Summary
هنا نقدم بروتوكول لتوليد NMJs في المختبر من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs). يمكن أن تحفز هذه الطريقة NMJs مع مورفولوجيا ناضجة وظيفة في 1 شهر في بئر واحد. ويمكن استخدام NMJs الناتجة عن ذلك لنموذج الأمراض ذات الصلة، لدراسة الآليات المرضية أو لفحص مركبات المخدرات للعلاج.
Abstract
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك المتخصص الذي ينقل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحركية إلى العضلات الهيكلية للحركة الميكانيكية. الهندسة المعمارية للبنية NMJ يؤثر على وظائف الخلايا العصبية، والعضلات والتفاعل المتبادل. وقد أبلغت الدراسات السابقة العديد من الاستراتيجيات من خلال المشاركة في زراعة الخلايا العصبية الحركية وميوتوب لتوليد NMJ في المختبر مع عملية تحريض معقدة وفترة ثقافة طويلة ولكن ناضلت لتكخيص مورفولوجيا NMJ ناضجة والوظيفة. تم بناء نظامنا التعريفي NMJ في المختبر عن طريق التمييز بين iPSC البشري في طبق ثقافة واحد. عن طريق تبديل وسيط التعريفي ميوجيني وعصبية للتحريض، و NMJ الناتجة تحتوي على مكونات ما قبل وما بعد متشابك، بما في ذلك الخلايا العصبية الحركية، والعضلات والهيكل العظمي وخلايا شوان في ثقافة شهر واحد. كما أظهرت الفحص الوظيفي لـ NMJ أن انكماش اليوتوب يمكن أن يسببه Ca++ ثم يمنعه كوراري، وهو مثبط مستقبلات أستيل (AChR)، حيث تنتقل الإشارة المحفزة عبر NMJ. هذا النهج البسيط والقوي نجح في استخلاص الهيكل المعقد لـ NMJ مع الاتصال الوظيفي. هذا في المختبر NMJ الإنسان، مع هياكلها المتكاملة ووظيفتها، لديه إمكانات واعدة لدراسة الآليات المرضية والفحص المركب.
Introduction
تقاطع العصبية العضلية (NMJ) هو المشبك المتخصصة التي تنقل إشارات من الخلايا العصبية الحركية إلى عضلات الهيكل العظمي للسيطرة على حركة العضلات الطوعية1,2. يتكون هذا المشبك من أجزاء ما قبل وما بعد متشابك. في الجزء قبل متشابك, الخلايا العصبية الحركية النشرات أستيل (ACh) من vesicles متشابك بواسطة exocytosis. يتم تحرير ACh من الفيليات متشابك لعبور الشق متشابك وربط ل AChR على جزء ما بعد متشابك لتحريك العمل المحتملة لانكماش العضلات3,4. أي خلل في هذا الهيكل الدقيق يمكن أن يسبب أمراض NMJ ، بما في ذلك ضمور العضلات الشوكي (SMA) ، والمتلازمات الوهنائي الخلقية (CMS) ، الوهن العضلي العضلي الوبيل (MG)5،6،7، إلخ. هذه الأمراض تلحق ضررا كبيرا بنوعية حياة المرضى وللأسف ليس لديها نهج العلاج الفعال بسبب عدم فهم الآلية المرضية. في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى توليد في المختبر NMJ الإنسان من iPSCs الإنسان لنمس النمذجة المرض دقيقة وللفحص المركبات العلاجية.
