Summary
Инсульт является глобальной проблемой с минимальными вариантами лечения и отсутствием текущей клинической терапии для регенерации потерянной ткани мозга. Здесь описаны методы создания точного фототромботического инсульта в моторной коре грызунов и последующего введения гидрогелевых биоматериалов для изучения их влияния на регенерацию тканей после инсульта.
Abstract
Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими инсультами и определяются как внезапная закупорка сосуда, снабжающего кровью мозг. В течение нескольких минут после блокировки клетки начинают умирать и приводить к непоправимому повреждению тканей. Современные терапевтические методы лечения сосредоточены на удалении сгустков или лизисе, чтобы обеспечить реперфузию и предотвратить более серьезное повреждение головного мозга. Хотя преходящая пластичность мозга может со временем спасти часть поврежденной ткани, значительная часть пациентов остается с неврологическим дефицитом, который никогда не разрешится. Существует нехватка терапевтических возможностей для лечения неврологического дефицита, вызванного инсультом, что подчеркивает необходимость разработки новых стратегий лечения этой растущей популяции пациентов. Инъекционные биоматериалы в настоящее время разрабатываются для повышения пластичности мозга и улучшения эндогенного восстановления за счет доставки активных агентов или стволовых клеток. Одним из методов проверки этих подходов является использование модели инсульта грызунов, введение биоматериала в ядро инсульта и оценка восстановления. Знание точного местоположения ядра инсульта является обязательным для точного лечения после инсульта, поэтому модель инсульта, которая приводит к предсказуемому расположению инсульта, предпочтительнее, чтобы избежать необходимости визуализации до инъекции. Следующий протокол будет охватывать, как вызвать фототромботический инсульт, как вводить гидрогель контролируемым и точным образом, а также как извлекать и криосекционировать мозг, сохраняя биоматериал нетронутым. Кроме того, мы расскажем, как эти же гидрогелевые материалы могут быть использованы для совместной доставки стволовых клеток. Этот протокол может быть обобщен на использование других инъекционных биоматериалов в сердцевину инсульта.
Introduction
Инсульт является основной причиной инвалидности и пятой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах1. Примерно 87% всех инсультов являются ишемическими, в то время как большинство из оставшихся 13% являются геморрагическими2. Ишемический инсульт определяется как закупорка кровотока в артерии к окружающим тканям. Эта окклюзия приводит к кислородному голоданию и последующему некрозу, что часто приводит к постоянной инвалидности у выживших пациентов. Несмотря на снижение смертности от инсульта3,ожидается, что к 2030 году его распространенность возрастет до 3,4 млнчеловек4. Это увеличение числа выживших инвалидов и последующее экономическое бремя привели к толчку к исследованиям инсульта, которые сосредоточены на механизмах восстановления нейронов. После инсульта возникает воспалительный период, который приводит к образованию рубца, препятствующего расширению некротической области. Область, окружающая некротическое ядро, называется «периинфарктом», и есть убедительные доказательства того, что пластичность в этой области, которая включает в себя повышенный ангиогенез, нейрогенез и аксональное прорастание, напрямую связана с наблюдаемым восстановлением у животных моделей и людей5. Поскольку не существует моделей in vitro, которые могут правильно воспроизвести сложные взаимодействия после инсульта, животные модели необходимы для исследований инсульта.
Существует несколько моделей in vivo, которые могут быть использованы для получения ишемического инсульта. Одной из наиболее распространенных моделей, используемых у мышей, является окклюзия средней мозговой артерии, или MCAo, через дистальную или проксимальную (через внутриартериальную нить) окклюзию. Проксимальная модель, также известная как нить MCAo (fMCAo), обычно приводит к большим ишемическим инсультам, которые охватывают от 5% до 50% полушария головного мозга, в зависимости от количества факторов6. В этих моделях шов или нить продвигается от внутренней сонной артерии к основанию средней мозговой артерии (MCA) и удерживается на месте в течение определенного периода времени. Этот метод окклюзии, который может быть сделан временным или постоянным, вызывает инфаркт, который сосредоточен в полосатом теле и может включать или не включать вышележащую кору6. Результирующий размер удара сильно варьируется, и методы визуализации, такие как лазерная допплерография, необходимы для подтверждения эффективности процедуры у каждой мыши. Внутриартериальная или внутрисветная окклюзия нити, которая длится более 30 минут, вызывает инсульты на большем конце диапазона размеров. Некоторые исследователи сосредоточились на более коротком времени окклюзии нити, которое требует значительного экспериментального фокуса и лабораторнойпроверки 7. Модели MCAo нити у мышей следуют аналогичным стадиям гибели клеток, ишемической прогрессии и формирования периинфарктной области, как это наблюдается в случаях инсульта у человека; однако более крупные инсульты более близко напоминают болезненное состояние злокачественных инфарктов головного мозга, которые являются менее распространенными, менее излечимыми инсультами человека6. Между тем, дистальная окклюзия MCA требует более сложной операции и краниэктомии. В этой модели дистальная часть MCA, которая проходит вдоль поверхности мозга, непосредственно закупоривается шовным галстуком или прижиганием. В некоторых вариациях методики сонные артерии закупориваются односторонне или временно-двусторонне. Преимущество дистального MCAo заключается в том, что он производит кортикальный инсульт, который менее изменчив по размеру, чем модель нити. Тем не менее, дистальная модель производит более плохой поведенческий выход из-за трансекции наружной сонной артерии (ECA), что также является проблемой для fMCAo6.
