Summary
中风是一个全球性问题，治疗选择最少，目前没有用于再生丢失的脑组织的临床治疗方法。在这里，我们描述了在啮齿动物的运动皮层中产生精确光血栓性中风的方法，并随后注射水凝胶生物材料，以研究它们对中风后组织再生的影响。
Abstract
中风是美国残疾的主要原因和第五大死因。大约87%的中风是缺血性中风，被定义为向大脑供血的血管突然阻塞。在阻塞的几分钟内，细胞开始死亡并导致不可挽回的组织损伤。目前的治疗重点是血栓去除或裂解，以允许再灌注并防止更严重的脑损伤。虽然短暂的脑可塑性可能会随着时间的推移挽救一些受损组织，但很大一部分患者留下了永远无法解决的神经功能障碍。缺乏治疗中风引起的神经功能障碍的治疗选择，强调需要制定新的策略来治疗这一不断增长的患者群体。可注射的生物材料目前正在设计中，通过递送活性剂或干细胞来增强大脑可塑性并改善内源性修复。测试这些方法的一种方法是利用啮齿动物中风模型，将生物材料注射到中风核心中，并评估修复情况。了解卒中核心的精确位置对于卒中后的准确治疗至关重要，因此，最好使用导致可预测的卒中位置的卒中模型，以避免在注射前需要成像。以下方案将涵盖如何诱导光血栓性中风，如何以受控和精确的方式注射水凝胶，以及如何提取和冷冻切除大脑，同时保持生物材料完整。此外，我们将重点介绍如何将这些相同的水凝胶材料用于干细胞的共递送。该协议可以推广到使用其他可注射的生物材料进入中风核心。
Introduction
中风是美国残疾的主要原因和第五大死因1。大约87%的卒中是缺血性的，而其余13%中的大多数是出血性2。缺血性卒中被定义为动脉中流向周围组织的血流阻塞。这种闭塞导致缺氧和随后的坏死，这通常导致幸存患者的永久性残疾。虽然中风3的死亡率有所下降，但预计到2030年其患病率将增加到340万人4。残疾幸存者的增加以及随之而来的经济负担导致了对中风研究的推动，该研究的重点是神经修复机制。中风后有一个炎症期，导致疤痕的形成，阻止坏死区域扩张。坏死核心周围的区域被称为"围死期梗死"，并且有强有力的证据表明，该区域的可塑性（包括增加的血管生成，神经发生和轴突发芽）与动物模型和人类观察到的恢复直接相关5。由于没有体外模型可以正确复制中风后的复杂相互作用，因此动物模型对于中风研究至关重要。
有几种体内模型可用于产生缺血性中风。小鼠最常用的模型之一是通过远端或近端（通过动脉内丝）闭塞的脑中动脉闭塞或MCAo。近端模型，也称为细丝MCAo（fMCAo），通常会导致大的缺血性卒中，包括大脑半球的5%至50%，这取决于因素的数量6。在这些模型中，缝合线或细丝从颈内动脉推进到大脑中动脉（MCA）的底部，并保持在适当的位置一段时间。这种闭塞方法可以是暂时的或永久性的，产生以纹状体为中心的梗死，并且可能涉及也可能不涉及覆盖的皮层6。由此产生的笔画大小变化很大，并且需要成像技术（例如激光多普勒）来确认每个小鼠中该程序的有效性。持续超过30分钟的动脉内或腔内灯丝闭塞在尺寸范围的较大末端产生中风。一些研究人员专注于较短的灯丝闭塞时间，这需要大量的实验重点和实验室验证7。小鼠中的细丝MCAo模型遵循与人类中风病例相似的细胞死亡，缺血进展和围死区形成的阶段;然而，较大的中风更接近于恶性脑梗死的疾病状态，这是不太常见，不太可治疗的人类中风6。同时，远端 MCA 闭塞需要更复杂的手术和颅骨切除术。在这个模型中，沿着大脑表面运行的MCA的远端部分被缝合带或烧灼直接闭塞。在该技术的某些变体中，颈动脉是单侧或短暂双侧闭塞的。远端 MCAo 的一个好处是，它会产生基于皮质的卒中，其大小比灯丝模型变化较小。然而，由于颈外动脉（ECA）的横断，远端模型产生较差的行为输出，这也是fMCAo6的一个问题。
