Summary
Stroke är ett globalt problem med minimala behandlingsalternativ och ingen aktuell klinisk terapi för regenererande den förlorade hjärnvävnaden. Här beskriver vi metoder för att skapa exakta fototrobotiska stroke i motor cortex av gnagare och efterföljande injektion av hydrogel biomaterial för att studera deras effekter på vävnad regenerering efter stroke.
Abstract
Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte vanligaste dödsorsaken i USA. Ungefär 87% av alla stroke är ischemiska stroke och definieras som den plötsliga blockeringen av ett kärl som levererar blod till hjärnan. Inom några minuter efter blockeringen börjar celler dö och resulterar i irreparabla vävnadsskador. Nuvarande terapeutiska behandlingar fokuserar på blodproppsborttagning eller lys för att möjliggöra reperfusion och förhindra allvarligare hjärnskador. Även om övergående hjärnan plasticitet kan rädda en del av den skadade vävnaden över tid, betydande fraktioner av patienter lämnas med neurologiska underskott som aldrig kommer att lösa. Det saknas terapeutiska alternativ för att behandla neurologiska underskott orsakade av stroke, betonar behovet av att utveckla nya strategier för att behandla denna växande patientpopulation. Injicerbara biomaterial är för närvarande utformade för att förbättra hjärnans plasticitet och förbättra endogen reparation genom leverans av aktiva medel eller stamceller. En metod för att testa dessa metoder är att använda en gnagare stroke modell, injicera biomaterialet i strokekärnan och bedöma reparation. Att veta den exakta platsen för strokekärnan är absolut nödvändigt för korrekt behandling efter stroke, därför är en strokemodell som resulterar i en förutsägbar strokeplats att föredra för att undvika behovet av avbildning före injektion. Följande protokoll kommer att täcka hur man inducerar en fototrobotisk stroke, hur man injicerar en hydrogel på ett kontrollerat och exakt sätt och hur man extraherar och kryoserar hjärnan samtidigt som biomaterialet hålls intakt. Dessutom kommer vi att belysa hur samma hydrogelmaterial kan användas för samleverans av stamceller. Detta protokoll kan generaliseras till användning av andra injicerbara biomaterial i slagkärnan.
Introduction
Stroke är den främsta orsaken till funktionshinder och den femte ledande dödsorsaken i USA1. Cirka 87% av alla stroke är ischemiska, medan en majoritet av de återstående 13% är hemorragiska2. En ischemisk stroke definieras som blockering av blodflödet i en artär till den omgivande vävnaden. Denna ocklusion resulterar i syrebrist och efterföljande nekros som ofta leder till permanent funktionshinder hos överlevande patienter. Även om dödligheten i stroke3har minskat, förväntas prevalensen öka till 3,4 miljoner människor år 20304. Denna ökning av funktionshindrade överlevande och därav följande ekonomiska börda har lett till en push för strokeforskning som fokuserar på mekanismer för neural reparation. Efter stroke finns en inflammatorisk period som leder till bildandet av ett ärr som förhindrar att den nekrotiska regionen expanderar. Regionen kring den nekrotiska kärnan kallas "peri-infarct" och det finns starka bevis för att plasticiteten i denna region, som inkluderar ökad angiogenes, neurogenes och axonal groddning, är direkt kopplad till den observerade återhämtningen hos djurmodeller och människor5. Eftersom det inte finns några in vitro-modeller som korrekt kan replikera de komplexa interaktionerna efter stroke, är djurmodeller viktiga för strokeforskning.
Det finns flera in vivo-modeller som kan användas för att producera ischemisk stroke. En av de vanligaste modellerna som används hos möss är mellersta cerebrala gatan ocklusion, eller MCAo, genom distala eller proximal (via intraartär filament) ocklusion. Den proximala modellen, även känd som filament MCAo (fMCAo), resulterar vanligtvis i stora ischemiska slag som omfattar allt från 5% till 50% av hjärnhalvan, beroende på antalet faktorer6. I dessa modeller förs en sutur eller glödtråd fram från den inre halsartären till basen av den mellersta cerebrala artären (MCA) och hålls på plats under en viss tidsperiod. Denna metod för ocklusion, som kan göras tillfällig eller permanent, producerar en infarkt som är centrerad i striatum och kan eller inte kan innebära övergående cortex6. Den resulterande slagstorleken är mycket varierande, och avbildningstekniker, såsom laserdoppler, krävs för att bekräfta effektiviteten av proceduren i varje mus. Intraartär eller intra-luminal filamentocklusion som varar mer än 30 minuter producerar slag i den större änden av storleksområdet. Vissa utredare har fokuserat på kortare ocklusionstider för filament, vilket kräver betydande experimentellt fokus och labbvalidering7. Filament MCAo modeller i möss följer liknande stadier av celldöd, skandinavisk progression och bildandet av en peri-infarct region som ses i mänskliga stroke fall; de större stroke liknar dock sjukdomstillståndet hos maligna cerebrala hjärtinfarkter, som är mindre vanliga, mindre behandlingsbara mänskliga stroke6. Under tiden kräver distala MCA ocklusion en mer involverad kirurgi och craniectomy. I denna modell är den distala delen av MCA som löper längs hjärnans yta direkt ockluserad med en sutur slips eller cauterization. I vissa variationer av tekniken är halsartären ensidigt eller övergående-bilateralt ockluderade. En fördel med distala MCAo är att det producerar en närbaserad stroke som är mindre variabel i storlek än filamentmodellen. Den distala modellen producerar dock sämre beteendeutgång på grund av omsektion av den yttre halsartären (ECA), vilket också är ett problem med fMCAo6.