Альтернативной моделью инсульта, которая известна своей менее инвазивной, является фототромботическая (PT) модель. Модель PT приводит к четко определенному местоположению ишемии и связана с высокой выживаемостью8. Методика опирается на светочувствительный краситель, вводимый внутрибрюшинно, который позволяет осуществлять внутрисосудистое фотоокисление просто путем облучения желаемой ткани светом или лазером9. При возбуждении образуются кислородные радикалы, вызывающие повреждение эндотелия, что активирует агрегацию тромбоцитов и образование сгустков в облученнойобласти 8,9. Жесткий контроль над размером и расположением штриха, а также высокая воспроизводимость модели PT делают ее идеальной для изучения биоматериалов. Хотя точность становится возможной с помощью лазерных и стереотаксических координат, есть некоторые недостатки, которые могут сделать эту модель менее идеальной для нескольких исследований. В отличие от модели fMCAo, модель удара PT не может быть реперфузирована. Поэтому материалы для исследования нейропротекторных средств, специфичных для повреждений после реперфузии или механизмов после реперфузии, не были бы полезны здесь8. Кроме того, из-за микрососудистого повреждения модели PT наблюдается относительно небольшая ишемическая полутень. Вместо этого возникает локальный вазогенный отек, что нехарактерно для инсульта человека, что делает эту модель нежелательной для доклинических исследований лекарств, ориентированных на периинфарктнуюобласть 6,8.
Общая цель стратегий биоматериала при инсульте заключается в том, чтобы либо доставить биологически активные агенты, либо действовать как суррогатный внеклеточный матрикс для роста ткани мозга. Одна из стратегий, которую мы будем изучать с использованием наших методов, заключается в доставке гидрогеля непосредственно в ядро инсульта, в отличие от ткани периинфаркта, где многие современные клеточные терапии доставляются10. Обоснование этого подхода заключается в том, что доставка в некротическую ткань, обнаруженную в ядре, позволит избежать нарушения окружающей здоровой или восстанавливающейся ткани. Мы предполагаем, что диффузия любых активных агентов, входящих в состав биоматериала, сможет достичь периинфаркта из ядра, тем более что мы обнаруживаем, что доставка биоматериалов гидрогеля уменьшает толщину глиального рубца11. Это важно, поскольку было показано, что периинфарктная область демонстрирует нейропластичность после инсульта, что делает ее привлекательной мишенью. Кроме того, доставка суррогатной матрицы к инсультному ядру может быть загружена ангиогенными12 или нейрогенными13 факторами для руководства образованием новой ткани, а также клеток для доставки14. Доставка клеток значительно улучшается за счет использования матрицы, поскольку она защищает клетки от жестких сил инъекции и локальной среды, присутствующих во время доставки, а также способствует дифференцировке и приживлению15.
Эти инъекционные терапевтические биоматериалы имеют клиническое значение в приложениях для лечения инсульта, поскольку в настоящее время нет медицинских методов лечения, которые стимулируют восстановление нейронов после инсульта. Основные нейронные цепи, участвующие в восстановлении, лежат в ткани мозга, которая примыкает к ядру инсульта16,в то время как само ядро инсульта лишено жизнеспособной нервной ткани. Мы ожидаем, что доставка биоматериала в ядро некротического инсульта имеет потенциал для стимуляции прилегающей ткани к регенеративным процессам с помощью ряда ранее упомянутых механизмов, включая депо высвобождение факторов роста13,стимуляцию роста тканей и содействие развитию восстанавливающейся ткани мозга11,12,изменение иммунных реакций17и доставку терапевтических средств, полученных из стволовых клеток14, 18. Однако для эффективного изучения возможности этих применений необходим последовательный и воспроизводимый метод индуцирования инсульта и инъекций биоматериалов. Модель обводки PT использует методы, которые обеспечивают точный контроль над ориентацией и местоположением штриха. Лазер, прикрепленный к стереотаксическому устройству, направляет ориентацию, а насосы, прикрепленные к стереотаксическим устройствам, контролируют скорость впрыска материала без необходимости дополнительных форм визуализации. Поэтому мы решили описать методы выполнения инсульта ПТ в моторной коре мышей и для введения биоматериалов в ядро инсульта. Здесь мы используем микропористые отожженные частицы (MAP) гидрогели в качестве биоматериала для инъекций без добавления клеток или факторов роста. Кроме того, мы объясняем, как успешно извлечь мозг с неповрежденным биоматериалом, и мы обсуждаем иммунохимические анализы, используемые для анализа результатов инсульта с инъекцией биоматериалов и без нее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с IUCAC в Университете Дьюка и Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе. В этом исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6J в возрасте от 8 до 12 недель. Животные содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-темного цикла и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum. Протоколы анальгезии и седации описываются как одобренные IUCAC, но могут отличаться от протоколов, используемых в других лабораториях.