另一种已知侵入性较小的卒中模型是光血栓形成（PT）模型。PT模型导致缺血的明确定义位置，并且与高生存率相关8。该技术依赖于腹腔内注射的光敏染料，只需用光或激光照射所需组织9，即可实现血管内光氧化。在激发时，形成氧自由基，引起内皮损伤，从而激活受照区域中的血小板聚集和凝块形成8，9。对行程大小和位置的严格控制，以及PT模型的高再现性，使其成为研究生物材料的理想选择。虽然使用激光和立体自聚焦坐标可以实现精度，但存在一些缺点，可能会使该模型在少数研究中不那么理想。与 fMCAo 模型不同，PT 行程模型不能重新熔化。因此，用于研究针对再灌注后损伤的神经保护剂或再灌注后机制的材料在这里没有用8。此外，由于PT模型的微血管损伤，可见相对较小的缺血性半影。相反，局部血管源性水肿发生，这是人类卒中的特征，使得该模型不适合专注于围梗死区域的临床前药物研究6，8。
中风中生物材料策略的总体目标是提供生物活性剂或作为脑组织生长的替代细胞外基质。我们将使用我们的方法探索的一种策略是将水凝胶直接输送到中风核心，而不是在梗死周围组织，其中许多当前的细胞疗法都提供10。这种方法的基本原理是，递送到核心中发现的坏死组织将避免破坏周围的健康或恢复组织。我们假设生物材料中包含的任何活性剂的扩散将能够从核心到达围陷圈，特别是因为我们发现水凝胶生物材料的输送减少了神经胶质疤痕的厚度11。这一点很重要，因为围陷区域已被证明在卒中后表现出神经可塑性，使其成为一个有吸引力的靶标。此外，将替代基质递送到卒中核心可以加载血管生成12 或神经源性13 因子，以指导新组织的形成，以及用于递送的细胞14。通过使用基质可以大大增强细胞递送，因为它可以保护细胞免受递送过程中存在的苛刻注射力和局部环境的影响，并鼓励分化和植入15。
这些可注射的治疗性生物材料在中风应用中具有临床相关性，因为目前还没有药物疗法可以刺激中风后的神经元恢复。参与恢复的底层神经回路位于与中风核心16相邻的脑组织中，而中风核心本身缺乏活的神经组织。我们预计，将生物材料递送到坏死性卒中核心具有通过前面提到的许多机制刺激相邻组织走向再生过程的潜力，包括生长因子13的库释放，刺激生长中的组织并促进恢复的脑组织发育11，12，免疫反应的改变17，以及干细胞衍生疗法的递送14， 18.然而，为了有效地研究这些应用的可能性，需要一种一致且可重复的方法来诱导中风和注射生物材料。PT 行程模型使用的技术可精确控制行程的方向和位置。连接到立体定位装置的激光引导方向，连接到立体定位装置的泵控制材料的注入速率，而无需其他形式的成像。因此，我们选择描述在小鼠运动皮层中执行PT中风以及将生物材料注射到中风核心的方法。在这里，我们使用微孔退火颗粒（MAP）水凝胶作为注射生物材料，不添加细胞或生长因子。此外，我们解释了如何使用完整的生物材料成功检索大脑，并讨论了用于分析中风结果的免疫化学测定，无论是否注射生物材料。
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Protocol
实验是根据杜克大学和加州大学洛杉矶分校的IUCAC进行的。本研究使用8至12周龄雄性C57Bl / 6J小鼠。这些动物被安置在受控温度（22±2°C）下，具有12小时的光暗循环期，并随意获得颗粒状食物和水。镇痛和镇静方案被描述为由IUCAC批准，但可能与其他实验室使用的方案不同。
如果动物经历过度不安，发声（表明无法控制的疼痛），自我创伤，行动能力下降或受损，皮肤感染的身体体征，食欲不振和/或体重减轻超过10%-15%，作为生存手术的结果，可能会过早安乐死。注射凝胶没有预期的不良影响，因为它是由大脑中天然存在的聚合物组成的。应每天监测动物，包括周末和节假日，并每隔一天重新称重一次。我们实验室和其他人的研究发现，在这些小的皮质或皮质下中风后，小鼠在梳理，体重减轻或戒断或慢性压力的体征/症状方面没有缺陷。如果动物表现出任何局部头部伤口感染的迹象，则应对它们实施安乐死。还应监测动物梳理不良、伤口状况和动物之间打架的证据（背部伤口）。如果有争斗或伤口裂开的证据，动物在接触兽医后应首先接受治疗。这通常涉及水中的抗生素和/或局部局部抗生素的应用。如果这些措施无法治愈，动物应该被安乐死。
