Summary
붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
원고의 목적은 붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 감마 혼합빔에 의해 유도된 방사선 유도 DNA 손상 반응을 연구하기 위해 면역형광 현미경 검사를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공하는 것이다. 구체적으로, 제안된 방법론은 DNA 이중 가닥 휴식(DNA-DSBs)에 특이적인 항체를 사용하여 포시로 시각화될 수 있는 수리 단백질 활성화의 검출을 위해 적용된다. DNA 복구 포시는 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 결장 암 세포 (HCT-116)에서 면역 형광에 의해 평가되었다. DNA-DSB는 가장 유독성 병변이며 두 가지 주요 경로에 의해 포유류 세포에서 수리됩니다: 비 동형 최종 결합 경로 (NHEJ) 및 상동성 재조합 수리 (HRR). 국소, 면역화학적으로 염색된 포시의 주파수는 γ-H2AX와 같은 방사선 생물학에서 일반적으로 사용되는 마커를 위해, 53BP1은 DNA-DSB 번호와 연관되고 DNA-DSB의 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 포시가 수리 단백질을 유치하여 DSB 근처의 고농도의 수리 인자를 유도한다는 것이 확립되었습니다. 세포 수준에서 DNA 손상을 모니터링하기 위해, HRR 통로로부터 의 DNA-PKcs 대표 수리 단백질 포시의 존재를 위한 면역형광 분석및 HRR 통로로부터 Rad52가 계획되었다. NHEJ 및 HRR 경로및 관찰된 방사선 유도 포시(RIF)로부터의 수리 인자에 특이적인 항체를 이용한 방사선 유도 DNA 손상 반응의 검출을 위한 신뢰할 수 있는 면역형 염색 프로토콜을 개발 및 도입했습니다. 제안된 방법론은 중성자 혼합 빔 방사선의 경우 고도로 활성화되는 수리 단백질을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 이로 인해 수리 경로의 지배력을 나타낸다.
Introduction
붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 결정되지 않았다. 이러한 프로토콜은 중성자 혼합 빔을 조사한 후 인간 대장암 세포주에서 면역형 염색에 의한 수리 단백질의 방사선 유도 포시(RIF)의 검출을 수행하기 위한 단계별 절차를 제공한다.
이온화 방사선(IR)은 DNA 이중 가닥 휴식이 가장 유전자 독성 DNA 병변1인DNA 손상(DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA 기지 손상)의 다양한 유형의 DNA 손상을 유도한다. 수리되지 않은 휴식은 세포 사망을 일으킬 수 있으며, 잘못 수리된 휴식은 염색체 재배열, 돌연변이 발생 및 결정적인 유전 정보의 손실 가능성을 높입니다. DSB에 반응하는 손상 반응 경로는 비 동형 종조 (NHEJ) 같은 DNA 수리의 경로를 포함, Ku 70/80을 필요로하는 메커니즘, DNA -PKcs, Xrcc4, DNA 리개세 IV주요 요인으로22,3,,4,,5,,6. 포유류에서, 두 번째 주요 DNA 수리 경로는 주요 구성 요소를 필요로 동종 재조합 수리 (HRR) 경로 - Rad52 에피스타시스 유전자 가족 - Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 및 Rad587. Rad51 및 Rad54는 진핵생물의 복제 스트레스 및 DNA 파손과 관련된 수리 메커니즘에 관여하는 주요 인간 재조합 요소입니다. 흥미롭게도, HRR 통로의 다운규제는 게놈 안정성에 대한 HR 통로 관련성을 가리키는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ 통로를 향상시키는 것으로 관찰되었다8.