En alternativ strokemodell som är känd för att vara mindre invasiv är den fototrobotiska (PT) modellen. PT-modellen resulterar i en väldefinierad plats för ischemi och är förknippad med en hög överlevnadsgrad8. Tekniken förlitar sig på ett ljuskänsligt färgämne injicerat intraperitoneally som möjliggör intravaskulär fotooxidation helt enkelt genom att bestråla önskad vävnad med ett ljus eller laser9. Vid excitation bildas syreradikaler som orsakar endotelskada, vilket aktiverar trombocytaggregering och koagelbildning i det bestrålade området8,9. Den snäva kontrollen över slagstorlek och placering, liksom pt-modellens höga reproducerbarhet, gör den idealisk för att studera biomaterial. Medan precision möjliggörs med hjälp av en laser och stereotaxiska koordinater, finns det några nackdelar som kan göra denna modell mindre idealisk för få studier. Till skillnad från fMCAo-modellen kan PT-linjemodellen inte reperfuseeras. Därför skulle material för att undersöka neuroprotektiva medel som är specifika för skador efter reperfusion eller mekanismerna efter reperfusion inte vara användbara här8. Dessutom, på grund av den mikrovaskulära förolämpningen av PT-modellen, ses relativt liten ischemisk penumbra. Istället uppstår lokalt vasogent ödem, vilket är okarakteristiskt för mänsklig stroke, vilket gör denna modell oönskad för prekliniska läkemedelsstudier fokuserade på peri-infarktområdet6,8.
Det övergripande målet med biomaterialstrategier i stroke är att antingen leverera bioaktiva medel eller att fungera som en surrogat extracellulär matris för hjärnvävnadstillväxt. En strategi som vi kommer att utforska med våra metoder är att leverera hydrogel direkt in i strokekärnan, i motsats till peri-infarktvävnaden där många nuvarande cellterapier levereras10. Grunden för detta tillvägagångssätt är att leverans till den nekrotiska vävnaden som finns i kärnan kommer att undvika att störa den omgivande friska eller återhämtande vävnaden. Vi antar att diffusion av alla aktiva medel som ingår i biomaterialet kommer att kunna nå peri-infarct från kärnan, särskilt eftersom vi finner att leverans av hydrogelbiomaterial minskar tjockleken på gliaärret11. Detta är viktigt eftersom regionen peri-infarct har visat sig uppvisa neuroplasticitet efter stroke, vilket gör det till ett attraktivt mål. Dessutom kan leveransen av en surrogatmatris till slagkärnan laddas med angiogena12 eller neurogena13 faktorer för att styra bildandet av ny vävnad, liksom celler för leveransen14. Celltillförseln förbättras avsevärt genom att använda en matris eftersom den skyddar cellerna från de hårda injektionskrafterna och den lokala miljön som finns under leveransen, samt uppmuntrar differentiering och inympning15.
Dessa injicerbara terapeutiska biomaterial har klinisk relevans i stroke applikationer, eftersom det för närvarande inte finns några medicinska terapier som stimulerar neuronal återhämtning efter stroke. De underliggande neurala kretsarna som är involverade i återhämtning ligger i hjärnvävnad som ligger intill strokekärnan16, medan strokekärnan själv saknar livskraftig neural vävnad. Vi förväntar oss att leverans av ett biomaterial i den nekrotiska strokekärnan har potential att stimulera den intilliggande vävnaden mot regenerativa processer genom ett antal mekanismer som tidigare nämnts, inklusive depåutgivning av tillväxtfaktorer13,stimulering av vävnadstillväxt och främjande av återhämtning av hjärnvävnadsutveckling11,12,förändring av immunsvar17och leverans av stamcellsbaserade terapier14, 18. För att effektivt studera möjligheten till dessa tillämpningar behövs dock en konsekvent och reproducerbar metod för att inducera stroke och injicera biomaterial. PT-linjemodellen använder tekniker som ger exakt kontroll över orienteringen och platsen för slaget. En laser som är fäst vid den stereotaxiska enheten styr orienteringar, och pumpar som är anslutna till de stereotaxiska enheterna styr insprutningshastigheten för materialet utan att behöva ytterligare former av avbildning. Därför har vi valt att beskriva metoderna för att utföra en PT-stroke i mössens motoriska cortexer och för att injicera biomaterial i strokekärnan. Här använder vi mikroporösa glödgade partiklar (MAP) hydrogeler som biomaterial för injektion utan tillsatta celler eller tillväxtfaktorer. Dessutom förklarar vi hur man framgångsrikt hämtar hjärnan med intakt biomaterial, och vi diskuterar immunokemiska analyser som används för att analysera stroke resultatet med och utan injektion av biomaterial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes i enlighet med IUCAC vid Duke University och University of California Los Angeles. 8 till 12 veckor gamla manliga C57Bl/6J möss användes i denna studie. Djuren hölls under kontrollerad temperatur (22 ± 2 °C), med en ljusmörk cykelperiod på 12 timmar och tillgång till pelleterad mat och vatten ad libitum. Analgesi- och sederingsprotokoll beskrivs som godkända av IUCAC men kan skilja sig från protokoll som används i andra laboratorier.