1. 准备材料和仪器
- 在手术前准备光血栓染料。称出15毫克孟加拉玫瑰到2毫升微量离心管中。
注意：孟加拉玫瑰会造成严重的眼睛损伤/刺激。- 将孟加拉玫瑰溶解在1.5毫升无菌过滤的1x PBS中，使工作浓度达到10毫克/毫升。
- 涡旋管子，直到看不到团块，表明染料已完全溶解，然后覆盖在箔片中直至进一步使用。
注意：所需的染料量取决于小鼠的数量。将染料以10μL / g的浓度在腹膜内IP内注射，例如，20g小鼠为200μL。
- 打开加热垫，在麻醉（37°C）期间保持小鼠体温。
- 准备高压灭菌剪刀，镊子，棉花，兽医眼药膏，手术胶水或缝合材料，蓝色或黑色手术标志物，无菌酒精和β碘湿巾。准备带有无菌钻头的骨钻头。
- 将微球灭菌打开至160°C，以允许在小鼠手术之间对器械进行灭菌。留出一个50 mL锥形管无菌盐水或1x PBS溶液，供以后用于维持水合的操作区域。
- 将激光连接到立体定位设备。戴上激光安全护目镜，测量激光的功率（mW）。
注意：在手术过程中，只要打开激光，就使用激光安全护目镜。- 按照激光制造说明调整激光控制台上的电流，直到激光功率输出读数为10 mW，并将电流设置为主屏幕控制台上的预设。然后再次调整电流以建立另一个预设，其中激光输出功率读数为40 mW。现在关闭激光，直到进一步使用。
注：10 mW将在使用前用于定向激光器。
- 按照激光制造说明调整激光控制台上的电流，直到激光功率输出读数为10 mW，并将电流设置为主屏幕控制台上的预设。然后再次调整电流以建立另一个预设，其中激光输出功率读数为40 mW。现在关闭激光，直到进一步使用。
- 手术后为小鼠准备一个干净的笼子。然后，将小鼠放入异氟醚浓度为4%的诱导室中麻醉它，直到自发运动停止，其呼吸达到缓慢，稳定的速率。
- 一旦睡着，称量鼠标以确定注射多少玫瑰孟加拉染料。然后，将鼠标转移到立体束装置中，维持异氟醚浓度为1.5%。
注意：增加异氟醚浓度可以扩张血管并防止小鼠之间的足够闭塞或大小一致的中风。 - 将兽医眼药膏涂抹在双眼上。
注意：在整个过程中注意呼吸和体温，并偶尔捏住脚趾，以确保鼠标感觉不到任何东西。
2. 光血栓性卒中模型9
- 剃掉老鼠头上的皮毛，然后用酒精擦拭布和β-碘擦拭物无菌地准备该区域。重复三次。
注意：如有必要，最后使用额外的酒精擦拭巾来清除所有β碘，因为它会引起皮肤刺激，导致小鼠在手术后头骨瘙痒。 - 使用小手术剪刀，在耳朵到眼睛之间做一个横向切口，约1-2厘米。为此，用镊子向上拉皮肤以形成帐篷，向下切割一次，然后将剪刀插入开口并形成连续的中线切口。
- 分开皮肤，用镊子轻轻按压顶骨以定位胸骨。使用手术标记用点标记胸膜。
注意：骨碎片运动突出显示顶骨的额边缘。胸膜是额骨和顶骨碎片相遇的中心点（图1A）。 - 戴上激光安全护目镜，将激光移到鼠标的头骨上，将立体定位装置固定在90°角。选择10 mW预设并打开激光器。
- 调整激光的 x 轴和 y 轴，直到它直接超过边角。重置数字显示控制台上的 x 和 y，然后将激光器移动到边距左侧 1.8 mm 处。现在，将激光尽可能靠近颅骨，不要让它接触颅骨。
- 将激光移动到边角左侧 2.2 mm 处，以确保它可以在没有任何障碍物的情况下移动。关闭激光。
- 使用一次性29 G针头腹腔注射适量的Rose Bengal染料（IP）。立即启动定时器7分钟，让染料全身循环。选择预设的 40 mW，无需打开激光器。
注意：一旦熟悉该过程，可以在小鼠无菌制备之前注射染料，并在7分钟结束之前完成以节省时间。 - 当7分钟计时器关闭时，戴上激光安全护目镜，打开激光（40 mW），并设置10分钟计时器。
- 10分钟后，将激光移动到边角左侧2.2毫米处，不将其关闭，并设置另一个10分钟计时器。
