות. NMJ זה מתאים מחקרים איכותיים במקום הניתוח הדורש מערכות תרבות הומוגנית. השתמשנו גם קווי תא אחרים, eq., H9 (קו תא ES)18 ו- A11 (קו תא iPS, נתונים לא מוצגים) כדי ליצור NMJ על-ידי פרוטוקול זה. NMJ יכול להיווצר בהצלחה מורפולוגיה ופונקציה. מצב התרבות, בכל זאת, צריך להיות אופטימיזציה עבור קווי תא שונים.
התכווצות myotubes מופעל כימית ועיכוב תלוי curare אישר כי שלנו במבחנה NMJ היה פונקציונלי, יכול להיות מיושם פוטנציאלית עבור בדיקות מעשיות. התכווצויות שרירים ספונטניות נצפו באופן אקראי ב 3\u20124 שבועות של תרבות, אבל זה יכול להימנע על ידי הארכת זמן התרבות עדחודשיים 18.
אסטרטגיות שונות פורסמו ליצירת במבחנה NMJ של שלבי התבגרות שונים, אבל המבחנה NMJ שנוצר במערכת שלנו הראה את הבגרות המשמעותית, כפי שאנו יכולים לצפות המעבר של גמא כדי אפסילון יחידות של AChR במהלךהתרבות 18. בגרות היא שיקול חשוב עבור מידול מחלה עם במבחנה NMJ21. לסיכום, במבחנה NMJ עם רכיבים מבניים משולבים, בגרות ותפקוד הוא שימוש פוטנציאלי לפיתוח טיפולי.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד"ר Sakurai על מתן 201B7MYOD. מחקר מיקרוסקופאלקטרונים נתמך על ידי קייקו אוקמוטו-פורוטה ו Haruyasu Kohda (החטיבה של מחקר מיקרוסקופי אלקטרונים, המרכז ללימודים אנטומיים, בוגר בית הספר לרפואה, אוניברסיטת קיוטו). הנוגדן החד-קלוני פותח על ידי אוניברסיטת HHMI/Columbia, שהתקבלה מבנק Hybridoma למחקרים התפתחותיים, שנוצר על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של ה-NIH, והתחזק במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת איווה. אנו מודים גם לשיורי אושימה, קזוהירו נאקגאווה ואריקו מטסוי על ניתוח וקטור התנועה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהחברה יפן לקידום המדע KAKENHI, מספרי מענקים 16H05352 ו 20H03642 (לח"כים); קרן מחקר תאי iPS (ל-CYL וח"כים); קרן מוכידה לחקר הרפואה והתרופות (לח"כים); הקרן למדע תקדה (לח"כים); ומענק מהתוכנית לחקר מחלות בלתי הפיכות תוך שימוש בתאי iPS ספציפיים למחלות, אשר נעזר הסוכנות יפן למחקר ופיתוח רפואי (17935400 ל CYL וח"כים, ו 17935423 לח"כים).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W.
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H.
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