Животные могут быть преждевременно усыплены, если они испытывают чрезмерное беспокойство, вокализацию (указывающую на неконтролируемую боль), самотравмирование, снижение или нарушение подвижности, физические признаки кожной инфекции, потерю аппетита и / или потерю веса более чем на 10-15% в результате операции по выживанию. Нет никаких ожидаемых побочных эффектов от инъекции геля, так как он состоит из естественного полимера в мозге. За животными следует следить ежедневно, включая выходные и праздничные дни, и перевешивать через день. Исследования, проведенные в нашей лаборатории и других, не обнаружили дефицита в груминге, потере массы тела или признаках / симптомах абстиненции или хронического стресса у мышей после этих небольших корковых или подкорковых инсультов. Если животные проявляют какие-либо признаки местной инфекции раны головы, они должны быть усыплены. Животные также должны контролироваться на предмет плохого ухода, состояния ран и признаков драки между животными (раны спины). Если есть признаки драки или дегисценции раны, животных следует сначала лечить после обращения к ветеринарам. Это часто включает антибиотик в воде и / или местное местное применение антибиотиков. Если эти меры не приводят к исцелению, животные должны быть усыплены.
1. Подготовка материалов и инструментов
- Подготовьте фототромботический краситель перед операцией. Взвесьте 15 мг розовой бенгальской розы в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл.
ВНИМАНИЕ: Роза бенгальская может вызвать серьезное повреждение / раздражение глаз.- Растворите розу бенгальскую в 1,5 мл стерильного фильтрованного 1x PBS, чтобы получить рабочую концентрацию 10 мг/мл.
- Вихрьте трубку до тех пор, пока не будут видны сгустки, указывая на то, что краситель полностью растворился, затем накройте фольгой до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимого красителя будет зависеть от количества мышей. Краситель вводят внутрибрюшинно IP в концентрации 10 мкл/г, например, 200 мкл для мыши весом 20 г.
- Включите грелку для поддержания температуры тела мыши во время анестезии (37 °C).
- Приготовьте автоклавные ножницы, щипцы, хлопок, ветеринарную глазную мазь, хирургический клей или шовной материал, синий или черный хирургический маркер, а также стерильные спиртовые и бета-йодные салфетки. Подготовьте сверло для костей со стерилизованными головками сверл.
- Включите стерилизацию шариков до 160 °C, чтобы обеспечить стерилизацию инструментов между операциями на мышах. Отложите коническую трубку стерильного физиологического раствора объемом 50 мл или 1 раствор PBS для последующего использования в поддержании гидратированной рабочей зоны.
- Подключите лазер к стереотаксическому устройству. Надев лазерные защитные очки, измерьте мощность лазера (мВт).
ВНИМАНИЕ: Используйте лазерные защитные очки всякий раз, когда лазер включен во время процедуры.- Отрегулируйте ток на лазерной консоли, следуя инструкциям по изготовлению лазера, до тех пор, пока выходная мощность лазера не достигнет 10 мВт, и установите ток в качестве предварительно установленного на консоли домашнего экрана. Затем снова отрегулируйте ток, чтобы установить другой предустановленный, где выходная мощность лазера составляет 40 мВт. Теперь выключите лазер до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мВт будут использоваться для ориентации лазера перед использованием.
- Отрегулируйте ток на лазерной консоли, следуя инструкциям по изготовлению лазера, до тех пор, пока выходная мощность лазера не достигнет 10 мВт, и установите ток в качестве предварительно установленного на консоли домашнего экрана. Затем снова отрегулируйте ток, чтобы установить другой предустановленный, где выходная мощность лазера составляет 40 мВт. Теперь выключите лазер до дальнейшего использования.
- Подготовьте чистую клетку для мышей после операции. Затем поместите мышь в индукционную камеру с концентрацией изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение не прекратится и ее дыхание не достигнет медленной, устойчивой скорости.
- После сна взвесьте мышь, чтобы определить, сколько красителя Rose Bengal ввести. Затем перенесите и закрепите мышь на стереотаксическом устройстве с поддерживающей концентрацией изофлурана 1,5%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение концентрации изофлурана может расширить сосуды и предотвратить достаточную окклюзию или удары постоянного размера между мышами. - Нанесите ветеринарную глазную мазь на оба глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием и температурой на протяжении всей процедуры и время от времени сжимайте пальцы ног, чтобы мышь ничего не чувствовала.
2. Фототромботический инсульт модель9
- Сбрите мех с головы мыши и асептически подготовьте область, используя спиртовую салфетку, а затем салфетку из бета-йода. Повторите три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте дополнительную спиртовую салфетку в конце, чтобы очистить весь бета-йод, так как это вызывает раздражение кожи, что приводит к тому, что мыши чешут череп после операции. - С помощью небольших ножниц делают боковой разрез между ушами к глазам, примерно на 1-2 см. Сделайте это, потянув кожу вверх щипцами, чтобы создать палатку, разрезав один раз вниз, затем вставив ножницы в отверстие и создав непрерывный разрез средней линии.
- Отделите кожу и слегка надавите на теменные кости щипцами, чтобы найти брегму. Пометьте брегму точкой с помощью хирургического маркера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Движение фрагментов кости подчеркивает лобную границу теменных костей. Брегма является центральной точкой, в которой встречаются фрагменты лобной и теменной костей(рисунок 1А). - Надев лазерные защитные очки, переместите лазер над черепом мыши, зафиксировав стереотаксическое устройство под углом 90°. Выберите предустановленную мощность 10 мВт и включите лазер.
- Отрегулируйте оси X и Y лазера до тех пор, пока он не окажется непосредственно над брегмой. Сбросьте значения x и y на консоли цифрового дисплея, а затем переместите лазер на 1,8 мм влево от брегмы. Теперь поднесите лазер как можно ближе к черепу, не позволяя ему коснуться черепа.
- Переместите лазер на 2,2 мм влево от брегмы, чтобы он мог двигаться без каких-либо препятствий. Выключите лазер.