وقد أظهرت الدراسات السابقة إمكانية توليد NMJ في المختبر من خلال استراتيجيات الثقافة المشتركة. يتم إنشاء الخلايا العصبية الحركية وتيوبات الهيكل العظمي على التوالي. يمكن توليد نوعين من الخلايا من الثقافات البشرية أو الماوس الأنسجة الأولية أو أن يكون مستحثا من الخلايا الجذعية8,9,10,11 ومن ثم شارك في تربية تشكيل NMJ. وتشمل التطبيقات الأخرى دمج NMJ المشتركة في الثقافة في أجهزة microfluidic 3D واستخدام وحدات optogenetic لقاسم قابل للقياس الكميوظيفية 12,13. ومع ذلك، هذه الاستراتيجيات تأخذ فترة طويلة الثقافة وتتطلب النضال من أجل الحصول على المكونات الأساسية ل NMJ، إما الخلايا العصبية الحركية أو الهيكل العظمي myotube في وقت واحد. ومع ذلك، لا يمكن إنشاء مكون هام آخر من مكونات NMJ، وهو خلية شوان، في هذه النظم الثقافية. نظام الثقافة المتقدمة التي تحتوي على ميوتوب, الخلايا العصبية الحركية وخلية شوان هو مرغوب فيه كما أنه يمكن أن تقدم نموذجا موثوقا وقويا للدراسات NMJ.
تمايز ميوجيني 1 (MYOD1) هو منظم ميوجينيك المعروفة لesiogenesi14. تم بناء طريقة التمايز الميوجينية الفعالة التي طبقت MYOD1 لدفع iPSC في myotubes في دراسة سابقة15. ولذلك، نحن مستحثة myotubes عن طريق overexpressing MYOD1 في iPSCs15، وظهرت كفاءة عالية من التمايز الميوجين. ومن المثير للاهتمام، ظهرت الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع myotubes تلقائيا بعد اليوم 10. وقد أدى ظهور الخلايا العصبية في الثقافة ميوجيني لنا لتطوير استراتيجية لتوليد NMJ في المختبر في طبق واحد. هنا نقدم استراتيجية لتوليد NMJs عن طريق overexing MYOD1 في iPSCs الإنسان لتحريض الخلايا العصبية الحركية وميوجيني في طبق الثقافة نفسها. يتم حث الخلايا العصبية الحركية تلقائيا مع العديد من العوامل العصبية (GDNF، BDNF، NT3، الخ.) 8، وفي الوقت نفسه ، يمكن أيضا أن تكون الخلايا Schwann الناجمة16،17. من خلال التفاعلات بين ميوتوبس, الخلايا العصبية الحركية وخلايا Schwann, يتم تشكيل NMJ ناضجة18. يمكن لهذه الطريقة توليد NMJ وظيفية بكفاءة، مما يتيح الدراسة المحتملة للآليات المرضية وفحص المركبات العلاجية.
Protocol
1. إعداد مصفوفة خارج الخلية (ECM) لوحات المغلفة
- تخفيف ECM (انظر جدول المواد)مع الجليد البارد 1X PBS إلى تركيز نهائي من 2٪.
- إضافة 1 مل من ECM إلى 49 مل من 1X PBS في أنبوب بلاستيكي 50 مل. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
- وضع 1 يغطي في كل بئر من لوحة 6-جيدا. إضافة 1.5 مل من 2٪ ECM في كل بئر.
- احتضان لوحة البئر مع 2٪ ECM لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
- استلهم ECM من لوحة البئر وتخزين لوحة في 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2- تمايز مراكز iPSCs تجاه NMJ
- البذور 4 × 105 من iPSCs في بئر على لوحة 6-آبار المعدة في القسم 1. تأكد من أن البذور الخلايا على غطاء قبل المودعة في البئر.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام خط الخلية 201B7MYOD iPS، هدية من مختبر الدكتور ساكراي،15.- إزالة المتوسطة من iPSCs على طبق ثقافة 6 سم وغسل iPSCs مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 1 مل من حل مفرزة الخلية إلى الطبق واحتضان لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- إضافة 3 مل من الرئيسيات الجذعية الجنينية (ES) خلية المتوسطة إلى الطبق والميصة 3 مرات بلطف.
- جمع ناظر، الذي يحتوي على iPSCs منفصلة، في أنبوب بلاستيكية 50 مل والطرد المركزي في 160 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- التعرق بعناية، resuspend iPSCs في 3 مل الرئيسيات ES خلية المتوسطة مع 10 μM Y27632، وعد رقم الخلية باستخدام مقياس الهيموزيت.
- تخفيف iPSCs مع الرئيسيات ES خلية المتوسطة و 10 μM Y27632 إلى تركيز 2 × 105 خلايا / مل. إضافة 2 مل من iPSCs على الغطاء المودعة مسبقا في البئر الذي هو موضح في القسم 1.
