Summary
Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронной смешанной балки, используемой в бор нейтронной терапии захвата (BNCT) не была полностью установлена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции в линиях раковых клеток толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.
Abstract
Целью рукописи является предоставление пошагового протокола для выполнения иммунофлуоресценции микроскопии для изучения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК, вызванного нейтронно-гамма-смешанным лучом, используемым в терапии захвата боров нейтронов (BNCT). В частности, предлагаемая методология применяется для обнаружения активации ремонтных белков, которые могут быть визуализированы как очаги с использованием антител, характерных для ДНК двойных разрывов (ДНК-DSBs). Очаги репарации ДНК были оценены иммунофлуоресценцией в раковых клетках толстой кишки (HCT-116) после облучения нейтронно-смешанным лучом. ДНК-DSBs являются наиболее генотоксических поражений и восстанавливаются в клетках млекопитающих двумя основными путями: нехомологичные пути конечного присоединения (NHEJ) и гомологичные ремонт рекомбинации (HRR). Частоты очагов, иммунохимически окрашенных, для широко используемых маркеров в радиобиологии, как q-H2AX, 53BP1 связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs. Было установлено, что фочи q-H2AX привлекают ремонтные белки, что приводит к более высокой концентрации факторов ремонта вблизи DSB. Для мониторинга повреждения ДНК на клеточном уровне был запланирован иммунофлуоресценциотический анализ на наличие репрезентативного протеинового очага ДНК-ПКК от пути NHEJ и Rad52 от пути HRR. Мы разработали и внедрили надежный протокол окрашивания иммунофлуоресценции для обнаружения радиационно-индуцированного реакции повреждения ДНК с антителами, специфическими для ремонтных факторов от NHEJ и HRR путей и наблюдаемых радиационно-индуцированных очагов (RIF). Предлагаемая методология может быть использована для исследования ремонта белка, который высоко активирован в случае нейтронно-смешанного луча излучения, тем самым указывая на доминирование пути ремонта.
Introduction
Радиационно-индуцированная реакция повреждения ДНК активируется нейтронным смешанным лучом, используемым в терапии захвата бора нейтронов (BNCT), не была полностью определена. Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру для выполнения обнаружения радиационно-индуцированных очагов (РИФ) ремонтных белков путем окрашивания иммунофлуоресценции, например, в линии рака толстой кишки человека после облучения нейтронно-смешанным лучом.
Ионизирующее излучение (ИО) вызывает множество различных типов повреждений ДНК (ДНК-ДСБ, ДНК-SSBs, повреждение основания ДНК), из которых ДНК двойных разрывов являются наиболее генотоксических поражений ДНК1. Неремонтированные разрывы могут привести к гибели клеток, в то время как неправильное расстройство повышает вероятность перестановки в хромосоме, мутагенеза и потери решающей генетической информации. Пути реагирования на повреждения, реагирующие на DSBs, включают пути репарации ДНК, такие как нехомологичное присоединение к концу (NHEJ), механизм, который требует Ku 70/80, ДНК-PKcs, Xrcc4 и ДНК-лигаза IV в качестве ключевых факторов2,3,4,5,6. У млекопитающих, второй основной путь репарации ДНК гомологии рекомбинации ремонта (HRR) путь, который требует ключевых компонентов - Rad52 эпистаз гена семьи Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 и Rad587. Rad51 и Rad54 являются ключевыми факторами рекомбинации человека, участвующими в механизмах восстановления, связанных со стрессом репликации и разрывами ДНК в эукариотах. Интересно, было отмечено, что downregulation пути HRR повышает ПУТЬ NHEJ, который является подверженным ошибкам указывая на HR пути актуальность для стабильности генома8.