DSB의 형성의 첫 번째 단계는 PI3 키나아제 패밀리7,,8에서알로카 텔란지크시아 돌연변이 키나아제(ATM)에 의해 Ser-139에서 γ-H2AX 히스톤의 인광이다. 흥미롭게도, H2AX 인산화는 인광H2AX6에특이적 항체를 사용하여 포시(γ-H2AX foci)로서 면역형광 기술에 의해 쉽게 시각화될 수 있다. DSB와 γ-H2AX 포시의 수 사이에 는 1:1 관계가 있기 때문에, DSB 마커, γ-H2AX는, 포시 형성, 크기 및 수량6,,7,,8,,9,,10,,11의특성화를 통해 광범위하게 연구된다. γ-H2AX 포시의 형성은 53BP1(p53 결합 단백질 1), MDC1(DNA 손상 체크포인트의 중재자), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, 및 많은 수산 계보(이와 같은 DNA 손상 반응)의 모집 및 축적으로 이어집니다. 이러한 모든 단백질은 직간접 결합1,,11,12를통해 γ-H2AX와 공동 국한한다.,
적절한 민감한 검사를 통해 DNA 손상을 감지하고 수리하는 것이 중요하므로, 고정밀 기술의 개발에 더 많은 주의를기울인다(13). DNA 손상 및 수리 연구의 맥락에서, 방법론은 게놈 DNA 손상의 민감한 검출, 손상 범주의 설명 및 DNA 손상 및 수리 메커니즘의 정량화에 매우 중요하다13. 손상된 DNA를 가진 단 하나 세포를 검출하기 위하여는, 혜성 분석은 방사선 생물학 연구결과 14에서일반적으로 이용됩니다. 다른 사용 가능한 세포 유전학 방법은 다심루, 전좌, 심심 단편, 고리 및 크로마티드 형 수차 및 미세 핵 염색체 손상(Mn)을 포함한 염색체 수차를 인식합니다. 방사선 생물학에서 가장 자주 사용되는 방법은, 특히 생물학적 도시계에서, 방사선 에 대한 높은 특이성으로 인한 심루 염색체 분석이다15. 예를 들어, 고전적인 분자 방법인 PCR은 검출된 DNA 손상의 유형을 인식할 수 없습니다. 이 경우, 면역측정 방법은 반응이 항원과 항체 사이에 특이적이기 때문에 감도 수준을 통과한다. 면역 형광 화상 진찰은 이온화 방사선16같이 DNA 손상 에이전트에 응하여 구별되는 foci에 있는 다른 단백질의 외관을 위한 시각적인 증거를 제공합니다. 그러나, 손상 및 수리 단백질의 mRNA 수준의 활성화 수준은 DNA 손상 반응반응(17)의맥락에서 추가 분자 연구를 위한 적절한 정량적 방법이되는 실시간 PCR에 의해 쉽게 검출할 수 있다.
γ-H2AX 포시가 수리인자(18)를유치하고, 세포 수준에서 DNA 손상 및 수리를 모니터링하는 것을 고려하여, HRR 통로에서 NHEJ 통로(DNA-PKcs)와 Rad52로부터 대표적인 수리 단백질 포치의 분석을 기반으로 신뢰할 수 있는 면역형 플루오레스 염색 절차를 개발했습니다.
여기에서, 우리는 DNA-DSB 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 절차로 이 단백질을 위한 면역 검출의 사용을 제안합니다. 지금까지, Γ-H2AX 및 53BP1 마커19를제외하고 BNCT에 대한 중성자 혼합 빔 조사 후 세포 수준에서 수리 단백질의 초점에 기초하여 DNA-DSBs에 대한 사용 가능한 데이터가 없었다. 우리는 HCT-116 결장암 세포주의 적응을 건의합니다, 그것은 DSBs foci에서 풍부하기 때문에, DNA 손상 분석을 위한 표준 세포주로서, RIF는 쉽게 검출하기 때문에. 이 부착 된 세포주 유지 하기 쉽고 조사 절차에 대 한 적절 한. 제안된 절차는 γ-H2AX 염색의 일반적인 면역 형광 절차와 관련된 이전 연구의 거대한 양을 기반으로합니다. 그러나, 각 수리 경로에 속하는 각 대표적인 단백질에 대해 테스트된 희석을 가진 적절한 항체의 선택에 관한 모든 세부 사항을 포함한다. 더욱이, BNCT 치료에 사용되는 독특한 중성자 혼합 빔의 활용을 설명합니다. 그러나,이전에,수행된 바와 같이 고비용 분자 분석을 통해 두 가지 방법, 면역형광 염색을 먼저 연장하는 것이좋습니다.