- إدخال iPSCs إلى NMJ
- في اليوم 1، 24 ح بعد بذر iPSCs إلى لوحة 6-well، وإزالة المتوسطة الثقافة واستبداله مع 2 مل من الرئيسيات الطازجة خلية ES المتوسطة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دوكسيسكلين لكل بئر.
- تغيير المتوسطة مع 2 مل من تمايز ميوجيني المتوسطة (MDM)(الجدول 1)تحتوي على 1 ميكروغرام / مل دوكسيسيكلين (التركيز النهائي) لكل بئر. قم بتحديث الوسط كل يوم من اليوم الثاني إلى اليوم العاشر.
- من اليوم 11، التبديل متوسط إلى 2 مل من المتوسط NMJ(الجدول 1)إلى كل بئر. قم بتحديث الوسط كل 3\u20124 يوماً بعد ذلك حتى اليوم 30.
- مراقبة NMJ متمايزة عن طريق المجهر المرحلة المقلوبة في اليوم 30. ويمكن استخدام NMJ للتحليل التالي.
3. تلطّخ الفلوروس المناعي (IF)
- في اليوم 30، الطامح المتوسطة الثقافة من لوحة 6-جيدا. إصلاح ثقافة NMJ بإضافة 2 مل من 4٪ شبهformaldehyde إلى كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل العينات 3 مرات عن طريق إضافة 2 مل من 1x PBS لكل بئر (3 دقائق لكل غسل).
- Permeabilize العينات مع 0.1٪ تريتون / برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- كرر الخطوة 3.2.
- كتلة العينات مع 0.5٪ BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- كرر الخطوة 3.2.
- احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. التخفيف من الأجسام المضادة هو على النحو التالي: جزيرة 1 (1 ميكروغرام / مل), سلسلة الميوسين الثقيلة (MYH) (1/300), الليفية العصبية (NF) (1 μg /مل), S-100 (1/300), بروتين vesicle متشابك 2 (SV2) (1 ميكروغرام /مل), Tuj1 (1/1000).
- كرر الخطوة 3.2.
- احتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. تركيز الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هو كما يلي: IgG 488 المضادة للماوس مترافق (0.1 ميكروغرام / مل)، المضادة للأرانب IgG 488 مترافق (0.1 ميكروغرام / مل).
- كرر الخطوة 3.2.
- احتضان العينات مع aBTX-647 (0.5 ميكروغرام / مل) لتشوطي AChR ومع DAPI (1 ميكروغرام / مل) لتلطيب النواة.
- كرر الخطوة 3.2.
- التقاط غطاء مع زوج من ملقط من لوحة 6-well واركبه في محلول 50٪ جليسرول/برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر.
4. المسح المجهري الإلكتروني (SEM)
- إصلاح ثقافة NMJ مع 4٪ شبهformaldehyde و 1٪ glutaraldehyde أعدت في 0.1 M البوتاسيوم الفوسفات العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- اغسل العينات 3 مرات عن طريق غمرها في 0.1 M فوسفات البوتاسيوم العازلة في درجة حرارة الغرفة (10 دقيقة لكل غسل).
- تجفيف العينات مع تركيزات تصاعدية من الإيثانول (50٪، 70٪، 90٪، 95٪ و 100٪ مرتين). تزج العينات في كل تركيز الإيثانول لمدة 10 دقيقة.
- تجفيف العينات بواسطة مجفف نقطة حرجة (-30 درجة مئوية، 0.1 تور).
- معطف العينات مع Pt (البلاتين) أيون المعطف (30 mA لمدة 3 دقائق; سمك Pt حوالي 20 نانومتر).
- مراقبة العينات بواسطة SEM في 5 كيلو فولت.