- Введите соответствующее количество красителя Rose Bengal внутрибрюшинно (IP) с помощью одноразовой иглы 29 г. Немедленно запустите таймер на 7 мин, чтобы краситель циркулировал системно. Выберите предустановленную мощность 40 мВт без включения лазера.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как вы освоитесь с процедурой, краситель может быть введен перед асептической подготовкой мыши и закончен до истечения 7 минут, чтобы сэкономить время. - Включите лазер (40 мВт), когда сработает 7-минутный таймер, надев лазерные защитные очки, и установите 10-минутный таймер.
- Через 10 мин переместите лазер на 2,2 мм влево от брегмы, не выключая его, и установите еще 10-минутный таймер.
- Как только второй 10-минутный таймер сработает, измените лазер обратно на 10 мВт и переместите лазер на 2,0 мм слева от брегмы. Отметьте это место хирургическим маркером. Затем выключите лазер.
- Поднимите лазер и разблокируйте его под углом 90°, чтобы его можно было отодвинуть от мыши. В этот момент нанесите стерильный физиологический раствор или PBS с хлопком, если хирургическая область сухая.
- Сверлите небольшими очередями на отметке 2,0 мм перпендикулярно поверхности черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы сверлить медленно, чтобы не сверлить слишком глубоко и не ударить по мозгу. После того, как сверло пройдет через череп, произойдет небольшое падение / изменение сопротивления, и сверление может вызвать кровотечение.- Используйте хлопок, чтобы поглотить избыток крови. Типично видеть кровь из проколотых артерий в черепе после сверления - чрезмерная кровь означает, что сверло попало в мозг. В этом случае запишите идентификатор мыши и двигайтесь дальше.
- Поместите небольшую салфетку рядом с мышью. Используя щипцы, подтяните кожу близко друг к другу, чтобы подготовиться к склеиванию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо этого здесь можно сделать шов. Для наложения швов обычно требуется всего 3 шва.- Используя щипцы, схватите две стороны кожи и потяните их вместе и вверх. Смажьте все большие капли хирургического клея в конце кончика на салфетке перед нанесением на мышь.
- Нанесите хирургический клей экономно и удерживайте кожу щипцами в течение 10 с. Продолжайте до тех пор, пока не появятся видимые отверстия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клей выходит быстро – не сжимайте бутылку. Избегайте приклеивания кожи к черепу или попадания клея в глаз.
- После склеивания или наложения швов поместите мышь в новую клетку, чтобы восстановиться после анестезии. Животному требуется 5-10 минут, чтобы восстановиться, и это помогает отдохнуть половине клетки на грелке.
3. Операция при фиктивном инсульте
- Выполняйте все процедуры идентично операции, описанной выше в разделе 2, за исключением инъекции 1x PBS или физиологического раствора вместо красителя Rose Bengal.
4. Инъекции гидрогеля или других биоматериалов
- Выполняйте инъекции биоматериалов в определенное пользователем время. В этом эксперименте инъекции выполнялись между 5- и 7-дневными днями после инсульта. Вводят 2 - 6 мкл гидрогеля (определяемого пользователем).
- Включите грелку для поддержания температуры тела мыши во время анестезии (37 °C).
- Приготовьте автоклавные ножницы, щипцы, хлопок, ветеринарную глазную мазь, хирургический клей или шовной материал, а также стерильные спиртовые и бета-йодные салфетки. Подготовьте костную дрель со стерильными наконечниками сверл и стеклянными шприцами Hamilton объемом 25 мкл с металлическими иглами 30 г.
- Включите стерилизацию шариков до 160 °C, чтобы обеспечить стерилизацию инструментов между мышами.
- Прикрепите насосы впрыска к стереотаксическому устройству. Установите скорость потока на 1 мкл/мин и установите объем на 4 мкл.
- Подготовьте чистую клетку для мышей после операции.
- Поместите мышь в индукционную камеру с концентрацией изофлурана 4%, чтобы обезболить ее до тех пор, пока спонтанное движение не прекратится и ее дыхание не достигнет медленной, устойчивой скорости.
- После сна перенесите и закрепите мышь к стереотаксическому устройству с поддерживающей концентрацией изофлурана 1,5%.
- Нанесите ветеринарную глазную мазь на оба глаза.
- Побрейте любой мех, который, возможно, отрос головы мыши, и асептически подготовьте область, используя спиртовую салфетку, а затем салфетку из бета-йода. Повторите три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте дополнительную спиртовую салфетку в конце, чтобы очистить весь бета-йод, поскольку он вызывает раздражение кожи и заставляет мышей чесать череп после операции.
- Используя небольшие ножницы и / или щипцы, снова откройте кожу над мозгом. Используйте хлопок со стерильным физиологическим раствором или PBS, чтобы очистить череп от любого мусора. Будет виден бело-желтый круг (штрих, рисунок 1B)и отверстие заусенца от сверла. Если омертвевшая ткань не видна, скорее всего, инсульта не произошло. Если отверстие для заусенцев не центрировано выше хода, повторно просверлите, чтобы центрировать его.
- Наведите насос впрыска на мышь и зафиксируйте на 90°. Очистите шприц стерильным физиологическим раствором или раствором PBS перед обратной загрузкой материала.
- После очистки разберите стеклянный шприц, чтобы не было иглы. Перегрузите шприц с помощью пипетки с положительным смещением 25 мкл с 10 мкл гидрогеля (или другого биоматериала здесь с клетками или без них).