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Protocol
1. 세포 배양 및 실험 설정 준비
- 인간 대장암세포를 유지, HCT-116 공급 업체에 의해 권장, 75cm2 배양 플라스크에서 단층으로 10 mL를 포함하는 맥코이의 5a 중간 변형, 10% 태아 소 혈청과 1% 항생제 항mycotic 용액으로 보충.
- 가습된 5%CO2 환경에서 37°C에서 2~3일마다 중간 재생과 함께 70%의 응력까지 세포를 성장시다.
- BNCT 빔(예를 들어,21중성자 빔 플러스 10BPA) 및 BNCT 효과를 얻기 위해 암세포를 중입자로 죽이고 붕소 함유 암세포 내에서 대부분의 에너지를 증착하고, 조사 전날, 세포 배양 배지에 붕소 전달제를 추가 - 예를 들어, 10BPA, 4-보로노-L-phenylanine (10 μg 10B/mL, 0.925 mM MM 최종) 12-16 h (붕소의 최대 섭취량) 조사 전에, 이전에 대장암 세포와 갑상선 암 세포에 대한 연구로20.,
참고: BNCT 연구의 경우 데이터가 없는 다른 세포주를 사용하는 경우 각 세포주에 대한 붕소 섭취를 테스트하여 최적의 붕소 농도를 얻습니다. 다로사그룹(21)이수행한 플라즈마 광학 방출 분광법(ICP-OES)을 유도하여 10BPA세포 섭취를 측정한다. - 붕소 전달의 12-16 h 후, 배지를 흡인하고 1x PBS의 10 mL로 세포를 세척한다. 그런 다음 세포에 트립신-EDTA 용액 2mL을 추가하여 세포를 시험해보고 37°C에서 5분 동안 배양하여 세포 분리를 강화한다. 세포가 분리되기 시작하면 완전한 배지의 10mL를 추가하여 트립신 동작을 중지하십시오.
- 15mL 튜브에서 셀 서스펜션을 흡습하고 셀의 10 μL에서 10μL까지 10μL를 추가하여 자동 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산하고, 셀슬라이드에 10μL을 혼합하고 알리쿼팅한다. 세포 현탁액을 배지의 1 x 106 세포/mL의 농도로 희석시. 극저온튜브 당 세포 현탁액의 알리쿼트 1 mL.
- 중성자 불경을 위한 감마선 용량 및 금호일을 측정하기 위한 열발성 도지계(TD)를 준비하고 조사 전에 극저온튜브 또는 세포 배양 플라스크에 TD를 부착한다.
- 1 x 106 셀/mL을 중성자 혼합 빔으로 조사하여 시설 기능에 따라 배양 플라스크 또는 냉동튜브에서 5.9 x10 11 (n/cm-2 분-1)4의 권장되는 최소 열 중성자 플럭스에서 조사할 수 있습니다.
참고: 권장 중성자 플럭스를 얻기 전에 조사 시간을 설정합니다. - 조사 후, 조사 셀의 씨앗 1 mL (1 x 106 셀 / mL) 에 22 x 22 mm 커버립 35 mm 페트리 접시 또는 6 웰 플레이트, 필요한 매체의 2 mL보충. 가습 5%CO2 환경에서 37°C에서 최대 3시간 동안 세포를 배양하여 커버립에 부착할 수 있도록 한다. 20배 의 객관적인 반전 된 현미경으로 때때로 세포의 부착을 관찰하십시오.
참고: HCT-116 세포의 경우 최소 밀도는 종자에 600,000개의 세포이다. 빠른 염색 절차를 위해 챔버 슬라이드를 사용, 그에 따라 세포 밀도를 감소.
2. 셀 고정
- 세포의 조사 및 배양 후, 부착 된 세포에서 배지를 제거하고 PBS의 2.5 mL로 한 번 세포를 세척하십시오.
- RT에서 10 분 동안 70 % 에탄올의 1 mL로 셀을 수정합니다.
참고: 또는 1%-3.7% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 이전에 권장되는19번으로고정하십시오. 프로토콜은 여기에서 일시 중지됩니다. 추가 분석 및 면역 형광 염색을 위해 몇 주 이상 -20 °C의 냉동고에 고정 된 세포를 저장합니다.
3. 세포의 투과성
- 고정 후 페트리 접시에서 에탄올을 제거하고 1 x PBS의 2.5 mL로 씻어.