Первым шагом формирования DSBs является фосфорилирование гистона q-H2AX в Сер-139 от Ataxia telangiectasia мутировавших киназы (ATM) из семейства PI3киназы 7,8. Интересно, что фосфорилирование H2AX можно легко визуализировать с помощью иммунофлуоресценции, как foci (К-H2AX foci) с использованием антител, специфических для фосфорилированного H2AX6. Существует 1:1 связь между числом DSBs и Q-H2AX foci, поэтому, DSB маркер, q-H2AX, изучается широко через характеристику формирования очагов, размер, и количество6,7,8,9,10,11.7 Формирование очагов q-H2AX приводит к набору и накоплению белков реакции на повреждение ДНК (DDR) и хроматин-модифицирующих факторов, таких как 53BP1 (p53 связывающий белок 1), MDC1 (посредник контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 и многие другие ремонтные факторы, таким образом, образуя радиацию. Все эти белки совместно локализуются с помощью q-H2AX через прямую или косвенную привязку1,,11,12.
Важно обнаружить повреждение ДНК и восстановить с помощью правильного чувствительного теста, поэтому больше внимания уделяется разработке высокоточных методов13. В контексте повреждения ДНК и ремонтных исследований, методология имеет решающее значение для чувствительного обнаружения повреждения ДНК генома, описание категории повреждений, а также количественное повреждение ДНК и механизмы ремонта13. Для обнаружения одиночных клеток с поврежденной ДНК, комета анализ обычно используется в радиобиологических исследованиях14. Другие доступные цитогенетические методы распознают хромосомные аберрации, включая дицентрические, транслокации, ацентрические фрагменты, кольца и аберрации хроматированного типа и хромосомные повреждения микронуклеуса (Mn). Наиболее часто используемым методом в радиобиологии, особенно в биологической дозиметрии, является дицентрический анализ хромосомы из-за его высокой специфичности для излучения15. Например, ПЦР, классический молекулярный метод, не может распознать тип обнаруженного повреждения ДНК. В этом случае иммунометрические методы проходят уровень чувствительности, потому что реакции специфичны между антигеном и антителом. Иммунофлуоресценция изображений обеспечивает визуальные доказательства появления различных белков в различных очагов в ответ на ДНК повреждения агентов, как ионизирующее излучение16. Тем не менее, уровни активации повреждения и восстановления белков мРНК уровни легко обнаруживаются в режиме реального времени ПЦР, который является надлежащим количественным методом для дальнейших молекулярных исследований в контексте реакции повреждения ДНК17.
Принимая во внимание, что foci q-H2AX привлекает факторы ремонта18, для мониторинга повреждения ДНК и ремонта на клеточном уровне, мы разработали надежную процедуру окрашивания иммунофлуоресценции, основанную на анализе репрезентативного ремонта белковых очагов из NHL pathway (DNA-PKcs) и Rad52 от пути HRR.
Здесь мы предлагаем использовать иммунодефицит для этих белков в качестве эффективной и чувствительной процедуры для мониторинга индукции дНК-DSB и ремонта. До сих пор не было доступных данных о ДНК-DSBs на основе очагов ремонтных белков на клеточном уровне после нейтронного смешанного луча облучения для БНКТ, за исключением маркеров З-H2AX и 53BP119. Мы предлагаем адаптацию линии раковых клеток толстой кишки HCT-116, так как она богата в DSBs foci, как стандартная линия клеток для анализа повреждений ДНК, потому что РИФ легко обнаруживаются. Эта линия адепта клетки проста в обслуживании и надлежащим для процедур облучения. Предлагаемая процедура основана на огромном количестве предыдущих исследований, связанных с общей процедурой иммунофлуоресценции окрашивания в З-H2AX. Тем не менее, он включает в себя все детали, касающиеся выбора соответствующих антител с проверенными разбавлениями для каждого репрезентативного белка, принадлежащего к каждому пути ремонта. Кроме того, он описывает использование уникального нейтронно-смешанного луча, используемого в терапии БНКТ. Тем не менее, мы рекомендуем расширить исследования с обоих методов, иммунофлуоресценции окрашивания во-первых, а затем, с высокой стоимости молекулярного анализа, как это было выполнено ранее4,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка клеточной культуры и экспериментальная настройка
- Поддержание человеческих клеток рака толстой кишки, HCT-116, как рекомендовано поставщиком, в монослой в 75 см2 культуры фляги, содержащие 10 мЛ сформулированы Маккой 5a Medium модифицированных, дополнены 10% плода бычьей сыворотки и 1% антибиотика антимикотического раствора.
