Summary
脳卒中は、最小限の治療オプションと失われた脳組織を再生するための現在の臨床療法のない世界的な問題です。ここでは、げっ歯類の運動皮質における正確な光血栓性脳卒中を作成し、その後のヒドロゲル生体材料の注入を行い、脳卒中後の組織再生に及ぼす影響を研究する方法を説明する。
Abstract
脳卒中は障害の主な原因であり、米国における死亡原因の第5位である。脳卒中の約87%は虚血性脳卒中であり、脳に血液を供給する血管の突然の閉塞と定義されています。閉塞の数分以内に、細胞は死に始め、回復不可能な組織損傷をもたらす。現在の治療は、再灌流を可能にし、より深刻な脳損傷を防ぐために血栓除去またはリシスに焦点を当てています。一過性の脳可塑性は、時間の経過とともに損傷した組織の一部を救う可能性がありますが、患者のかなりの部分は決して解決しない神経学的欠陥を残しています。脳卒中によって引き起こされる神経学的欠陥を治療するための治療オプションの欠如があり、この増加する患者集団を治療するための新しい戦略を開発する必要性を強調している。注射可能な生体材料は現在、脳の可塑性を高め、活性薬剤または幹細胞の送達を通じて内因性修復を改善するように設計されている。これらのアプローチをテストする1つの方法は、げっ歯類のストロークモデルを利用し、生体材料をストロークコアに注入し、修復を評価することです。脳卒中後の正確な治療にはストロークコアの正確な位置を知ることが不可欠であり、したがって、射出前のイメージングの必要性を避けるために、予測可能なストローク位置をもたらすストロークモデルが好ましい。次のプロトコルは、フォトトロンボミックストロークを誘導する方法、制御された正確な方法でヒドロゲルを注入する方法、および生体材料をそのまま維持しながら脳を抽出し、凍結する方法をカバーします。また、これらと同じヒドロゲル材料を幹細胞の共送にどう使うことができるかを強調します。このプロトコルは、ストロークコアに他の注射可能な生体材料を使用するように一般化することができる。
Introduction
脳卒中は障害の主な原因であり、米国における死因の第5位である。全脳卒中の約87%が虚血性であり、残りの13%の大部分は出血性2である。虚血性脳卒中は、周囲の組織への動脈の血流の閉塞として定義される。この閉塞は、酸素欠乏とその後の壊死をもたらし、しばしば生き残った患者の永久的な障害につながる。脳卒中3の死亡率は減少しているが、その罹患率は2030年4年までに340万人に増加すると予想されている。この障害を持つ生存者の増加とそれに伴う経済的負担は、神経修復のメカニズムに焦点を当てた脳卒中研究の推進につながっています。脳卒中の後には、壊死領域の拡大を妨げる瘢痕の形成につながる炎症期がある。壊死性コアを取り巻く領域は「梗塞周囲」と呼ばれ、血管新生の増加、神経新生、および軸索発芽を含むこの領域の可塑性が、動物モデルおよびヒト5での観察された回復に直接関連しているという強い証拠がある。脳卒中後の複雑な相互作用を適切に再現できるインビトロモデルがないため、脳卒中の研究には動物モデルが不可欠です。
虚血性脳卒中を作り出すために使用することができるいくつかのin vivoモデルがある。マウスで使用される最も一般的なモデルの1つは、中大脳動脈閉塞(MCAo)が遠位または近位(動脈内フィラメントを介して)閉塞を介してである。近位モデルはフィラメントMCAo(fMCAo)としても知られており、通常、大脳半球の5%から50%を包含する大きな虚血性脳卒中をもたらし、因子数6に依存する。これらのモデルでは、縫合またはフィラメントが中大脳動脈(MCA)の基部に頸動脈の内部から進み、一定期間所定の位置に保たれる。この閉塞の方法は、一時的または永久的に作ることができるが、線条体を中心とする梗塞を生じ、皮質6を覆うことを伴う場合も、関与しないかもしれない。得られたストロークサイズは非常に可変であり、レーザードップラーなどのイメージング技術は、各マウスにおける手順の有効性を確認するために必要とされる。30分以上続く動脈内または発光フィラメント閉塞は、サイズ範囲の大きな端部でストロークを生成します。一部の研究者は、実質的な実験的焦点と実験室検証7を必要とするフィラメント閉塞時間の短縮に焦点を当てています。マウスのフィラメント MCAo モデルは、同様の段階の細胞死、虚血性進行、およびヒト脳卒中症例に見られる梗塞部の形成に従います。しかし、大きな脳卒中は悪性脳梗塞の疾患状態によく似ており、これはあまり一般的ではなく、治療が少ない人間の脳卒中6である。一方、遠位MCA閉塞は、より関与する手術とクラニエクトミーを必要とする。このモデルでは、脳の表面に沿って走るMCAの遠位部分は、縫合結または焼灼で直接閉塞される。この技術のいくつかのバリエーションでは、頸動脈は一方的または一時的に二国間閉塞である。遠位MCAoの利点は、フィラメントモデルよりもサイズが小さい皮質ベースのストロークを生成することです。しかし、遠位モデルは、外的頸動脈(ECA)の斜離による悪い行動出力を生じるが、これはfMCAo6にも懸念される。