Djur kan avlivas i förtid om de upplever överdriven rastlöshet, vokalisering (vilket indikerar okontrollerbar smärta), självtrauma, minskad eller nedsatt rörlighet, fysiska tecken på hudinfektion, aptitlöshet och/eller viktminskning större än 10-15% som ett resultat av överlevnadsoperationen. Det finns inga förväntade negativa effekter från injektion av gelén, eftersom den består av en naturligt förekommande polymer i hjärnan. Djuren bör övervakas dagligen, inklusive helger och helgdagar, och vägas om varannan dag. Studier från vårt laboratorium och andras har inte funnit några underskott i grooming, förlust av kroppsvikt eller tecken / symtom på abstinens eller kronisk stress hos möss efter dessa små när eller subkortikala stroke. Om djur uppvisar några tecken på lokal huvud sårinfektion bör de avlivas. Djur bör också övervakas för dålig grooming, sårtillstånd och bevis på kamp mellan djur (ryggsår). Om det finns bevis för kamp eller sårdehiscence, bör djur först behandlas efter att ha kontaktat veterinärerna. Detta innebär ofta antibiotika i vattnet och/eller lokal topikal antibiotikaapplikation. Om dessa åtgärder misslyckas med att producera läkning, bör djur avlivas.
1. Beredning av material och instrument
- Förbered fototrobotiskt färgämne före operationen. Väg ut 15 mg Rose Bengal i ett 2 ml microcentrifugerör.
VARNING: Rose Bengal kan orsaka allvarliga ögonskador/irritation.- Lös upp Rosenbengalen i 1,5 ml sterilt filtrerat 1x PBS för att göra en arbetskoncentration på 10 mg/ml.
- Virvla röret tills inga klumpar är synliga, vilket indikerar att färgämnet har löst sig helt och täck sedan i folie tills vidare användning.
OBS: Mängden färg som krävs beror på antalet möss. Färgämne injiceras intraperitoneally IP vid en koncentration av 10 μL/g, t.ex. 200 μL för en mus på 20 g.
- Slå på värmedynan för att bibehålla musens kroppstemperatur under anestesi (37 °C).
- Förbered autoklaverad sax, tång, bomull, veterinär ögonsalva, kirurgiskt lim eller suturmaterial, en blå eller svart kirurgisk markör och sterila alkohol- och betajodservetter. Förbered benborr med steriliserade borrkronor.
- Slå på pärlsteriliseringen till 160 °C för att möjliggöra sterilisering av instrument mellan mösskirurgi. Avsätt ett koniskt rör på 50 ml steril saltlösning eller 1x PBS-lösning för senare användning för att upprätthålla ett hydratiserat driftsområde.
- Fäst lasern på stereotaxic-enheten. Bär laser säkerhetsglasögon, mät laserns (mW) kraft.
VARNING: Använd laserglasögon när lasern är påslagen i proceduren.- Justera strömmen på laserkonsolen enligt anvisningarna för lasertillverkning tills lasereffekten avtar 10 mW och ställ in strömmen som en förinställda på hemskärmskonsolen. Justera sedan strömmen igen för att etablera en annan förinställda där laserutgångens effekt läser 40 mW. Stäng nu av lasern tills vidare användning.
OBS: 10 mW kommer att användas för att orientera lasern före användning.
- Justera strömmen på laserkonsolen enligt anvisningarna för lasertillverkning tills lasereffekten avtar 10 mW och ställ in strömmen som en förinställda på hemskärmskonsolen. Justera sedan strömmen igen för att etablera en annan förinställda där laserutgångens effekt läser 40 mW. Stäng nu av lasern tills vidare användning.
- Förbered en ren bur för möss efter operationen. Placera sedan musen i induktionskammaren med en isoflurankoncentration på 4% för att bedöva den tills spontan rörelse slutar och andningen kommer till en långsam, stadig hastighet.
- När du sover, väg musen för att bestämma hur mycket Rose Bengal färg att injicera. Överför sedan och säkra musen till den stereotaxiska enheten med en underhållsisflurankoncentration på 1,5%.
OBS: Ökande isoflurankoncentrationer kan vidga kärlen och förhindra tillräcklig ocklusion eller konsekvent stora slag mellan möss. - Applicera veterinär ögonsalva på båda ögonen.
OBS: Titta på andning och temperatur under hela proceduren och nyp tår ibland för att säkerställa att musen inte kan känna någonting.
2. Fototrobotisk slagmodell9
- Raka pälsen från musens huvud och förbered aseptiskt området med hjälp av en alkoholservett följt av en beta jodtorka. Upprepa tre gånger.
OBS: Använd vid behov en extra alkoholservett i slutet för att rengöra all betajod eftersom det orsakar hudirritation som leder till att mössen kliar skallen efter operationen. - Använd liten operationssax, gör ett lateralt snitt mellan öronen till ögonen, ca 1-2 cm. Gör detta genom att dra huden uppåt med tång för att skapa ett tält, skära en gång nedåt, sedan sätta saxen i öppningen och skapa ett kontinuerligt mittlinjesnitt.
- Separera huden och tryck lätt på parietalbenen med tången för att lokalisera bregma. Markera bregma med en punkt med hjälp av den kirurgiska markören.
OBS: Benfragment rörelse belyser frontal gränsen av parietal ben. Bregma är den mittpunkt där frontal- och parietalbensfragmenten möts (figur 1A). - Bär laser säkerhetsglasögon, flytta lasern över musens skalle och fixera stereotaxic enheten i 90° vinkel. Välj 10 mW förinställda och slå på lasern.