- Выращивайте клетки в увлажненной среде 5% CO2 при 37 градусах Цельсия до 70% слияния со средним обновлением каждые 2-3 дня.
- Чтобы получить луч BNCT (например, нейтронный луч плюс 10BPA) и эффект БНКТ, убивающий раковые клетки как тяжелые частицы, и отнести большую часть своей энергии в боро-содержащихся раковых клетках, за день до облучения, добавить агента доставки бора в среду клеточной культуры - например, 10BPA, 4-Borono-L-фенилаланин (10 мкг 10B/mL, 0,925 мМ финал) 12-16 ч (максимальное поглощение бора) до облучения, как ранее изучали для клеток рака толстой кишки и раковых клеток щитовидной железы20,21.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании другой клеточной линии, для которой нет данных в случае исследования BNCT, проверьте поглощение бора для каждой клеточной линии для получения оптимальной концентрации бора. Измерьте 10BPA клеточного поглощения путем индуктивно связаны плазмы оптической спектроскопии выбросов (ICP-OES) в исполнении Dagrosa группы21. - После 12-16 ч доставки бора, аспирировать средний и мыть клетки с 10 мл 1x PBS. Затем пробуйте клетки, добавляя 2 мЛ раствора Трипсина-ЭДТА в клетки и инкубировать в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию для усиления отсоединение клеток. Когда клетки начинают отсоединяться, прекратите действие трипсина, добавив 10 мЛ полной среды.
- Аспирируйте суспензию ячейки в трубке 15 мл и подсчитывайте клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток, добавляя 10 мл 0,4% трипан синего до 10 мл клеток, смешивания и аликвотинга 10 мл на счетном слайде. Разбавить суспензию клетки до концентрации 1 х 106 клеток/мЛ среды. Aliquot 1 mL клеточной суспензии на криотвку.
- Подготовка термолюминесцентных дозиметров (TLDs) для измерения доз гамма-лучей и золотых фольг для нейтронных fluencies и прикрепите TLDs к криотрубам или фляме клеточной культуры перед облучением.
- Облучать 1 х 106 клеток/мл с нейтронно-смешанным лучом при рекомендуемом минимальном потоке теплового нейтрона 5,9 х10 11 (н/см-2 минNo1)4 в культурных колбах или криотрубках в зависимости от возможностей объекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наставьте время облучения, прежде чем получить рекомендуемый поток нейтрона. - После облучения, семена 1 мл облученных клеток (1 х 106 клеток / мл) на 22 х 22 мм coverslips в 35 мм Петри блюда или 6 хорошо пластин, дополнение с 2 мл требуемого среднего. Инкубировать клетки максимум 3 ч при 37 градусах в увлажненной среде 5% CO2, чтобы позволить им прикрепиться к крышки. Наблюдайте за привязанностью клеток время от времени под перевернутым микроскопом с 20-кратной целью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для Клеток HCT-116 минимальная плотность составляет 600 000 клеток для семян. Для быстрого дальнейшего окрашивания процедуры используйте камерные слайды, соответственно снижайте плотность клеток.
2. Фиксация клеток
- После облучения и инкубации клеток, удалить среду из прикрепленных клеток и мыть клетки один раз с 2,5 мл PBS.
- Исправить клетки с 1 мл 70% этанола в течение 10 минут на RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно используйте 1%-3,7% параформальдегида (ПФА) для фиксации, как рекомендовалось ранее19. Протокол приостанавливается здесь. Храните фиксированные клетки в этаноле в морозильной камере при температуре -20 градусов в течение не более нескольких недель для дальнейшего анализа и окрашивания иммунофлуоресценции.
