Summary
Здесь представлен протокол количественной оценки инъекционной пригодности материала через систему шприц-иглы с использованием стандартной механической испытательной установки.
Abstract
Инъекционные биоматериалы становятся все более популярными для минимально инвазивной доставки лекарств и клеток. Эти материалы, как правило, более вязкие, чем традиционные акальные инъекции и могут быть полутвердые, поэтому их инъекционные нельзя предположить. Этот протокол описывает метод объективной оценки инъекционной пригодности этих материалов с помощью стандартного механического тестера. Шприц-поршень сжимается поперечной головой с установленной скоростью, и сила измеряется. Максимальное значение силы или значения силы плато может быть использовано для сравнения выборок или до абсолютного предела силы. Этот протокол может быть использован с любым материалом, и любой шприц и размер иглы или геометрии. Полученные результаты могут быть использованы для принятия решений о формулировках, размерах шприцев и игл в начале процесса перевода. Кроме того, влияние изменения формулировок на инъекционные препараты может быть количественно, и оптимальное время для введения временно меняющихся материалов определяется. Этот метод также подходит в качестве воспроизводимого способа изучения влияния инъекций на материал, для изучения таких явлений, как самовосстановление и фильтрация нажатия или изучения влияния инъекций на клетки. Этот протокол быстрее и более непосредственно применим к инъекционной, чем вращательной реологии, и требует минимальной обработки после получения ключевых значений для прямых сравнений.
Introduction
Биоматериалы часто изучаются и используются в качестве эшафотов для регенерации тканей на клеточной основе и складов для целенаправленной, устойчивой доставкитерапевтических средств 1. В этой области, инъекционные биоматериалы растут в популярности, поскольку они являются минимально инвазивными, что снижает риск инфекции, боли и рубцов, связанных симплантацией 2. Кроме того, поскольку они обычно применяются в качестве жидкости, они идеально соответствуют дефектам тканей, и препараты и клетки могут быть смешаныв них непосредственно перед применением 3,4,5. Таким образом, в то время как инъекционные биоматериалы могут быть изготовлены в качестве предварительно загруженных шприцев, они часто готовятся врачами непосредственно перед применением. Например, цементы начинают устанавливать после того, как порошок и жидкие фазы смешиваются, и поэтому не могут храниться в течение длительных периодов времени передиспользованием 6. Таким образом, характеристика этих материалов зависит от времени и неразрывно связана с их подготовкой.
Общие инъекционные биоматериалы включают цементы кальция, полиметил метакрилат, биогласы, и различные полимерныегидрогели 3,7. В отличие от традиционных инъекций препаратов, которые имеют те же реологические свойства, что и вода, эти инъекционные биоматериалы, как правило, более вязкие, неньютоновские, могут иметь некоторый эластичный характер, а также могут меняться с течением времени. Поэтому нельзя предположить, что инъекционные эти материалы могут быть оценены экспериментально. Путем количественной оценки силы, необходимой для инъекций, и соотнося ее с легкостью инъекций, ранние решения о том, какие биоматериалы, шприц и размеры иглы, чтобы двигаться вперед, могут быть приняты на раннихстадиях процесса развития 8. Такие эксперименты могут также количественно влияние изменения формулировок на инъекционной9.