- Используя шприц-поршень, протолкните гель до передней части шприца. Затем снова соберите шприц и продолжайте толкать, пока гель заметно не вытечет из иглы.
- Поместите шприц на насос. Заднюю часть насоса, возможно, потребуется отрегулировать, чтобы шприц подходил. Сделайте это, отрегулировав скорость потока до 30 мкл/мин, выберите Вывод или Впрыск в зависимости от направления движения, а затем нажмите кнопку Пуск. Нажмите «Стоп», когда задняя часть насоса находится в правильном месте.
- Прикрутите заднюю часть насоса, чтобы шприц был надежно закреплен. Если корректировки были сделаны ранее, убедитесь, что скорость потока установлена на уровне 1 мкл / мин и настроена на впрыск.
- Переместите насос в направлении x и y, чтобы сориентировать его над отверстием. Перемещайте насос вниз в направлении z до тех пор, пока игла шприца не коснется верхней части отверстия.
- Сбросьте z на консоли цифрового дисплея. Затем переместите шприц вниз в направлении z на 0,750 мм. Если шприц сгибается или есть сопротивление, череп либо зажил, либо не был полностью просверлен и нуждается в повторном просверлении.
- Нажмите кнопку Пуск на консоли насоса, чтобы впрыснуть 4 - 6 мкл гидрогеля со скоростью 1 мкл/мин.
- Установите 5-минутный таймер, когда насос перестает впрыскиваться, чтобы гель начал сшиваться.
- Через 5 мин медленно подтяните шприц, повернув z nob. Следите за тем, чтобы убедиться, что какой-либо материал случайно вытащился или просочился из отверстия. Разблокируйте насос и отодвиньте его от мыши, когда игла находится достаточно далеко от черепа.
- С помощью щипцов, хирургического клея или швов закройте кожу над головой. Поместите мышь в чистую клетку и наблюдайте за ее восстановлением. Мыши должно потребоваться около 5-10 минут, чтобы оправиться от анестезии.
5. Перфузия и отбор проб
- Обезболить мышь с помощью изофлурана.
- Зафиксируйте животное в положении лежа на спине и откройте брюшную полость срединным разрезом. Опционально зажмите нисходящую брюшную аорту, чтобы использовать меньше фиксаторов и PBS.
- Разрежьте диафрагму и переместите вверх по бокам грудной клетки, чтобы открыть грудную полость. Вставьте перфузионную канюлю в левый желудочек и вырежьте отверстие в правом предсердии. Начните медленно перфузить с 10-20 мл PBS или до тех пор, пока жидкость не станет полупрозрачной.
- После очистки переключитесь на 4% PFA для еще 10 – 20 мл. Открепление оружия позволяет им сжиматься по мере вливания PFA. Как только они перестанут двигаться, подождите еще 30 с.
- Обезглавить животное и оттянуть кожу, чтобы обнажить череп. Используя тупые, тонкие щипцы, осторожно удалите куски черепа, чтобы обнажить мозг. Особую осторожность нужно соблюдать при удалении черепа над местом инсульта. Небольшие хирургические ножницы могут быть использованы здесь, чтобы помочь отрезать череп. Самая большая проблема заключается в том, что гель прилипает к черепу и выходит из мозга при удалении черепа.
- Как только мозг отсоединится, поместите в 10-15 мл 4% PFA на ночь (не дольше 24 ч).
- Переместите мозг с PFA на 30% сахарозы на следующий день. Мозг готов к криосекции, как только он опускается на дно (около 2-3 дней). Его также можно оставить для хранения в этот момент.
6. Криосечение и окрашивание
- Выньте мозг из сахарозы и положите на стеклянную горку. Отрежьте небольшую часть задней части мозга лезвием бритвы, чтобы создать плоскую часть, которая будет установлена на патроне.
- Поместите кусочек соединения оптимальной температуры резки (OCT) на патрон, а затем поместите мозг плоской стороной вниз на патрон в OCT. Поместите этот образец на сухой лед до замерзания или в криостат на морозильной блоке.
ПРИМЕЧАНИЕ: OCT может быть добавлен, чтобы полностью охватить мозг, чтобы помочь предотвратить отделение материала от мозга во время сечения.
- Поместите кусочек соединения оптимальной температуры резки (OCT) на патрон, а затем поместите мозг плоской стороной вниз на патрон в OCT. Поместите этот образец на сухой лед до замерзания или в криостат на морозильной блоке.
- Последовательно разрезайте мозги на криостате при -20 °C на участках толщиной 30 мкм на 10 слайдах с желатиновым покрытием. Будьте осторожны при секционировании, чтобы не потерять гидрогель. Если эта часть затруднена, поместите немного ОКТ на верхнюю часть мозга над гелем(рисунок 3). Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.
- Выньте горки при температуре -80 °C и поместите на окрашивающий лоток, чтобы они высохли. Слайды, которые не были заморожены, а просто разделены, также могут быть немедленно окрашены.
- Используя гидрофобную ручку, нарисуйте круг вокруг срезов мозга на слайде. После высыхания регидратируйте ломтики мозга 1x отфильтрованным PBS и поместите на шейкер при комнатной температуре в течение 15 минут. Это занимает около 1 мл буфера на слайд с 9-12 участками мозга.
- Промыть слайды 1x фильтрованным PBS в течение 5 мин при комнатной температуре, повторить три раза.
- Блокируйте слайды на 30 мин-час с 10% ослиной сывороткой в 0,01% PBS-Triton X при комнатной температуре на животе танцовщицы. Это занимает около 200 мкл на слайд.
- Инкубировать первичное антитело в 10% ослиной сыворотке с 0,01% PBS-Triton X в течение ночи при 4°C на шейкере. Сначала проверьте первичные антитела, чтобы определить правильные концентрации. Здесь использовались GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500)(Рисунок 4).
- Вымойте слайды 1x фильтрованным PBS на следующий день в течение 5 мин при комнатной температуре, повторите три раза.
- Инкубировать с вторичным антителом в 10% ослиной сыворотке в 0,01% PBS-Triton X и DAPI в течение 2 ч на лабораторном шейкере при комнатной температуре. 1:1000 использовалось для всех вторичных и DAPI.
- Мойте слайды в течение 5 минут с 1x фильтрованным PBS.
- Дайте секциям высохнуть при комнатной температуре в темноте. Это может занять от 20 мин до 4 ч; размещение слайдов в осушителе может ускорить процесс.
- Обезвоживание скользит в возрастающих концентрациях алкоголя (1 мин на раствор) 50%, 70%, 95%, 100% и 100%.
- Обезжиривание в первой ванне ксилола в течение 1 мин, затем во второй ванне ксилола в течение 5 мин.
- Быстро вынимайте слайды один за другим и добавляйте монтажную среду, пока участки мозга мокрые от ксилола. Быстро добавьте стеклянную крышку сверху. Используйте крышку, которая имеет правильную длину и толщину, необходимую для слайда и микроскопа, используемых для визуализации, соответственно.
- Избавьтесь от пузырьков под крышкой, осторожно надавливая кончиком пипетки наружу от центра слайда. Дайте DPX высохнуть в течение 4 ч до ночи в темноте при комнатной температуре.
- Используйте лезвие бритвы, чтобы соскоблить любую высохшую монтажную среду, которая пролилась на горки. Протрите слайды с помощью очистителя объектива. Слайды теперь можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего хранить слайд в темноте или при 4 °C до тех пор, пока изображение не будет завершено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью этого метода была демонстрация того, как вводить биоматериалы в мозг после инсульта. Фототромботическая модель с розовой бенгальской розой и лазером 520 нм использовалась для контролируемой ориентации поражений инсульта как по размеру, так и по местоположению. Через пять дней после инсульта инфаркт может быть визуализирован во время операции(рисунок 1B)и с помощью TTC и визуализации окрашенных слайдов IHC(рисунок 2). Увеличение диаметра лазера с 2-кратной линзой привело к визуальному увеличению поражения удара, которое охватывало более 2,5 мм по сравнению с одним участком 1 мм только с лазером(рисунок 2). Смертность во время операции с моделью PT возникала редко, менее 1%, из-за минимально инвазивной процедуры. Смерть после операции также была низкой и наблюдалась менее чем у 5% мышей.
Микрочастицы гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты (HMP) вводили через пять дней после инсульта(рисунок 3). HMP отжигают после инъекции в поражение инсульта с образованием микроаннелированных частиц (MAP) с пористым каркасом, что позволило осуществить миграцию клеток в сердцевину инсульта(рисунок 4). Через десять дней после инъекции мышей перфузировали 4% PFA, и их мозг был извлечен, помещен в 4% PFA на ночь, а затем в 30% сахарозы в течение двух дней, прежде чем они были заморожены и разделены для окрашивания и анализа IHC.
Предыдущая работа в нашей лаборатории продемонстрировала инъекцию гидрогелей MAP в поражение инсульта через пять дней после инсульта26. Инъекция гиалуроновых гидрогелей, соответствующих модулю коры, привела к значительному снижению реактивных астроцитов внутри периинфаркта, а также внутри геля MAP. Кроме того, микроглия, которая также находилась в гидрогеле, выражала проремонтные маркеры M2. Это говорит о том, что гидрогель MAP может снижать реактивность астроцитов всего за два дня после инъекций и способствовать созданию более противовоспалительной среды с про-восстановительными астроцитами и микроглией(рисунок 5).
