Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolasjon og kultur av Chick Ciliary Ganglion Neurons

doi: 10.3791/61431 Published: August 8, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Chick ciliary ganglia (CG) er en del av det parasympatiske nervesystemet. Nevronale kulturer av kylling CG nevroner ble vist å være effektive cellemodeller i studiet av nervemuskel interaksjoner. Vi beskriver en detaljert protokoll for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av CG nevroner fra chick embryoer.

Abstract

Chick ciliary ganglia (CG) er en del av det parasympatiske nervesystemet og er ansvarlige for innervering av muskelvevet som er tilstede i øyet. Denne ganglion er sammensatt av en homogen populasjon av ciliary og choroidal nevroner som innervate striated og glatt muskelfibre, henholdsvis. Hver av disse nevronale typene regulerer spesifikke øyestrukturer og funksjoner. Gjennom årene, nevronale kulturer av chick ciliary ganglia ble vist å være effektive cellemodeller i studiet av muskel-nervesystem interaksjoner, som kommuniserer gjennom kolinerge synapser. Ciliary ganglion nevroner er, i sitt flertall, kolinerg. Denne cellemodellen har vist seg å være nyttig relativt til tidligere brukte heterogene cellemodeller som består av flere nevronale typer, foruten kolinerge. Anatomisk er ciliary ganglion lokalisert mellom optisk nerve (ON) og choroid fissur (CF). Her beskriver vi en detaljert prosedyre for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av ciliary ganglia nevroner fra kylling embryoer. Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å oppnå svært rene og stabile cellulære kulturer av CG-nevroner, og fremhever viktige trinn i prosessen. Disse kulturene kan opprettholdes in vitro i 15 dager, og herved viser vi den normale utviklingen av CG-kulturer. Resultatene viser også at disse nevronene kan samhandle med muskelfibre gjennom nevromuskulerte kolinerge synapser.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ciliary ganglion (CG) nevroner tilhører det parasympatiske nervesystemet. Disse nevronene er kolinerge, å kunne etablere muskariiniske eller nikotiniske synapser1,2,3. Anatomisk ligger CG i den bakre delen av øyet mellom synsnerven (ON) og choroidfissur (CF) og består av rundt 6000 nevroner i tidlige embryonale stadier1,4. For den første uken i kulturen presenterer ciliary ganglion nevroner en multipolar morfologi. Etter en uke begynner de å gå over til en unipolar tilstand, med en neurite som strekker seg og danner axon5. I tillegg dør omtrent halvparten av CG-nevronene mellom 8th og 14th dag av chick embryo utvikling, gjennom en programmert prosess med celledød. Denne nedgangen i antall nevroner resulterer i en total populasjon av ciliary ganglion av rundt 3000 nevroner6,7,8. In vitro, det er ingen reduksjon i antall CG nevroner når dyrket med muskelceller9 og CG nevroner kan dyrkes i flere uker1,9.

Ciliary ganglion består av en homogen populasjon av ciliary nevroner og choroidal nevroner, som hver representerer halvparten av den nevronale befolkningen i CG, innervating muskelen i øyet. Disse to typer nevroner er strukturelt, anatomisk og funksjonelt distinkt. Ciliary nevroner innervate striated muskelfibre på iris og linse, som er ansvarlig for elev sammentrekning. Choroidal nevroner innervate glatt muskelen i choroid1,10,11,12.

Kulturer av kylling ciliary ganglion nevroner har vist seg å være nyttige verktøy for studiet av nevromuskulære synapser og synapseformasjon 1,5,9. Tatt i betraktning at nevromuskulære synapser er kolinerge13, ved hjelp av en nevronal populasjon som er kolinerge – CG nevroner - dukket opp som et potensielt alternativ til tidligere cellemodeller14. Disse modellene besto i en heterogen nevronal befolkning, der bare en liten del er kolinerg. Alternativt utvikler ciliary ganglion nevroner relativt rask in vitro, og etter ca 15 timer danner allerede synapser1. CG nevroner har blitt brukt som et modellsystem gjennom årene for forskjellige forskningsstudier, på grunn av sin relativt enkle isolasjon og manipulasjon. Disse programmene inkluderer optogenetiske studier, synapse utvikling, apoptose og nevromuskulære interaksjoner14,15.