Существует несколько методов оценки свойств инъекционных материалов. Вращательной реологии часто используется для оценки вязкости, неньютоновского поведения, пост-шир восстановления, установление времени, идругие свойства этих материалов 10,11,12. Хотя этот тип теста полезен для установления фундаментальных свойств материалов, эти свойства не коррелируют непосредственно с инъекционной. Для ньютоновской жидкости и цилиндрических шприцев и иглы, инъекционная сила может быть оценена из формы уравнения Хаген-Пуазей13:
Там, где F является силой, необходимой для инъекций (N), Rs является внутренним радиусом шприца (м), Rn - внутренним радиусом иглы (м), L - длиной иглы (м), - это скорость потока жидкости(м 3 с-1),η - динамическая вязкость (Pa.s) и Ff - сила трения между поршенем и стенкой ствола (N). Таким образом, если вязкость измеряется с помощью вращательной реологии, размеры шприца и иглы известны и скорость потока оценивается, сила инъекции может быть оценена. Тем не менее, это уравнение не учитывает конический конец шприца или любые другие геометрии, такие как внецентровые розетки, и Ffдолжны быть оценены или найдены экспериментально путем механического тестирования. Кроме того, биоматериалы, как правило, не ньютоновские, но обладают сложными реологическими свойствами. Для простого истончения жидкости стрижки, уравнениестановится 14:
Где n является индекс мощности (-) и K является индекс согласованности (Pa.sn) от выражения Ostwald de Waele: , где 
скорость 
стрижки (s-1). Сложность значительно возрастает для материалов, реологические свойства которых не могут характеризоваться двумя значениями, и особенно для зависящих от времени материалов, таких как установка цементов. Кроме того, если свойства материала зависят от снора, то материал должен быть протестирован на скорости снора, ожидаемой в игле, которая может намного превышать диапазон вращательногореометра 15.
Другой количественный метод измерения инъекционной пригодности включает в себя присоединение датчиков давления и смещения к шприцу при выполнении инъекции, либо вручную, либо с помощью шприц-насоса. Это оборудование является относительно недорогим, однако, требует от пользователей для создания скриптов и кривых калибровки для преобразования в силу данных16. Кроме того, шприц-насос может не обладать достаточным крутящим моментом для сжатия поршеня с точной скоростью, если требуются высокие силы для экструды вязких или полутвердых материалов. Кроме того, использование этих датчиков при введении вручную может быть полезно, поскольку они могут быть использованы в реальном клиническом сценарии, во время клинических процедур17. Тем не менее, это займет гораздо больше времени и может ввести предвзятость пользователей, и, следовательно, потребуется большее количество повторений с различными пользователями для получения надежных результатов. Таким образом, это может быть более подходящим для материалов, которые находятся дальше по трансляционной конвейеру, или продуктов, уже используемых в клинических условиях.
В этом протоколе используется механический тестер для сжатия поршеня с установленной скоростью и измерения силы, необходимой для этого. Этот тип механического тестера распространен в лабораториях материалов и был использован для количественной оценки инъекцийдля различных биоматериалов 18,19,20,21,22,23,24. Этот тест может быть использован с любым размером и геометрией шприца и иглы, содержащей любой материал. Кроме того, в случае биоматериалов, которые сделаны непосредственно перед использованием, точная процедура разработки, которая будет использоваться в клинике или хирургии может быть продолжена до тестирования. Еще одним преимуществом этой процедуры является то, что она является относительно быстрой; как только механический испытатель настроен, десятки образцов могут быть изучены в час, в зависимости от скорости экструзии и объема шприца. Это контрастирует с вращательной реологией, которая обычно занимает не менее 5 - 10 минут за тест, плюс загрузка, равномерность и время очистки. Использование механического тестера производит надежную скорость экструзии в равной степени по сравнению с поршенем, что особенно выгодно для вязких составов или тех, у кого есть зависящие от времени свойства. После тестирования требуется минимальная после обработки данных для получения важных значений для объективного сравнения.
Protocol
1. Подготовка образцов
- Подготовь образец и загрузи его в шприц.
- Чтобы имитировать предварительно загруженный шприц, подготовите образец заранее, загрузите его в шприц и прикрепите иглу. Хранить по мере необходимости, до тестирования. Это может быть подходящим для гидрогели и материалов, которые не меняются со временем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для приготовления 2% альгинатных растворов растворяют 2 г соли натрия альгиновой кислоты в 100 мл деионизированной воды, помешивая при комнатной температуре. Аспирировать раствор в 5 мл шприцев и хранить 24 ч при комнатной температуре. - Кроме того, чтобы имитировать инъекцию, сформулированную непосредственно перед применением, подготовить образец таким же образом, он будет сделан в клинике, что позволяет в любое время установки. Загрузите в шприц и прикрепите иглу. Это может быть подходящим для цементов, и материалы, свойства которых меняются со временем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для приготовления цемента сульфата кальция, вручную смешать 4 г сульфата кальция гемигидрат в 5 мл деионизированной воды с шпателем в течение 1 мин. Снимите поршень со шприца и загрузите цемент в бочку со шпателем. Начните механическое тестирование через 4 мин.