3. Пермяковаябилизация клеток
- После фиксации удалить этанол из чашки Петри и промыть 2,5 мл 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте клеткам высохнуть между шагами полоскания. - Аккуратно добавьте 1 мл 0,2% от Triton X-100/PBS, чтобы покрыть крышки с клетками в чашках Петри.
- Инкубация в течение 5 минут в RT.
- Вымойте клетки 3x с 2,5 мл 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличьте процент Triton X-100 в PBS до 0,5% при необходимости (более очаги обнаруживаются, зависят от тестируемой линии клеток). Выполните дополнительные моет с PBST (PBS с 0,5% Tween), чтобы избежать неспецифической привязки. - Блок пермяки шаг с 1 mL 2% BSA (Bovine Serum Fraction V альбумин) разбавленной в PBS и инкубировать в течение как минимум 30 мин или 1 ч с 1% BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть опущен и зависит от типа используемого антитела. Кроме того, использовать 5% FBS, как это рекомендовано в рефери4.
4. Окрашивание иммунофлуоресценции
- Добавьте правильное количество первичных антител (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs и Anti-Rad52), разбавленных в PBS с BSA (2% Bovine Serum Fraction V альбумин) в соответствии с рекомендациями (см. Таблицу 1 с рекомендуемыми разбавлениями) (100 мл необходимо на образец).
| Первичное антитело | Функции | Рекомендуемая разбавления | хранение (C) |
| Анти-ɣ-H2AX | обнаружение ДНК-ДСБ | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Анти-ДНК-ПК | обнаружение РИФов белка ДНК-ПК, принадлежащего NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Анти-Рад52 | обнаружение RIFs белка Rad52, принадлежащего HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Вторичное антитело | В неведении | ||
| анти-мышь IgG FITC | ɣ-H2AX очаги | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Коза Анти-Кролик IgG H и L (Alexa Fluor 488) | для NHEJ и HRR ремонт белков очагов | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Таблица 1: Рекомендуемые разбавления и примечания для использования антител, используемых в разделе 4.
- Обложка чашки Петри для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином с использованием дистиллированной воды и инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Инкубация может быть выполнена при 4 градусах цельсия в течение ночи. - После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте слайду высохнуть во время полоскания. - Добавьте правильное количество вторичных антител (анти-мым мыши IgG FITC, Коза Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488) разбавленный в PBS с BSA (см. таблицу 1) (100 МЛ необходимо на образец). Для этого и следующие шаги работают в темноте.
- Накройте чашку Петри снова для поддержания влажности в пластиковой коробке с увлажненным лигнином и инкубировать в течение 30 минут минимум при температуре 37 градусов по Цельсию в инкубаторе.
- После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
- Добавьте 100 МЛ DAPI, разбавленного в PBS, к окончательной концентрации 1 мкг/мл, чтобы противостоять ядрам.
- Инкубировать в ближайшее время, в течение максимум 2 мин на RT.
- После инкубации выполните 3 стирки с 2,5 мл PBS.
- Снимите PBS и аккуратно положить крышку на верхней части монтажа среды, избегая образования пузырьков воздуха и уплотнения края крышки с лаком для ногтей. Подождите, пока лак высохнет и краска coverslip вокруг.
- Дождитесь затвердевания монтажной среды (до 3 ч) перед анализом изображения под флуоресценцией микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Храните стеклянные горки в пластиковой коробке при 4 градусов по Цельсию в темноте.
5. Приобретение и анализ изображений
- Приобретайте изображения с помощью флуоресценции под 100x цели с погружением нефти.