5. نقل المجهر الإلكتروني (TEM)
- استخدام مكشطة الخلية لحصاد الأنسجة من لوحة ثقافة NMJ. شكل الأنسجة في بيليه صغيرة (3 مم3) مع شفرة الحلاقة والغراء عن طريق هلام لتشكيل قطعة هلام ملفوفة. إصلاح قطعة هلام ملفوفة مع 2٪ شبهformaldehyde و 2٪ الجلوتارالديهيد أعدت في 0.1 M البوتاسيوم الفوسفات العازلة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- غسل العينات 3 مرات عن طريق غمرها في 0.1 M البوتاسيوم الفوسفات العازلة (15 دقيقة لكل غسل) في درجة حرارة الغرفة.
- Postfix العينات مع 1٪ أوسميوم تتروكسيد أعدت في مزدوجة المقطرة H2O لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائي. - كرر الخطوة 5.2.
- تجفيف العينات مع تركيزات تصاعدية من الإيثانول (50٪، 70٪، 90٪، 95٪ و 100٪ مرتين). تزج العينات في كل تركيز الإيثانول لمدة 10 دقيقة.
- التعرق الإيثانول 100٪ التسلل إلى العينات مع ارتفاع نسب حجم راتنج الايبوكسي إلى 100٪ من خليط الإيثانول (1:3، 1:1 و 3:1). تهيج كل خليط بلطف عند 10 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- استبدال خليط الايبوكسي الإيثانول مع الراتنج الايبوكسي النقي وتهيج بلطف في 10 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 4 ح، تحديث راتنج الايبوكسي مع راتنج الايبوكسي الطازجة وتهيج بلطف في 10 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تضمين العينات في كبسولات تضمين مع راتنج الايبوكسي الطازجة وعلاج العينات في فرن في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- استئصال فائقة
- تقليم بشكى كتل العينة تحت مجهر تشريح للاتجاه الصحيح.
- تقليم ناعما كتل قلصت بخيل مع سكين زجاجي على ultramicrotome للحصول على أسطح ناعمة.
- إعداد 70 نانومتر مقاطع فائقة من كتل مشذبة جيدا مع سكين الماس. استرداد المقاطع فائقة مع 200 شبكة الشبكات الكربونية- الشبكات المغلفة بالفرن النحاس.
- وصمة عار المقاطع فائقة التي تحتوي على شبكات مع خلات الأورانيل المشبعة أعدت في مزدوجة المقطر H2O لمدة 30 دقيقة وغسل الشبكات 3 مرات مع مزدوجة المقطر H2O (10 دقيقة لكل غسل).
- علاوة على ذلك، على النقيض من الأقسام فائقة الوثينة مع سيترات الرصاص رينولد19 (2.5٪) لمدة 5 دقائق واغسل مع H2مغلي O تبريدها مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة 3 مرات (10 دقيقة لكل غسل). وضع العديد من الكريات هيدروكسيد الصوديوم حول منطقة تلطيخ لمنع CO2 هطول الأمطار على الأقسام.
- مراقبة أقسام ultrathin بواسطة TEM في 70 كيلو فولت.
6. تقلص العضلات والعلاج curare
- لتحريك تقلص myotube، إضافة 25 mM CaCl2 في الوسط ثقافة في الخطوة 2.3. يمكن ملاحظة حركة الالوبس في 1\u20122 دقيقة.
- ضع لوحة 6-جيدا على خشبة المسرح من المجهر المقلوب. تسجيل فيلم من تقلص myotube عن طريق المجهر الخلية الحية.
- لوقف انكماش myotube، إضافة كوراري إلى الوسط الثقافة (300 نانوغرام / مل). ثم تسجيل الفيلم كخطوة 6.2.
- افتح ملف الفيلم مع برنامج تحليل ناقلات الحركة ثم انقر فوق الزر تحليل الحركة لتحليل الفيلم.
ملاحظة: يظهر تقلص myotubes كرسومة حركة الوقت. يتم ترميز الأفلام بالألوان لإظهار سرعة حركة ميوتوب. تشير الإشارات المتألقة المرمزة بالألوان إلى حركات الالوتوب حيث يظهر اللون الأحمر سرعة الحركة الأسرع واللون الأزرق يظهر أبطأ سرعة حركة.