참고: 헹구는 단계 사이에 세포가 건조시키지 마십시오. - 트리톤 X-100/PBS의 0.2%의 1mL를 부드럽게 추가하여 페트리 요리의 셀로 커버립을 덮습니다.
- RT에서 5분 동안 배양하십시오.
- 1x PBS의 2.5mL로 셀을 3배 세척합니다.
참고: 필요한 경우 PBS에서 Triton X-100의 비율을 최대 0.5%까지 증가시면(테스트된 세포주에 따라 더 많은 포시 검출 가능). PBST(0.5% Tween의 PBS)를 사용하여 추가 세베를 수행하여 특이하지 않은 바인딩을 방지합니다. - PBS에서 희석된 2% BSA(소세럼 분수 V 알부민)의 1mL로 블록 투과화 단계는 최소 30분 또는 1h의 BSA를 통해 배양한다.
참고: 이 단계는 생략될 수 있고 사용되는 항체의 종류에 따라 달라집니다. 또는 참조4에서권장하는 5% FBS를 사용하십시오.
4. 면역 형광 염색
- BSA(2% 소 세럼 분별 V 알부민)를 사용하여 PBS에서 희석된 1차 항체(안티-ɣ-H2AX, 안티-DNA-PKcs 및 안티-Rad52)를 권장하는 대로 추가합니다(권장 희석제가 있는 표 1 참조) (샘플당 100 μL이 필요합니다).
| 1차 항체 | 함수 | 권장 희석 | 저장 [°C] |
| 안티 ɣ-H2AX | DNA-DSB의 검출 | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| 안티 DNA - PKcs | NHEJ에 속하는 DNA-PKcs 단백질의 RIFs 검출 | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| 안티 라드52 | HRR에 속하는 Rad52 단백질의 RIF의 검출 | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| 이차 항체 | 정보에 어두운 | ||
| 안티 마우스 IgG FITC | ɣ-H2AX 포시 | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| 염소 안티 래빗 IgG H & L (알렉사 플루어 488) | NHEJ 및 HRR 수리 단백질 foci용 | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
표 1: 섹션 4에 사용되는 항체의 사용에 대한 권장 희석 및 노트.
- 페트리 접시를 덮어 증류수를 사용하여 보습 리그닌으로 플라스틱 상자의 습도를 유지하고 인큐베이터에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 인큐베이션은 하룻밤 동안 4°C에서 수행될 수 있다. - 인큐베이션 후 PBS2.5mL로 3개의 세시브를 수행한다.
참고: 헹구는 단계에서 슬라이드가 건조되는 것을 허용하지 마십시오. - BSA를 사용하여 PBS에서 희석된 이차 항체(안티 마우스 IgG FITC, 염소 안티래빗 IgG(알렉사 플루어 488)를 추가합니다(표 1참조) (샘플당 100μL이 필요합니다). 이를 위해 다음 단계는 어둠 속에서 작동합니다.
- 페트리 접시를 다시 덮고 보습 리그닌으로 플라스틱 상자의 습도를 유지하고 인큐베이터에서 37 °C에서 최소 30 분 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 후 PBS2.5mL로 3개의 세시브를 수행한다.
- PBS에서 희석된 DAPI 100 μL을 1 μg/mL의 최종 농도에 추가하여 핵을 대응합니다.
- RT에서 최대 2분 동안 곧 인큐베이션을 할 수 있습니다.
- 인큐베이션 후 PBS2.5mL로 3개의 세시브를 수행한다.
- PBS를 제거하고 마운팅 매체 의 상단에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 매니큐어로 커버 슬립의 기포와 씰 가장자리의 형성을 피하십시오. 바니시가 건조해질 때까지 기다렸다가 덮개를 칠합니다.
- 형광 현미경 검사법에 따라 이미지 분석 전에 마운팅 매체(최대 3시간)의 경화를 기다립니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 어두운 4 °C의 플라스틱 상자에 유리 슬라이드를 보관하십시오.
5. 이미지 수집 및 분석
- 침지 오일로 100배 목표 미만의 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다.