- 第二个10分钟计时器关闭后，将激光器切换回10 mW，并将激光器移动到边角左侧2.0 mm处。用手术标记标记标记此位置。然后关闭激光。
- 提起激光并从90°角度解锁，以便将其移离鼠标。此时，如果手术区域干燥，请用棉涂抹无菌盐水或PBS。
- 在垂直于颅骨表面的2.0毫米标记处进行小爆发钻孔。
注意：小心慢慢钻孔，以避免钻孔太深并击中大脑。一旦钻头穿过头骨，阻力就会略有下降/变化，钻孔可能会导致出血。- 使用棉花吸收多余的血液。钻孔后，通常会从颅骨的切口动脉中看到一些血液 - 过多的血液意味着钻头会击中大脑。如果发生这种情况，请记录鼠标标识符，然后继续。
- 在鼠标旁边放一个小擦拭布。使用镊子，将皮肤拉近以准备粘合。
注意：缝合可以在这里完成。缝合通常只需要3次缝合。- 使用镊子，抓住皮肤的两侧，将它们拉在一起并向上拉。在涂抹到鼠标之前，在擦拭巾的尖端末端轻拍任何大滴的手术胶水。
- 小心翼翼地涂抹手术胶水，并用镊子将皮肤固定在一起10秒。继续，直到没有可见的开口。
注意：胶水很快出来 - 不要挤压瓶子。避免将皮肤粘在颅骨上或将胶水粘在眼睛里。
- 粘合或缝合后，将小鼠放入新笼子中以从麻醉中恢复。动物需要5-10分钟才能恢复，并且有助于将笼子的一半放在加热垫上。
3. 假中风手术
- 执行与上述第2节中描述的操作相同的所有程序，除了注射1x PBS或盐水而不是Rose Bengal染料。
4. 注射水凝胶或其他生物材料
- 在用户定义的时间注射生物材料。在该实验中，注射在中风后5至7天之间进行。注射2 - 6μL水凝胶（用户定义）。
- 打开加热垫，在麻醉（37°C）期间保持小鼠体温。
- 准备高压灭菌剪刀，镊子，棉花，兽医眼膏，手术胶水或缝合材料，以及无菌酒精和β碘湿巾。准备带有无菌钻头的骨钻头和带有金属30 G针头的25μL玻璃汉密尔顿注射器。
- 将磁珠灭菌打开至160°C，以允许对小鼠之间的器械进行灭菌。
- 将喷射泵连接到立体定位装置。将流速设置为 1 μL/min，将体积设置为 4 μL。
- 手术后为小鼠准备一个干净的笼子。
- 将小鼠放入异氟醚浓度为4%的诱导室中麻醉它，直到自发运动停止，其呼吸达到缓慢，稳定的速率。
- 一旦睡着，将小鼠转移到立体定位装置中，维持异氟醚浓度为1.5%。
- 将兽医眼药膏涂抹在双眼上。
- 剃掉任何可能已经重新长出小鼠头部的皮毛，并使用酒精擦拭布然后使用β-碘擦拭物无菌地准备该区域。重复三次。
注意：如有必要，最后使用额外的酒精湿巾来清除所有的β碘，因为它会引起皮肤刺激并导致小鼠在手术后头骨瘙痒。
- 使用小剪刀和/或镊子，重新打开大脑上方的皮肤。使用含无菌盐水或PBS的棉花清洁颅骨上的任何碎屑。一个白黄色的圆圈（笔程， 图1B）和钻头上的毛刺孔将可见。如果死组织不可见，则可能没有发生中风。如果毛刺孔未在冲程上方居中，请重新钻孔以使其居中。
- 将注射泵定向到鼠标上方，并锁定在90°。在回装材料之前，用无菌盐水或PBS溶液清洁注射器。
- 清洁后，拆卸玻璃注射器，使没有针头。使用25μL正置换移液器将注射器与10μL水凝胶（或其他生物材料，有或没有细胞）回加载注射器。
- 使用注射器柱塞，将凝胶一直推到注射器的前面。然后，重新组装注射器并继续推动，直到凝胶从针头中明显渗出。
- 将注射器放到泵上。可能需要调整泵的背面，以便注射器适合。为此，请将流速调整为30μL/min，根据需要移动方向选择 "撤液 "或" 注射"， 然后按 "开始"。当泵的背面位于正确的位置时，点击 停止 。
- 拧紧泵的背面，使注射器牢固。如果之前进行了调整，请确保将流速设置回1μL / min并设置为注射。
- 沿 x 和 y 方向移动泵，使其在孔上定向。沿 z 方向向下移动泵，直到注射器的针头接触到孔的顶部。