Vi beskriver en detaljert prosedyre for disseksjon, dissosiasjon og in vitro kultur av ciliary ganglia nevroner fra embryonale dag 7 (E7) chick embryoer. Vi tilbyr en trinnvis protokoll for å oppnå svært rene og stabile cellulære kulturer av kolinerge nevroner. Vi fremhever også viktige trinn i protokollen som krever spesiell oppmerksomhet, og som vil forbedre kvaliteten på nevronale kulturer. Disse kulturene kan opprettholdes in vitro i minst 15 dager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tilberedning av reagenser

MERK: Materialene som er nødvendige for denne prosedyren er følgende: tang (nº 5 og nº 55), kirurgiske pinsett, disseksjon Petri retter (svart bunn), 24-brønnplater, plast Pasteur pipette, brannpolert glass Pasteur pipette, 10 ml sprøyte, 0,22 μm sprøytefilter.

  1. Forbered og steriliser alt materialet som trengs for protokollen, inkludert glassdeksler, tang (nº 5 og nº 55), kirurgiske pinsett, Petri-retter (svart bunn), destillert H2O, pipetter og materiale for kirurgi.
  2. Forbered 0,1 mg/ml poly-d-lysin (PDL) oppløsning.
    1. Rekonstituer PDL i 0,1 M boratbuffer (pH 8.2) til en konsentrasjon på 1 mg/ml (10x oppløsning).
    2. Fortynn 1:10 i 166,6 mM boratbuffer (pH 8.2) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,1 mg/ml.
  3. Forbered 10 μg/ml lamininoppløsning.
    1. Fortynn 1 mg/ml laminin i vanlig nevrobasal medium til en endelig konsentrasjon på 10 μg/ml.
  4. Forbered Hanks balanserte saltløsning (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4·2H2O, 5 mM glukose, 1 mM natriumpyuvat, 10 mM HEPES buffer, 0,001% fenol rød. Juster pH til 7.2.
  5. Forbered 0,1% trypsin løsning.
    1. Oppløs 5 mg trypsin 1:250 pulver i 5 ml HBSS for en endelig konsentrasjon på 0,1%.
    2. Plasser i en rullemikser ved 4 °C til den er fullstendig oppløst.
    3. Filtrer med en 10 ml sprøyte og et 0,22 μm sprøytefilter.
  6. Forbered ciliary ganglia ufullstendig medium: neurobasal medium uten glutamin, 1X B27 (fotofølsom), 10% varme-inaktivert hest serum, 2% varme-inaktivert FBS, 12,5 U / ml penicillin / streptomycin (0.25x) og 2 mM glutamin. Bruk sterile reagenser og klargjør mediet under sterile forhold.
  7. Forbered ciliary ganglia komplett medium (supplert med vekstfaktorer): til ufullstendig medium, tilsett 5 ng / ml GDNF og 5 ng / ml CNTF.

2. Tilberedning av glassdeksler for 24-brønnplater

  1. Plasser ønsket antall glassdeksler i en syrebestandig beholder og tilsett 65% salpetersyre til alle dekkslips er nedsenket. Plasser beholderen i en orbital shaker og inkuber over natten ved romtemperatur (RT) med en hastighet på 1000 rpm.
  2. Neste dag, forsiktig overføre salpetersyre til et lite reservoar og lagre for videre bruk. Salpetersyre kan brukes på nytt 2-3x.
  3. Legg destillert H2O forsiktig til dekkslipsene for å fjerne gjenværende salpetersyre. Plasser i agitasjon i 30 minutter, kast vaskeoppløsningen og gjenta denne 5x.
  4. Skyll dekklipsene med 75% etanol to ganger.
  5. Lukk forsiktig og plasser individuelle dekkslepper i et metallstativ dekket med aluminiumsfolie og inkuber ved 50 ºC i 10-15 minutter eller til det er helt tørt.
    MERK: Ikke autoklaver glassdeksler som de vil holde seg til hverandre.
  6. Steriliser dekkslipsene under UV-lys i 10-15 minutter. Opprettholde dekklips steril for nevronal vev kultur.