- Анализ очагов в ядрах с помощью флуоресценционного микроскопа, оснащенного следующими фильтрами для: Alexa Fluor 488: возбуждение выбросов (нм): 496/519, зеленый цвет выбросов; DAPI: возбуждение выбросов (нм): 358'461, цвет излучения синий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ DSBs вдоль одночастичных треков может потребовать передовой микроскопии, как конфокальное лазерное сканирование микроскопии с более высоким разрешением.
- Анализ очагов в ядрах с помощью флуоресценционного микроскопа, оснащенного следующими фильтрами для: Alexa Fluor 488: возбуждение выбросов (нм): 496/519, зеленый цвет выбросов; DAPI: возбуждение выбросов (нм): 358'461, цвет излучения синий.
- Сохранить приобретенные изображения и процесс с соответствующим программным обеспечением изображений, например, ImageJ или Image Pro3,20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использование отдельных макросов и плагинов, разработанных для автоматического анализа или разработки/покупки индивидуального биоинформатического программного обеспечения. - При использовании программного обеспечения Image-Pro для анализа очагов, обработка изображений в файлах TIFF: выберите кнопку Count/Size, затем нажмите Типы «выберите тип измерения (например, диаметр или область)», нажмите Диапазоны «набор диапазона измерения», нажмите Сплит объектов, если это необходимо. Чтобы отрегулировать яркость, щелкните «Яркий» «отрегулируйте тресолд». Затем нажмите графа «красная кнопка».
- Для экспорта данных нажмите таблицу данных Статистика Экспорт в Excel. В программном обеспечении электронной таблицы нарисуйте графики с требуемым статистическим анализом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во-первых, мы провели анализ стандартного маркера обнаружения ДНК-DSBs, foci в раковых клетках толстой кишки, неизлученных и облученных нейтронно-смешанным лучом. Foci q-H2AX появляются как отдельные флуоресцентные точки и показывают образование ДНК-DSB (так как каждая флуоресцентная точка q-H2AX представляет собой одну DSB) (см. рисунок 1).
Рисунок 1: Репрезентативные изображения моделей очагов q-H2AX в раковых клетках толстой кишки клеточной линии HCT-116 (без излучения) и после облучения нейтронного смешанного луча. Облучение нейтронно-смешанного пучка проводилось в дозе 2,6 г. в клетках, обработанных накануне с помощью BPA (НЗ BPA). (A) Левая панель представляет DAPI-окрашивание ядер. Правая панель, зеленый очаг (Alexa 488), соответствует иммунодефициту q-H2AX. На желтой стрелке указывается след частицы, пересекающие ядро (шкала штриха 10 мкм). (B) Репрезентативные диаграммы, иллюстрирующие наблюдаемое увеличение размера радиоиндуцированных очагов. Среднее значение диаметра foci q-H2AX было выполнено автоматически программным обеспечением Image-Pro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Интересно, что в облученных клетках с нейтронно-смешанным лучом (НЗ BPA) в дозе приблизительно 2,6 Ги (1,33 г. и 1,26 Ги (N)) мы наблюдали более высокие уровни диаметра foci q-H2AX (Рисунок 1B). Кроме того, был обнаружен один трек высокой частицы LET (из-за ядерной реакции БНКТ), пересекающей ядра клетки (желтая стрелка)(рисунок 1A). Различные типы излучения могут вызвать различные эффекты: чем выше LET излучения, тем более сложные ДНК-DSBs, тем больше foci q-H2AX и более высокие уровни области ремонта белков, видимых как радиационно-индуцированных foci18.
Поэтому мы протестировали уровни репрезентативных ремонтных белков ДНК-ПКК (от пути восстановления NHEJ) и Rad52 (от HR-пути) с помощью иммунофлуоресценции микроскопии в тех же условиях, которые не были выполнены ранее в случае пучка БНКТ. Мы смогли обнаружить высокое среднее значение диаметра очагов ДНК-ПКК при разрывах ДНК после нейтрона-смешанного по сравнению с контрольными клетками (без излучения) (см. рисунок 2).