侵襲性が低いという別のストロークモデルは、フォトトロンボティック(PT)モデルです。PTモデルは虚血の明確な位置をもたらし、高い生存率8と関連している。この技術は、光またはレーザー9で所望の組織を照射するだけで血管内光酸化を可能にする腹腔内に注入された感光性色素に依存する。興奮すると、内皮損傷を引き起こす酸素ラジカルが形成され、照射領域8,9における血小板凝集および血栓形成を活性化する。ストロークの大きさや位置を厳しく制御し、PTモデルの再現性が高いため、生体材料の研究に最適です。レーザーと立体的な座標を使用して精度を実現できますが、このモデルを少数の研究にはあまり理想的にしないかもしれないいくつかの欠点があります。fMCAo モデルとは異なり、PT ストローク モデルは再設定できません。したがって、再灌流後の損傷に特異的な神経保護剤や再灌流後の機構を調査するための材料は、ここでは有用ではないであろう8.さらに、PTモデルの微小血管侮辱のために、比較的小さい虚血性陰茎が見られる。その代わりに、局所的な血管形成性浮腫が生じ、これはヒトの脳卒中に対して特徴を有せず、梗塞周辺領域6,8に焦点を当てた前臨床試験ではこのモデルは望ましくない。
脳卒中の生体材料戦略の全体的な目標は、生理活性剤を提供するか、脳組織の成長のための代理細胞外マトリックスとして機能することです。我々の方法を用いて探求する1つの戦略は、多くの現在の細胞療法が10に送達される梗塞周辺組織とは対照的に、ヒドロゲルをストロークコアに直接送達することである。このアプローチの根拠は、コアに見られる壊死組織への送達が周囲の健康または回復組織を破壊することを避けることである。我々は、生体材料内に含まれる任意の活性剤の拡散がコアから梗塞の下に到達することができると仮定し、特にヒドロゲル生体材料の送達は、グリア瘢痕11の厚さを減少させることを発見した。これは、梗塞後の神経可塑性を示すことが示されているので、これは重要であり、魅力的な標的となっています。さらに、ストロークコアへの代理マトリックスの送達には、血管新生12 または神経原性13 因子を装填して、新しい組織の形成を誘導し、また送達用細胞14を装うことができる。細胞送達は、送達中に存在する過酷な注入力や局所環境から細胞を保護し、また分化及び生着を促進するのでマトリックスを用いて大きく増強される。
これらの注射可能な治療用バイオマテリアルは、脳卒中後の神経回復を刺激する医療療法がないため、脳卒中の適用に臨床的関連性を有する。回復に関与する基礎となる神経回路は、脳卒中コア16に隣接する脳組織にあり、脳卒中コア自体には実行可能な神経組織が欠けている。壊死性脳卒中コアに生体材料を送達することは、成長因子13のデポ放出、成長中の組織の刺激、脳組織の回復の促進を含む多くのメカニズムを通じて、回生プロセスに向けて隣接組織を刺激する可能性があると予想する。 18.しかし、これらの応用の可能性を効果的に研究するためには、脳卒中を誘導し、生体材料を注入するための一貫した、再現性のある方法が必要である。PT ストローク モデルでは、ストロークの向きと位置を正確に制御できる手法を使用します。ステレオタキシックデバイスに取り付けられたレーザーは、向きを導き、立体装置に取り付けられたポンプは、画像化の追加の形態を必要とせずに材料の射出速度を制御する。そこで、マウスの運動皮質でPTストロークを行う方法や、生体材料をストロークコアに注入する方法を説明することを選択しました。ここでは、細胞や成長因子を加えずに注入するための生体材料として、微孔性アニール粒子(MAP)ヒドロゲルを使用します。また、生体材料をそのまま脳に取り出す方法を説明し、生体材料の注入の有無にかかわらず脳卒中の結果を分析するための免疫化学アッセイについて議論する。
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Protocol
実験は、デューク大学とカリフォルニア大学ロサンゼルス校のIUCACに従って行われました。8〜12週齢の雄C57Bl/6Jマウスをこの研究で使用した。動物は制御された温度(22±2°C)下に収容され、12時間の明暗サイクル期間とペレット化された食品および水のアドリビタムへのアクセスを有する。鎮痛および沈下プロトコルは、IUCACによって承認されたとして記述されているが、他の研究所で使用されるプロトコルとは異なる場合があります。
動物は、生存手術の結果として過度の落ち着きのなさ、発声(制御不能な痛みを示す)、自己外傷、運動性の低下または障害、真皮感染の物理的徴候、食欲不振および/または体重減少を経験した場合、早期に安楽死させる可能性がある。それは脳内の天然のポリマーで構成されているとして、ゲルの注入による予想される副作用はありません。動物は、週末や休日を含む毎日監視され、一日おきに体重を量り直す必要があります。私たちの研究室や他の人からの研究は、これらの小さな皮質または皮質下脳卒中の後にマウスの身だしなみ、体重の喪失、または離脱または慢性ストレスの徴候/症状に赤字を発見していない。動物が局所的な頭部創傷感染の徴候を示すならば、彼らは安楽死させるべきです。動物はまた、貧しいグルーミング、創傷の状態、および動物(背中の傷)間の戦いの証拠を監視する必要があります。戦いや傷の非組織化の証拠がある場合、動物は獣医師に連絡した後、まず治療する必要があります。これはしばしば水および/または局所的な局所抗生物質適用の抗生物質を含む。これらの措置が治癒を生み出さない場合、動物は安楽死させるべきです。
1. 材料・器具の準備
- 手術前にフォトトロンボティック色素を準備してください。2 mL マイクロ遠心分離チューブにローズベンガルの 15 mg を計量します。.