- 重置数字显示控制台上的 z。然后，将注射器沿z方向向下移动0.750 mm。如果注射器弯曲或有阻力，则颅骨愈合或未完全钻孔，需要重新钻孔。
- 按泵控制台上的 "开始" 键，以 1 μL/min 的速率注入 4 - 6 μL 水凝胶。
- 当泵停止进样时，设置一个5分钟的计时器，以使凝胶开始交联。
- 5分钟后，通过转动z nob慢慢拉起注射器。观察是否有任何材料意外拉出或从孔中泄漏。解锁泵，当针头离头骨足够远时，将其移离鼠标。
- 使用镊子，手术胶水或缝合线，关闭头部上方的皮肤。将鼠标放入干净的笼子中，观察其恢复情况。小鼠从麻醉中恢复大约需要5-10分钟。
5. 灌注和样本采集
- 使用异氟醚麻醉小鼠。
- 将动物固定在仰卧位，并用正中切口打开腹腔。（可选）夹住降腹主动脉以使用较少的固定剂和PBS。
- 切开隔膜，向上移动肋骨的两侧以打开胸腔。将灌注插管插入左心室，并在右心房切开一个开口。开始缓慢灌注 10-20 mL PBS 或直到液体半透明。
- 清除后，换用 4% PFA，再加 10 – 20 mL。松开双臂的销钉允许它们在PFA注入时收缩。一旦他们停止移动，再等30秒。
- 斩首动物并拉回皮肤以暴露头骨。使用钝而细的镊子，小心地取出头骨的碎片以暴露大脑。移除卒中部位上方的颅骨时需要特别小心。这里可以使用小型手术剪刀来帮助切除颅骨。最大的挑战是凝胶粘在头骨上，并在头骨被移除时从大脑中出来。
- 一旦大脑脱离，放入10-15毫升4%PFA过夜（不超过24小时）。
- 第二天将大脑从PFA移动到30%蔗糖。一旦大脑沉入底部（约2-3天），大脑就准备好进行冷冻切除。此时也可以将其保留用于存储。
6. 冷冻切除和染色
- 将大脑从蔗糖中取出，放在载玻片上。用剃须刀片切掉大脑后部的一小部分，形成一个平坦的部分，可以安装在卡盘上。
- 将一小块最佳切割温度化合物（OCT）放在卡盘上，然后将大脑平放一面朝下，放在OCT中的卡盘上。将此标本放在干冰上，直到冷冻或冷冻块上的低温恒温器中。
注意：可以添加OCT以完全包围大脑，以帮助防止材料在切片过程中与大脑分离。
- 将一小块最佳切割温度化合物（OCT）放在卡盘上，然后将大脑平放一面朝下，放在OCT中的卡盘上。将此标本放在干冰上，直到冷冻或冷冻块上的低温恒温器中。
- 在-20°C的低温恒温器上，在10个明胶包被的载玻片上以30μm厚的部分连续切割大脑。切片时要小心，确保不会丢失水凝胶。如果这部分很困难，请在凝胶上方的大脑顶部放置一些OCT（图3）。储存在-80°C直至进一步使用。
- 将载玻片从-80°C中取出，放在染色盘上以使其干燥。尚未冷冻但刚刚切片的载玻片也可以立即染色。
- 使用疏水笔，在幻灯片上的脑切片周围画一个圆圈。干燥后，用1x过滤的PBS重新水润脑切片，并在室温下置于摇摇杯上15分钟。每张载玻片需要约1 mL缓冲液，具有9-12个脑切片。
- 在室温下用1x过滤的PBS洗涤载玻片5分钟，重复三次。
- 在室温下用10%驴血清在0.01%PBS-Triton X中在肚皮舞者身上阻断载玻片30分钟至一小时。每张载玻片大约需要200μL。
- 将一抗与0.01%PBS-Triton X在4°C的摇摇杯上孵育10%驴血清中过夜。首先测试一抗以确定正确的浓度。这里使用了GFAP（1：400），Iba1（1：250），Glut1（1：500）（图4）。
- 第二天用1x过滤的PBS洗涤载玻片，在室温下洗涤5分钟，重复三次。
- 在室温下，将二抗与10%驴血清在0.01%PBS-Triton X和DAPI中孵育2小时。1：1，000 用于所有辅助数据库和 DAPI。
- 用1x过滤的PBS洗涤载玻片5分钟。
- 让切片在室温下在黑暗中干燥。这可能需要20分钟到4小时;将载玻片放入干燥器中可以加快该过程。
- 脱水载玻片在升压浓度的酒精（每个溶液1分钟）为50%，70%，95%，100%和100%。
- 在第一次二甲苯浴中脱脂1分钟，然后在第二次二甲苯浴中脱脂5分钟。
- 快速将载玻片逐个取出，并在大脑切片被二甲苯润湿时加入安装介质。在顶部快速添加玻璃盖玻片。使用分别用于成像的载玻片和显微镜所需的正确长度和厚度的盖玻片。
- 通过用移液器吸头从载玻片中心向外运动轻轻按压盖板下的任何气泡，摆脱盖玻片下的任何气泡。让DPX在室温下干燥4小时，在黑暗中过夜。
- 使用剃须刀片刮掉溅到载玻片上的任何干燥安装介质。用镜头清洁剂擦拭幻灯片。载玻片现在可以用荧光显微镜成像。
注意：最好将载玻片存放在黑暗中或4°C下，直到成像完成。
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Representative Results
这种方法的目的是展示如何在中风后将生物材料注射到大脑中。使用带有玫瑰孟加拉和520nm激光的光血栓形成模型来控制卒中病变的大小和位置的方向。卒中五天后，梗死可以在手术过程中（图1B）和TTC和成像IHC染色载玻片（图2）可视化。使用2倍透镜增加激光直径会导致行程病变的视觉增加，其范围超过2.5 mm，而仅使用激光的单个1 mm部分（图2）。由于微创手术，PT模型手术期间的死亡率很少发生，低于1%。手术后的死亡率也很低，在不到5%的小鼠中可见。
在中风后五天注射透明质酸基水凝胶微粒（HMP）（图3）。HMP在注射到中风病变后退火以形成微退火颗粒（MAP），具有多孔支架，允许细胞迁移到中风核心（图4）。注射后十天，用4%PFA灌注小鼠并提取其大脑，置于4%PFA中过夜，然后在30%蔗糖中浸泡两天，然后冷冻并切片进行IHC染色和分析。
我们实验室以前的工作证明了在中风26后五天将MAP水凝胶注射到中风病变中 。注射与皮层模量相匹配的透明质酸水凝胶导致梗死周围以及MAP凝胶内的反应性星形胶质细胞显着减少。此外，水凝胶中的小胶质细胞也表达了促修复M2标记。这表明MAP水凝胶可以在注射后短短两天内降低星形胶质细胞反应性，并通过促恢复星形胶质细胞和小胶质细胞促进更强的抗炎环境（图5）。
图 1：边角的示意图和行程的定位。（A） 顶叶在顶部相遇形成胸毛。激光放置位于胸围左侧2.0 mm的中心。（B）卒中后5 d可见脑卒中和毛刺孔的视觉构象。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：横跨梗死的日冕部分。（A） 中风后 5 天对大脑进行连续 IHC 切片，仅用激光（上图）和 2 倍透镜（下图）进行中风。切片厚度为30μm，每个部分与前一部分相距300μm。（B） 放大的 IHC 染色剂，500 μm 比例尺。细胞核（DAPI）以蓝色显示，星形胶质细胞（GFAP +）以红色显示，小胶质细胞（Iba1 +）以绿色显示，放大倍率为4倍。（C）用TTC染色的大脑切片，以在中风后5天可视化病变体积，用1厘米比例尺观察1毫米厚的部分。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：生物材料的注射和可视化。（A） 手术期间凝胶注射的视觉效果。（B） 当移除头骨时，凝胶可以被眼睛看到。（C）一旦冷冻并安装，凝胶在切片时在大脑中可见。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：仅与使用水凝胶的中风相比，中风的免疫组织化学染色。（A） 30μm厚的冷冻切除脑示意图。中间的几个部分被选择用于图像分析。（B） 仅卒中，卒中后 15 天进行免疫组织化学 （IHC） 染色。星形胶质细胞（GFAP +）细胞以红色显示，小胶质细胞（Iba1 +）为绿色，血管（GLUT1 +）为白色。中风+水凝胶条件，注射后IHC10d，中风后15天。