Representative Results
باستخدام استراتيجيتنا التمايزية، أظهرت الثقافة مكونات ما قبل وما بعد متشابك من NMJ في اليوم 30. وقد تم تحريض مكونات NMJ وتطويرها بشكل جيد في بئر واحد ، وتجلت مورفولوجيا ومواقعها في NMJ بواسطة المجهر IF(الشكل 1). يلخص مخطط التدفق في الشكل 1A المسار الزمني لتقدم تمايز NMJ. تلطيخ من النفوية العصبية (NF)، vesicles متشابك (SV2) و AChR(الشكل 1B, C)تشير إلى الخلايا العصبية. يتم عرض الصور تلطيخ واحد من NF و SV2 في الشكل التكميلي 1. ألفا bungarotoxin تلطيخ يشير إلى AChR (الشكل 1C). الصورة المدمجة يظهر المواقع النسبية من الخلايا العصبية الحركية و ACHR في NMJ (الشكل 1D, E). المجموعة الثانية من تلطيخ IF يشير إلى الخلايا العصبية الحركية من قبل Tuj1 و جزيرة 1(الشكل 1G, H)وما بعد متشابك myotubes بواسطة سلسلة ديوسين الثقيلة(الشكل 1I). كما وصفت الخلايا شوان من قبل S-100 الأجسام المضادة في ثقافة NMJ(الشكل التكميلي 2).
وللتأكد من هويات مكونات NMJ، استخدمنا SEM للتحليل المورفولوجي التفصيلي. تظهر مورفولوجيا NMJ الناضجة مع محطات محور عصبي موسعة ومحور عصبي وألياف العضلات في الشكل 2A،B. تم تنفيذ TEM للكشف عن البنية الفائقة الناضجة لمكونات NMJ بما في ذلك محطة المحور العصبي قبل مع vesicles متشابك والجزء ما بعد متشابك، والذي يفصله الشق متشابك(الشكل 2C\u2012E). يشار إلى طيات تقاطعية من قبل خط صفراء متقطعة، الذي يمثل تقاطع الخلايا العصبية وألياف العضلات (الشكل 2C). وتظهر محطات محور عصبي ناضجة التي تحتوي على vesicles متشابك في الشكل 2D،E (الأسهم الصفراء). تظهر النتائج المورفولوجية أن مكونات NMJ كانت مستحثة بشكل جيد ونضجت.
لتقييم وظيفة NMJ في المختبر, قمنا بإجراء تحليل الحركة عن طريق تحفيز الخلايا العصبية الحركية مع CaCl2 لتحريك تقلصات myotube. وأظهرت النتائج أن كاليفورنيا2 + يمكن أن تؤدي إلى تقلصات العضلات. يمكن أن توقف الانقباضات من قبل كوراري. وأظهرت NMJ إشارات الحركة البارزة التي اختفت مع العلاج curare (الشكل 3). ويؤكد هذا التأثير أن إشارات الخلايا العصبية الحركية كانت تنتقل من خلال NMJ لتحريك تقلص العضلات. وقد أظهرت بيانات المجهر IF و SEM وTEM معاً التوزيع المكاني والمورفولوجيا ونضج مكونات NMJ في NMJ في المختبرات التي تم إنشاؤها بواسطة البروتوكول الموصوف أعلاه. تحليل الحركة التحقق من صحة وظيفة NMJ في المختبر، والذي يعني تطبيقه المحتملة لتطوير استراتيجيات علاجية.