- Justera laserns x- och y-axel tills den är direkt över bregma. Återställ x och y på den digitala displaykonsolen och flytta sedan lasern 1,8 mm till vänster om bregma. Ta nu lasern så nära skallen som möjligt utan att låta den vidröra skallen.
- Flytta lasern till 2,2 mm vänster om bregma för att säkerställa att den kan röra sig utan hinder. Stäng av lasern.
- Injicera lämplig mängd Rose Bengal färg intraperitoneally (IP) med en engångs 29 G nål. Starta omedelbart en timer i 7 min för att låta färgämne cirkulera systemiskt. Välj förinställda på 40 mW utan att slå på lasern.
OBS: När färgämnet är bekvämt med proceduren kan det injiceras före aseptisk förberedelse av musen och avslutas innan 7 min är över för att spara tid. - Slå på lasern (40 mW) när 7 min-timern går av, medan du bär lasersäkerhetsglasögon, och ställ in en 10 min timer.
- Efter 10 min, flytta lasern till 2,2 mm vänster om bregma utan att stänga av den och ställ in ytterligare 10 min timer.
- När den andra 10 min timern har gått av, byt tillbaka lasern till 10 mW och flytta lasern till 2,0 mm vänster om bregma. Markera den här platsen med den kirurgiska markören. Stäng sedan av lasern.
- Lyft lasern och lås upp den från 90°-vinkeln så att den kan flyttas bort från musen. Applicera vid denna punkt den sterila saltlösningen eller PBS med bomull om operationsområdet är torrt.
- Borra i små skurar vid 2,0 mm-märket vinkelrätt mot skallens yta.
OBS: Var noga med att borra långsamt för att undvika att borra för djupt och träffa hjärnan. Motståndet kommer att minska något när borren har gått igenom skallen, och borrning kan orsaka blödning.- Använd bomull för att absorbera överflödigt blod. Det är typiskt att se lite blod från hackade artärer i skallen efter borrning – överdrivet blod betyder att borrkronan träffade hjärnan. Om detta händer spelar du in musidentifieraren och går vidare.
- Placera en liten rensning bredvid musen. Använd tångarna och dra huden nära varandra för att förbereda för limning.
OBS: Suturering kan göras här istället. Suturering kräver vanligtvis bara 3 suturer.- Använd tångarna, ta tag i de två sidorna av huden och dra dem tillsammans och uppåt. Doppa av alla stora droppar kirurgiskt lim i slutet av spetsen på våtservetten innan du applicerar på musen.
- Applicera det kirurgiska limet sparsamt och håll ihop huden med tång i 10 s. Fortsätt tills det inte finns några synliga öppningar.
OBS: Limet kommer ut snabbt – pressa inte flaskan. Undvik att limma huden på skallen eller få lim i ögat.
- Efter limning, eller suturering, placera musen i den nya buren för att återhämta sig från anestesi. Det tar 5-10 min för djuret att återhämta sig, och det hjälper till att vila hälften av buret på en värmeplatta.
3. Skenslagsoperation
- Utför alla procedurer identiskt med den operation som beskrivs ovan i avsnitt 2 utom injicera 1x PBS eller saltlösning istället för Rose Bengal färgämne.
4. Injektion av hydrogel eller andra biomaterial
- Utför injektionen av biomaterial vid en användardefinierad tidpunkt. I detta experiment injektioner utfördes mellan 5- och 7-dagar post-stroke. 2 - 6 μL hydrogel injiceras (användardefinierad).
- Slå på värmedynan för att bibehålla musens kroppstemperatur under anestesi (37 °C).
- Förbered autoklaverad sax, tång, bomull, veterinär ögonsalva, kirurgiskt lim eller suturmaterial och sterila alkohol- och betajodservetter. Förbered benborren med sterila borrkronor och Hamiltonsprutorna i 25 μL glas med metall 30 G nålar.
- Slå på pärlsteriliseringen till 160 °C för att möjliggöra sterilisering av instrument mellan möss.
- Fäst insprutningspumparna på stereotaxiska enheten. Ställ in flödeshastigheten på 1 μL/min och ställ in volymen på 4 μL.
- Förbered en ren bur för mössen efter operationen.
- Placera musen i induktionskammaren med en isoflurankoncentration på 4% för att bedöva den tills spontan rörelse stannar och andningen kommer till en långsam, stadig hastighet.
- När du sover överför och fäst musen till den stereotaxiska enheten med en underhållsisflurankoncentration på 1,5%.
- Applicera veterinärens ögonsalva på båda ögonen.
- Raka päls som kan ha återväxt av musens huvud och förbered aseptiskt området genom att använda en alkoholservett följt av en betajodservett. Upprepa tre gånger.
OBS: Använd vid behov en extra alkoholservett i slutet för att rengöra bort allt betajod eftersom det orsakar hudirritation och leder till att mössen kliar skallen efter operationen.
- Använd den lilla saxen och/eller tången igen, öppna huden ovanför hjärnan igen. Använd bomull med steril saltlösning eller PBS för att rengöra skräp från skallen. En vitgul cirkel (slaget, figur 1B) och borrhålet från borren kommer att vara synliga. Om den döda vävnaden inte är synlig, troligen ingen stroke inträffade. Om borrhålet inte är centrerat ovanför slaget, borra om för att centrera det.