星形胶质细胞（GFAP +）细胞显示为红色，小胶质细胞（Iba1 +）为绿色，水凝胶材料为白色。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：微孔退火颗粒水凝胶对中风后反应性星形胶质细胞和小胶质细胞的影响。（A） 实验时间线示意图，箭头表示中风日，+ 表示注射日，x 表示牺牲和分析时间点。（B） 分析设置示意图，显示切片的成像和分析位置。（C） IHC 图像显示星形胶质细胞反应性通过 pERK、 S100b、 GFAP。（D） 高度反应性星形胶质细胞的 pERK/GFAP 百分比的定量。（E） S100b/GFAP%的高反应性星形胶质细胞的定量。（F） 通过 CD11b、Arg1 和 iNOS 染色的 IHC 小胶质细胞反应性图像。（G） 定量 iNOS/Dapi 用于测定小胶质细胞促炎表型。（H） Arg1/Dapi的定量用于测定小胶质细胞促修复表型。所有比例尺 = 100 μm。统计分析是在GraphPad Prism中完成的。*指示数据使用Tukey事后测试和95%置信区间P<0.05进行分析。单个 p 值表示 T 检验。此图由参考文献26修改而来。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在这里，我们展示了一个易于重复的，微创的，永久性的中风模型，并描述了如何在中风后五天将生物材料注射到梗死中。使用光血栓染料Rose Bengal和连接到立体束装置的520nm准直激光器使我们能够以更高的精度将行程定位在小鼠的运动皮层。卒中五天后，在照射中心用眼睛可以看到梗死的位置，距胸侧2.0mm。然后使用注射泵将水凝胶准确地注射到行程核心中。该模型中手术期间和中风后的死亡率几乎不存在，只有少数小鼠在手术后因麻醉并发症而死亡。尽管将PT中风用于生物材料应用具有优势，但仍有一些生物学限制和技术困难需要解决。
就生物学局限性而言，PT不是一种中风模型，它为脑再灌注提供了选择，这一过程可以在人类卒中自发发生，也可以响应血管内血栓的检索/裂解。此外，与通过阻塞主要脑血管来模仿大多数人类中风病因的MCAo模型不同，PT会损害通过许多较小血管的血流。注射水凝胶生物材料的一个技术困难是它们在手术过程中倾向于粘附在注射器上或在提取过程中粘附在颅骨上。设计一种在注射过程中保持液体，然后原位凝胶的水凝胶可以解决第一个问题;然而，防止凝胶粘附在硬脑膜上通常是不可避免的，因为注射部位和中风核心位于大脑表面。这使得在保持生物材料完整的同时提取脑组织变得困难。因此，从大脑中取出颅骨碎片时必须特别小心，以确保硬脑膜不会随颅骨一起抬起并无意中连根拔起凝胶。冷冻切除大脑也需要技术技能，因为处理过程和刀片横切都可以很容易地将凝胶从周围组织中分离出来，从而限制了有关细胞浸润的数据收集。当材料未与组织完全结合时，分离会加剧。用OCT制备样品会产生一个增强壳，有助于最大限度地减少切割过程中的材料分离。
在注射生物材料之前，我们建议根据啮齿动物菌株和实验室设置优化所需的行程大小。通过调整三个主要参数可以产生较小或较大的梗死：激光输出强度，光束放大倍率和照射时间。其他也被证明影响中风大小的因素包括异氟醚19 的浓度和染料在照射前允许循环的时间。关于激光输出强度（功率/面积或mW/cm2），我们发现10 mW的激光功率足以产生水平直径略小于激光束的小梗死。由于激光束具有高斯辐照剖面，因此更高的激光功率产生略宽但更深的梗塞（数据未显示）。通过增加强度，最大辐照度的中心点可以穿透颅骨更深处，并导致激光的光斑尺寸穿透力略有增加。其他笔程模型通过在施加光或激光之前对其进行打磨来稀释头骨，以增加光穿透和随后凝血的再现性，同时保持较低的激光强度20;然而，这可能会导致颅骨出血，并且在手术和技能过程中需要相当多的时间才能掌握，而不会在此过程中意外损坏大脑。