Рисунок 1: Схематическое изображение брегмы и локализация инсульта. (A) Теменные доли встречаются в верхней части, образуя брегму. Лазерное размещение было центрировано на 2,0 мм слева от брегмы. (B) Визуальная конформация инсульта и отверстия заусенца наблюдались через 5 дней после инсульта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Корональные срезы, охватывающие инфаркт. (A) Последовательные IHC участки мозга через 5 дней после инсульта, инсульт только лазером (вверху) и 2x линзой (снизу). Толщина ломтиков составляла 30 мкм, каждая секция находилась на расстоянии 300 мкм от предыдущей секции. (B) Увеличенное окрашивание IHC, 500 мкм шкалы-бар. Ядра (DAPI) показаны синим цветом, астроциты (GFAP+) красным цветом, а микроглиальные (Iba1+) зеленым, с 4-кратным увеличением. (C) Участки мозга, окрашенные TTC для визуализации объема поражения через 5 дней после инсульта, участки толщиной 1 мм с 1 см шкалой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Инъекция и визуализация биоматериала. (A) Визуальный эффект инъекции геля во время операции. (B) Гель может быть визуализирован глазом при удалении черепа. (C) После замораживания и установки гель был виден в мозге во время сечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Иммуногистохимические пятна инсульта только по сравнению с инсультом с гидрогелями. (A) Схема криосекционного мозга толщиной 30 мкм. Для анализа изображений было выбрано несколько разделов посередине. (B) Только инсульт, иммуногистохимия (IHC) окрашивает через 15 дней после инсульта. Клетки астроцитов (GFAP+) показаны красным цветом, микроглия (Iba1+) зеленым, а сосуды (GLUT1+) белыми. Инсульт + Состояние гидрогеля, IHC 10d после инъекции, через 15 дней после инсульта. Клетки астроцитов (GFAP+) показаны красным цветом, микроглия (Iba1+) зеленая, гидрогелевой материал белый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние микропористых отожженных гидрогелей частиц на реактивные астроциты и микроглию после инсульта. (A) Схема экспериментальной временной шкалы, где стрелка обозначает день инсульта, + обозначает день инъекции, а x обозначает точку времени жертвоприношения и анализа. (B) Схема установки анализа, показывающая, где были изображены и проанализированы участки. (C)Изображения IHC, показывающие реактивность астроцитов через pERK, S100b, GFAP. (D)Количественная оценка pERK/GFAP процентов астроцитов, которые были высокореакционноспособными. (E)Количественная оценка S100b/GFAP процентов астроцитов, которые были высокореактивными. (F)IHC изображения реактивности микроглии через окрашивание CD11b, Arg1 и iNOS. (G) Количественная оценка iNOS/Dapi для определения провоспалительного фенотипа микроглии. (H) Количественная оценка Arg1/Dapi для определения фенотипа микроглиального прорепарации. Все шкалы = 100 мкм. Статистический анализ проводился в GraphPad Prism. * указанные данные анализировали с помощью пост-хок теста Туки и 95% доверительного интервала с P<0,05. Отдельные p-значения указывают на Т-тест. Эта цифра изменена по сравнению со ссылкой26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы демонстрируем легко воспроизводимую, минимально инвазивную, постоянную модель инсульта и описываем, как ввести биоматериал в инфаркт через пять дней после инсульта. Использование фототромботического красителя Rose Bengal и коллимированного лазера 520 нм, подключенного к стереотаксическому устройству, дает нам возможность позиционировать удар в моторной коре мыши с повышенной точностью. Через пять дней после инсульта расположение инфаркта видно на глаз в центре облучения, 2,0 мм медио-латерально к брегме. Затем гидрогель точно вводится в сердечник хода с помощью шприцевых насосов. Смертность во время операции и после инсульта в этой модели практически отсутствует, и только горстка мышей умирает после операции из-за анестезиологических осложнений. Несмотря на преимущества использования PT stroke для применения биоматериала, существует несколько биологических ограничений и технических трудностей, которые следует устранить.
С точки зрения биологических ограничений, PT не является моделью инсульта, которая предлагает вариант реперфузии головного мозга, процесса, который может происходить спонтанно при инсультах человека или в ответ на извлечение / лизис эндоваскулярного сгустка. Кроме того, в отличие от модели MCAo, которая имитирует этиологию большинства инсультов человека, закупоривая крупный мозговой сосуд, PT ухудшает кровоток через многие более мелкие сосуды. Техническая сложность инъекционных биоматериалов гидрогеля заключается в их склонности прилипать к шприцу во время операции или к черепу во время экстракции. Проектирование гидрогеля, который остается в виде жидкости во время инъекции, а затем гелей in situ, может решить первую проблему; однако предотвращение прилипания геля к твердой мозговой оболочке часто неизбежно, поскольку место инъекции и ядро инсульта находятся на поверхности мозга. Это может затруднить извлечение мозговой ткани, сохраняя при этом биоматериал нетронутым. Таким образом, при удалении кусочков черепа из мозга необходимо проявлять особую осторожность, чтобы гарантировать, что твердая мозговая оболочка не поднимается вместе с черепом и непреднамеренно не выкорчевывает гель. Криосечение мозга также требует технических навыков, потому что как процесс обработки, так и трансекция лезвия могут легко отделить гель от окружающих тканей, тем самым ограничивая сбор данных об инфильтрации клеток. Отслоение усугубляется, когда материал не полностью интегрирован с тканью. Подготовка образца с помощью OCT создает арматурную оболочку, которая помогает свести к минимуму разделение материала во время резки.