- Rikta insprutningspumpen över musen och lås vid 90°. Rengör sprutan med steril saltlösning eller PBS-lösning innan du laddar om materialet.
- När glassprutan är ren, ta isär glassprutan så att det inte finns någon nål. Ladda sprutan igen med en 25 μL positiv deplacementpipetter med 10 μL hydrogel (eller annat biomaterial här med eller utan celler).
- Tryck gelén hela vägen fram till sprutans framsida med sprutan. Sätt sedan ihop sprutan igen och fortsätt att trycka tills gelén synligt utstrålar från nålen.
- Placera sprutan på pumpen. Pumpens baksida kan behöva justeras så att sprutan passar. Gör detta genom att justera flödeshastigheten till 30 μL/min, välj Uttag eller Injicera beroende på vilken riktning den behöver röra sig och tryck sedan på Start. Tryck på Stopp när pumpens baksida är på rätt plats.
- Skruva fast pumpens baksida så att sprutan är säker. Om justeringar tidigare har gjorts, se till att flödeshastigheten är inställd på 1 μL/min och är inställd på att injicera.
- Flytta pumpen i x- och y-riktningen för att orientera den över hålet. Flytta pumpen nedåt i z-riktningen tills sprutans nål vidrör hålets överkant.
- Återställ z på den digitala bildskärmskonsolen. Flytta sedan sprutan nedåt i z-riktningen 0,750 mm. Om sprutan böjer sig eller det finns motstånd, läkte skallen eller borrades inte helt igenom och måste borras om.
- Tryck på Start på pumpkonsolen för att injicera 4 - 6 μL av hydrogelen med en hastighet av 1 μL/min.
- Ställ in en 5 min timer när pumpen slutar injicera så att gelén kan börja korsas.
- Dra långsamt upp sprutan efter 5 minuter genom att vrida z nob. Titta för att se om något material oavsiktligt dras eller läcker från hålet. Lås upp pumpen och flytta den bort från musen när nålen är tillräckligt långt borta från skallen.
- Använd tång, kirurgiskt lim eller suturer, stäng huden ovanför huvudet. Placera musen i den rena buren och observera dess återhämtning. Det bör ta ca 5 – 10 min för musen att återhämta sig från anestesi.
5. Perfusion och provsamling
- Bedöva musen med isofluran.
- Fixera djuret i supinläge och öppna bukhålan med ett mediansnitt. Kläm eventuellt fast den fallande bukaortan för att använda mindre fixativ och PBS.
- Skär upp membranet och flytta upp sidorna av revbenskorgen för att öppna brösthålan. Sätt in en perfusions cannula i vänster kammare och skär en öppning i höger förmak. Börja långsamt perfusera med 10-20 ml PBS eller tills vätskan går halvklart.
- När det är klart, byt till 4% PFA för ytterligare 10 - 20 ml. Att lossa armarna gör det möjligt för dem att dra ihop sig när PFA infuserar. När de slutar röra sig, vänta på ytterligare 30 s.
- Halshugga djuret och dra tillbaka huden för att exponera skallen. Använd trubbiga, tunna tångar, ta försiktigt bort bitarna av skallen för att exponera hjärnan. Särskild försiktighet måste iakttas när du tar bort skallen ovanför slagstället. Små kirurgiska saxar kan användas här för att skära bort skallen. Den största utmaningen är att gel fastnar i skallen och kommer ut ur hjärnan när skallen tas bort.
- När hjärnan är fristående, placera i 10 - 15 ml 4% PFA över natten (inte längre än 24 h).
- Flytta hjärnan från PFA till 30% sackaros följande dag. Hjärnan är redo för kryosektion när den sjunker till botten (ca 2 - 3 dagar). Det kan också lämnas för lagring vid denna tidpunkt.
6. Cryosectioning och färgning
- Ta hjärnan ur sackaros och placera på en glasrutschbana. Skär av en liten del av hjärnans baksida med ett rakblad för att skapa en platt del som ska monteras på en chuck.
- Placera en klick optimal skärtemperaturförening (OCT) på chucken och placera sedan hjärnan, platt sida ner, på chucken i OKT. Placera detta prov på torr is tills det är fruset eller i kryostaten på frysblocket.
OBS: OCT kan läggas till för att helt omfatta hjärnan för att förhindra att materialet separeras från hjärnan under sektionering.
- Placera en klick optimal skärtemperaturförening (OCT) på chucken och placera sedan hjärnan, platt sida ner, på chucken i OKT. Placera detta prov på torr is tills det är fruset eller i kryostaten på frysblocket.
- Skär hjärnorna seriellt på en kryostat vid -20 °C vid 30 μm tjocka sektioner över 10 gelatinbelagda diabilder. Var försiktig när du delar ut den och se till att hydrogelen inte förloras. Om denna del är svår, placera lite OCT på toppen av hjärnan över gelén (figur 3). Förvara vid -80 °C tills vidare användning.
- Ta ut bilder ur -80 °C och placera på en färgbricka så att de kan torka. Diabilder som inte har frusits men bara delars upp kan också färgas omedelbart.
- Använd en hydrofobisk penna och rita en cirkel runt hjärnskivorna på bilden. När du är torr, rehydrera hjärnskivorna med 1x filtrerad PBS och placera på en shaker vid rumstemperatur i 15 min. Detta tar cirka 1 ml buffert per bild med 9 - 12 hjärnsektioner.