注意:ローズベンガルは深刻な目の損傷/刺激を引き起こす可能性があります。- ローズベンガルを1.5mLの無菌濾過1x PBSに溶解し、10mg/mLの作業濃度を作ります。
- 塊が見えないまでチューブをボルテックスし、染料が完全に溶解したことを示し、さらに使用するまでホイルで覆う。
注:必要な染料の量は、マウスの数によって異なります。色素は、20gマウスの場合、例えば200μLの濃度で腹腔内IPを注入される。
- 麻酔中にマウスの体温を維持するために加熱パッドをオンにします(37°C)。
- オートクレーブハサミ、鉗子、綿、獣医の目の軟膏、外科用接着剤、または縫合材料、青または黒の外科用マーカー、滅菌アルコールおよびベータヨウ素ワイプを準備する。滅菌ドリルビットヘッドで骨ドリルを準備します。
- ビード滅菌を160°Cに切り替え、マウス手術間の器具の滅菌を可能にします。滅菌生理食塩水または1x PBS溶液の50 mL円錐チューブを脇に置き、後で水和操作領域を維持する際に使用します。
- ステレオタックスデバイスにレーザーを取り付けます。レーザー安全ゴーグルを装着し、レーザー(mW)のパワーを測定します。
注意:手順でレーザーがオンになっているときはいつでもレーザー安全ゴーグルを使用してください。- レーザー電源出力が10 mWを読み取るまでレーザーコンソールの電流を調整し、ホーム画面コンソールで事前設定として電流を設定します。次に、電流を再調整して、レーザー出力電力が40 mWを読み取る別の事前設定を確立します。次に、レーザーの電源を切り、さらに使用するまではオフにします。
注:10 mWは、使用前にレーザーの向きを指定するために使用されます。
- レーザー電源出力が10 mWを読み取るまでレーザーコンソールの電流を調整し、ホーム画面コンソールで事前設定として電流を設定します。次に、電流を再調整して、レーザー出力電力が40 mWを読み取る別の事前設定を確立します。次に、レーザーの電源を切り、さらに使用するまではオフにします。
- 手術後にマウス用の清潔なケージを用意します。次に、イオブルラン濃度4%の誘導室にマウスを入れて、自発的な動きが止まり、呼吸が遅く安定した速度になるまで麻酔します。
- 眠ったら、マウスの重量を量ってローズベンガル染料の量を決定します。次いで、マウスを1.5%の維持イオブルラン濃度でステレオタックスデバイスに移し、固定する。
注:イソフルラン濃度を増加させることで、血管を拡張し、マウス間の十分な閉塞または一貫したサイズのストロークを防ぐことができます。 - 両眼に獣医の眼軟膏を適用する。
注:手順全体の呼吸と温度を監視し、マウスが何も感じることができないことを確認するために時々つまみます。
2. フォトトロンボティックストロークモデル9
- マウスの頭から毛皮を剃り、アルコール拭きに続いてベータヨウ素ワイプを使用して無菌で領域を準備します。3 回繰り返します。
注:必要に応じて、手術後にマウスを頭蓋骨のかゆみに導く皮膚刺激を引き起こすので、すべてのベータヨウ素をきれいにするために最後に余分なアルコール拭き取りを使用してください。 - 小さい操作はさみを使用して、目に耳の間の横切り、約1〜2センチメートルを作ります。これを行うには、鉗子で皮膚を上方に引っ張ってテントを作り、一度下向きに切断し、ハサミを開口部に挿入し、連続した正中線切開を作成します。
- 皮膚を分離し、頭頂骨を鉗子で軽く押してブレグマを見つけます。外科用マーカーを使用して、ドットでブレグマをマークします。
注: 骨の断片の動きは、頭頂骨の正面境界を強調します。ブレグマは、前頭骨と頭頂部の骨片が交わす中心点である(図1A)。 - レーザー安全ゴーグルを着用し、マウスの頭蓋骨の上にレーザーを移動し、ステレオタックスデバイスを90°の角度で固定します。10 mWのプレセットを選択し、レーザーをオンにします。
- レーザーのx軸とy軸を、ブレグマの真上に向かうまで調整します。デジタルディスプレイコンソールのxとyをリセットし、ブレグマの左にレーザー1.8mmを移動します。頭蓋骨に触れることなく、できるだけ頭蓋骨の近くにレーザーを持って来てください。
- レーザーをブレグマの左2.2mmに移動して、障害物なしで動かないようにします。レーザーをオフにします。
- 使い捨ての29G針を使用して、腹腔内(IP)に適量のローズベンガル染料(IP)を注入する。すぐに7分間タイマーを開始し、染料が全身に循環できるようにします。レーザーをオンにせずに40mWのプリセットを選択します。
注意:手順に慣れたら、色素はマウスの無菌調製前に注入することができ、時間を節約するために7分が終わる前に終了します。 - 7分タイマが消えたらレーザー(40mW)をオンにし、レーザー安全ゴーグルを着用し、10分タイマーを設定します。
- 10分後、レーザーをオフにせずにブレグマの左2.2mmに移動し、さらに10分のタイマーを設定します。
- 2番目の10分タイマーが消えたら、レーザーを10mWに戻し、レーザーをブレグマの左2.0mmに移動します。この場所に外科用マーカーを付けます。その後、レーザーをオフにします。
- レーザーを持ち上げて90°の角度からロックを解除して、マウスから離すことができます。この時点で、手術領域が乾燥している場合は、綿で滅菌生理食いまたはPBSを適用する。
- 頭蓋骨の表面に垂直な2.0 mmのマークで小さなバーストでドリル。
注:あまりにも深く掘削し、脳を打つことを避けるためにゆっくりとドリルするように注意してください。ドリルが頭蓋骨を通過すると、抵抗がわずかに低下/変化し、掘削が出血を引き起こす可能性があります。- 余分な血液を吸収するために綿を使用してください。それは、掘削後に頭蓋骨の細かい動脈からいくつかの血液を見ることは典型的です - 過剰な血液は、ドリルビットが脳に当たることを意味します。この場合は、マウス ID を記録して次に進みます。
- マウスの横に小さなワイプを置きます。鉗子を使用して、接着の準備のために皮膚を近くに引っ張ります。
注: 縫合は、ここで行うことができます。縫合は通常3縫合糸しか必要としないです。- 鉗子を使用して、皮膚の両側をつかみ、それらを一緒に上に引っ張ります。マウスに適用する前に、ワイプの先端の端に外科用接着剤の大きな滴を取り除きます。
- 外科用接着剤を控えめに塗布し、10 sの鉗子と一緒に皮膚を保持します。目に見える開口部がなくなるまで続けます。
注:接着剤はすぐに出てくる - ボトルを絞らないでください。頭蓋骨に皮膚を接着したり、目に接着剤を取得しないでください。
- 接着、または縫合した後、新しいケージにマウスを置き、麻酔から回復します。動物が回復するのに5-10分かかり、暖房パッドのケージの半分を休ませるのに役立ちます。
3. シャムストローク操作
- ローズベンガル染料の代わりに1x PBSまたは生理食物を注入する以外は、セクション2で前述の操作と同じすべての手順を実行します。
4. ヒドロゲルまたは他の生体材料の注入
- ユーザー定義の時間に生体材料の注入を行います。この実験では、注射を5日から7日間の脳卒中後に行った。2 -6 μLのヒドロゲルを注入する(ユーザー定義)。
- 麻酔中にマウスの体温を維持するために加熱パッドをオンにします(37°C)。
- オートクレーブハサミ、鉗子、綿、獣医の目の軟膏、外科用接着剤または縫合材料、滅菌アルコールおよびベータヨウ素ワイプを準備する。無菌ドリルビットヘッドと金属30G針の25 μLガラスハミルトン注射器で骨ドリルを準備します。
- ビード滅菌を160°Cに切り替え、マウス間の器具の滅菌を可能にします。
- インジェクションポンプを立体装置に取り付けます。流量を1μL/minに設定し、体積を4μLに設定します。
- 手術後にマウス用の清潔なケージを用意します。
- イオブルラン濃度4%の誘導室にマウスを入れ、自発的な動きが止まり、呼吸が遅く安定した速度になるまで麻酔します。
- 眠ったら、マウスを1.5%のメンテナンスイオブルラン濃度でステレオタックスデバイスに移して固定します。
- 両目に獣医の目の軟膏を適用します。
- マウスの頭を再成長させた可能性のある毛皮を剃り、アルコール拭きとベータヨウ素ワイプを使用して無菌的に領域を準備します。3 回繰り返します。
注:必要に応じて、皮膚刺激を引き起こし、手術後にマウスを頭蓋骨のかゆみに導くため、最後に余分なアルコール拭き取りを使用して、すべてのベータヨウ素をきれいにしてください。
- 小さいはさみや鉗子を使用して、脳の上の皮膚を再び開きます。綿を無菌生理またはPBSで使用して、頭蓋骨の破片を除去します。白黄色の円(ストローク、 図1B)とドリルのバリ穴が見えます。死んだ組織が見えない場合、脳卒中が起こらなかった可能性が高い。バリ穴がストロークの中心になっていない場合は、ドリルを再びドリルして中央に配置します。
- マウスの上に注入ポンプを向け、90°でロックします。素材をバックローディングする前に、滅菌生理食水またはPBS溶液で注射器を洗浄してください。
- クリーニングが完了したら、針がないようにガラスの注射器を分解します。10 μLのヒドロゲル(または細胞の有無にかかわらず、他の生体材料)を用いて25μL正の変位ピペットを使用してシリンジをバックロードします。
- シリンジプランジャーを使用して、ゲルをシリンジの前面まで押し込む。その後、注射器を再組み立てし、ゲルが針から目に見えて滲み出るまで押し続けます。