Рисунок 2: Репрезентативные изображения моделей ДНК-ПКК и Rad52 ремонт очагов в клетках рака толстой кишки клеточной линии HCT-116 (без излучения) и после нейтронного смешанного облучения пучка. Облучение нейтронно-смешанного пучка проводилось в дозе 2,6 г. в клетках, обработанных накануне с помощью BPA (НЗ BPA). (A) Левая панель представляет DAPI-окрашивание ядер. Средняя панель представляет собой обнаружение радиационно-индуцированных очагов. Правая панель представляет собой слитое изображение. (B) Репрезентативные диаграммы, иллюстрирующие наблюдаемое увеличение размера радиоиндуцированных очагов. Среднее значение диаметра очагов Rad52 и DNA-PKcs было выполнено автоматически с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
В этом случае мы наблюдали кластерные ДНК-DSBs в облученных клетках HCT-116 нейтронно-смешанным лучом, так как ДНК-ПКК специфична для более сложных очагов. В облученных клетках, с помощью нейтронно-смешанного луча, эти очаги наблюдались только в ядре клетки как более сложные, крупные и сгруппированные с более высокой интенсивностью(Рисунок 2A,B). В случае Rad52, эффект был не столь сильным, как для ДНК-PKCs, что указывает на доминирование пути NHEJ в этом типе излучения. Более того, на основе литературных данных, сложные DSB медленно восстанавливаются и ДНК-ПКК набирается только в более долговечные сложные DSBs, что указывает на то, что нейтронно-смешанный луч приводит к образованию сложных ДСБ и ремонту через ДНК-ПКК, однако необходимы дополнительные исследования на молекулярном уровне для подтверждения этих ранее полученных результатов22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Частоты очагов, иммунохимически окрашенных для q-H2AX и 53BP1 широко используются в радиобиологии и связаны с ДНК-DSB число и считаются эффективными и чувствительными маркерами для мониторинга индукции и ремонта ДНК-DSBs19. Процедура совместного окрашивания q-H2AX и 53BP1 является стандартной процедурой для обнаружения ДНК-DSBs. Формирование очагов Q-H2AX связано с набором 53BP1, регулятора реакции повреждения ДНК23. Тем не менее, различные линии клеток могут варьироваться в фоновом уровне q-H2AX /53BP1 foci 11. Было показано, что foci q-H2AX привлекает факторы ремонта18, накапливая более высокую концентрацию ремонтных белков близко к сайту DSB. Чем сложнее ДНК-ДСБ, тем больше очагов q-H2AX и тем выше уровень ремонтных белков. Он активирует каскад ремонтных путей, если факторы ремонта накапливаются в более высокой концентрации в месте DSB, они легко обнаруживаются с помощью конкретных антител и предлагаемый протокол позволяет им быть визуализированы легко. Здесь мы демонстрируем методологию изучения биологического воздействия на клеточном уровне для терапии BNCT воздействия нейтронно-смешанного луча на ремонт ДНК с использованием иммунофлуоресценции в раковых клетках толстой кишки человека. Авторы разработали и ввели пошаговый надежный протокол с конкретными антителами для обнаружения путей репарации ДНК на основе иммунофлуоресцентного окрашивания антитела, специфичного для ремонтных факторов от NHEJ и HRR пути и наблюдаемых радиационных очагов (RIF). Кроме того, авторы предлагают использовать HCT-116 линии раковых клеток толстой кишки в качестве стандартной клеточной линии для анализа повреждения ДНК и в качестве линии контрольной клетки для проверки антител репарации ДНК, потому что эта линия клеток сама по себе богата очагами DSBs. ДНК-DSBs легко обнаружить, и различные клеточные линии, особенно раковые клетки, как линия клеток шейки матки представляют различные фоновые уровни H2AX foci, и интенсивность24.