Перед инъекцией биоматериалов мы рекомендуем оптимизировать желаемый размер инсульта в зависимости от штамма грызунов и лабораторных настроек. Меньшие или большие инфаркты могут быть сделаны путем настройки трех основных параметров: интенсивности выхода лазера, увеличения луча и времени облучения. Другие факторы, которые, как было также показано, влияют на размер инсульта, включают концентрацию изофлурана19 и количество времени, в течение которого красителю разрешается циркулировать до облучения. Что касается выходной интенсивности лазера (мощность / площадь или мВт /см2),мы обнаружили, что мощность лазера 10 мВт была достаточной для получения небольшого инфаркта с горизонтальным диаметром, немного меньшим, чем у лазерного луча. Более высокая мощность лазера давала незначительно более широкие, но существенно более глубокие инфаркты (данные не показаны) из-за лазерного луча, имеющего гауссов профиль облучения. Увеличивая интенсивность, центральная точка максимального излучения может проникать глубже мимо черепа, а также вызывать незначительное увеличение размеров пятна проникновения лазера. Другие модели инсульта истончали череп, шлифуя его перед применением света или лазера, чтобы увеличить проникновение света и последующую воспроизводимость свертывания при сохранении более низкой интенсивности лазера20; Однако это может вызвать кровоизлияние в череп и занимает изрядное количество времени во время операции и навыков, чтобы освоить без случайного повреждения мозга в процессе. Подобно интенсивности, увеличение диаметра лазерного луча также увеличивало размер инфаркта; однако интенсивность лазера и диаметр луча не масштабируются линейно относительно друг друга, а следуют уравнению, плотность мощности = мощность лазера (w)/ πr2, где — радиус луча. С точки зрения времени облучения, мы обнаружили, что для получения воспроизводимых ударов требуется минимум 10 минут. Чтобы увеличить горизонтальный диаметр инфаркта, сохраняя при этом вертикальную глубину постоянной, мы наносили лазер на соседние места в течение 10 минут каждое, последовательно. Чтобы устранить влияние концентрации изофлурана и времени циркуляции бенгальской розы, мы обнаружили, что 1,5% концентрация изофлурана и 7 мин циркуляции после инъекции IP приводили к последовательному образованию ударов. Эти пять параметров были оптимизированы для нашего конкретного использования. Нам потребовался достаточно большой инсульт, чтобы вызвать поведенческие изменения, но не вмешиваться в субвентрикулярную зону, где мы стремились изучить влияние нашего материала на нейронные клетки-предшественники. В дополнение к размеру удара, нам также нужно было определить оптимальный объем геля для инъекции. Как минимум, нам нужно было достаточно геля, чтобы полностью заполнить полость инсульта, потому что мы обнаружили, что промежутки между гелем и окружающими тканями приводят к таким же результатам, как и в наших контрольных группах, в то время как контакт между гелем и тканью приводит к меньшему количеству реактивных астроцитов и увеличению клеточной инфильтрации. Мы пришли к нижнему пределу в 4-6 мкл геля, который не вызывал побочных эффектов после инъекции (неопубликованные данные).
Что касается оценки исхода инсульта, есть несколько вариантов, помимо окрашивания IHC, таких как магнитно-резонансная томография, поведенческие тесты, гистологический анализ и окрашивание TTC (2,3,5-трифенилтетразолия хлорида). Настоятельно рекомендуется использовать TTC для предварительной оптимизации инсульта из-за его простоты использования и немедленных результатов. Предыдущее поведенческое тестирование в нашей лаборатории рассматривало тест цилиндра / спонтанную задачу передней конечности, тест на ходьбу по сетке и тест макаронных изделий12,21. Следует отметить, что ротародное тестирование не показало значительного снижения поведенческих исходов после внедрения метода ПТ-инсульта (данные не показаны). Таким образом, поведенческие тесты должны оценивать очень сложные задачи, которые требуют значительного коркового ввода.
Здесь мы продемонстрировали технику введения гидрогелей после инсульта без доставки факторов роста или клеток. Тем не менее, гидрогели также использовались для трансплантации клеток, а также доставки лекарств и факторов роста и могут оказаться ценным ресурсом как для изучения биологии после инсульта, так и для исследования новых методов терапии. В контексте инсульта наша лаборатория ввела непористые гидрогели гиалуроновой кислоты, инкапсулирующие индуцированные плюрипотентные нейронные клетки-предшественники, полученные из стволовых клеток14,18 в концентрациях от 25 000 клеток / мкл до 50 000 клеток / мкл геля. Использование гидрогеля приводило к увеличению жизнеспособности и дифференцировки клеток. Другие лаборатории также сообщили о дифференцировке клеток и увеличении регенерации тканей в ответ на гидрогели, используемые для трансплантации стволовых клеток после инсульта 22-24. Кроме того, мы ввели гидрогели с факторами роста после инсульта, которые приводят к регенерации тканей и улучшению поведения после инсульта13,14. С точки зрения конструкции материала, инъекционная способность является ценной особенностью, которая служит для минимизации инвазивности; поэтому гидрогели должны быть сформулированы либо как золь-гели (от жидкости до твердого тела), либо как истончение сдвига (G' > G" в статических условиях; G" > G' во время потока), или гранулированные гели, состоящие из строительных блоков, диаметр которых меньше внутреннего диаметра иглы12,25,26. Затем следует выполнить оптимизацию для проверки диффузии лекарств или факторов роста, жизнеспособности клеток в диапазоне клеточных концентраций, условий геля и параметров инъекции, таких как скорость, датчик иглы, глубина инъекции и день инъекции относительно того, когда был вызван инсульт. Например, день инъекции материала варьировался от одного дня после инсульта до трех недель после инсульта27,28. Здесь мы сообщаем о пяти днях, но ранее вводили через семь дней после инсульта при пересадке клеток. Эти дни были выбраны на основе временной шкалы воспалительной реакции, а также пиковой активности ангиогенеза и нейрогенеза, наблюдаемой через неделю после инсульта5,29,30,31. Характеристика объема также должна выполняться в каждой точке времени инъекции, так как объем удара будет уменьшаться со временем из-за атрофии. Учитывая, что эти параметры оптимизированы перед инъекцией, приведенные здесь методы достаточны для того, чтобы направлять пользователей для инъекций биоматериалов с добавлением клеток и/ или факторов роста и лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что TS является основателем Tempo Therapeutics, которая стремится коммерциализировать гидрогели MAP.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Национальные институты здравоохранения и Национальный институт неврологических расстройств и инсульта за финансирование (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