ВНИМАНИЕ: Иглы представляют угрозу безопасности, использовать тупые иглы, если это возможно. Если материал содержит клетки или другие биологические материалы, следует принять дополнительные меры для предотвращения острых травм.
- Чтобы имитировать предварительно загруженный шприц, подготовите образец заранее, загрузите его в шприц и прикрепите иглу. Хранить по мере необходимости, до тестирования. Это может быть подходящим для гидрогели и материалов, которые не меняются со временем.
2. Настройка механического тестера
- Прикрепите плоские пластины (для компрессионного тестирования) к механическому тестеру.
- Вручную оснастить механический испытатель грузоподъемной ячейкой с максимальной нагрузкой 200 Н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использована большая нагрузка ячейки, при условии, что она имеет достаточную точность в диапазоне 1 - 200 N. Образцы, которые являются более вязкими и не предназначены для введения вручную может потребовать большей нагрузки ячейки. - Отделяйте пластины, используя кнопки ручного управления, чтобы обеспечить достаточно места для иглы, шприца и поршеня (около 30 см будет достаточно).
- Создайте протокол тестирования.
- Откройте тестовый мастер и установите тип теста для одноосного сжатия.
- Установите предварительную нагрузку. Это измеренное значение силы, с которого начнется тестирование. 0,5 Н достаточно.
- Установите скорость предварительной загрузки до 5 мм/мин. Это скорость кроссхед будет двигаться вниз, пока он не сталкивается с предварительной нагрузкой.
- Установите нагрузку для управления перемещением и выберите соответствующую скорость тестирования. 1 мм/с является подходящей скоростью для стандартного шприца 5 мл.
- Установите верхний предел силы, при котором остановить тест, например, 200 Н. Это в первую очередь по соображениям безопасности. Тест также может быть автоматически остановлен при данном перемещении, например, длина шприца.
3. Настройка системы зажима
- Прикрепите два комплекта зажимов к двум стендам, с рукоятками достаточно большими, чтобы надежно укрыться от выбранного шприца.
- Поместите ручки между поперечной головой и базой, с достаточным пространством ниже захватов для шприца и иглы.
- Выстроить центры двух захватов, и выстроить их с центром поперечного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание зажима сжимает друг с другом и центр кроссхеда может занять некоторое время и итерации для достижения, но важно, чтобы получить высококачественные данные. - Убедитесь, что зажимы надежно закреплены таким образом, чтобы не было движения в зажимах при применении нисходящей силы.
- Поместите блюдо на нижнюю тарелку, чтобы собрать экструдированную материал.
4. Запуск протокола инъекционной
- Вставьте шприц в зажим ручки и закрыть их. Ручки должны держать шприц на месте, но позволяют ему двигаться вверх и вниз без сопротивления.
- Убедитесь, что шприц и поршень перпендикулярны кроссхеду. Это гарантирует, что будет измеряться только одноосное сжатие материала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пустой шприц следует использовать для проверки шагов 4.1 и 4.2. - Опустите верхнюю пластину в положение чуть выше поршеня, используя кнопки ручного движения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе механического тестераможновыбрать позицию «Старт», чтобы исходное положение над поршенем было достигнуто автоматически и соответствовало всему тестированию. - Нулевой измеренной силы, нажав 'нулевой силы'.
- Запустите протокол тестирования, нажав'Run'.