- 다음 필터를 장착한 형광 현미경으로 핵에서 의 초점을 분석합니다: 알렉사 플루서 488: 여기⁄방출(nm): 496/519, 방출 색상 녹색; DAPI: 여기□방출(nm): 358⁄461, 방출 색상 파란색.
참고: 단일 입자 트랙을 따라 DSB를 분석하려면 더 높은 해상도의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사법과 같은 고급 현미경 검사가 필요할 수 있습니다.
- 다음 필터를 장착한 형광 현미경으로 핵에서 의 초점을 분석합니다: 알렉사 플루서 488: 여기⁄방출(nm): 496/519, 방출 색상 녹색; DAPI: 여기□방출(nm): 358⁄461, 방출 색상 파란색.
- 이미지 J 또는 이미지 프로3,,20등 적절한 이미징 소프트웨어로 획득 된 이미지와 프로세스를 저장합니다.
참고: 개별 생물정보 소프트웨어의 자동 분석 또는 개발/구매를 위해 개발된 개별 매크로 및 플러그인을 사용하는 것이 좋습니다. - 포시 분석을 위해 이미지-프로 소프트웨어를 사용하는 경우 TIFF 파일의 이미지 처리: 카운트/크기 단추를 선택한 다음 [측정 유형(예: 직경 또는 영역)을 선택], 범위[측정 범위 설정]을 클릭하고 필요한 경우 분할 객체를클릭합니다. Ranges 밝기를 조정하려면 밝게 클릭하십시오 [treshold 조정]. 그런 다음 [빨간색 버튼] 카운트를 클릭합니다.
- 데이터를 내보내려면 데이터 테이블을 클릭 | 통계 | 엑셀로 내보내기합니다. 스프레드시트 소프트웨어에서 필요한 통계 분석과 함께 그래프를 그립니다.
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Representative Results
첫째, 우리는 대장암세포에서 DNA-DSB, γH2AX 포시의 검출의 표준 마커의 분석을 수행, 비방사, 중성자 혼합 빔으로 조사. γ-H2AX 포시는 뚜렷한 형광점으로 나타나고 DNA-DSB의 형성을 나타낸다(각 γ-H2AX 형광점은 단일 DSB를 나타내기 때문에)(도 1참조).
도 1: 세포주 HCT-116(방사선 없이) 및 중성자 혼합 빔 조사의 대장 암세포에서 γ-H2AX 초점의 패턴의 대표적인 영상. 중성자 혼합 빔 조사는 BPA (N+BPA)로 전날 처리 된 세포에서 2.6 Gy의 용량으로 수행되었다. (A)왼쪽 패널은 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. 오른쪽 패널인 녹색 포시(Alexa 488)는 γ-H2AX의 면역 검출에 해당한다. 노란색 화살표는 핵을 가로지르는 α 입자의 추적을 나타냅니다 (스케일 바 = 10 μm). (B)무선 유도 포시의 크기가 관찰된 증가를 보여주는 대표적인 다이어그램. γ-H2AX 포시 직경의 평균은 이미지-프로 소프트웨어에 의해 자동으로 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
흥미롭게도, 중성자 혼합 빔(N+BPA)을 가진 조사된 세포에서 약 2.6Gy(1,33 Gy(γ) + 1,26 Gy(N)의 투여량으로 조사된 세포에서, 우리는 γ-H2AX 초점의 높은 직경 수준을 관찰하였다(도1B). 더욱이, 높은 LET α-입자의 단일 트랙이 검출되었다(BNCT 핵 반응때문에) 세포의 핵을 교차(노란색 화살표)(도 1A). 방사선의 다른 모형은 다른 효력을 일으키는 원인이 될 수 있습니다: LET 방사선이 높을수록, 더 복잡한 DNA-DSB, 더 큰 γ-H2AX foci 및 방사선 유도foci18로보이는 복구 단백질의 더 높은 지역 수준.
따라서, 우리는 BNCT 빔의 경우 이전에 수행되지 않은 동일한 조건에서 면역 형광 현미경 검사법에 의해 DNA-PKcs (NHEJ 수리 경로에서) 및 Rad52 (HR 통로에서)의 대표적인 수리 단백질 수준을 테스트했습니다. 우리는 대조군 세포 (아니 방사선)와 비교하여 중성자 혼합 후 DNA 휴식에서 DNA -PKcs의 초점 직경의 높은 평균 값을 감지 할 수 있었다 (도 2참조).
그림 2: 세포주 HCT-116(방사선 없이) 및 중성자 혼합 빔 조사의 대장암세포에서 DNA-PKcs 및 Rad52의 패턴의 대표적인 이미지가 포시를 수리한다. 중성자 혼합 빔 조사는 BPA (N+BPA)로 전날 처리 된 세포에서 2.6 Gy의 용량으로 수행되었다. (A)왼쪽 패널은 핵의 DAPI 염색을 나타낸다. 중간 패널은 방사선 유도 된 초점의 검출을 나타냅니다. 오른쪽 패널은 병합된 이미지입니다. (B)무선 유도 포시의 크기가 관찰된 증가를 보여주는 대표적인 다이어그램. Rad52 및 DNA-PKcs 포치 직경의 평균은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 경우, 우리는 DNA-PKcs가 더 복잡한 포시에 특정이기 때문에 중성자 혼합 빔에 의해 조사된 HCT-116 세포에서 클러스터된 DNA-DSB를 관찰하였다. 조사된 세포에서, 중성자 혼합 빔에 의해, 이들 포시는 세포 핵 내에서만 더 복잡하고, 더 크고, 더 높은강도(도 2A,B)로군집하였다. Rad52의 경우, 이러한 유형의 방사선에서 NHEJ 통로의 지배력을 나타내는 DNA-PKcs의 경우 그 효과는 강하지 않았습니다. 더욱이, 문헌 데이터를 기반으로, 복잡한 DSB는 천천히 수리되고 DNA-PKcs는 중성자 혼합 빔이 복잡한 DSB의 형성으로 이어지고 DNA-PKcs를 통해 복구한다는 것을 나타내는 장기 복합 DSB에만 모집되지만, 이러한 이전에 얻은결과를확인하기 위해 분자 수준에서 더 많은 연구가 필요하다.
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Discussion
포시의 주파수, γ-H2AX 및 53BP1을 위해 면역화학적으로 염색된 것은 방사선생물학에서 일반적으로 사용되며 DNA-DSB 번호와 연관되며 DNA-DSB(19)의 유도 및19수리를 모니터링하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 및 53BP1의 공동 염색 절차는 DNA-DSBs의 검출을 위한 표준 절차입니다.23 그러나, 상이한 세포주(γ-H2AX/53BP1 foci 11)의배경 수준에서 달라질 수있다. γ-H2AX 포시가 수리인자(18)를유치하여 DSB 부위에 가까운 고농도의 수리 단백질을 축적하는 것으로 나타났다. 더 복잡한 DNA-DSB, 더 큰 γ-H2AX foci 및 더 높은 수리 단백질의 수준. DSB 부위에 고농도로 수리인이 축적되는 경우, 특정 항체를 사용하여 쉽게 검출할 수 있으며 제안된 프로토콜을 통해 쉽게 시각화할 수 있도록 수리 경로의 폭포를 활성화합니다. 여기서 우리는 BNCT 치료를 위한 세포 수준에서 생물학적 효과를 연구하는 방법론을 보여 주며, 인간 대장암세포에서 면역형광 기술을 이용하여 DNA 수리에 중성자 혼합 빔의 영향. 저자는 NHEJ 및 HRR 통로및 관찰된 방사선 유도 포시 (RIF)에서 복구 인자를 위해 특정 항체를 가진 면역 형광 염색에 근거를 둔 DNA 복구 통로를 검출하기 위한 특정 항체를 가진 단계별 신뢰할 수 있는 프로토콜을 개발하고 소개했습니다. 더욱이, 저자는 이러한 세포주 자체가 DSBs foci가 풍부하기 때문에 DNA 손상 분석을 위한 표준 세포주로서 및 DNA 복구 항체의 시험을 위한 대조군 세포주로서 HCT-116 결장암 세포주의 사용을 제안한다. DNA-DSB는 쉽게 검출할 수 있고, 상이한 세포주, 특히 자궁 경부 세포주 같이 암세포는 H2AX 포시의 상이한 배경 수준을 나타내고, 강도24.
프로토콜, 세포 고정 및 면역 염색 절차에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 저자는 장시간 세포를 보존하고 몇 주 이상 냉동고에 배양되기 때문에 70 % 에탄올에서 세포의 고정을 권장합니다. 또한 이 단계는 조사 절차가 수행된 후 다른 기관/건물/다른 날에 일시 중지할 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 단계는 항체의 적절한 농도입니다. 저자는 표에 1 차 및 이차 항체의 시험된 농도를 첨부했습니다.
제시된 절차는 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위하여 단계별 프로토콜을 제공하지만, 몇몇 매개변수는 사용된 항체의 적당한 선택, 고정 및 투과화 단계, 잠복기의 시간, 심약의 중요한 백분율, 세척 단계, 어둠 속에서 작동및 적당한 형광 현미경과 같이 실험의 결과를 바꿀 수 있었습니다. 저자는 노트에서 신뢰할 수 있고 반복 가능한 결과를 얻는 방법을 설명합니다.
이 기술의 사소한 제한은 중성자 소스와 같은 방사선의 근원에 접근할 수 있으나, 그러나, 프로토콜은 상이한 유형의 방사선 후에 얻어진 DNA 수리 통로의 검출을 위한 일반적인 프로토콜로서 사용될 수 있고, 예를 들어, 저-LET 및 고-LET 방사선 수리 경로를 비교하는 등 다양한 유형의 방사선에 대한 보편적 프로토콜로 취급될 수 있다.
우리는 BNCT 치료의 맥락에서 생물학적 효과를 분석하기 위해 세포 수준에서 사용할 수있는 보편적 인 즉시 사용 방법론을 제공합니다. BNCT에서는, 비방사성 붕소-10(예를 들어, 4-보로노-L-페닐라닌, BPA-붕소 전달제로 치료후)는 저에너지 열 중성자로 조사되고 핵 반응 알파 입자 및 리튬-7 핵의 결과로25,,26을생산한다. 따라서, 당사의 프로토콜은 양성자 빔치료(27)에사용되는 양성자 및 하드론 치료에 사용되는 탄소 이온(28)과 같은 다른28높은 LET 빔에 의해 대표되는 방사선에 대해서도 세포 수준에서 생물학적 효과의 분석에 유용할 수 있다. 우리는 고-LET 방사선 및 혼합 빔 분야에서 보다 상세한 연구가 필요하다는 것을 관찰하고, DNA 수리 과정의 지식은 효과적인 항암 요법을 개발하기 위하여 요구되고, 그러므로, 우리는 중성자 혼합 광선에 의해 활성화된 방사선 유도된 DNA 손상 반응을 연구하는 것을 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 더욱이, DNA 손상 반응 및 DNA 수리의 검출의 면역 형광 방법은 종양의 평가 및 검출을 위한 잠재적인 방법이 될 수 있었습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
중성자/감마 방사선으로 구성된 중성자 혼합 빔은 폴란드 국립 핵연구 센터의 마리아 연구 원자로에서 접근했다. K.M.O.는 폴란드 국립 과학 센터(Miniatura 2)가 #2018/02/X/NZ5/02849를 지원받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 7.183.390.000 | |
| 4-Borono-L-phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | 17755 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad | Abcam | AB18192 | |
| Anti-Mouse IgG (whole molecule)–FITC antibody produced in goat | SIGMA-ALDRICH | F0257 | |
| Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | MerckMillipore | 05-636 | |
| Anti-RAD52 antibody | Abcam | AB117097 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Roche | BSAV-RO | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | SIGMA-ALDRICH | F9665 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | AB150077 | |
| HCT-116 cell line | ATCC | CCL-247™ | |
| ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Image Pro | Media cybernetics | http://www.mediacy.com/imagepro | |
| LUNA II Automated Cell Counter | Logos Biosystems | L40002 | |
| McCoy’s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate) | SIGMA-ALDRICH | M9309 | |
| microscope slides | ThermoFisher SCIENTIFIC | B-1198 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS | 20.59.52.0 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | X100 | |
| Trypan Blue Stain, 0.4% | Logos Biosystems | T13001 | |
| Trypsin-EDTA solution 0.25% | SIGMA-ALDRICH | T4049 |
References
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