- Tvätta rutschkanorna med 1x filtrerad PBS i 5 min vid rumstemperatur, upprepa tre gånger.
- Blockera diabilder i 30 minuter till en timme med 10% åsneserum i 0,01% PBS-Triton X vid rumstemperatur på magdansösen. Detta tar cirka 200 μL per bild.
- Inkubera den primära antikroppen i 10% åsneserum med 0, 01% PBS-Triton X över natten vid 4°C på en shaker. Testa primära antikroppar först för att bestämma korrekta koncentrationer. Här användes GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (figur 4).
- Tvätta rutschkanorna med 1x filtrerad PBS följande dag i 5 min vid rumstemperatur, upprepa tre gånger.
- Inkubera med sekundär antikropp i 10% åsneserum i 0, 01% PBS-Triton X och DAPI i 2 timmar på labbskakaret vid rumstemperatur. 1:1,000 användes för alla sekundärer och DAPI.
- Tvätta rutschkanorna i 5 min med 1x filtrerad PBS.
- Låt sektionerna torka i rumstemperatur i mörkret. Detta kan ta 20 min till 4 h; att placera bilderna i en desiccator kan påskynda processen.
- Dehydrera diabilder i stigande koncentrationer av alkohol (1 min per lösning) på 50%, 70%, 95%, 100% och 100%.
- Fett i första badet av xylen i 1 min, sedan andra badet av xylen i 5 min.
- Ta snabbt ut bilderna en efter en och lägg till monteringsmedium medan hjärnsektionerna är våta med xylen. Lägg snabbt till ett glasöverdrag ovanpå. Använd ett täckdrag som är av rätt längd och tjocklek som behövs för den bild och mikroskop som används för avbildning.
- Bli av med eventuella bubblor under täcksläket genom att trycka försiktigt med en pipettspets i en utåtgående rörelse från mitten av bilden. Låt DPX torka i 4 timmar till över natten i mörker vid rumstemperatur.
- Använd ett rakblad för att skrapa bort alla torkade monteringsmedier som spills på rutschkanorna. Torka av rutschkanorna med linsrengörare. Diabilder kan nu avbildas med fluorescensmikroskopi.
OBS: Det är bäst att förvara rutschkanan i mörker eller vid 4 °C tills avbildningen är klar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med denna metod var att visa hur man injicerar biomaterial i hjärnan efter stroke. En fotothrombotic modell med rose bengal och en 520 nm laser användes för kontrollerad orientering av stroke lesion i både storlek och plats. Fem dagar efter stroke kunde infarkten visualiseras under operationen(figur 1B) och av TTC och bildbehandling IHC färgade diabilder (figur 2). En ökning av laserdiametern med en 2x lins leder till en visuell ökning av strokeskadan som sträckte sig över 2,5 mm jämfört med en enda 1 mm sektion med endast lasern(figur 2). Dödlighet under kirurgi med PT modellen inträffade sällan, mindre än 1%, på grund av att minimalt invasiva förfarandet. Dödsfall efter kirurgi var också låg och ses i mindre än 5% av mössen.
Hyaluronsyrabaserade hydrogelmikropartiklar (HMPs) injicerades fem dagar efter stroke(figur 3). HMPs glödgning efter injektion i stroke lesion för att bilda mikroannealed partiklar (MAP) med en porös ställning som möjliggjorde cellmigrering i strokekärnan(figur 4). Tio dagar efter injektion möss perfused med 4% PFA och deras hjärnor extraherades, placeras i 4% PFA över natten, och sedan i 30% sackaros i två dagar innan de frystes och sektionerades för IHC färgning och analys.
Tidigare arbete i vårt labb visade injektionen av MAP hydrogeler i stroke lesion fem dagar efter stroke26. Injektion av hyaluron hydrogeler som matchar modulus i cortex ledde till en betydande minskning av de reaktiva astrocyterna inom peri-infarct samt inuti MAP gel. Dessutom uttryckte mikroglia som också fanns inom hydrogelen proreparations M2-markörer. Detta tyder på att MAP hydrogel kan minska astrocytreaktiviteten på bara två dagar efter injektioner och främja en mer antiinflammatorisk miljö med pro-återhämtningsastrocyter och mikroglia (figur 5).
Figur 1: Schematisk representation av bregma och lokalisering av stroke. a)Parietalloberna möts upptill och bildar bregma. Laser placering var centrerad 2,0 mm vänster om bregma. (B) Visuell konformation av slag och burr hål sågs 5 dagar efter stroke. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Koronalsektioner som spänner över infarkten. (A) Seriella IHC-sektioner av hjärnor 5 dagar efter stroke, stroke med laser endast (överst) och 2x lins (botten). Skivorna var 30 μm tjocka med varje sektion 300 μm från föregående avsnitt. b)Förstorad IHC-fläck, 500 μm skalstång. Kärnor (DAPI) visas i blått, astrocyter (GFAP+) i rött och mikroglial (Iba1+) i grönt, 4x förstoring. (C) Sektioner av hjärnor färgade med TTC för att visualisera lesionsvolymen 5 dagar efter stroke, 1 mm tjocka sektioner med 1 cm scalebar. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Injektion och visualisering av biomaterial. (A) Visuellt av gelinjektion under operationen. (B) Gelén kan visualiseras med öga när skallen tas bort. (C) När gelén väl var frusen och monterad var den synlig i hjärnan under sektionering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Immunohistokemi fläckar av stroke endast jämfört med stroke med hydrogeler. ( A) Schematic av kryomulerade hjärnor 30 μm tjocka. Flera sektioner i mitten valdes för bildanalys. (B) Endast stroke, immunohistokemi (IHC) fläckar 15 dagar efter stroke. Astrocyter (GFAP+) celler visas i rött, mikroglia (Iba1+) är gröna och kärl (GLUT1+) är vita. Stroke + Hydrogel tillstånd, IHC 10d efter injektion, 15 dagar efter stroke. Astrocyter (GFAP+) celler visas i rött, mikroglia (Iba1+) är gröna, hydrogelmaterial är vitt. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Effekter av mikroporösa glödgade partikelhydrogeler på reaktiva astrocyter och mikroglia efter stroke. (A) Schemat för experimentell tidslinje där pilen betyder strokedag, + betyder injektionsdag och x betecknar offer och analystidpunkt. (B) Schematisk analysinställning som visar var avsnitt avbildades och analyserades. (C)IHC-bilder som visar astrocytreaktivitet genom pERK, S100b, GFAP. (D) Kvantifiering av pERK/GFAP procent av astrocyter som var mycket reaktiva. (E) Kvantifiering av S100b/GFAP procent av astrocyter som var mycket reaktiva. (F)IHC-bilder av mikrogliareaktivitet genom CD11b, Arg1 och iNOS färgning. G)Kvantifiering av iNOS/Dapi för bestämning av mikrogliaprofysatorisk fenotyp. H)Kvantifiering av Arg1/Dapi för bestämning av mikrogliaproreparationsfenotyp. Alla skalstreck = 100 μm. Statistisk analys gjordes i GraphPad Prism. * indikerade data analyserades med Tukey post-hoc test och ett 95% konfidensintervall med P<0.05. Individuella p-värden indikerade T-test. Denna siffra ändras från ref.26. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi en lätt reproducerbar, minimalt invasiv, permanent stroke modell och beskriver hur man injicerar ett biomaterial i infarct fem dagar efter stroke. Användningen av det fototrobotiska färgämnet Rose Bengal och en 520 nm kollimerad laser ansluten till den stereotaxiska enheten ger oss möjlighet att placera slaget vid musens motorbark med förbättrad precision. Fem dagar efter stroke är infarktens placering synlig med ögat i centrum av bestrålning, 2,0 mm medio-lateral till bregma. Hydrogel injiceras sedan noggrant i slagkärnan med hjälp av sprutpumpar. Dödlighet under operationen och efter stroke i denna modell är praktiskt taget frånvarande, med endast en handfull möss dör efter kirurgi på grund av anestesiologiska komplikationer. Trots fördelarna med att använda PT stroke för biomaterialapplikationer finns det flera biologiska begränsningar och tekniska svårigheter som bör åtgärdas.
När det gäller biologiska begränsningar är PT inte en strokemodell som erbjuder alternativet för cerebral reperfusion, en process som kan uppstå spontant i mänskliga stroke eller som svar på endovaskulär blodproppsåterhämtning/lys. Dessutom, till skillnad från MCAo-modellen som efterliknar etiologin hos de flesta mänskliga stroke genom att ockludera ett stort cerebralt kärl, försämrar PT blodflödet genom många mindre kärl. En teknisk svårighet att injicera hydrogelbiomaterial är deras tendens att hålla fast vid sprutan under operationen eller på skallen under extraktioner. Att designa en hydrogel som förblir som en vätska under injektionen och sedan geler in situ kan ta itu med det första problemet; Att förhindra att gelén fastnar på duramater är dock ofta oundvikligt eftersom injektionsstället och strokekärnan finns på hjärnans yta. Detta kan göra det svårt att extrahera hjärnvävnaden samtidigt som biomaterialet hålls intakt. Som sådan måste särskild försiktighet iakttas när man tar bort bitar av skallen från hjärnan för att säkerställa att dura mater inte lyfter med skallen och oavsiktligt rycker upp gelén. Cryosectioning hjärnor kräver också teknisk skicklighet eftersom både hanteringsprocessen och bladtransection lätt kan lossa gelén från dess omgivande vävnad, vilket begränsar datainsamlingen om cellinfiltration. Lossningen förvärras när materialet inte är helt integrerat med vävnaden. Genom att förbereda provet med OCT skapas ett förstärkningsskal som hjälper till att minimera materialseparation under skärning.
Innan du injicerar biomaterial rekommenderar vi att du optimerar önskad strokestorlek beroende på gnagare stam och laboratorieinställning. Mindre eller större infarkter kan göras genom att justera tre huvudparametrar: laserutgångsintensitet, strålförstoring och bestrålningstid. Andra faktorer som också har visat sig påverka strokestorleken är koncentrationen av isofluran19 och hur lång tid färgämnet får cirkulera före bestrålning. När det gäller laserutgångsintensitet (effekt/område eller mW/cm2) fann vi att en lasereffekt på 10 mW var tillräcklig för att producera en liten infarkt med horisontell diameter något mindre än laserstrålens. Högre lasereffekt gav marginellt bredare men betydligt djupare infarkter (data visas inte) på grund av att laserstrålen hade en gaussisk bestrålningsprofil. Genom att öka intensiteten kan centrumpunkten för maximal strålning tränga djupare förbi skallen, samt orsaka den lilla ökningen av laserns spotstorlekspenetration. Andra slagmodeller har tunnat ut skallen genom att slipa den innan den appliceras ljus eller laser för att öka ljuspenetration och efterföljande reproducerbarhet av koagulering samtidigt som en lägre laserintensitetbibehålls 20; Detta kan dock orsaka blödning i skallen och tar en hel del tid under kirurgi och skicklighet att behärska utan att oavsiktligt skada hjärnan i processen. I likhet med intensiteten ökade laserstrålediametern också infarktstorleken; Laserintensitet och stråldiameter skalas dock inte linjärt med avseende på varandra utan följer ekvationen, effekttäthet = lasereffekt (w)/ πr2, där är strålens radie. När det gäller bestrålningstid fann vi att minst 10 min behövdes för att ge reproducerbara slag. För att öka den horisontella diametern på infarkten samtidigt som vi höll det vertikala djupet konstant, applicerade vi lasern på intilliggande platser i 10 min vardera, sekventiellt. För att ta itu med påverkan av isofluran koncentration och cirkulationstid av rose bengal, fann vi att 1,5% isofluran koncentration och 7 min av cirkulation efter IP injektion resulterade i konsekvent bildandet av stroke. Dessa fem parametrar var optimerade för vår specifika användning. Vi krävde en tillräckligt stor stroke för att orsaka beteendeförändringar men ändå inte störa den subventriska zonen, där vi syftade till att studera effekten av vårt material på neurala stamceller. Förutom strokestorlek behövde vi också bestämma den optimala gelvolymen för att injicera. Åtminstone behövde vi tillräckligt med gel för att helt fylla slaghålan eftersom vi fann att luckor mellan gel och omgivande vävnad ledde till liknande resultat som våra kontrollgrupper, medan kontakt mellan gel och vävnad resulterade i färre reaktiva astrocyter och ökad cellulär infiltration. Vi kom fram till en lägre gräns på 4-6 μL gel, som inte gav några negativa effekter efter injicerade (opublicerade data).
När det gäller att bedöma stroke resultatet finns det flera alternativ utöver IHC färgning, såsom magnetisk resonans imaging, beteendemässiga tester, histologiska analys, och TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium klorid) färgning. Det rekommenderas starkt att använda TTC för preliminär optimering av stroke på grund av dess användarvänlighet och omedelbara resultat. Tidigare beteendetester i vårt labb har tittat på cylindertestet / spontana förbensuppgiften, rutnätsvandringstestet och pastatestet12,21. Det bör noteras att rotarod testning inte visade betydande minskningar av beteendemässiga resultat efter PT stroke metoden genomfördes (data visas inte). Beteendetester bör därför bedöma mycket komplexa uppgifter som kräver betydande närinmatning.
Här visade vi tekniken att injicera hydrogeler efter stroke utan leverans av tillväxtfaktorer eller celler. Hydrogeler har dock också använts för celltransplantation, liksom läkemedels- och tillväxtfaktorleverans, och kan visa sig vara en värdefull resurs för att både studera biologi efter stroke och undersöka nya behandlingsmetoder. I samband med stroke har vårt labb injicerat icke-porösa hyaluronsyrahydrogeler som kapslar in inducerade pluripotenta stamcellsbaserade neurala stamceller14,18 vid koncentrationer från 25 000 celler/ μL till 50 000 celler/μL gel. Användningen av en hydrogel resulterade i en ökning av cellens livskraft och differentiering. Andra laboratorier har också rapporterat celldifferentiering och ökad vävnadsregenerering som svar på hydrogeler som används för att transplantera stamceller efter stroke 22-24. Dessutom har vi injicerat hydrogeler med tillväxtfaktorer efter stroke som leder till vävnadsregenerering och beteendeförbättring efter stroke13,14. När det gäller materialdesign är injicerbarhet en värdefull egenskap som tjänar till att minimera invasivitet; Hydrogeler bör därför formuleras som antingen solgeler (flytande till fasta), skjuvförtunning (G' > G" under statiska förhållanden. G" > G' under flödet) eller granulatgel som består av byggstenar vars diameter är mindre än innerdiametern på ennål 12,25,26. Optimering bör sedan utföras för att testa diffusion av läkemedel eller tillväxtfaktorer, cellens livskraft under en rad cellkoncentrationer, gelförhållanden och injektionsparametrar, såsom hastighet, nålmätare, injektionsdjup och injektionsdag i förhållande till när stroke inducerades. Till exempel har dagen för materialinjektion varierat från en dag efter stroke till, så länge som tre veckor efter stroke27,28. Här rapporterar vi fem dagar men har tidigare injicerat sju dagar efter stroke vid transplantation av celler. Dessa dagar valdes baserat på tidslinjen för det inflammatoriska svaret samt toppaktiviteten av angiogenes och neurogenes sett en vecka efter stroke5,29,30,31. Volymkarakterisering bör också utföras vid varje injektionstillfälle, eftersom strokevolymen kommer att minska med tiden på grund av atrofi. Med tanke på att dessa parametrar optimeras före injektion, metoderna här är tillräckliga för att vägleda användare att injicera biomaterial med tillsats av celler och / eller tillväxtfaktorer och läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att TS är en grundare i Tempo Therapeutics, som försöker kommersialisera MAP-hydrogeler.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma National Institutes of Health och National Institute of Neurological Disorders and Stroke för finansiering (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