ВНИМАНИЕ: Экспериментатор должен всегда присутствовать, чтобы наблюдать за каждым испытанием, и готов активировать аварийную остановку в случае неудачи. - Поднимите пластины на достаточную высоту, используя кнопки ручного движения, так что шприц может быть удален.
- Повторите шаг 4 для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, шприц и экструдированная образец могут быть отброшены, если не требуется дальнейший анализ, но могут быть сохранены для того, чтобы изучить нажатие фильтра, самовосстановление, воздействие на клетки и т.д.
5. Сбор данных
- Сохраните данные из каждого исследования в формате, из которого может быть создана таблица значений силы и перемещения (.txt, .xls, .xlsx).
- Участок результаты каждого испытания, с перемещением на x-оси и силы на оси.
- Прочитайте максимальную силу (если она существует) и силу плато из графиков.
Representative Results
Настройка механического тестера и системы зажима показана на рисунке 1A. Этот протокол генерирует таблицу и график силы по сравнению с перемещением для каждого тестного образца. Типичная кривая смещения силы состоит изтрех секций (рисунок 1B):начальный градиент, так как поршень преодолевает трение от ствола и материал ускоряется, максимум силы, и плато, так как материал выдавливается в устойчивом состоянии.
Однако, отчетливый максимум существует только там, где сила плато ниже, чем сила, необходимая для ускорения поршеня. Таким образом, пики видны только для inviscid образцов, проходящих через широкие иглы. Для вязких образцов, проходящих через более узкое отверстие, сила, необходимая для впрыскивки образца на постоянной скорости, больше, чем сила, необходимая для преодоления трения в бочке и ускорения материала, и не наблюдается четкого пика(рисунок 1C). Для высоко вязких образцов или очень узких игл, сила, необходимая для экструды материала может быть настолько велика, что шприц пряжки и не удается, часто с очень небольшим экструзии материала (Рисунок 1D). Если впрыскиваемый материал содержит частицы или проходит установку, такие как цемент, нажатие фильтра (преференциальное изгнание жидкой фазы) или навалом настройки могут произойти, что приводит к неполной инъекции (рисунок 1E).
Рисунок 1: Пример кривых, генерируемых этим протоколом. (A)Настройка механического тестера для этого протокола. (B)Типичная кривая экструзии силы. (C)Кривая форс-экструзии без четкого максимального пика. (D)Кривая форс-экструзии для отказа шприца. (E)Кривая форс-экструзии для установки цемента. Эта цифра адаптирована из Робинсон и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Механическое тестирование, пожалуй, самый простой и надежный способ количественной оценки инъекционной. Ключевым преимуществом этого протокола является то, что не требуется специального оборудования, кроме механического испытателя, что распространено в лабораториях материалов. Этот протокол является весьма универсальным; любой материал, датчик иглы и размер шприца могут быть использованы, при условии, что шприц может быть размещен зажимами. Это было проверено в этом протоколе для шприцев до 10 мл. Кроме того, материал может быть подготовлен точно так же, как это было бы для реального приложения25. Наконец, эта процедура очень быстрая, занимает всего до нескольких минут на образец, что позволяет обрабатывать десятки образцов в час.
Для образцов, которые дают типичные кривые, можно извлечь два значения: максимальную силу и кривые силы плато. Максимальная сила, возможно, является более объективной и может быть извлечена вычислительно из таблицы данных для каждой выборки. И наоборот, сила плато может быть более репрезентативной, поскольку это будет сила, переживаемая в течение наибольшего количества времени, и, как в среднем, в меньшей степени зависит от кривых с большими колебаниями. Эти колебания могут быть вызваны пузырьками воздуха или частицами в материале, вызывающими периодические изменения по мере их экструдирования, или низкой точностью приборов для небольших измерений силы. Тем не менее, примечательно, что для многих образцов, нет максимального пика силы, и поэтому максимальное и плато значение то же самое. Объективные сравнения между инъекционными силами могут быть сделаны до тех пор, пока используется последовательное значение.