与强度相似，增加激光束直径也增加了梗死尺寸;然而，激光强度和光束直径不会相对于彼此线性缩放，而是遵循等式，功率密度=激光功率（w）/ πr2，其中是光束的半径。就照射时间而言，我们发现至少需要10分钟才能产生可重复的笔画。为了增加梗死的水平直径，同时保持垂直深度恒定，我们依次将激光施加到相邻位置10分钟。为了解决异氟醚浓度和玫瑰孟加拉循环时间的影响，我们发现IP注射后1.5%异氟醚浓度和7分钟循环导致中风的一致形成。这五个参数针对我们的特定用途进行了优化。我们需要足够大的中风来引起行为改变，但又不会干扰脑室下区域，我们的目的是研究我们的材料对神经祖细胞的影响。除了笔程大小外，我们还需要确定要注射的最佳凝胶体积。至少，我们需要足够的凝胶来完全填充中风腔，因为我们发现凝胶和周围组织之间的间隙导致与对照组相似的结果，而凝胶和组织之间的接触导致反应性星形胶质细胞减少并增加细胞浸润。我们达到了4-6μL凝胶的下限，注射后未产生不良反应（未发表的数据）。
关于评估卒中结局，除了 IHC 染色外，还有其他选择，例如磁共振成像、行为测试、组织学分析和 TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）染色。强烈建议使用TTC进行笔画的初步优化，因为它易于使用且效果立竿见影。我们实验室以前的行为测试已经研究了圆柱体测试/自发前肢任务，网格行走测试和意大利面测试12，21。应该注意的是，在实施PT卒中方法后，旋转测试没有显示行为结局显着降低（数据未显示）。因此，行为测试应该评估需要大量皮质输入的非常复杂的任务。
在这里，我们展示了在中风后注射水凝胶而不输送生长因子或细胞的技术。然而，水凝胶也被用于细胞移植，以及药物和生长因子递送，并且可能被证明是研究中风后生物学和研究新治疗方法的宝贵资源。在中风的情况下，我们的实验室注射了无孔透明质酸水凝胶，封装诱导多能干细胞衍生的神经祖细胞14，18，浓度范围为25，000个细胞/ μL至50，000个细胞/ μL凝胶。使用水凝胶导致细胞活力和分化增加。其他实验室也报告了细胞分化和增加的组织再生，以响应于中风后用于移植干细胞的水凝胶22-24。此外，我们在中风后注射了含有生长因子的水凝胶，这些生长因子导致中风后的组织再生和行为改善13，14。在材料设计方面，注射性是一个有价值的特征，用于最大限度地减少侵入性;因此，水凝胶应在静态条件下配制成溶胶凝胶（液对固体），剪切变稀（G'>G";G">G'在流动过程中），或由直径小于针头内径12，25，26的构建块组成的颗粒凝胶。然后应进行优化以测试药物或生长因子的扩散，在一系列细胞浓度，凝胶条件和注射参数（例如速度，针规，注射深度和注射日期相对于诱导卒中时）下的细胞活力。例如，材料注射的日范围从中风后一天到中风后长达三周27，28。在这里，我们报告了五天，但之前在移植细胞时在中风后七天注射。这些天是根据炎症反应的时间线以及中风后一周看到的血管生成和神经发生的峰值活性来选择的5，29，30，31。还应在每个注射时间点进行体积表征，因为由于萎缩，每搏量会随着时间的推移而减少。鉴于这些参数在注射前进行了优化，这里的方法足以指导用户在添加细胞和/或生长因子和药物的情况下注射生物材料。
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Disclosures
作者宣称TS是Tempo Therapeutics的创始人，该公司旨在将MAP水凝胶商业化。
Acknowledgments
我们要感谢美国国立卫生研究院和美国国家神经疾病和中风研究所的资助（R01NS079691）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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