3. Belegg av glassdeksler for 24-brønnplater

  1. Bruk en steril pinsett, plasser en deksler i hver brønn av en 24-brønnplate.
  2. Tilsett 500 μL på 0,1 mg/ml PDL og inkuber over natten ved 37 °C.
  3. Neste dag, skyll dekkslips to ganger med steril destillert H2O. Tilsett deretter 500 μL destillert vann til hver dekkslip og la stå i 30 minutter ved romtemperatur.
  4. Kast vannet og tilsett 350 μL 10 μg/ml lamininoppløsning i hver brønn.
  5. Plasser i en 37 °C inkubator i 2 timer.
  6. Før celleplating, fjern lamininoppløsningen og vask to ganger med vanlig neurobasal medium.
    MERK: Det er viktig at dekkslipsene ikke tørker når som helst.
  7. Tilsett 300 μL komplett medium og la det stå i en inkubator ved 37 °C og 5 % CO2 til platingtid. Fjern dette mediet før du plating celler.

4. Kultur av ciliary ganglia fra kylling embryo (embryonal dag 7)

  1. Disseksjon av ciliary ganglia (CG)
    1. Fjern egg fra inkubator og spray dem med 75% etanol.
      MERK: Egg lagres ved ca. 16 °C før de inkuberes ved 37,7 °C i 7 dager (eller ønsket embryonal stadium). Egg som brukes her er fra Ross kylling arter.
    2. Klipp toppen av egget med en saks og ta ut embryoet ved hjelp av en skje. Legg embryoet i en petriskål med iskald HBSS og skill hodet fra kroppen ved å kutte i nakkeområdet.
      MERK: Så snart embryoet er fjernet fra egget, kan det produsere proteaser som er ansvarlige for celledød. Det er viktig å raskt skille hodet fra kroppen når embryoet er utenfor skallet for å minimere celledød.
    3. Hold embryoets hode i iskalde HBSS.
    4. Hold embryohodet opp og fest det i nebbet til kyllingen med nº 5 tang. Deretter med nº 55 tang, begynn å fjerne det tynne laget av huden rundt øyet.
    5. Fjern forsiktig øyet og roter det for å få tilgang til den bakre delen. Mens du skiller øyet fra hodet på kyllingen, legg merke til at optisk nerve blir seksjonert. Dette vil bidra til å lokalisere ciliary ganglion.
    6. Når øyet er skilt, hold det med bakre side opp og legg merke til ciliary ganglion ved siden av den seksjonerte optiske nerven og choroid sprekk. Den preganglionic nerve kan fortsatt være festet til ciliary ganglion, som letter identifisering.
    7. Dissekere ciliary ganglion fra hvert øye og rengjør veldig godt ved å fjerne overflødig vev rundt hver ganglion.
      MERK: For å ha et utbytte på ~ 1x106 celler / ml, dissekere ~ 70 CGs. Vær oppmerksom på at cellepopulasjonen som er oppnådd, også inneholder ikke-nevronale celler. For å redusere antall ikke-nevronale celler og dermed øke renheten til den nevronale befolkningen, er det svært viktig å rengjøre ciliary ganglia så mye som mulig, fjerne alt overflødig vev.
  2. Dissosiasjon og kultur av ciliary ganglia
    1. Samle alle ciliary ganglia til en 15 ml rør ved hjelp av en steril plast Pasteur pipette.
      MERK: Det er viktig å fukte Pasteur-pipetten for å minimere feste av ganglia til veggen på pipetten.
    2. Sentrifuger ciliary ganglia i 2 minutter ved 200 x g.
    3. Fjern forsiktig alt HBSS-mediet ved hjelp av en Pasteur pipette og deretter en P1000 mikropipette. Tilsett 1 ml 0,1% trypsinløsning og inkuber i 20 minutter ved 37 °C i et vannbad, uten agitasjon.
    4. Sentrifuge i 2 minutter ved 200 x g.
    5. Fjern umiddelbart trypsinløsningen og tilsett 1 ml ufullstendig medium.
      MERK: Ufullstendig medium inneholder serum som umiddelbart vil stoppe effekten av trypsin.
    6. Sentrifuge i 2 minutter ved 200 x g og fjern alle medier.
    7. Tilsett 350-500 μL komplett medium.
      MERK: Det nødvendige volumet for å dissosiere celler avhenger av antall ciliære ganglia oppnådd og dermed på den oppnådde pelletstørrelsen. For ~ 70 CG anbefales det å bruke 500 μL medium.
    8. Ta avstand fra CGs ved å pipe opp og ned 10-15x først ved hjelp av en P1000 etterfulgt av 10-15x ved hjelp av et brannpolert glass Pasteur pipette. Unngå luftbobledannelse for å minimere celletap.
      MERK: Hold cellulær fjæring på is til plating.
    9. Bestem cellulær tetthet ved hjelp av en Trypan blå løsning og et standard Neubauer kammer.
    10. Plate 1 x 104 celler/ml i hver brønn av 24-brønnplaten ved å fortynne riktig volum av celleoppheng i 500 μL komplett medium (supplert med 10 μM 5'-FDU).
    11. Inkuberceller i en 37 °C,2 5 % CO 2-inkubator.