Полученные данные можно использовать несколькими способами. Значения силы инъекций можно сравнить с легкостью инъекций, чтобы установить, какие формулировки, шприцы и размеры игл являются жизнеспособными для перевода8. Кроме того, сравнение между образцами позволяет количественно оценить изменения в формулировках по инъекционной. Например, в цементах, изменяя вязкость жидкой фазы, распределение размера частиц, и добавление добавок, таких как цитрат, чтобы изменить коллоидные свойства, может иметь большие изменения в инъекционной9. Эти тесты могут также информировать протокол разработки для цементов, например, время смешивания, время загрузки и время для применения, для оптимальной инъекции и после инъекций производительности. Кроме того, этот метод может быть использован для проверки первоначальной осуществимости новых биоинкв для 3D-печати.
Этот протокол может быть изменен несколькими способами. Система зажима может быть заменена заказной 3D печатной конструкцией для хостим шприца, что может облегчить обеспечение того, чтобы шприц и поршень перпендикулярно поперечной голове, а шприц держался надежно. Иглу можно заменить канюлей или любым устройством, которое выдавливает материал путем сжатия поршеня и может быть любого размера и геометрии. Для того, чтобы увеличить точность результатов, кончик иглы может быть помещен в ткань или гидрогель, для того, чтобы более точно имитировать клинические инъекции. Однако это добавляет дополнительных сложностей протоколу, так как состав ткани/геля и глубина иглы должны оставаться неизменными. Кроме того, в этом протоколе используется экструзия, контролируемая перемещением, для измерения силы, необходимой для инъекций на заданной скорости. Кроме того, сила инъекции может быть указана, и количество экструзии может быть измерено со временем. Это может быть полезно для материалов с зависящими от времени свойствами, такими как цементы. Например, используя корреляцию между силой впрыска и легкостью инъекционной установки длявыбора силы 8,этот протокол может быть использован для установления того, может ли весь объем цемента быть введен с этой скоростью до установки. Наконец, этот протокол можно легко комбинировать с другими экспериментами, чтобы проверить влияние инъекций на свойства материала и изучить такие явления, как нажатие фильтра и самовосстановление, или влияние инъекций на клетки.
Основным ограничением этого протокола является то, что требуется универсальный механический тестер. Хотя они являются общими в лабораториях тестирования материалов, они являются дорогостоящими для покупки, если пользователь не может получить доступ к одному. Кроме того, механический испытатель обеспечивает одноосное сжатие либо при установленной силе, либо при скорости смещения, в то время как применяемая сила и скорость впрыска могут варьироваться в течение инъекций вручную. Этот протокол также непригоден для репликации некоторых инъекций реального мира, таких как инъекции в сложные ткани в театре, или инъекций под разными углами. Для количественной оценки силы инъекций в клинике, силы и перемещения превью может быть лучшим методом.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась EPSRC CDT для разработки инженерии в Школе химической инженерии в Университете Бирмингема, Великобритания, Грант ссылки EP/L015153/1, и Королевский центр оборонной медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginic Acid Sodium Salt | Sigma | A2033-100G | |
| Blunt Needles | Needlez | NB19G1.5 | Any size may be used, depending on application |
| Calcium Sulphate Hemihydrate | Acros Organics | 22441.296 | |
| Clamp stand | Eisco | MTST5 | Two required |
| Clamps | R&L Enterprises | 41 | Two required, should have flat tops |
| Syringes | BD | 307731 | Any size can be used, depending on application |
| Universal Mechanical Tester | Zwick Roell | Z030 |
References
- Webber, M. J., Appel, E. A., Meijer, E. W., Langer, R.
- Mathew, A. P., Uthaman, S., Cho, K. -H., Cho, C. -S., Park, I. -K. Injectable hydrogels for delivering biotherapeutic molecules. International Journal of Biological Macromolecules. 110, 17-29 (2018).
- Zhou, H., et al. Injectable biomaterials for translational medicine. Materials Today. 28, 81-97 (2019).
- Alves, H. L. R., dos Santos, L. A., Bergmann, C. P. Injectability evaluation of tricalcium phosphate bone cement. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 19, 2241-2246 (2008).
- Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chemical Society Reviews. 37, 1473 (2008).
- Pawelec, K. M., Planell, J. A. Bone Repair Biomaterials: Regeneration and Clinical Applications. , Elseiver, Woodhead Publishing. (2019).
- Fernandez de Grado, G., et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. Journal of Tissue Engineering. 9, 204173141877681 (2018).
- Robinson, T. E., et al. Filling the Gap: A Correlation between Objective and Subjective Measures of Injectability. Advanced Healthcare Materials. , 1901521 (2020).
- O'Neill, R., et al. Critical review: Injectability of calcium phosphate pastes and cements. Acta Biomaterialia. 50, 1-19 (2017).
- Gantar, A., et al. Injectable and self-healing dynamic hydrogel containing bioactive glass nanoparticles as a potential biomaterial for bone regeneration. RSC Advances. 6, 69156-69166 (2016).
- Ramin, M. A., Latxague, L., Sindhu, K. R., Chassande, O., Barthélémy, P. Low molecular weight hydrogels derived from urea based-bolaamphiphiles as new injectable biomaterials. Biomaterials. 145, 72-80 (2017).
- Ren, K., He, C., Xiao, C., Li, G., Chen, X. Injectable glycopolypeptide hydrogels as biomimetic scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 51, 238-249 (2015).
- Burckbuchler, V., et al. Rheological and syringeability properties of highly concentrated human polyclonal immunoglobulin solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76, 351-356 (2010).
- Allmendinger, A., et al. Rheological characterization and injection forces of concentrated protein formulations: An alternative predictive model for non-Newtonian solutions. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87, 318-328 (2014).
- Davison, P. F. The Effect of Hydrodynamic Shear on the Deoxyribonucleic Acid from T2 and T4 Bacteriophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 45, 1560-1568 (1959).
- Chen, M. H., et al. Methods to Assess Shear-Thinning Hydrogels for Application As Injectable Biomaterials. ACS Biomaterials Science and Engineering. 3, 3146-3160 (2017).
- Krebs, J., et al. Clinical measurements of cement injection pressure during vertebroplasty. Spine. 30, (2005).
- Bohner, M., Baroud, G.
- Gbureck, U., Barralet, J. E., Spatz, K., Grover, L. M., Thull, R. Ionic Modification of Calcium Phosphate Cement Viscosity. Part I: Hypodermic Injection and Strength Improvement of Apatite Cement. Biomaterials. 25, 2187-2195 (2004).
- Habib, M., Baroud, G., Galea, L., Bohner, M. Evaluation of the ultrasonication process for injectability of hydraulic calcium phosphate pastes. Acta Biomaterialia. 8, 1164-1168 (2012).
- Martin, B. C., Minner, E. J., Wiseman, S. L., Klank, R. L., Gilbert, R. J. Agarose and methylcellulose hydrogel blends for nerve regeneration applications. Journal of Neural Engineering. 5, 221-231 (2008).
- Borzacchiello, A., Russo, L., Malle, B. M., Schwach-Abdellaoui, K., Ambrosio, L. Hyaluronic Acid Based Hydrogels for Regenerative Medicine Applications. BioMed Research International. 2015, 871218 (2015).
- Zhao, L., Weir, M. D., Xu, H. H. K. An injectable calcium phosphate-alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 31, 6502-6510 (2010).
- Ji, D. -Y., Kuo, T. -F., Wu, H. -D., Yang, J. -C., Lee, S. -Y. A novel injectable chitosan/polyglutamate polyelectrolyte complex hydrogel with hydroxyapatite for soft-tissue augmentation. Carbohydrate Polymers. 89, 1123-1130 (2012).
- Vaishya, R., Chauhan, M., Vaish, A.