Есть два основных критических шага в протоколе, фиксация клеток, и иммуносуляции процедуры. Авторы рекомендуют фиксацию клеток в 70% этанола, так как он сохраняет клетки в течение длительного времени, и инкубируется в морозильной камере не более нескольких недель. Кроме того, этот шаг имеет решающее значение, поскольку это может быть точка паузы после процедуры облучения выполняется, например, в другом учреждении / здание / другой день. Другим важным шагом является надлежащая концентрация антител. Авторы прикрепили в таблице проверенные концентрации первичных и вторичных антител.
Представленная процедура обеспечивает пошаговый протокол для получения надежных результатов, однако, некоторые параметры могут изменить результаты экспериментов, как правильный выбор используемых антител, различные реагенты, используемые для фиксации и пермяки шаги, время инкубации, критический процент реагентов, мытья шаги, работа в темноте, и надлежащего флуоресцентного микроскопа. Авторы объясняют, как получить надежные и повторяемые результаты в примечаниях.
Незначительное ограничение этого метода заключается в том, чтобы иметь доступ к источнику излучения, как нейтронный источник, однако, протокол может быть использован в качестве общего протокола для обнаружения путей репарации ДНК, полученных после различных типов излучения и может рассматриваться как универсальный протокол для различных типов излучения, например, сравнивая низко-LET и высоко-LET радиационного ремонта путей активации.
Мы предоставляем универсальную, готовую к использованию методологию, которая может быть использована на клеточном уровне для анализа биологического эффекта в контексте терапии БНКТ. В БНКТ нерадиоактивный бор-10 (например, после обработки 4-Бороно-L-фенилаланин, BPA - агент доставки бора) облучается низкоэнергетическими тепловыми нейтронами и в результате ядерной реакции альфа-частицы и ядра лития-7 с высоким LET производятся25,26. Таким образом, наш протокол может быть полезен для анализа биологических эффектов на клеточном уровне также для излучения, представленного другими высокими лучами LET, такими как протоны, используемые в протонной лучевой терапии27, и углеродные ионы, используемые в адровой терапии28. Мы заметили, что необходимы более детальные исследования в области высоко-LET излучения и смешанных лучей, и знание процесса восстановления ДНК требуется для разработки эффективных противораковых методов лечения, поэтому мы разработали протокол, который позволяет исследовать радиационно-индуцированных ДНК повреждения ответ активируется нейтронно-смешанного луча. Кроме того, иммунофлуоресцентный метод выявления реакции на повреждения ДНК и репарации ДНК может быть потенциальным методом оценки и выявления опухолей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Нейтронно-смешанный луч, состоящий из нейтронного/гамма-излучения, был получен из исследовательского реактора Марии в Национальном центре ядерных исследований в Польше. K.M.O. была поддержана Национальным научным центром, Польша (Miniatura 2) грант No #2018/02/X/N'5/02849.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
- Carter, R. J., et al. Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).
- Kondo, N., et al. DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV. Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).
- Sakai, W., Sugasawa, K. DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair. DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , Springer. Tokyo. 155-174 (2016).
- Rodriguez, C., et al. In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line. Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).
- Sollazzo, A., et al. Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).
- Jeggo, P., Löbrich, M.
- Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54. The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).
- Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells. Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Sage, E., Shikazono, N. Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis. Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: immunoassays in DNA damage and instability detection. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Møller, P., et al. Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay. Mutagenesis. , geaa011 (2020).
- Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).
- Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy. Methods. 48 (1), 63-71 (2009).
- Cheng, L., et al. Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes. PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).
- Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
- Okumura, K., et al. Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells. Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).
- Dagrosa, M. A., et al. First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).
- Dagrosa, A., et al. Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer. Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).
- Reynolds, P., et al. The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage. Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).
- Rasche, L., et al. Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study. PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).
- Banáth, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).
- Barth, R. F., et al. Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer. Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).
- Mirzaei, H. R., et al. Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy. Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).
- Vitti, E. T., Parsons, J. L. The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair. Cancers. 11 (7), Basel. 946 (2019).
- Mohamad, O., et al. Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair. Cancers. 9 (6), Basel. 66 (2017).