الشكل 1: مخطط تدفق لـ NMJ التعريفي وIF صور لثقافة NMJ. (أ) مخطط انسيابي لتقدم تمايز NMJ. (B\u2012F) الكشف عن مكونات NMJ، الليفية العصبية (NF)، vesicles متشابك (SV2) و AChR. الأسهم البيضاء في اللوحة D تشير إلى NMJ. (G\u2012K) قبل وما بعد المكونات متشابك من NMJ. Tuj1 و Islet1 تشير إلى الخلايا العصبية الحركية، وسلسلة الميوسين الثقيلة (MYH) يشير إلى myotube. أ-BTX، ألفا-bungarotoxin. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: SEM و TEM صور من NMJ ناضجة. (أ)يظهر التوزيع المكاني لمكونات NMJ محطة محور عصبي راسية على سطح الألياف العضلية (Mf). (ب) ارتفاع التكبير NMJ يظهر محطات محور عصبي. (C) البنية الفائقة لـ NMJ الناضجة مع محطة محور عصبي قبل متشابك (رؤوس الأسهم الحمراء) والهياج متشابك (Sv) ، والشقوق متشابك (Sc) وأجزاء ما بعد متشابك (السهام الحمراء). الطيات الملتقى (jf) يشار إليها من قبل خط متقطع أصفر. أكس، محور عصبي. (D, E) تظهر صور التكبير العالية الهرجة المتشابكة في محطات المحاور (الأسهم الصفراء). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Myotubes تحليل تقلص NMJ في المختبر. وقد أثار انكماش Myotubes مع 25 mM CaCl2 حل (الخط الأخضر). تم تثبيط الانقباضات بعد علاجها بالـ كوراري (الخط الأصفر). يرجى أيضا الاطلاع على الفيلم التكميلي 1 والفيلم التكميلي 2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيلم تكميلي 1: انكماش myotubes التي أثارها Ca++. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيلم تكميلي 2: يظهر تقلص أضعف بكثير من myotubes بعد العلاج curare. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
الشكل التكميلي 1: الصور تلطيخ واحد من الاعصاب (NF، السهام البيضاء) في ثقافة NMJ. صور تلطيخ واحد من الهفوات متشابك (SV2، السهام البيضاء) في ثقافة NMJ. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
الشكل التكميلي 2: خلايا شوان التي تحمل اسم الأجسام المضادة S-100 في ثقافة NMJ. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.
| متوسط تمايز ميوجيني (MDM) | مي إم-ألفا | 500 مل |
| 100mM 2-ME | 1117μL | |
| الدوكسيسيكلين | 1μg / مل | |
| KSR | 56 مل (نهائي إلى 10%) | |
| القلم / بكتيريا | 2.5 مل | |
| مجموع | 560 مل | |
| 100m 2-ميركابتول | 2-ميركابتاتول | 7μL |
| d.d. المياه | 993μL | |
| مجموع | 1000μL | |
| NMJ المتوسطة | متوسطة عصبية (NB) | 500 مل |
| B27 | 1x (الأسهم في 50x) | |
| BDNF | 10ng/mL | |
| GDNF | 10ng/mL | |
| N2 | 1x (الأسهم في 100x) | |
| NT3 | 10ng/mL | |
| القلم / بكتيريا | 2.5 مل | |
الجدول 1: صيغة المتوسط.
Discussion
وقد أفادت الدراسات السابقة أساليب تشكيل NMJ في المختبر مع أساليب متطورة تتطلب ثقافة طويلة الأجل8,10,12,13,20. هذه الإنجازات تؤدي إلى التقدم في المختبر NMJ. ومع ذلك، أعاقت المنهجيات المعقدة الوصول إلى دراسات الجهاز الوطني لجمهورية أقليات. بروتوكولنا يتجنب الثقافة المشتركة لتوليد NMJs بكفاءة وقوة في بئر واحدة. وقد لوحظت ثلاثة أنواع الخلايا في NMJ في نظام الحث لدينا, بما في ذلك ميوتيوب, الخلايا العصبية الحركية وخلايا Schwann18. وبالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من مورفولوجيا ناضجة وظيفة.
استنادا إلى دراستنا السابقة، وكثافة الخلايا الأولية هو عامل حاسم لتشكيل NMJ، وكثافات الخلايا المختلفة تحفز أعداد مختلفة من NMJs في ثقافة18. تسبب كثافة الخلايا المنخفضة (< 1 × 104/ سم2) عددًا منخفضًا من الخلايا العصبية ، وهو غير موات لتشكيل NMJ. على الرغم من أن الأمر سيستغرق المزيد من الوقت والموارد لإعداد كثافة أعلى من الخلايا (> 1 × 105/ سم2)، نوصي بأن تكون كثافة الخلية بين 1.5 × 104/ سم2 و 5 × 104/ سم2 باستخدام بروتوكولنا. NMJ التي تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول هو نسيج غير متجانسة مع أنواع الخلايا المتعددة التي هي أقرب إلى محاكاة الظروف الفسيولوجية. تم العثور على myotubes لتوزيع بالتساوي على طبق الثقافة ولكن الخلايا العصبية الحركية تظهر بشكل عشوائي ، والتي تؤدي هذه الظاهرة إلى التوزيع غير المتكافئ ل NMJs في ثقافة. هذا الجهاز هو مناسبة للدراسات النوعية بدلا من التحليل الذي يتطلب نظم ثقافة متجانسة. كما استخدمنا خطوط الخلية الأخرى، eq.، H9 (ES خط الخلية)18 و A11 (خط الخلية iPS، لا تظهر البيانات) لتوليد NMJ بواسطة هذا البروتوكول. يمكن إنشاء NMJ بنجاح في مورفولوجيا ودالة. ومع ذلك، فإن حالة الثقافة تحتاج إلى تحسين خطوط الخلايا المختلفة.
وأكد انكماش اليوتيوب التي تسبب كيميائيا وتثبيط كوراري تعتمد على أن لدينا في المختبر NMJ كان وظيفيا ويمكن أن تطبق يحتمل أن تكون لتحاليل عملية. وقد لوحظ تقلصات العضلات عفوية عشوائيا في 3\u20124 أسابيع من الثقافة، ولكن يمكن تجنبها عن طريق تمديد الوقت الثقافة إلى ما دام شهرين18.
وقد نشرت استراتيجيات مختلفة لتوليد في المختبر NMJ مراحل نضوج مختلفة، ولكن NMJ في المختبر ولدت في نظامنا أظهرت النضج الكبير، كما يمكننا أن نلاحظ انتقال غاما إلى وحدات فرعية ابسيلون من AChR خلال الثقافة18. النضج هو اعتبار مهم للأمراض النمذجة مع NMJ في المختبر21. في الختام ، NMJ في المختبر مع مكونات هيكلية متكاملة ، والنضج وظيفة من الاستخدام المحتمل للتنمية العلاجية.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر الدكتور ساكراي على التكرم بتوفير 201B7MYOD. وقد دعم دراسة المجهر الإلكتروني كيكو أوكاموتو-فوروتا وهاروياسو كوهدا (شعبة الدراسة المجهرية الإلكترونية، مركز الدراسات التشريحية، كلية الدراسات العليا للطب، جامعة كيوتو). تم تطوير الجسم المضاد أحادي النسيلة من قبل جامعة HHMI/ كولومبيا ، تم الحصول عليها من بنك الدراسات التنموية الهجينة ، الذي أنشأه المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية في المعاهد القومية للصحة ، وحافظ عليه في قسم البيولوجيا ، جامعة أيوا. ونشكر أيضا شيوري أوشيما، وكازوهيرو ناكاغاوا، وإريكو ماتسوي على تحليل ناقلات الحركة. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI، وعدد المنح 16H05352 و 20H03642 (إلى MKS)؛ صندوق بحوث الخلايا iPS (إلى CYL وMKS)؛ مؤسسة موخيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية (إلى MKS)؛ مؤسسة تاكيدا للعلوم (إلى MKS)؛ و منحة من برنامج أبحاث الأمراض المستعصية باستخدام خلايا iPS الخاصة بالأمراض، والتي ساعدتها الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (17935400 إلى CYL و MKS، و 17935423 إلى MKS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium, growth factors and reagents | Item | Brand | Cat. Number |
| 2-mercaptoethanol | Nacalai tesque | 21418-42 | |
| B27, Gibco | Gibco | 12587-001 | |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD | |
| Cell detachment solution, Accumax | STEMCELL Technologies | #07921 | |
| Critical point dryer | Hitachi | ES-2030 | |
| Doxycycline | Takara | 631311 | |
| ECM, Matrigel (growth factor reduced) | Corning | 356230 | |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD | |
| Gelation, IP gel | Geno Staff | PG20-1 | |
| Ions coater | JEOL | JEC3000FC | |
| iPSC medium, mTeSR | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| KnockOut SR (KSR) | Gibco | 10828-028 | |
| live cell microscopy | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| MEM-alpha | Gibco | 12571-071 | |
| Motion vector analysis software | Sony | SI8000 | |
| N2, Gibco | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| NT3 | R & D Systems | 267-N3 | |