- スポイトをポンプの上に置きます。ポンプの背部は、シリンジが収まるように調整する必要があります。流量を 30 μL/min に調整し、移動する方向に応じて [退出] または[ 注入 ]を選択し、[ 開始]を押します。ポンプの背面が正しい位置にあるときに 停止 を押します。
- スポイトがしっかりできるようにポンプの背面をねじ込みます。以前に調整を行った場合は、流量が1 μL/minに戻り、注入するように設定されていることを確認してください。
- ポンプを x 方向と y 方向に移動して、穴の上に向けます。スポイトの針が穴の上部に触れるまで、ポンプをz方向に下に移動します。
- デジタルディスプレイコンソールのzをリセットします。次に、0.750 mm の z 方向にシリンジを下に移動します。注射器が曲がったり抵抗がある場合、頭蓋骨は治癒したか、完全に掘削されておらず、再掘削する必要があります。
- ポンプコンソールで Start を押して、1 μL/minの速度で4~6μLのヒドロゲルを注入します。
- ポンプが注入を停止したときに5分のタイマーを設定して、ゲルが架橋を開始できるようにします。
- 5分後、zノブを回してゆっくりと注射器を引き上げる。材料が誤って引っ張られたり、穴から漏れたりしているかどうかを確認します。針が頭蓋骨から十分に離れているときにポンプのロックを解除し、マウスから離れて移動します。
- 鉗子、外科用接着剤、縫合糸を使用して、頭の上の皮膚を閉じます。マウスを清潔なケージに入れ、回復を観察します。マウスが麻酔から回復するには約5〜10分かかります。
5. 灌流とサンプルコレクション
- イオブルランを使用してマウスを麻酔します。
- 動物を腹腔の位置に固定し、中央値カットで腹腔を開きます。必要に応じて、下腹部大動脈をクランプして、固定性とPBSを少なくします。
- ダイヤフラムを切り開き、胸部の空洞を開くために、リブケージの側面を上に移動します。左心室にカニューレを注入し、右心房の開口部を切ります。PBSの10〜20 mLでゆっくりと浸透するか、液体が半透明になるまで浸透し始めます。
- クリアしたら、別の10〜20 mLの4%PFAに切り替えます。腕の支えを外すので、PFAが注入する際に収縮することができます。彼らが動くのを止めたら、別の30 sを待ちます。
- 動物の首を切り落とし、皮膚を引き戻して頭蓋骨を露出させます。鈍い、薄い鉗子を使用して、慎重に脳を露出させるために頭蓋骨の部分を削除します。脳卒中部位の上の頭蓋骨を取り除くときは、特別な注意が必要です。小さな外科用ハサミは、頭蓋骨を切り取るのを助けるためにここで使用することができます。最大の課題は、ゲルが頭蓋骨にくっついて、頭蓋骨が取り除かれるにつれて脳から出てくることである。
- 脳が切り離されると、一晩で4%PFAの10〜15mLに置きます(24時間以下)。
- 次の日にPFAから30%スクロースに脳を移動します。脳は、それが底に沈むと、凍結切除の準備ができています (約 2 - 3 日).この時点でストレージ用に残すこともできます。
6. クライオセクションと染色
- スクロースから脳を取り出し、ガラスのスライドの上に置きます。脳の後ろの小さな部分をカミソリの刃で切り取り、チャックに取り付ける平らな部分を作成します。
- 最適な切断温度化合物(OCT)の人形をチャックの上に置き、脳を平らにしてOCTのチャックの上に置き、凍結するまでドライアイスの上に置くか、凍結ブロックのクライオスタットに置きます。
注:OCTは、断面化中に材料が脳から分離するのを防ぐために脳を完全に包含するために追加することができます。
- 最適な切断温度化合物(OCT)の人形をチャックの上に置き、脳を平らにしてOCTのチャックの上に置き、凍結するまでドライアイスの上に置くか、凍結ブロックのクライオスタットに置きます。
- 10ゼラチンコーティングスライド全体に30 μmの厚いセクションで-20°Cのクライオスタットで脳を連続してカットします。ヒドロゲルを失わないように切除する際は注意してください。この部分が難しい場合は、脳の上部にいくらかOCTを置き、ゲルを上に置きます(図3)。さらに使用するまで-80°Cで保管してください。
- 80°Cからスライドを取り出し、染色トレイに置いて乾燥させます。固定されていないが、単に切り離されたスライドもすぐに染色することができます。
- 疎水性ペンを使用して、スライド上の脳のスライスの周りに円を描きます。乾いたら、1x濾過したPBSで脳スライスを水分補給し、室温でシェーカーの上に15分間置きます。これは、9 – 12脳のセクションでスライドあたりのバッファーの約1 mLを取ります.
- 1x濾過したPBSで室温で5分間スライドを洗い、3回繰り返します。
- ベリーダンサーの室温で0.01%PBS-トリトンXで10%ロバ血清で30分から1時間のスライドをブロックします。これはスライドあたり約200 μLかかります。
- シェーカーで一晩4°Cで0.01%PBS-トリトンXで10%ロバ血清中の一次抗体をインキュベートします。一次抗体をまずテストして、正しい濃度を決定します。ここでGFAP(1:400)、Iba1(1:250)、Glut1(1:500)(図4)が使用された。
- 翌日1倍ろ過したPBSでスライドを室温で5分間洗浄し、3回繰り返します。
- 室温でラボシェーカーで0.01%PBS-トリトンXおよびDAPIで10%ロバ血清中の2次抗体とインキュベート。1:1,000 はすべてのセカンダリと DAPI に使用されました。
- スライドを1xフィルターでPBSで5分間洗います。
- 暗い状態で、セクションを室温で乾燥させます。これは4時間に20分かかることがあります。デシケータにスライドを配置すると、プロセスをスピードアップできます。
- 50%、70%、95%、100%、100%のアルコール(溶液あたり1分)の上昇濃度でスライドを脱水します。
- キシレンの第一浴で脱脂1分間、次にキシレンの第二浴を5分間脱脂する。
- すぐにスライドを1つずつ取り出し、脳のセクションがキシレンで濡れている間、取り付け媒体を追加します。上に素早くガラスカバースリップを追加します。イメージングに使用するスライドと顕微鏡に必要な正しい長さと厚さのカバースリップを使用してください。
- スライドの中央から外向きの動きでピペットチップを軽く押して、カバースリップの下の気泡を取り除きます。DPXを室温で暗闇の中で一晩4時間乾燥させます。
- かみそりの刃を使用して、スライドにこぼれた乾燥した取り付け媒体を削り取ります。レンズクリーナーでスライドを拭き取ります。スライドは蛍光顕微鏡で画像化できるようになりました。
メモ:画像が完成するまで、暗闇の中または4°Cでスライドを保存するのが最善です。
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Representative Results
この方法の目的は、脳卒中後に生体物質を脳に注入する方法を実証することであった。ローズベンガルと520 nmレーザーを有するフォトトロンボティックモデルは、サイズと位置の両方で脳卒中病変の制御された向きに使用されました。脳卒中の5日後に梗塞を手術中に可視化することができた(図1B)、TTCおよび画像IHC染色スライド(図2)。2倍レンズでレーザー径が増加すると、2.5mm以上のストローク病変が、レーザーのみで1mmのセクションに対して視覚的に増加する(図2)。PTモデルによる手術中の死亡率は、低侵襲処置のために1%未満でめったに起こらなかった。手術後の死亡も低く、マウスの5%未満で見られた。
ヒアルロン酸系ヒドロゲル微粒子(HMP)を、脳卒中の5日後に注入した(図3)。このHMPは、脳卒中病変に注入した後にアニールし、脳卒中コアへの細胞移動を可能にする多孔性足場を有する微小焼結粒子(MAP)を形成する(図4)。注射マウスを4%PFAで浸透させ、その脳を抽出し、一晩で4%PFAに入れ、30%のスクロースで凍結し、IHC染色および分析のために切除した。
私たちの研究室での以前の研究は、ストローク26の5日後にMAPヒドロゲルを脳卒中病変に注入する実証を行いました。皮質の弾性率に一致するヒアルロン酸ヒドロゲルの注入は、MAPゲル内だけでなく、梗塞中の反応性アストロサイトの有意な減少につながった。さらに、ヒドロゲル内にもあったミクログリアは、プロリペアM2マーカーを発現した。これは、MAPヒドロゲルが注射後わずか2日間でアストロサイト反応性を低下させ、回復促進アストロサイトおよびミクログリアでより抗炎症環境を促進できることを示唆している(図5)。
図1:ブレグマの概略表現とストロークの局在化(A)頭頂葉が上部で交わし、ブレグマを形成する。レーザー配置はブレグマの左2.0mmを中心とした。(B)脳卒中とバリ穴の視覚的立体構造は、脳卒中の5日後に見られた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:梗塞にまたがるコロナセクション。(A)脳のシリアルIHCセクションは、脳卒中の5日後、レーザーのみ(上)と2xレンズ(下)でストローク。スライスは、前のセクションから300μm離れた各セクションで30μmの厚さでした。(B)拡大IHC染色、500 μmスケールバー。核(DAPI)は青、アストロサイト(GFAP+)は赤、ミクログリア(Iba1+)は緑色、4倍の倍率で示されています。(C)脳卒中の5日後に病変容容を可視化するためにTTCで染色された脳のセクション、1 cmのスケールバーを有する1mm厚いセクション。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生体材料の注入と可視化(A) 手術中のゲル注射のビジュアル(B) 頭蓋骨を取り除くときに、ゲルを目で可視化できる。(C)凍結して装着すると、断面化中に脳内にゲルが見える。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ヒドロゲルを用いたストロークと比較した場合のみ、脳卒中の免疫検査染色。(A) 厚さ30μmの凍結切除脳の模式図。真ん中のいくつかのセクションが画像解析のために選ばれました。(B)脳卒中のみ、免疫体化学(IHC)は脳卒中の15日後に染色する。アストロサイト(GFAP+)細胞は赤、ミクログリア(Iba1+)は緑色、血管(GLUT1+)は白色です。ストローク+ヒドロゲル状態、IHC 10dポスト注射、脳卒中後15日目。アストロサイト(GFAP+)細胞は赤色で示され、ミクログリア(Iba1+)は緑色であり、ヒドロゲル材料は白色である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:脳卒中後の反応性アノサイトおよびミクログリアに対する微多孔性アニール粒子ヒドロゲルの影響。(A) 実験タイムラインの概略図で、矢印はストロークの日を意味し、+ は射出日を意味し、xは犠牲と分析の時間ポイントを意味します。(B) セクションの画像化と分析の場所を示す解析設定の概略。(C) pERK、 S100b、 GFAP を介したアストロサイト反応性を示す IHC 画像。(D) 反応性が高いアストロサイトの pERK/GFAP パーセントの定量化。(E) 高反応性のアストロサイトのS100b/GFAPパーセントの定量化。(F) CD11b、Arg1、および iNOS 染色を介したミクログリア反応性の IHC 画像。(G) iNOS/Dapiの定量化による、ミクログリア炎症プロ炎症表現型の測定(H) ミクログリア補修表現型の測定のためのArg1/Dapiの定量化すべてのスケールバー= 100 μm。統計分析はグラフパッドプリズムで行われました。* 示されたデータは、P<0.05でTukey事後検定と95%信頼区間を使用して分析した。個々のp値はT検定を示した。この図は ref.26から変更されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、簡単に再現可能で、低侵襲、永久的な脳卒中モデルを示し、脳卒中の5日後に梗塞に生体材料を注入する方法を説明します。フォトトロンボティック色素ローズベンガルとステレオタックシックデバイスに接続された520 nmコリメートレーザーの使用は、私たちに強化された精度でマウスの運動皮質にストロークを配置する能力を与えます。脳卒中の5日後、梗塞の位置は、照射の中心に目で見える、ブレグマに2.0mmの平凡な側面である。ヒドロゲルは、次いで、シリンジポンプを使用してストロークコアに正確に注入されます。このモデルの手術中および脳卒中後の死亡率は事実上存在せず、麻酔学的合併症のために手術後に死亡するマウスはほんの一握りである。生体材料用途にPTストロークを使用する利点にもかかわらず、対処すべきいくつかの生物学的限界と技術的な困難があります。
生物学的限界の面では、PTは脳再灌流の選択肢を提供するストロークモデルではなく、人間の脳卒中や血管内血栓検索/リシスに応答して自発的に起こり得るプロセスである。さらに、主要な脳血管を閉塞させることによってほとんどの人間の脳卒中の病因を模倣するMCAoモデルとは異なり、PTは多くの小さな血管を通る血流を損なう。ヒドロゲル生体材料を注入する技術的な難しさは、手術中に注射器に付着する傾向や、抽出中に頭蓋骨に付着する傾向にあります。注射中に液体として残り、その場でゲルを設計すると、最初の問題に対処することができます。しかし、注射部位と脳卒中コアが脳の表面に存在するため、硬膜にゲルが付着するのを防ぐことはしばしば避けられない。これは、生体物質をそのまま維持しながら、脳組織を抽出することが困難なことができます。.したがって、硬膜が頭蓋骨で持ち上がり、意図せずにゲルを根こそぎにしないように、脳から頭蓋骨の破片を取り除く際には特別な注意が必要です。脳の切除には、処理プロセスとブレード切除の両方が周囲の組織からゲルを簡単に取り外し、細胞浸潤に関するデータ収集を制限できるため、技術的なスキルも必要です。材料が組織と完全に統合されていない場合、剥離が悪化する。OCT でサンプルを準備すると、切断時の材料分離を最小限に抑えるのに役立つ補強シェルが作成されます。
生体材料を注入する前に、げっ歯類の歪みや実験室のセットアップに応じて、所望のストロークサイズを最適化することをお勧めします。小さいかより大きい梗塞は3つの主要な変数を調節することによって作ることができる:レーザー出力強度、ビーム倍率および照射時間。また、ストロークサイズに影響を与える他の要因は、イソフルラン19の濃度および色素が照射前に循環させていられる時間の量を含む。レーザー出力強度(パワー/面積またはmW/cm2)に関しては、10mWのレーザーパワーで、レーザービームに対してわずかに小さい水平直径の小さな梗塞を作り出すのに十分であることがわかりました。より高いレーザーパワーは、ガウス照射プロファイルを有するレーザー光によるわずかに広いが、実質的に深い梗塞(データは示さない)をもたらした。強度を高めることで、最大放射照度の中心点は頭蓋骨を超えて深く浸透し、レーザーのスポットサイズの浸透がわずかに増加する可能性があります。他のストロークモデルは、低レーザー強度20を維持しながら、光の浸透とその後の凝固の再現性を高めるために光やレーザーを適用する前に、それをサンディングすることによって頭蓋骨を薄くしています。しかし、これは頭蓋骨の出血を引き起こす可能性があり、手術中にかなりの時間がかかり、その過程で誤って脳を損傷することなく習得するスキルを習得する。強度と同様に、レーザービーム径を増加させることも梗塞サイズを増加させる。しかし、レーザー強度とビーム直径は互いに対して線形にスケーリングされませんが、方程式に従って、パワー密度 = レーザーパワー(w)/πr2(ここでビームの半径)です。照射時間の観点から、再現性のあるストロークを得るためには最低10分が必要であることがわかりました。縦深さを一定に保ちながら梗塞の水平直径を大きくするため、それぞれ10分間、連続して隣接する場所にレーザーを塗布しました。イオブルラン濃度とローズベンガルの循環時間の影響に対処するために、IP注入後の1.5%のイオブルラン濃度および7分の循環が脳卒中の一貫した形成をもたらしたことを発見した。これらの5つのパラメータは、私たちの特定の用途に最適化されました。行動変化を引き起こすのに十分な大きさの脳卒中を必要とし、神経前駆細胞に対する物質の影響を研究することを目指しました。また、ストロークサイズに加えて、最適なゲル量を注入する必要があります。少なくとも、ゲルと周囲の組織の間のギャップが対照群と同様の結果をもたらし、ゲルと組織の接触は反応性アストロサイトの減少と細胞浸潤の増加をもたらしたため、脳卒中空洞を完全に満たすのに十分なゲルが必要でした。ゲルの4-6 μLの下限に達し、注入後に悪影響を及ぼさなかった(未発表データ)。
脳卒中の結果を評価することに関しては、磁気共鳴画像法、行動検査、組織学的分析、TTC(2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド)染色など、IHC染色以外にもいくつかの選択肢があります。使いやすさと即座の結果から、ストロークの予備最適化に TTC を使用することを強くお勧めします。私たちの研究室での以前の行動テストでは、シリンダーテスト/自発的前肢タスク、グリッドウォーキングテスト、およびパスタテスト12、21を見てきました。なお、ロタロッド試験はPTストローク法が実施された後の行動結果の有意な低下を示さなかった(データは示さなかった)。したがって、行動テストは、有意な皮質入力を必要とする非常に複雑なタスクを評価する必要があります。
ここでは、成長因子や細胞の送達を伴わずに、脳卒中後にヒドロゲルを注入する手法を実証した。しかし、ヒドロゲルは細胞移植、薬物および成長因子送達にも利用されており、脳卒中後の生物学を研究し、新しい治療法を調査する上で貴重な資源となる可能性がある。脳卒中の文脈では、私たちの研究室は、25,000細胞/μLから50,000細胞/μLまでの濃度で、誘導多能性幹細胞由来神経前駆細胞14、18個のゲルをカプセル化する非多孔性ヒアルロン酸ヒドロゲルを注入しました。ヒドロゲルを使用すると、細胞の生存率および分化が増加した。他の研究室はまた、脳卒中22-24後に幹細胞を移植するために使用されるヒドロゲルに応答して細胞分化および組織再生の増加を報告している。さらに、脳卒中後の成長因子を含むヒドロゲルを注入し、脳卒中13、14後の組織再生および行動改善につながる。材料設計の面では、注入可能性は侵襲性を最小限に抑えるのに役立つ貴重な特徴です。したがって、ヒドロゲルは、静的条件下でソルゲル(液体から固体)、剪断間引き(G'>G"のいずれかとして処方されるべきです。G">G')、または直径が針12、25、26の内径未満であるビルディングブロックから構成される顆粒ゲル。次に、薬物または成長因子の拡散、細胞濃度、ゲル条件、および注射パラメータ(速度、針ゲージ、注射深度、注射日など)の範囲での細胞生存率を、脳卒中が誘発された時期に対してテストするために最適化を行う必要があります。例えば、射出の日は、1日のポストストロークから、3週間の脳卒中後27、28まで及んでいる。ここでは、5日間報告していますが、細胞を移植する際に脳卒中後7日間注射しました。これらの日は、炎症反応のタイムラインと、脳卒中5、29、30、31の1週間後に見られる血管新生および神経新生のピーク活性に基づいて選択された。また、ストロークの体積は萎縮のために時間の経過とともに減少するため、ボリュームの特性評価は、射出時間ごとに行う必要があります。これらのパラメータが注射前に最適化されていることを考えると、ここでの方法は、細胞および/または成長因子および薬物を添加して生体材料を注入するようにユーザーを導くのに十分である。
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Disclosures
著者らは、TSがMAPヒドロゲルの商品化を目指すテンポセラピューティクスの創設者であると宣言している。
Acknowledgments
私たちは、国立衛生研究所と国立神経疾患・脳卒中研究所の資金提供を認めたいです(R01NS079691)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
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