5. Immunocytokjemi og bildeanalyse av ciliary nevroner

  1. Utfør immunocytokjekjemianalysen som presenteres i dette papiret som tidligere beskrevet16,17.
  2. Bruk følgende primære antistoffer: mus monoklonal b-III tubulin (1:1000, T8578), kylling monoklonal nevrofilament M (1:1000, AB5735), mus monoklonal SV2 (1:1000, AB2315387).
  3. Som sekundære antistoffer, bruk Alexa Fluor 568-conjugated geit anti-mus antistoff (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-conjugated geit anti-kylling antistoff (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-conjugated geit anti-mus antistoff (1:1000, A21235).
  4. Monter dekkslips ved hjelp av monteringsmedium med DAPI, for kjernefarging (P36935).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den estimerte varigheten for denne prosedyren avhenger tett av utbyttet som trengs for hvert enkelt eksperiment, og dermed på antall ciliary ganglia som må isoleres. For et estimert utbytte på 1 x 106 celler/ml, isolerer du rundt 70 ciliary ganglia (35 egg). For dette antallet ganglia vil det ta 2-3 timer for disseksjonsprosedyren og totalt 4-5 timer for den totale prosedyren. En trinnvis illustrasjon av isolasjonsprotokollen vises i figur 1A. Identifiseringen av ciliary ganglion kan være vanskelig, spesielt når du utfører denne protokollen for første gang. Ciliary ganglion er lokalisert nær optisk nerve og choroid sprekk (Figur 1B). De viktigste trinnene i disseksjonsprosedyren vises i figur 2. Først blir embryoet fjernet fra egget og plassert i iskald HBSS. Hodet er skilt fra kroppen og, igjen, plassert i iskald HBSS i en disseksjon Petriskål (Figur 2A-2C). Deretter fjernes øyet fra kyllingens hode og ciliary ganglion er isolert (Figur 2D-2H).

Kulturene som er oppnådd med denne protokollen er svært rene. Men rengjøring av ganglia og fjerne overflødig vev dikterer sterkt suksessen og renheten til kulturen. Cellene utvikler seg raskt og kan brukes allerede i de første dagene i kulturen hvis det generelle eksperimentet krever det. Likevel kan kulturene opprettholdes i 15 dager, eller mer. Hvis du bruker kulturene i mer enn 7-8 dager, sørg for å erstatte en tredjedel av kulturmediet med friskt medium hver 2-3 dager. Etter 1 dag in vitro viser CG-nevroner en multipolar morfologi. Imidlertid oppstår neurite forlengelse raskt, og et primært nevronalt nettverk er allerede etablert etter 24 timer. Etter 8 dager in vitro gikk nevroner allerede over til en unipolar tilstand, hvor en av neurittene strekker seg og danner aksonet. Det nevronale nettverket er svært tett på dette utviklingsstadiet (figur 3 og figur 4).