| Primate ES cell medium | ReproCell | RCHEMD001 | |
| SEM | Hitachi | S-4700 | |
| TEM | Hitachi | H7650 | |
| Y27632 | Wako Chemicals GmbH | 253-00513 | |
| Antibodies | Brand | Cat. Number | Dilutions |
| Molecular Probes | B3545 | 0.5 ug/ml | |
| Islet 1 | DSHB | 40.2D6 | 1/100 |
| Myosin heavy chain (MYH) | MilliporeSigma | A4.1025 | 1/300 |
| Neurofilaments (NF) | MilliporeSigma | MAB5254 | 1/500 |
| S-100 | Abcam | ab14849 | 1/300 |
| Synaptic vesicle protein 2 (SV2) | DSHB | SV2 | 1/50 |
| Tuj1 | Covance | MMS435P | 1/1000 |
References
- Hong, I. H. K., Etherington, S. J. Neuromuscular Junction. eLS. , John Wiley & Sons, Ltd. (2001).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W.
- Jones, R. A., et al. Cellular and Molecular Anatomy of the Human Neuromuscular Junction. Cell Reports. 21 (9), 2348-2356 (2017).
- Slater, C. R. The Structure of Human Neuromuscular Junctions: Some Unanswered Molecular Questions. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2183 (2017).
- Comley, L. H., Nijssen, J., Frost-Nylen, J., Hedlund, E. Cross-disease comparison of amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy reveals conservation of selective vulnerability but differential neuromuscular junction pathology. Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1424-1442 (2016).
- Shigemoto, K., et al. Muscle weakness and neuromuscular junctions in aging and disease. Geriatrics & Gerontology International. 10, 137-147 (2010).
- Abicht, A., Müller, J., Lochmüller, H.
- Faravelli, I., et al. Motor neuron derivation from human embryonic and induced pluripotent stem cells: experimental approaches and clinical perspectives. Stem Cell Research & Therapy. 5 (4), 87-100 (2014).
- Demestre, M., et al. Formation and characterisation of neuromuscular junctions between hiPSC derived motoneurons and myotubes. Stem Cell Research. 15 (2), 328-336 (2015).
- Yoshida, M., et al. Modeling the early phenotype at the neuromuscular junction of spinal muscular atrophy using patient-derived iPSCs. Stem Cell Reports. 4 (4), 561-568 (2015).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system for studying mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. 143 (13), 2464-2477 (2016).
- Uzel, S. G. M., et al. Microfluidic device for the formation of optically excitable, three-dimensional, compartmentalized motor units. Science Advances. 2 (8), 1501429 (2016).
- Santhanam, N., et al. Stem cell derived phenotypic human neuromuscular junction model for dose response evaluation of therapeutics. Biomaterials. 166, 64-78 (2018).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Tanaka, A., et al. Efficient and reproducible myogenic differentiation from human iPS cells: prospects for modeling Miyoshi Myopathy in vitro. PLoS One. 8 (4), 61540 (2013).
- Furlan, A., Adameyko, I. Schwann cell precursor: a neural crest cell in disguise. Developmental Biology. 444, 25-35 (2018).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Schwann Cell Precursors; Multipotent Glial Cells in Embryonic Nerves. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12 (69), (2019).
- Lin, C. Y., et al. iPSC-derived functional human neuromuscular junctions model the pathophysiology of neuromuscular diseases. JCI Insight. 4 (18), (2019).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Steinbeck, J. A., et al. Functional Connectivity under Optogenetic Control Allows Modeling of Human Neuromuscular Disease. Cell Stem Cell. 18 (1), 134-143 (2016).
- Bucchia, M., Merwin, S. J., Re, D. B., Kariya, S. Limitations and Challenges in Modeling Diseases Involving Spinal Motor Neuron Degeneration in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 61 (2018).
