Summary
Qui è presentato un protocollo per valutare quantitativamente l'iniettabilità di un materiale attraverso un sistema di aghi per siringhe utilizzando un banco di prova meccanico standard.
Abstract
I biomateriali iniettabili stanno diventando sempre più popolari per la somministrazione minimamente invasiva di farmaci e cellule. Questi materiali sono tipicamente più viscosi delle tradizionali iniezioni acquose e possono essere semi-solidi, quindi la loro iniettabilità non può essere assunta. Questo protocollo descrive un metodo per valutare oggettivamente l'iniettabilità di questi materiali utilizzando un tester meccanico standard. Lo stantuffo della siringa viene compresso dalla traversa a una velocità prestabilita e la forza viene misurata. Il valore di forza massima o plateau può quindi essere utilizzato per il confronto tra campioni o per un limite di forza assoluto. Questo protocollo può essere utilizzato con qualsiasi materiale e qualsiasi dimensione o geometria di siringa e ago. I risultati ottenuti possono essere utilizzati per prendere decisioni su formulazioni, dimensioni di siringhe e aghi all'inizio del processo traslizionale. Inoltre, possono essere quantificati gli effetti dell'alterazione delle formulazioni sull'iniettabilità e determinare il tempo ottimale per iniettare materiali che cambiano temporaneamente. Questo metodo è adatto anche come modo riproducibile per esaminare gli effetti dell'iniezione su un materiale, per studiare fenomeni come l'autoguarigione e la pressatura del filtro o studiare gli effetti dell'iniezione sulle cellule. Questo protocollo è più veloce e più direttamente applicabile all'iniettabilità rispetto alla reologia rotazionale e richiede una post-elaborazione minima per ottenere valori chiave per i confronti diretti.
Introduction
I biomateriali sono spesso studiati e utilizzati come impalcature per la rigenerazione dei tessuti a base cellulare e depositi per la somministrazione mirata e sostenuta di terapie1. All'interno di questo campo, i biomateriali iniettabili stanno crescendo in popolarità in quanto sono minimamente invasivi, il che riduce il rischio di infezione, dolore e cicatrici associate all'impianto2. Inoltre, poiché di solito vengono applicati come fluidi, si conformano perfettamente ai difetti tissutali e farmaci e cellule possono essere mescolati in essi immediatamente primadell'applicazione 3,4,5. Pertanto, mentre i biomateriali iniettabili possono essere fabbricati come siringhe precaricate, sono spesso preparati dai medici direttamente prima dell'applicazione. Ad esempio, i cementi iniziano a essere impostati una volta mescolate le fasi polvere e liquido e quindi non possono essere conservati per lunghi periodi primadell'uso 6. La caratterizzazione di questi materiali dipende quindi dal tempo e indissolubilmente legata alla loro preparazione.
I comuni biomateriali iniettabili includono cementi di calcio, metacrilato di polimetile, biosessi e vari idrogel polimerici3,7. A differenza delle iniezioni tradizionali di farmaci, che hanno le stesse proprietà reologiche dell'acqua, questi biomateriali iniettabili sono tipicamente più viscosi, non newtoniani, possono avere un certo carattere elastico e possono anche cambiare nel tempo. Pertanto, l'iniettabilità di questi materiali non può essere assunta, ma deve essere valutata sperimentalmente. Quantificando la forza necessaria per l'iniezione e correlandla alla facilità di iniezione, le prime decisioni su quali formulazioni di biomateriali, siringa e dimensioni dell'ago portare avanti possono essere prese all'inizio del processo di sviluppo8. Tali esperimenti possono anche quantificare gli effetti del cambiamento delle formulazioni sull'iniettabilità9.
Esistono diversi metodi per valutare le proprietà dei materiali iniettabili. La reologia rotazionale viene spesso utilizzata per valutare la viscosità, il comportamento non newtoniano, il recupero post-taglio, il tempo di impostazione e altreproprietà di questi materiali 10,11,12. Sebbene questo tipo di test sia utile per stabilire proprietà fondamentali dei materiali, queste proprietà non sono direttamente correlate all'iniettabilità. Per un fluido newtoniano e una siringa cilindrica e un ago, la forza di iniezione può essere stimata da una forma dell'equazione di Hagen-Poiseuille13:
Dove F è la forza richiesta per l'iniezione (N), R s è il raggio interno della siringa (m), R nè il raggio interno dell'ago (m), L è la lunghezza dell'ago (m), Q è la portata del fluido (m3 s-1), η è la viscosità dinamica (Pa.s) e F f èla forza di attrito tra lo stantuffo e la parete della canna (N). Pertanto, se la viscosità viene misurata tramite reologia rotazionale, le dimensioni della siringa e dell'ago sono note e la portata stimata, la forza di iniezione può essere stimata. Tuttavia, questa equazione non tiene conto dell'estremità conica della siringa o di altre geometrie, come le prese fuori centro, e Ff deveessere stimato o trovato sperimentalmente mediante prove meccaniche. Inoltre, i biomateriali non sono tipicamente newtoniani, ma mostrano proprietà reologiche complesse. Per un semplice fluido di assottigliamento a taglio, l'equazionediventa 14:
Dove n è l'indice di potenza (-) e K è l'indice di coerenza (Pa.sn) dall'espressione di Ostwald de Waele: , dove è la velocità di 
taglio 
(s-1). La complessità aumenta notevolmente per i materiali le cui proprietà reologiche non possono essere caratterizzate da due valori, e in particolare per i materiali dipendenti dal tempo come l'impostazione dei cementi. Inoltre, se le proprietà del materiale dipendono dalla cesoia, il materiale deve essere testato alla velocità di taglio prevista nell'ago, che può superare di gran lunga l'intervallo di un reometro rotazionale15.
Un altro metodo quantitativo per misurare l'iniettabilità consiste nel collegare sensori di pressione e spostamento a una siringa durante l'esecuzione di un'iniezione, a mano o utilizzando una pompa per siringhe. Questa apparecchiatura è relativamente economica, tuttavia, richiede agli utenti di generare script e curve di calibrazione per convertire in forza i dati16. Inoltre, una pompa per siringhe potrebbe non possedere una coppia sufficiente per comprimere lo stantuffo a una velocità precisa se sono necessarie forze elevate per estrudere materiali viscosi o semi-solidi. In alternativa, l'utilizzo di questi sensori durante l'iniezione a mano può essere utile in quanto possono essere utilizzati in uno scenario clinico reale, durante le procedurecliniche 17. Tuttavia, ciò richiederà molto più tempo e potrebbe introdurre pregiudizi da parte degli utenti e, pertanto, avrà bisogno di un numero maggiore di ripetizioni con utenti diversi per ottenere risultati affidabili. Questo può, quindi, essere più appropriato per i materiali che si trovano più in basso nella pipeline traslizionale o per i prodotti già in uso clinico.
In questo protocollo, un tester meccanico viene utilizzato per comprimere lo stantuffo a una velocità prestabilita e misurare la forza necessaria per farlo. Questo tipo di tester meccanico è comune nei laboratori dei materiali ed è stato utilizzato per quantificare l'iniettabilità per vari biomateriali18,19,20,21,22,23,24. Questo test può essere utilizzato con qualsiasi dimensione e geometria di siringa e ago, contenente qualsiasi materiale. Inoltre, nel caso di biomateriali che vengono realizzati immediatamente prima dell'uso, la procedura di formulazione esatta che sarebbe stata utilizzata in clinica o in chirurgia può essere seguita prima del test. Un ulteriore vantaggio di questa procedura è che è relativamente veloce; una volta impostato il tester meccanico, decine di campioni possono essere studiati in un'ora, a seconda della velocità di estrusione e del volume della siringa. Questo è in contrasto con la reologia rotazionale, che in genere richiede almeno 5 - 10 minuti per test, oltre a tempo di caricamento, equilibrazione e pulizia. L'utilizzo di un tester meccanico produce un tasso di estrusione affidabile equamente rispetto allo stantuffo, il che è particolarmente vantaggioso per le formulazioni viscose o quelle con proprietà dipendenti dal tempo. Dopo i test, è necessaria una post-elaborazione minima dei dati per estrarre valori importanti per confronti oggettivi.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Preparare il campione e caricarlo nella siringa.
- Per simulare una siringa precaricata, preparare il campione in anticipo, caricarlo nella siringa e attaccare l'ago. Conservare come richiesto, fino al test. Questo può essere adatto per idrogel e materiali che non cambiano con il tempo.
NOTA: Ad esempio, per preparare soluzioni alginate al 2%, sciogliere 2 g di sale di sodio acido alginico in 100 mL di acqua deionizzata, mescolando a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione in siringhe da 5 ml e conservare per 24 ore a temperatura ambiente. - In alternativa, per simulare un'iniezione formulata direttamente prima dell'applicazione, preparare il campione nello stesso modo in cui sarebbe stato fatto in clinica, consentendo eventuali tempi di impostazione. Caricare nella siringa e attaccare l'ago. Questo può essere adatto per cementi e materiali le cui proprietà cambiano con il tempo.
NOTA: Ad esempio, per preparare il cemento solfato di calcio, mescolare manualmente 4 g di emiidrato di solfato di calcio in 5 mL di acqua deionizzata con una spatola per 1 minuto. Rimuovere lo stantuffo dalla siringa e caricare il cemento nella canna della siringa con la spatola. Iniziare il test meccanico dopo 4 minuti.
ATTENZIONE: Gli aghi rappresentano un rischio per la sicurezza, se possibile utilizzare aghi smussati. Se il materiale contiene cellule o altri materiali biologici, si deve fare particolare attenzione a prevenire lesioni taglienti.
- Per simulare una siringa precaricata, preparare il campione in anticipo, caricarlo nella siringa e attaccare l'ago. Conservare come richiesto, fino al test. Questo può essere adatto per idrogel e materiali che non cambiano con il tempo.
2. Impostare il tester meccanico
- Attaccare le lastre piatte (per le prove di compressione) al tester meccanico.
- Dotare manualmente il collaudatore meccanico di una cella di carico con un carico massimo di 200 N.
NOTA: può essere utilizzata una cella di carico più grande, a condizione che abbia una precisione sufficiente nella gamma da 1 a 200 N. I campioni più viscosi e non destinati ad essere iniettati a mano possono richiedere una cella di carico più grande. - Separare le piastre, utilizzando i pulsanti di controllo manuali, per consentire spazio sufficiente per l'ago, la siringa e lo stantuffo (saranno sufficienti circa 30 cm).
- Creare un protocollo di test.
- Aprire la procedura guidata di test e impostare il tipo di test sulla compressione uniassiale.
- Impostare il pre-caricamento. Questo è il valore di forza misurato a cui inizierà il test. 0,5 N è sufficiente.
- Impostare la velocità per precaricarsi su 5 mm/min. Questa è la velocità con cui la traversa si sposterà verso il basso fino a quando non incontra il precarico.
- Impostare il carico sul controllo dello spostamento e selezionare una velocità di prova appropriata. 1 mm/s è una velocità appropriata per una siringa standard da 5 ml.
- Impostare un limite di forza superiore al quale interrompere il test, ad esempio 200 N. Ciò è dovuto principalmente a motivi di sicurezza. La prova può anche essere interrotta automaticamente a un determinato spostamento, ad esempio la lunghezza della siringa.
3. Impostare il sistema di bloccaggio
- Attaccare due set di morsetti a due supporti, con impugnature abbastanza grandi da garantire in modo sicuro la siringa scelta.
- Posizionare le impugnature tra la traversa e la base, con abbastanza spazio sotto le impugnature per la siringa e l'ago.
- Allineare i centri dei due appigli e allinearli con il centro della traversa.
NOTA: l'allineamento delle impugnature del morsetto tra loro e il centro della traversa possono richiedere del tempo e dell'iterazione per essere raggiunto, ma è importante acquisire dati di alta qualità. - Assicurarsi che i morsetti siano fissati saldamente in modo che non vi sia movimento nei morsetti quando viene applicata una forza verso il basso.
- Posizionare un piatto sulla piastra inferiore per raccogliere il materiale estruso.
4. Eseguire il protocollo di iniettabilità
- Inserire la siringa nelle impugnature del morsetto e chiuderle. Le impugnature dovrebbero tenere la siringa in posizione, ma consentirgli di muoversi su e giù senza resistenza.
- Assicurarsi che la siringa e lo stantuffo siano perpendicolari alla traversa. Ciò garantisce che venga misurata solo la compressione uniassiale del materiale.
NOTA: Una siringa vuota deve essere utilizzata per controllare i passaggi 4.1 e 4.2. - Abbassare la piastra superiore in una posizione appena sopra lo stantuffo, utilizzando i pulsanti di movimento manuali.
NOTA: Potrebbe essere possibile selezionare una 'posizione iniziale' nel protocollo del tester meccanico, in modo che la posizione originale sopra lo stantuffo venga raggiunta automaticamente ed è coerente durante il test. - Azzerare la forza misurata facendo clic su' ForzaZero '.
- Eseguire il protocollo di test premendo 'Esegui'.
ATTENZIONE: Lo sperimentatore deve essere sempre presente per osservare ogni prova e pronto ad attivare l'arresto di emergenza in caso di incidente. - Sollevare le piastre a un'altezza sufficiente, utilizzando i pulsanti di movimento manuali, in modo che la siringa possa essere rimossa.
- Ripetere il passaggio 4 per ogni campione.
NOTA: A questo punto, la siringa e il campione estruso possono essere scartati se non sono necessarie ulteriori analisi, ma possono essere conservati al fine di esaminare la pressatura del filtro, l'autoguarigione, gli effetti sulle cellule, ecc.
5. Raccolta dei dati
- Salvare i dati di ogni prova in un formato da cui è possibile generare una tabella di valori di forza e spostamento (.txt, .xls, .xlsx).
- Tracciate i risultati di ogni prova, con spostamento sull'asse x e forza sull'asse y.
- Leggi la forza massima (se esiste) e la forza del plateau dai grafici.
Representative Results
L'impianto del collaudatore meccanico e del sistema di bloccaggio è illustrato nella figura 1A. Questo protocollo genera una tabella e un grafico della forza rispetto allo spostamento per ogni campione testato. Una tipica curva di spostamento della forza è costituita da tre sezioni(Figura 1B):un gradiente iniziale, poiché lo stantuffo supera l'attrito dalla canna e il materiale viene accelerato, una forza massima e un plateau, poiché il materiale viene estruso a uno stato stazionario.
Tuttavia, esiste un massimo distinto solo quando la forza dell'altopiano è inferiore alla forza richiesta per accelerare lo stantuffo. Come tale, i picchi sono visti solo per campioni inviscidi che passano attraverso aghi larghi. Per i campioni viscosi che passano attraverso un orifizio più stretto, la forza necessaria per iniettare il campione a velocità costante è maggiore della forza necessaria per superare l'attrito nella canna e accelerare il materiale, e non si vede alcun picco distinto (Figura 1C). Per campioni altamente viscosi o aghi molto stretti, la forza necessaria per estrudere il materiale può essere così grande che la siringa si allaccia e fallisce, spesso con pochissima estrusione del materiale (Figura 1D). Se il materiale iniettato contiene particelle o è in fase di impostazione, come cemento, pressatura del filtro (espulsione preferenziale della fase liquida) o impostazione di massa, portando a un'iniezione incompleta(figura 1E).
Figura 1: Curve di esempio generate da questo protocollo. (A) Creazione del collaudatore meccanico per questo protocollo. (B) Tipica curva di estrusione della forza. (C) Curva di estrusione della forza senza picco massimo distinto. (D) Curva di estrusione forzata per guasto alla siringa. (E) Curva di estrusione forzata per un cemento di impostazione. Questa cifra è adattata da Robinson etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I test meccanici sono forse il modo più semplice e affidabile per quantificare l'iniettabilità. Un vantaggio fondamentale di questo protocollo è che non è richiesta alcuna attrezzatura speciale, a parte il tester meccanico, che è comune nei laboratori di materiali. Questo protocollo è altamente versatile; è possibile utilizzare qualsiasi materiale, misuratore di ago e dimensione della siringa, a condizione che la siringa possa essere alloggiata dai morsetti. Questo è stato verificato in questo protocollo per siringhe fino a 10 ml. Inoltre, il materiale può essere preparato esattamente come farebbe per l'applicazione del mondo reale25. Infine, questa procedura è molto veloce, prendendo solo fino a pochi minuti per campione, consentendo l'elaborazione di decine di campioni all'ora.
Per i campioni che forniscono curve tipiche, è possibile estrarre due valori: la forza massima e le curve di forza del plateau. La forza massima è probabilmente più oggettiva e può essere estratta computazalmente dalla tabella dati per ogni campione. Al contrario, la forza dell'altopiano può essere più rappresentativa, in quanto questa sarà la forza sperimentata per la maggior quantità di tempo e, come media, è meno influenzata da curve con grandi fluttuazioni. Queste fluttuazioni possono essere causate da bolle d'aria o particelle nel materiale che causano cambiamenti intermittenti man mano che vengono estruse, o da una bassa precisione dello strumento per piccole misurazioni della forza. Tuttavia, è notevole che, per molti campioni, non ci sia un picco massimo di forza, e quindi il valore massimo e plateau sono gli stessi. I confronti oggettivi tra le forze di iniezione possono essere effettuati purché venga utilizzato un valore coerente.
I dati ottenuti possono essere utilizzati in diversi modi. I valori della forza di iniettabilità possono essere confrontati con la facilità di iniezione, per stabilire quali formulazioni, siringhe e aghi sono praticabili per la traduzione8. In alternativa, il confronto tra campioni consente la quantificazione delle modifiche alle formulazioni sull'iniettabilità. Ad esempio, nei cementi, cambiare la viscosità della fase liquida, la distribuzione delle dimensioni delle particelle e aggiungere additivi come il citrato per alterare le proprietà colloidali, può avere grandi cambiamenti nell'iniettabilità9. Questi test possono anche informare il protocollo di formulazione per i cementi, ad esempio il tempo di miscelazione, il tempo di caricamento e il tempo di applicazione, per prestazioni ottimali di iniezione e post-iniezione. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per testare la fattibilità iniziale di nuovi bioinchiostri per la stampa 3D.
Questo protocollo può essere modificato in diversi modi. Il sistema di morsetto può essere sostituito con un costrutto stampato in 3D su misura per contenere la siringa, il che può rendere più facile garantire che la siringa e lo stantuffo siano perpendicolari alla traversa e che la siringa sia tenuta saldamente. L'ago può essere sostituito con una cannula o qualsiasi dispositivo che estrude il materiale per compressione di uno stantuffo e può essere di qualsiasi dimensione e geometria. Al fine di aumentare la fedeltà dei risultati, la punta dell'ago può essere posizionata in un tessuto o in un idrogel, al fine di simulare più accuratamente l'iniezione clinica. Tuttavia, ciò aggiunge ulteriori complessità al protocollo, poiché la composizione dei tessuti / gel e la profondità dell'ago devono essere mantenute costanti. Inoltre, questo protocollo utilizza l'estrusione controllata dallo spostamento, per misurare la forza necessaria per iniettare alla velocità specificata. In alternativa, è possibile specificare la forza di iniezione e misurare la quantità di estrusione rispetto al tempo. Questo può essere utile per materiali con proprietà dipendenti dal tempo, come i cementi. Ad esempio, utilizzando una correlazione tra forza di iniezione e facilità di iniettabilità per selezionare una forza8, questo protocollo può essere utilizzato per stabilire se l'intero volume di cemento può essere iniettato con questa velocità prima dell'impostazione. Infine, questo protocollo può essere facilmente combinato con altri esperimenti, al fine di testare l'effetto dell'iniezione sulle proprietà del materiale ed esaminare fenomeni come la pressatura del filtro e l'autoguarigione, o l'effetto dell'iniezione sulle cellule.
La limitazione principale di questo protocollo è che è necessario un tester meccanico universale. Sebbene questi siano comuni nei laboratori di test dei materiali, sono costosi da acquistare se l'utente non può accedervi. Inoltre, il tester meccanico fornisce una compressione uniassiale a una forza impostata o a una velocità di spostamento, mentre la forza applicata e la velocità di iniezione possono variare nel corso dell'iniezione a mano. Questo protocollo non è adatto anche per replicare alcune iniezioni del mondo reale, come iniezioni in tessuti complessi in teatro o iniettare da diverse angolazioni. Per quantificare la forza di iniezione in clinica, i trasduttori di forza e spostamento possono essere un metodo migliore.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dall'EPSRC CDT for Formulation Engineering presso la School of Chemical Engineering dell'Università di Birmingham, Regno Unito, Grant reference EP/L015153/1 e dal Royal Centre for Defence Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
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