Ciliary ganglion nevroner er kolinerge nevroner som tilhører det parasympatiske nervesystemet. In vivo, disse nevronene er ansvarlige for muskel innervation i øyet. Disse nevronale kulturene er svært godt egnet for studiet av nevromuskulære synapser. For dette kan CG-nevroner belagt på toppen av muskelceller. Kyllingen pectoral muskelen ble dissekert og lov til å utvikle og maturate in vitro til DIV 4. CG nevroner ble deretter belagt på toppen av muskellaget og co-kulturen lov til å utvikle seg i 3 dager. På dette tidspunktet dannes muskelfibre og kan lett identifiseres ved tilstedeværelse av flere kjerner (blå). Synaptisk vesikkellykoprotein 2A (SV2) immunosanksjon, viser en presynaptisk markør tilstedeværelsen av synapser som er etablert mellom CG-nevronene axons og muskelfibre (Figur 5).

Figure 1
Figur 1: Ordningen med disseksjonsprotokollen og ciliary ganglion. (A)Diagram over isolasjons- og kulturprotokollen. (B) Ordningen med chick ciliary ganglion lokalisering i den bakre delen av øyet. Optisk nerve, ciliary ganglion og choroid fissur er indikert med piler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Disseksjon av E7 chick ciliary ganglion. KlippAtoppen av egget med saks. (B)Fjern embryoet fra egget med en skje og legg det i en disseksjon Petriskål med iskald HBSS. (C) Skill hodet fra kroppen ved å kutte i nakkeområdet. (D) Fest embryoets hode i nebbet, hold med forcep nº 5. (E) Fjern øyet ved skånsom rotasjon ved hjelp av forcep nº 55. (F)Bakre syn på øyet. Piler indikerer lokalisering av optisk nerve, choroid fissur og ciliary ganglion. Dissekereciliary ganglion. (H)Dissekert ciliary ganglion. Overflødig vev bør fjernes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Ciliary ganglion nevroner utvikling in vitro. Fasekontrastbilder av CG-nevroner ved DIV 1, 3, 8 og 15. Som CG nevroner er belagt, de umiddelbart initiere neurite utvekst. Ved DIV 15 er aksonisk nettverk svært tett, og på dette stadiet er neurites fullstendig differensiert i dendritter og aksoner. Fasekontrastbilder ble anskaffet ved hjelp av et konfusisk mikroskop med et plan-Apochromat 20x ph2-mål. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Immunocytokmi av CG-nevroner ved DIV 8. CG nevroner viser et veletablert nevronalt nettverk etter 8 dager in vitro. Kjerner ble farget med DAPI (blå) og aksoner ble farget med b-III tubulin (rød). Fluorescensbilder ble anskaffet ved hjelp av et konfusisk mikroskop med et plan-Apochromat 20x mål. Skala bar: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Kultiverte CG-nevroner etablerer synapser med muskelfibre. Immunocytokjekjemi bilder av CG nevroner-pectoral muskel co-kulturer. Muskelfibre identifisert av stiplede linjer presenterer flere kjerner, som var farget med DAPI (blå). Axons ble merket mot nevrofilament (rød) og synaptiske vesikler ble merket mot SV2 (cyan). Bilder ble anskaffet ved hjelp av et konfusisk mikroskop med et plan-Apochromat 63x oljemål. Skala bar: 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokollen demonstrerte vi hvordan vi skal forberede og kultur CG nevroner. Identifisering og disseksjon av ciliary ganglion kan være vanskelig for uerfarne brukere. Derfor presenterer vi en detaljert og trinnvis prosedyre for effektivt å dissekere E7 chick ciliary ganglia, dissosiere vevet og forberede nevronale kulturer som kan opprettholdes i minst 15 dager. Ciliary ganglion nevroner oppnådd med denne protokollen er også egnet for co-kultur med muskelceller.

Ciliary ganglia på ulike utviklingsstadier av chick embryonal utvikling kan brukes som en cellemodell, avhengig av formålet med studien. Men for kulturer av CG nevroner er det foreslått at de isoleres fra kylling embryo mellom embryonale dager 7 og 818. I embryonal stadium E8 har CG-nevroner ennå ikke gjennomgått nevronale dødsprosesser, og antall ikke-nevronale celler reduseres relativt med nevronale celler18. Dette, i kombinasjon med en streng disseksjonsprosedyre og svært godt rengjortgangen, vil bidra til en svært ren kultur av ciliary ganglion nevroner, med liten forurensning av ikke-nevronale celler, som fibroblaster eller glial celler.

Under isolering av CG-nevroner er et av de kritiske punktene identifisering og rengjøring av CG. Disseksjon av en så liten struktur, som ciliary ganglion, kan være vanskelig med tanke på lokaliseringen, evnen til å identifisere ganglion samt størrelsen på ganglion selv. Det er normalt at ganglia kan feste seg til tangen under disseksjon. Høy kvalitet disseksjon instrumenter er svært viktig for en vellykket disseksjon og vil minimere vedlegg av ganglia til tang. Rengjøring av GC er viktig for å forhindre kontaminering med ikke-nevronale celler. Det er nødvendig å isolere ca 70 ganglia for å oppnå en cellulær tetthet på ~ 1x106 celler / ml, i motsetning til andre nevronale vev i det perifere nervesystemet som har et 5-15x større antall ganglia3.

I kultur reduserer tillegg av 5'-FDU til det komplette mediet forurensningen av GC-kulturen med ikke-nevronale celler. 5'-FDU er en anti-mitotisk forbindelse som hemmer cellespredning, nemlig spredning av glialceller og fibroblaster. Konsentrasjonen av 5'-FDU lagt til mediet er nok til å stoppe cellesyklusen i S-fasen, men er ikke skadelig for normal utvikling av CG nevroner3,19,20. Behandlingstidspunktet med 5'-FDU kan justeres. Men siden CG-nevroner etablerer et tett axonalt nettverk på kort tid, bør 5'-FDU legges til kulturen så tidlig som tidspunktet for plating.

En av de viktigste begrensningene i denne modellen er at den ikke er representativ for normal utvikling av CG-nevroner under fysiologiske forhold. I ovo dør omtrent halvparten av CG-nevroner mellom 8th og 14th dag av chick embryo utvikling. I kultur er det ingen reduksjon i antall CG-nevroner når mediet suppleres med nevrotrofiske faktorer som tillater overlevelse1,,6,,14.

Den nevronale populasjonen hentet fra disseksjon av chick ciliary ganglion er en homogen populasjon av kolinerge nevroner, som tilhører det autonome nervesystemet. Det bør bemerkes at uttrykket av nevrotransmittere i choroid befolkningen i CG er målrettet drevet, som kan bli hindret avhengig av hvilken type muskel som brukes i co-kultur24. Hvis målet med studien er relatert til den genetiske identiteten eller undertypen av motornevronen selv, kan CG-nevroner ikke være den beste passende nevronale modellen. Også spesifisitet av motorneuroner i innervation av muskelfibre kan ikke oppnås ved bruk av CG neuron co-kulturer siden, i dette tilfellet, muskelfibrene kan multipliseresinnerverte 25. Imidlertid har denne nevronale kulturen flere fordeler, det krever bare grunnleggende utstyr for å opprettholde og inkubere eggene, det er en rimelig prosedyre og enda viktigere, gir en utmerket modell for studiet av nevromuskulære synapser1, siden CG nevroner neurotransmission mekanismer er svært lik de som forekommer i spinal motor nevroner. Cellemodellene som tidligere ble brukt til denne typen studier var sensoriske nevroner fra ryggmargen12,,21,22,23. Imidlertid var disse co-kulturene sammensatt av en heterogen populasjon av nevroner, ikke alle kolinergiske og dermed var bare en liten del av nevronene i stand til å etablere funksjonelle kontakter med muskelcellene1. Foruten utviklingsanalysen (immunocytokjemi) demonstrert i dette arbeidet kan andre analyser utføres i CG-kulturer som elektrofysiologi og nevronal overlevelse.

Basert på denne protokollen kan ytterligere vitenskapelige spørsmål tas opp, for eksempel hvordan subcellulær lokalisering av spesifikke mRNAer og proteiner regulerer synapsedannelse og funksjon. Videre kan nervemuskel co-kulturer lett etableres og brukes videre til å studere nevromuskulære sykdommer når skadestedet er det nevromuskulære krysset. Nevromuskulære sykdommer er heterogene i naturen i den forstand at dysfunksjonen kan være forbundet med selve muskelen, perifere nerver eller nevromuskulære veikryss26. Dermed, gjennom disse co-kulturer ville det være mulig å studere nevromuskulære knutepunkt endringer som til slutt ligger til grunn for utvikling og progresjon av nevromuskulære sykdommer. En annen interessant mulighet ville være å tilpasse denne protokollen til musen trigeminal system. Disse nevronene er lett tilgjengelige, og deres utviklingsmønster er velkjent27. Fordi mus er mottagelig for genetisk manipulasjon og trigeminussystemet er godt preget når det gjelder topografisk kartdannelse, oppstår nye muligheter ved hjelp av en trigeminalbasert protokoll for å studere nevronal utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av European Regional Development Fund (ERDF), gjennom Centro 2020 Regional Operational Programme under prosjekter CENTRO-01-0145-FEDER-000008:BrainHealth 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-FEDER-000003:pAGE, CENTRO-01-0246-FEDER-00018:MEDISIS, og gjennom COMPETE 2020 - Operativt program for konkurranseevne og internasjonalisering og portugisiske nasjonale midler via FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P., under prosjekter UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-FEDER-022122:PPBI, PTDC/SAU-NEU/104100/2008, og den enkelte gir SFRH/BD/141092/1 2018 (M.D.), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) og av Marie Curie Actions - IRG, 7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU) Merck (Sigma Aldrich) F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody Thermo Fisher Scientific A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody Thermo Fisher Scientific A21235
B27 supplement (50x), serum free Invitrogen (Gibco) 17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M Merck (Sigma Aldrich) AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate VWR 24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil Invitrogen (Gibco) 10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology Fisher Scientific 10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin Invitrogen (Gibco) 26050-070
L-Glutamine (200 mM) Invitrogen (Gibco) 25030-081
Mouse laminin I Cultrex (R&D systems) 3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin Merck (Sigma Aldrich) T8578
Mouse monoclonal SV2 DSHB AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x) Thermo Fisher Scientific 11874235
Neurobasal medium without glutamine Invitrogen (Gibco) 21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL) Invitrogen (Gibco) 15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture Merck (Sigma Aldrich) P3532
Poly-D-Lysine Merck (Sigma Aldrich) P7886
Potassium chloride Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals) 31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS Panreac Applichem 131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI Invitrogen (Gibco) P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk Fisher Scientific 10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) Peprotech 450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO Panreac Applichem 131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade Panreac Applichem 141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x) Thermo Fisher 11360039
Syringe without needle, 10 mL Thermo Fisher 11587292
Trypsin 1:250 powder Invitrogen (Gibco) 27250-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
  2. Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
  3. Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
  4. Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
  5. Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
  6. Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. 737-749 (1974).
  7. Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
  8. Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
  9. Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
  10. Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
  11. Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
  12. Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. 203-216 (1970).
  13. Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
  14. Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
  15. Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
  16. Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
  17. Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
  18. Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. 249-263 (1996).
  19. Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
  20. Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
  21. Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
  22. Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
  23. Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
  24. Squire, L. R. Encyclopedia of Neuroscience. (2010).
  25. Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
  26. Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. 409-418 (2016).
  27. Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).
Isolasjon og kultur av Chick Ciliary Ganglion Neurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).More

Costa, F. J., Dias, M. S., Costa, R. O., Pedro, J. R., Almeida, R. D. Isolation and Culture of Chick Ciliary Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (162), e61431, doi:10.3791/61431 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter