Summary
Hjerneslag er et globalt problem med minimale behandlingsalternativer og ingen nåværende klinisk terapi for å regenerere det tapte hjernevevet. Her beskriver vi metoder for å skape presis fototrombotisk slag i gnagernes motoriske cortex og etterfølgende injeksjon av hydrogelbiomaterialer for å studere deres effekter på vevregenerering etter hjerneslag.
Abstract
Hjerneslag er den ledende årsaken til funksjonshemming og den femte ledende dødsårsaken i USA. Omtrent 87% av alle slag er iskemiske slag og er definert som den plutselige blokkeringen av et kar som leverer blod til hjernen. Innen få minutter etter blokkeringen begynner cellene å dø og resulterer i uopprettelig vevsskade. Nåværende terapeutiske behandlinger fokuserer på fjerning av blodpropp eller lysis for å tillate reperfusjon og forhindre mer alvorlig hjerneskade. Selv om forbigående hjerneplastisitet kan redde noe av det skadede vevet over tid, sitter betydelige fraksjoner av pasienter igjen med nevrologiske underskudd som aldri vil løse. Det er mangel på terapeutiske alternativer for å behandle nevrologiske underskudd forårsaket av hjerneslag, og understreker behovet for å utvikle nye strategier for å behandle denne voksende pasientpopulasjonen. Injiserbare biomaterialer er for tiden designet for å forbedre hjernens plastisitet og forbedre endogen reparasjon gjennom levering av aktive midler eller stamceller. En metode for å teste disse tilnærmingene er å bruke en gnagerslagmodell, injisere biomaterialet i slagkjernen og vurdere reparasjon. Å vite den nøyaktige plasseringen av slagkjernen er avgjørende for nøyaktig behandling etter hjerneslag, derfor er en slagmodell som resulterer i en forutsigbar slagplassering å foretrekke for å unngå behovet for avbildning før injeksjon. Følgende protokoll vil dekke hvordan man induserer et fototrombotisk slag, hvordan man injiserer en hydrogel på en kontrollert og presis måte, og hvordan du trekker ut og gråter hjernen mens du holder biomaterialet intakt. I tillegg vil vi fremheve hvordan de samme hydrogelmaterialene kan brukes til samlevering av stamceller. Denne protokollen kan generaliseres til bruk av andre injiserbare biomaterialer i slagkjernen.
Introduction
Hjerneslag er den ledende årsaken til funksjonshemming og den femte ledende dødsårsaken i USA1. Omtrent 87% av alle slag er iskemiske, mens et flertall av de resterende 13% er hemorragiske2. Et iskemisk slag er definert som blokkering av blodstrøm i en arterie til det omkringliggende vevet. Denne okklusjonen resulterer i oksygenmangel og påfølgende nekrose som ofte fører til permanent funksjonshemming hos overlevende pasienter. Mens det har vært en nedgang i dødeligheten av hjerneslag3, forventes utbredelsen å øke til 3,4 millioner mennesker innen 20304. Denne økningen i funksjonshemmede overlevende og påfølgende økonomisk byrde har ført til et press for slagforskning som fokuserer på mekanismer for nevral reparasjon. Etter hjerneslag er det en inflammatorisk periode som fører til dannelsen av et arr som forhindrer at den nekrotiske regionen ekspanderer. Regionen rundt den nekrotiske kjernen kalles "peri-infarct", og det er et sterkt bevis på at plastisiteten i denne regionen, som inkluderer økt angiogenese, nevrogenese og axonal spiring, er direkte knyttet til observert utvinning i dyremodeller og mennesker5. Siden det ikke er noen in vitro-modeller som kan gjenskape de komplekse interaksjonene etter hjerneslag, er dyremodeller avgjørende for slagforskning.
Det finnes flere in vivo-modeller som kan brukes til å produsere iskemisk slag. En av de vanligste modellene som brukes i mus er midterste cerebral arterie okklusjon, eller MCAo, gjennom distal eller proksimal (via intraarteriell filament) okklusjon. Den proksimale modellen, også kjent som filament MCAo (fMCAo), resulterer vanligvis i store iskemiske slag som omfatter alt fra 5% til 50% av hjernehalvøya, avhengig av antall faktorer6. I disse modellene blir en sutur eller filament avansert fra den indre halspulsåren til bunnen av den midterste hjernearterien (MCA) og holdt på plass i en bestemt tidsperiode. Denne metoden for okklusjon, som kan gjøres midlertidig eller permanent, produserer et infarkt som er sentrert i striatum og kan eller ikke kan innebære overlying cortex6. Den resulterende slagstørrelsen er svært variabel, og bildeteknikker, for eksempel laserdoppler, kreves for å bekrefte effektiviteten av prosedyren i hver mus. Intraarteriell eller intra-luminal filament okklusjon som varer mer enn 30 minutter produserer slag i den større enden av størrelsesområdet. Noen etterforskere har fokusert på kortere filament okklusjonstider, noe som krever betydelig eksperimentelt fokus og laboratorievalidering7. Filament MCAo-modeller hos mus følger lignende stadier av celledød, iskemisk progresjon og dannelse av en peri-infarktregion sett i menneskelige slagtilfeller; Imidlertid ligner de større slagene nærmere sykdomstilstanden til ondartede hjerneinfarkter, som er mindre vanlige, mindre behandlede menneskelige slag6. I mellomtiden krever distal MCA-okklusjon en mer involvert kirurgi og craniectomy. I denne modellen er den distale delen av MCA som går langs overflaten av hjernen direkte okkludert med et suturbånd eller cauterization. I noen varianter av teknikken er karotisarteriene ensidig eller forbigående bilateralt okkludert. En fordel med den distale MCAo er at den produserer et kortikalebasert slag som er mindre variabelt i størrelse enn filamentmodellen. Den distale modellen produserer imidlertid dårligere atferdseffekt på grunn av transeksjon av den eksterne halspulsåren (ECA), som også er en bekymring for fMCAo6.
En alternativ slagmodell som er kjent for å være mindre invasiv, er den fototrombotiske (PT) modellen. PT-modellen resulterer i en veldefinert plassering av iskemi og er forbundet med en høy overlevelsesrate8. Teknikken er avhengig av et lysfølsomt fargestoff injisert intraperitonealt som gjør det mulig for den intravaskulære fotooksidasjonen ganske enkelt ved å bestråle ønsket vev med et lys eller laser9. Ved eksitasjon dannes oksygenradikaler som forårsaker endotelskade, som aktiverer blodplateaggregering og blodproppdannelse i det bestrålede området8,9. Den tette kontrollen over slagstørrelse og -plassering, samt høy reproduserbarhet av PT-modellen, gjør den ideell for å studere biomaterialer. Selv om presisjon er mulig ved hjelp av laser- og stereotaxiske koordinater, er det noen ulemper som kan gjøre denne modellen mindre ideell for få studier. I motsetning til fMCAo-modellen kan ikke PT-slagmodellen gjentas. Derfor vil materialer for å undersøke nevrobeskyttende midler som er spesifikke for skader etter reperfusjon eller mekanismene etter reperfusjon ikke være nyttige her8. I tillegg, på grunn av PT-modellens mikrovaskulære fornærmelse, ses relativt liten iskemisk penumbra. I stedet oppstår lokalt vasogent ødem, som er ukarakteristisk for menneskelig hjerneslag, noe som gjør denne modellen uønsket for prekliniske legemiddelstudier fokusert på peri-infarktområdet6,8.
Det overordnede målet med biomaterialestrategier i hjerneslag er enten å levere bioaktive midler eller å fungere som en surrogat ekstracellulær matrise for hjernevevsvekst. En strategi som vi vil utforske ved hjelp av metodene våre er å levere hydrogel direkte inn i slagkjernen, i motsetning til peri-infarktvevet der mange nåværende celleterapier leveres10. Begrunnelsen for denne tilnærmingen er at levering til det nekrotiske vevet som finnes i kjernen, vil unngå å forstyrre det omkringliggende sunne eller gjenopprettende vevet. Vi antar at diffusjon av eventuelle aktive midler som er inkludert i biomaterialet, vil kunne nå peri-infarktet fra kjernen, spesielt siden vi finner at levering av hydrogelbiomaterialer reduserer tykkelsen på glial arr11. Dette er viktig siden peri-infarkt-regionen har vist seg å vise nevroplastisitet etter hjerneslag, noe som gjør det til et attraktivt mål. Videre kan levering av en surrogatmatrise til slagkjernen lastes med angiogene12 eller nevrogene13 faktorer for å lede dannelsen av nytt vev, samt celler for levering14. Cellelevering er sterkt forbedret ved å bruke en matrise fordi den beskytter celler mot de harde injeksjonskreftene og det lokale miljøet som er tilstede under levering, samt oppfordrer til differensiering og engraftment15.
Disse injiserbare terapeutiske biomaterialer har klinisk relevans i slagapplikasjoner, da det for tiden ikke finnes medisinske terapier som stimulerer nevronal utvinning etter hjerneslag. De underliggende nevrale kretsene som er involvert i utvinning ligger i hjernevev som ligger ved siden avslagkjernen 16, mens slagkjernen i seg selv er blottet for levedyktig nevralt vev. Vi forventer at å levere en biomateriale inn i den nekrotiske slagkjernen har potensial til å stimulere det tilstøtende vevet mot regenerative prosesser gjennom en rekke mekanismer som tidligere er nevnt, inkludert depotfrigjøring av vekstfaktorer13, stimulering av vev i vekst og fremme av gjenopprettende hjernevevsutvikling11,12, endring av immunresponser17, og levering av stamcelleavledede terapeutiske midler14, 18. For å effektivt studere muligheten for disse applikasjonene, er det imidlertid nødvendig med en konsekvent og reproduserbar metode for å indusere slag og injisere biomaterialer. PT-strekmodellen bruker teknikker som gir nøyaktig kontroll over retningen og plasseringen av strøket. En laser festet til stereotaxic enheten guider orienteringer, og pumper festet til stereotaxic enheter kontrollerer injeksjonshastigheten til materialet uten behov for flere former for avbildning. Derfor har vi valgt å beskrive metodene for å utføre et PT-slag i musenes motoriske cortexes og for å injisere biomaterialer i slagkjernen. Her bruker vi mikroporøs glødet partikkel (MAP) hydrogeler som biomateriale til injeksjon uten tilsatte celler eller vekstfaktorer. I tillegg forklarer vi hvordan du lykkes med å hente hjernen med intakt biomateriale, og vi diskuterer immunkjemiske analyser som brukes til å analysere slagutfallet med og uten injeksjon av biomaterialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentene ble utført i samsvar med IUCAC ved Duke University og University of California Los Angeles. 8 til 12 uker gamle mannlige C57Bl/6J mus ble brukt i denne studien. Dyrene ble plassert under kontrollert temperatur (22 ± 2 °C), med en 12 timers lys-mørk syklusperiode og tilgang til pelletert mat og vann ad libitum. Smertestillende og sedasjonsprotokoller beskrives som godkjent av IUCAC, men kan avvike fra protokoller som brukes i andre laboratorier.
Dyr kan bli for tidlig euthanized hvis de opplever overdreven rastløshet, vokalisering (indikerer ukontrollerbar smerte), selvtraumer, redusert eller nedsatt mobilitet, fysiske tegn på dermal infeksjon, tap av appetitt og / eller vekttap større enn 10% -15% som et resultat av overlevelsesoperasjonen. Det er ingen forventede bivirkninger fra injeksjon av gelen, da den består av en naturlig forekommende polymer i hjernen. Dyr bør overvåkes daglig, inkludert helger og helligdager, og revektes annenhver dag. Studier fra vårt laboratorium og andres har ikke funnet noen underskudd i grooming, tap av kroppsvekt eller tegn / symptomer på abstinens eller kronisk stress hos mus etter disse små kortikale eller subkortiske slagene. Hvis dyr viser tegn på lokal hodesårinfeksjon, bør de avlives. Dyr bør også overvåkes for dårlig grooming, sårtilstand og bevis på kamp mellom dyr (ryggsår). Hvis det er tegn på kamp eller sårdehiscence, bør dyr først behandles etter å ha kontaktet veterinærene. Dette innebærer ofte antibiotika i vann og/eller lokal aktuell antibiotikaapplikasjon. Hvis disse tiltakene ikke klarer å produsere helbredelse, bør dyrene euthanatiseres.
1. Fremstilling av materialer og instrumenter
- Forbered fototrombotisk fargestoff før operasjonen. Vei ut 15 mg Rose Bengal i et 2 ml mikrosenterrør.
FORSIKTIG: Rose Bengal kan forårsake alvorlig øyeskade/irritasjon.- Løs opp Rose Bengal i 1,5 ml steril filtrert 1x PBS for å lage en arbeidskonsentrasjon på 10 mg/ml.
- Virvel røret til ingen klumper er synlige, noe som indikerer at fargestoffet er fullstendig oppløst, og dekk deretter i folie til videre bruk.
MERK: Mengden fargestoff som kreves vil avhenge av antall mus. Fargestoff injiseres intraperitonealt IP i en konsentrasjon på 10 μL/g, for eksempel 200 μL for en 20 g mus.
- Slå på varmeputen for å opprettholde musens kroppstemperatur under anestesi (37 °C).
- Forbered autoklavert saks, tang, bomull, veterinærøye salve, kirurgisk lim eller suturmateriale, en blå eller svart kirurgisk markør og sterile alkohol- og betajodservietter. Forbered beinbor med steriliserte borhoder.
- Slå på perlesteriliseringen til 160 °C for å muliggjøre sterilisering av instrumenter mellom muskirurgi. Sett til side et 50 ml konisk rør med steril saltvann eller 1x PBS-oppløsning for senere bruk for å opprettholde et hydrert operasjonsområde.
- Fest laseren til den stereotaktiske enheten. Bruk lasersikkerhetsbriller, mål laserens kraft (mW).
FORSIKTIG: Bruk lasersikkerhetsbriller når laseren slås på i prosedyren.- Juster strømmen på laserkonsollen ved å følge instruksjonene for laserproduksjon, til lasereffekten viser 10 mW, og angi strømmen som en forhåndsinnstilt på startskjermkonsollen. Juster deretter strømmen igjen for å etablere et annet forhåndsinnstilt der laserutgangseffekten lyder 40 mW. Slå nå av laseren til videre bruk.
MERK: 10 mW brukes til å orientere laseren før bruk.
- Juster strømmen på laserkonsollen ved å følge instruksjonene for laserproduksjon, til lasereffekten viser 10 mW, og angi strømmen som en forhåndsinnstilt på startskjermkonsollen. Juster deretter strømmen igjen for å etablere et annet forhåndsinnstilt der laserutgangseffekten lyder 40 mW. Slå nå av laseren til videre bruk.
- Forbered et rent bur for mus etter operasjonen. Plasser deretter musen i induksjonskammeret med en isoflurankonsentrasjon på 4% for å bedøve den til spontan bevegelse stopper og pusten kommer til en langsom, jevn hastighet.
- Når du sover, vei musen for å bestemme hvor mye Rose Bengal fargestoff å injisere. Deretter overfører og fester du musen til stereotaxic-enheten med en vedlikeholdsisoflurankonsentrasjon på 1,5%.
MERK: Økende isoflurankonsentrasjoner kan utvide kar og forhindre tilstrekkelig okklusjon eller konsekvent store slag mellom mus. - Påfør veterinær øyesalve på begge øynene.
MERK: Se pusten og temperaturen gjennom hele prosedyren og klyp tærne av og til for å sikre at musen ikke kan føle noe.
2. Fototrombotisk slagmodell9
- Barber pelsen av musens hode og forbered området aseptisk ved å bruke en alkoholserviett etterfulgt av en beta jodserviett. Gjenta tre ganger.
MERK: Bruk om nødvendig en ekstra alkoholserviett på enden for å rengjøre all betajodin, da det forårsaker hudirritasjon som fører musene til å klø på skallen etter operasjonen. - Ved hjelp av liten operasjon saks, gjør et lateralt snitt mellom ørene til øynene, ca 1-2 cm. Gjør dette ved å trekke huden oppover med tang for å lage et telt, kutte en gang nedover, deretter sette saksen inn i åpningen og skape et kontinuerlig midtlinje snitt.
- Skill huden og trykk lett på parietalbenene med tangene for å finne bregmaen. Merk bregmaen med en prikk ved hjelp av den kirurgiske markøren.
MERK: Benfragmentbevegelsen fremhever frontkanten av parietalbenene. Bregmaen er midtpunktet der front- og parietalbenfragmentene møtes (Figur 1A). - Bruk lasersikkerhetsbriller, beveg laseren over musens hodeskalle, og fest stereotaxic-enheten i en 90° vinkel. Velg 10 mW forhåndsinnstilt og slå på laseren.
- Juster laserens x- og y-akse til den er rett over bregmaen. Tilbakestill x og y på den digitale skjermkonsollen, og flytt deretter laseren 1,8 mm til venstre for bregmaen. Ta nå laseren så nær skallen som mulig uten å la den berøre skallen.
- Flytt laseren til 2,2 mm til venstre for bregmaen for å sikre at den kan bevege seg uten hindringer. Slå av laseren.
- Injiser riktig mengde Rose Bengal fargestoff intraperitoneally (IP) ved hjelp av en engangs 29 G nål. Start umiddelbart en timer i 7 min for å la fargestoffet sirkulere systemisk. Velg forhåndsinnstilt for 40 mW uten å slå på laseren.
MERK: Når fargestoffet er komfortabelt med prosedyren, kan det injiseres før aseptisk tilberedning av musen og avsluttes før 7 min er over for å spare tid. - Slå på laseren (40 mW) når 7 min timeren går av, mens du bruker lasersikkerhetsbriller, og still inn en 10 min timer.
- Etter 10 min flytter du laseren til 2,2 mm til venstre for bregmaen uten å slå den av, og stiller inn en annen 10 min timer.
- Når den andre 10 min timeren har gått av, bytt laseren tilbake til 10 mW og flytt laseren til 2,0 mm til venstre for bregmaen. Merk dette stedet med den kirurgiske markøren. Slå deretter av laseren.
- Løft laseren og lås den opp fra 90°-vinkelen slik at den kan flyttes bort fra musen. På dette tidspunktet, bruk den sterile saltvann eller PBS med bomull hvis det kirurgiske området er tørt.
- Bor i små eksplosjoner på 2,0 mm merket vinkelrett på overflaten av skallen.
MERK: Pass på at du borer sakte for å unngå å bore for dypt og treffe hjernen. Det vil være en liten fall/endring i motstand når boret har gått gjennom skallen, og boring kan forårsake blødning.- Bruk bomull til å absorbere overflødig blod. Det er typisk å se noe blod fra nicked arterier i skallen etter boring - overdreven blod betyr at borekronen treffer hjernen. Hvis dette skjer, registrerer du museidentifikatoren og går videre.
- Plasser en liten klut ved siden av musen. Bruk tangene, trekk huden tett sammen for å forberede liming.
MERK: Suturering kan gjøres her i stedet. Suturering krever vanligvis bare 3 suturer.- Bruk tangene, ta tak i de to sidene av huden og trekk dem sammen og oppover. Dab av noen store dråper kirurgisk lim på slutten av spissen på kluten før du søker på musen.
- Påfør kirurgisk lim sparsomt og hold huden sammen med tang i 10 s. Fortsett til det ikke er synlige åpninger.
MERK: Limet kommer raskt ut – ikke klem flasken. Unngå å lime huden til skallen eller få lim i øyet.
- Etter liming, eller suturing, plasser musen i det nye buret for å gjenopprette fra anestesi. Det tar 5-10 min for dyret å gjenopprette, og det bidrar til å hvile halvparten av buret på en varmepute.
3. Sham slag drift
- Utfør alle prosedyrer identisk med operasjonen beskrevet ovenfor i avsnitt 2, unntatt injiser 1x PBS eller saltvann i stedet for Rose Bengal fargestoff.
4. Injeksjon av hydrogel eller andre biomaterialer
- Utfør injeksjonen av biomaterialer på et brukerdefinert tidspunkt. I dette eksperimentet ble det utført injeksjoner mellom 5- og 7-dagers etter hjerneslag. 2 - 6 μL hydrogel injiseres (brukerdefinert).
- Slå på varmeputen for å opprettholde musens kroppstemperatur under anestesi (37 °C).
- Forbered autoklavert saks, tang, bomull, veterinær øyesalve, kirurgisk lim eller suturmateriale, og steril alkohol og beta jodservietter. Forbered beinboret med sterile borhoder og De 25 μL glass Hamilton-sprøytene med metall 30 G nåler.
- Slå på perlesteriliseringen til 160 °C for å muliggjøre sterilisering av instrumenter mellom mus.
- Fest injeksjonspumpene til stereotaxic-enheten. Sett strømningshastigheten til 1 μL/min og sett volumet til 4 μL.
- Forbered et rent bur for musene etter operasjonen.
- Plasser musen i induksjonskammeret med en isoflurankonsentrasjon på 4% for å bedøve den til spontan bevegelse stopper og pusten kommer til en langsom, jevn hastighet.
- Når du sover, overfør og fest musen til stereotaxic enheten med en vedlikeholdsisoflurankonsentrasjon på 1,5%.
- Påfør veterinærens øyesalve på begge øynene.
- Barber eventuell pels som kan ha gjenvunnet musens hode, og forbered området aseptisk ved å bruke en alkoholserviett etterfulgt av en beta jodserviett. Gjenta tre ganger.
MERK: Bruk om nødvendig en ekstra alkoholserviett på enden for å rengjøre all betajodon, da det forårsaker hudirritasjon og fører musene til å klø på skallen etter operasjonen.
- Bruk den lille saksen og/eller tangen til å gjenåpne huden over hjernen. Bruk bomull med steril saltvann eller PBS for å rengjøre rusk fra skallen. En hvit-gul sirkel (slaget, figur 1B) og burrhullet fra boret vil være synlig. Hvis det døde vevet ikke er synlig, oppstod sannsynligvis ingen slag. Hvis burrhullet ikke er sentrert over slaget, må du bore på nytt for å midtstille det.
- Plasser injeksjonspumpen over musen og lås den ved 90°. Rengjør sprøyten med steril saltvanns- eller PBS-oppløsning før du laster tilbake materialet.
- Når glasssprøyten er ren, demonter den slik at den ikke er noen kanyle. Last sprøyten tilbake ved hjelp av en 25 μL positiv forskyvningspipette med 10 μL hydrogel (eller annen biomateriale her med eller uten celler).
- Bruk sprøytestempeet til å skyve gelen helt til forsiden av sprøyten. Sett deretter sammen sprøyten igjen og fortsett å skyve til gelen synlig utstråler fra nålen.
- Sett sprøyten på pumpen. Baksiden av pumpen må kanskje justeres slik at sprøyten passer. Gjør dette ved å justere strømningshastigheten til 30 μL/min, velg Uttak eller Injiser avhengig av retningen den må bevege seg, og trykk deretter start. Trykk stopp når baksiden av pumpen er på riktig sted.
- Skru baksiden av pumpen slik at sprøyten sitter godt fast. Hvis det tidligere ble gjort justeringer, må du kontrollere at strømningshastigheten er satt tilbake til 1 μL/min og er satt til å injisere.
- Beveg pumpen i x- og y-retningen for å orientere den over hullet. Beveg pumpen ned i z-retningen til sprøytens kanyle berører toppen av hullet.
- Tilbakestill z på den digitale skjermkonsollen. Beveg deretter sprøyten ned i z-retningen 0,750 mm. Hvis sprøyten bøyer seg eller det er motstand, ble skallen enten helbredet eller ikke fullstendig boret gjennom og må bores på nytt.
- Trykk start på pumpekonsollen for å injisere 4 - 6 μL hydrogel med en hastighet på 1 μL/min.
- Still inn en 5 min timer når pumpen slutter å injisere slik at gelen kan begynne å krysskoble.
- Etter 5 min, trekk sakte opp sprøyten ved å dreie z nob. Se om noe materiale ved et uhell trekkes eller lekker ut av hullet. Lås opp pumpen og flytt den bort fra musen når nålen er langt nok borte fra skallen.
- Bruk tang, kirurgisk lim eller suturer, lukk huden over hodet. Plasser musen i det rene buret og observere utvinningen. Det bør ta ca 5 - 10 min for musen å gjenopprette fra anestesi.
5. Perfusjon og prøvetaking
- Bedøv musen ved hjelp av isofluran.
- Fest dyret i liggende stilling og åpne bukhulen med et median kutt. Eventuelt, klem den synkende abdominal aorta for å bruke mindre fixative og PBS.
- Klipp opp membranen og flytt opp sidene av ribbeburet for å åpne brysthulen. Sett inn en perfusjonskanyle i venstre ventrikel og kutt en åpning i høyre atrium. Begynn å sakte parfyme med 10-20 ml PBS eller til væsken går halvklar.
- Når du er klar, bytt til 4% PFA for ytterligere 10 - 20 ml. Unpinning armene tillater dem å kontrakt som PFA infuses. Når de slutter å bevege seg, vent på ytterligere 30 s.
- Decapitate dyret og trekk tilbake huden for å avsløre skallen. Bruk stumpe, tynne tang, fjern forsiktig delene av skallen for å avsløre hjernen. Spesiell forsiktighet må tas når du fjerner skallen over slagstedet. Små kirurgiske saks kan brukes her for å kutte bort skallen. Den største utfordringen er at gel setter seg fast i skallen og kommer ut av hjernen når skallen fjernes.
- Når hjernen er løsnet, plasser i 10 - 15 ml 4% PFA over natten (ikke lenger enn 24 timer).
- Flytt hjernen fra PFA til 30% sukrose neste dag. Hjernen er klar for kryoseksjon når den synker til bunnen (ca. 2 - 3 dager). Det kan også bli igjen for lagring på dette tidspunktet.
6. Kryooseksjon og farging
- Ta hjernen ut av sukrose og legg på en glasssklie. Klipp av en liten del av baksiden av hjernen med et barberblad for å lage en flat del som skal monteres på en chuck.
- Plasser en dukke med Optimal Skjæretemperaturforbindelse (OCT) på chucken, og plasser deretter hjernen, den flate siden ned, på chucken i OKT. Plasser denne prøven på tørris til den er frosset eller i kryostaten på fryseblokken.
MERK: OKT kan legges til for å omfatte hjernen fullt ut for å forhindre at materialet skiller seg fra hjernen under seksjonering.
- Plasser en dukke med Optimal Skjæretemperaturforbindelse (OCT) på chucken, og plasser deretter hjernen, den flate siden ned, på chucken i OKT. Plasser denne prøven på tørris til den er frosset eller i kryostaten på fryseblokken.
- Klipp hjernen serielt på en kryostat ved -20 °C ved 30 μm tykke seksjoner over 10 gelatinbelagte lysbilder. Vær forsiktig når du seksjonerer, og pass på at du ikke mister hydrogelen. Hvis denne delen er vanskelig, legg litt OCT på toppen av hjernen over gelen (Figur 3). Oppbevars ved -80 °C til videre bruk.
- Ta lysbilder ut av -80 °C og legg dem på en fargebrett slik at de kan tørke. Lysbilder som ikke har frosset, men bare seksjonert, kan også farges umiddelbart.
- Bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel rundt hjerneskivene på lysbildet. Når den er tørr, rehydrer hjerneskivene med 1x filtrert PBS og legg på en shaker ved romtemperatur i 15 minutter. Dette tar omtrent 1 ml buffer per lysbilde med 9 - 12 hjerneseksjoner.
- Vask lysbildene med 1x filtrert PBS i 5 min ved romtemperatur, gjenta tre ganger.
- Blokker lysbilder i 30 min til en time med 10% eselserum i 0,01% PBS-Triton X ved romtemperatur på magedanseren. Dette tar omtrent 200 μL per lysbilde.
- Inkuber det primære antistoffet i 10% eselserum med 0,01% PBS-Triton X over natten ved 4 °C på en shaker. Test primære antistoffer først for å bestemme riktige konsentrasjoner. Her ble GFAP (1:400), Iba1 (1:250), Glut1 (1:500) (Figur 4) brukt.
- Vask lysbilder med 1x filtrert PBS neste dag i 5 minutter ved romtemperatur, gjenta tre ganger.
- Inkuber med sekundært antistoff i 10% eselserum i 0,01% PBS-Triton X og DAPI i 2 timer på lab shaker ved romtemperatur. 1:1000 ble brukt for alle sekundære og DAPI.
- Vask lysbildene i 5 min med 1x filtrert PBS.
- La seksjonene tørke ved romtemperatur i mørket. Dette kan ta 20 min til 4 timer; plassering av lysbildene i en desiccator kan øke hastigheten på prosessen.
- Dehydrere lysbilder i stigende konsentrasjoner av alkohol (1 min per løsning) på 50%, 70%, 95%, 100% og 100%.
- De-fett i første bad av xylen i 1 min, deretter andre bad av xylen i 5 min.
- Ta raskt lysbildene ut en etter en og legg til monteringsmedium mens hjerneseksjonene er våte med xylen. Legg raskt til et glassdeksler på toppen. Bruk en dekselseddel som er av riktig lengde og tykkelse som trengs for henholdsvis lysbildet og mikroskopet som brukes til avbildning.
- Bli kvitt eventuelle bobler under dekslene ved å trykke forsiktig med en pipettespiss i en ytre bevegelse fra midten av lysbildet. La DPX tørke i 4 timer for å overnatte i mørket ved romtemperatur.
- Bruk et barberblad til å skrape av et tørket monteringsmedium som sølte på lysbildene. Tørk av lysbildene med linserenseren. Lysbilder kan nå avbildes med fluorescensmikroskopi.
MERK: Det er best å oppbevare glid i mørket eller ved 4 °C til bildet er ferdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne metoden var å demonstrere hvordan man injiserer biomaterialer i hjernen etter hjerneslag. En fototrombotisk modell med rose bengal og en 520 nm laser ble brukt til kontrollert orientering av slaglesjonen i både størrelse og plassering. Fem dager etter hjerneslag kan infarkten visualiseres under operasjonen (figur 1B) og ved TTC- og imaging IHC-fargede lysbilder (figur 2). En økning i laserdiameteren med en 2x linse fører til en visuell økning i slaglesjonen som strakte seg over 2,5 mm i forhold til en enkelt 1 mm seksjon bare med laseren (Figur 2). Dødelighet under kirurgi med PT-modellen oppstod sjelden, mindre enn 1%, på grunn av den minimalt invasive prosedyren. Døden etter operasjonen var også lav og sett hos mindre enn 5% av musene.
Hyaluronsyrebaserte hydrogelmikropartikler (HME) ble injisert fem dager etter hjerneslag (figur 3). HMPs anneal etter injeksjon i slaglesjonen for å danne mikroannealerte partikler (MAP) med et porøst stillas som tillot cellemigrasjon i slagkjernen (Figur 4). Ti dager etter injeksjon mus ble perfused med 4% PFA og deres hjerner ble ekstrahert, plassert i 4% PFA over natten, og deretter i 30% sukrose i to dager før de ble frosset og seksjonert for IHC farging og analyse.
Tidligere arbeid i laboratoriet vårt demonstrerte injeksjon av MAP hydrogeler i slaglesjonen fem dager etter hjerneslag26. Injeksjon av hyaluroniske hydrogeler som samsvarer med cortexens modulus førte til en betydelig reduksjon i de reaktive astrocyttene i peri-infarktet så vel som inne i MAP gel. Videre uttrykte mikroglia som også var innenfor hydrogelen pro-reparasjon M2 markører. Dette antyder at MAP hydrogel kan redusere astrocytt reaktivitet på bare to dager etter injeksjoner og for å fremme et mer antiinflammatorisk miljø med pro-recovery astrocytter og mikroglia (Figur 5).
Figur 1: Skjematisk representasjon av bregma og lokalisering av hjerneslag. (A) Parietal lobes møtes øverst for å danne bregma. Laserplasseringen var sentrert 2,0 mm til venstre for bregmaen. (B) Visuell konformasjon av slag og burr hull ble sett 5 dager etter hjerneslag. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Koronaseksjoner som spenner over infarktet. (A) Serielle IHC-deler av hjerner 5 dager etter hjerneslag, slag bare med laser (topp) og 2x linse (bunn). Skiver var 30 μm tykke med hver seksjon 300 μm unna forrige seksjon. (B) Forstørret IHC-flekk, 500 μm skalastang. Nuklei (DAPI) vises i blått, astrocytter (GFAP+) i rødt og mikroglialt (Iba1+) i grønt, 4x forstørrelse. (C) Deler av hjerner farget med TTC for å visualisere lesjonsvolum 5 dager etter hjerneslag, 1 mm tykke seksjoner med 1 cm skalabar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Injeksjon og visualisering av biomateriale. (A) Visuell gelinjeksjon under operasjonen. (B) Gelen kan visualiseres med øye når du fjerner skallen. (C) Når gelen var frosset og montert, var den synlig i hjernen under seksjonering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Immunhiistokjemi flekker av hjerneslag bare sammenlignet med slag med hydrogeler. (A) Skjematisk av kryoskoperte hjerner 30 μm tykk. Flere seksjoner i midten ble valgt for bildeanalyse. (B) Kun slag, immunhiistokjemi (IHC) flekker 15 dager etter hjerneslag. Astrocytter (GFAP+) celler er vist i rødt, mikroglia (Iba1+) er grønne, og kar (GLUT1+) er hvite. Slag + Hydrogel tilstand, IHC 10d post injeksjon, 15 dager etter hjerneslag. Astrocytter (GFAP+) celler er vist i rødt, mikroglia (Iba1+) er grønne, hydrogelmaterialet er hvitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekter av mikroporøse glødede partikkelhydrogeler på reaktive astrocytter og mikroglia etter hjerneslag. (A) Skjematisk for eksperimentell tidslinje der pil betyr slagdag, + betyr injeksjonsdag, og x betyr offer- og analysetidspunkt. (B) Skjematisk for analyseoppsett som viser hvor deler ble avbildet og analysert. (C) IHC-bilder som viser astrocytt reaktivitet gjennom pERK, S100b, GFAP. (D) Kvantifisering av pERK/GFAP prosent av astrocytter som var svært reaktive. (E) Kvantifisering av S100b/GFAP prosent av astrocytter som var svært reaktive. (F) IHC-bilder av mikroglia reaktivitet gjennom CD11b-, Arg1- og iNOS-farging. (G) Kvantifisering av iNOS/Dapi for bestemmelse av mikroglial proinflammatorisk fenotype. (H) Kvantifisering av Arg1/Dapi for bestemmelse av mikroglial pro-reparasjon fenotype. Alle skala bar = 100 μm. Statistisk analyse ble gjort i GraphPad Prism. * indikerte data ble analysert ved hjelp av Tukey post-hoc test og et 95% konfidensintervall med P<0,05. Individuelle p-verdier indikert T-test. Dette tallet er endret fra ref.26. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en lett reproduserbar, minimalt invasiv, permanent slagmodell og beskriver hvordan man injiserer en biomateriale i det infarktet fem dager etter hjerneslag. Bruken av det fototrombotiske fargestoffet Rose Bengal og en 520 nm kollatert laser koblet til stereotaxic-enheten gir oss muligheten til å plassere slaget ved musens motor cortex med forbedret presisjon. Fem dager etter hjerneslag er plasseringen av infarktet synlig for øye i midten av bestråling, 2,0 mm middelmådig til bregmaen. Hydrogel injiseres deretter nøyaktig i slagkjernen ved hjelp av sprøytepumper. Dødelighet under operasjonen og etter hjerneslag i denne modellen er nesten fraværende, med bare en håndfull mus som dør etter operasjonen på grunn av anestesiologiske komplikasjoner. Til tross for fordelene ved å bruke PT-slag for biomaterialer, er det flere biologiske begrensninger og tekniske vanskeligheter som bør løses.
Når det gjelder biologiske begrensninger, er PT ikke en slagmodell som tilbyr muligheten for cerebral reperfusjon, en prosess som kan oppstå spontant i menneskelige slag eller som svar på endovascular clot retrieval / lysis. I tillegg, i motsetning til MCAo-modellen som etterligner etiologien til de fleste menneskelige slag ved å okkludere et stort hjernekar, forringer PT blodstrømmen gjennom mange mindre kar. En teknisk vanskelighet med å injisere hydrogelbiomaterialer er deres tendens til å holde seg til sprøyten under operasjonen eller til skallen under ekstraksjoner. Å designe en hydrogel som forblir som væske under injeksjon og deretter geler in situ kan løse det første problemet; Men å hindre gelen i å holde seg til dura mater er ofte uunngåelig siden injeksjonsstedet og slagkjernen ligger på overflaten av hjernen. Dette kan gjøre det vanskelig å trekke ut hjernevevet samtidig som biomaterialet holdes intakt. Som sådan må det tas spesiell forsiktighet når du fjerner biter av skalle fra hjernen for å sikre at dura mater ikke løfter med skallen og utilsiktet rykker opp gelen. Kryoseksjonshjerner krever også teknisk dyktighet fordi både håndteringsprosessen og bladtranseksjonen lett kan løsne gelen fra det omkringliggende vevet, og dermed begrense datainnsamlingen angående celleinfiltrasjon. Løsrivelse forverres når materialet ikke er fullt integrert med vevet. Forberedelse av prøven med OCT skaper et forsterkningsskall som bidrar til å minimere materialseparasjon under kutting.
Før du injiserer biomaterialer, anbefaler vi å optimalisere ønsket slagstørrelse avhengig av gnagerstamme og laboratorieoppsett. Mindre eller større infarkter kan gjøres ved å justere tre hovedparametere: laserutgangsintensitet, stråleforstørrelse og bestrålingstid. Andre faktorer som også har vist seg å påvirke slagstørrelsen inkluderer konsentrasjon av isofluran19 og hvor lenge fargestoffet får lov til å sirkulere før bestråling. Når det gjelder laserutgangsintensitet (effekt / område eller mW / cm2), fant vi ut at en lasereffekt på 10 mW var tilstrekkelig til å produsere et lite infarkt med horisontal diameter litt mindre enn laserstrålen. Høyere laserkraft ga marginalt bredere, men vesentlig dypere infarkt (data ikke vist) på grunn av at laserstrålen hadde en gaussisk bestrålingsprofil. Ved å øke intensiteten kan midtpunktet for maksimal bestråling trenge dypere forbi skallen, samt forårsake den lille økningen i laserens spotstørrelse. Andre slagmodeller har tynnet skallen ved å slipe den før du bruker lys eller laser for å øke lysgjennomtrengning og påfølgende reproduserbarhet av koagulering samtidig som den opprettholder en lavere laserintensitet20; Dette kan imidlertid føre til blødning i skallen og tar en god del tid under kirurgi og dyktighet til å mestre uten å skade hjernen i prosessen ved et uhell. I likhet med intensiteten økte laserstrålediameteren også infarktstørrelsen; Laserintensitet og strålediameter skalerer imidlertid ikke lineært med hensyn til hverandre, men følger ligningen, krafttetthet = lasereffekt (w)/ πr2, hvor er strålens radius. Når det gjelder bestrålingstid, fant vi ut at minst 10 minutter var nødvendig for å gi reproduserbare slag. For å øke den horisontale diameteren på det infarktet mens vi holdt den vertikale dybden konstant, brukte vi laseren på tilstøtende steder i 10 minutter hver, sekvensielt. For å adressere påvirkningen av isoflurankonsentrasjon og sirkulasjonstid for rose bengal, fant vi at 1,5% isoflurankonsentrasjon og 7 min sirkulasjon etter IP-injeksjon resulterte i konsistent dannelse av slag. Disse fem parametrene ble optimalisert for vår spesielle bruk. Vi krevde et stort nok slag for å forårsake atferdsendringer, men ikke forstyrre den subventrikulære sonen, hvor vi hadde som mål å studere effekten av materialet vårt på nevrale stamceller. I tillegg til slagstørrelse måtte vi også bestemme det optimale gelvolumet for å injisere. I det minste trengte vi nok gel til å fylle slaghulen helt fordi vi fant ut at hull mellom gel og omkringliggende vev førte til lignende resultater som kontrollgruppene våre, mens kontakt mellom gel og vev resulterte i færre reaktive astrocytter og økt cellulær infiltrasjon. Vi kom til en nedre grense på 4-6 μL gel, som ikke ga noen bivirkninger etter injisert (upubliserte data).
Når det gjelder vurdering av slagutfallet er det flere alternativer utover IHC-farging, for eksempel magnetisk resonansavbildning, atferdstester, histologisk analyse og TTC (2,3,5-triphenyltetrazoliumklorid) farging. Det anbefales på det sterkeste å bruke TTC for foreløpig optimalisering av slag på grunn av brukervennlighet og umiddelbare resultater. Tidligere atferdstesting i laboratoriet vårt har sett på sylindertest / spontan forelimb-oppgave, grid-walking-testen og pastatesten12,21. Det skal bemerkes at rotarodtesting ikke viste signifikante reduksjoner i atferdsmessige resultater etter at PT-slagmetoden ble implementert (data ikke vist). Dermed bør atferdstester vurdere svært komplekse oppgaver som krever betydelig kortikale innspill.
Her demonstrerte vi teknikken for å injisere hydrogeler etter hjerneslag uten levering av vekstfaktorer eller celler. Hydrogeler har imidlertid også blitt brukt til celletransplantasjon, samt levering av narkotika- og vekstfaktorer, og kan vise seg å være en verdifull ressurs for både å studere biologi etter hjerneslag og undersøke nye behandlingsmetoder. I forbindelse med hjerneslag har laboratoriet vårt injisert ikke-porøse hyaluronsyrehydrgeler som innkapsler induserte pluripotente stamcelleavledede nevrale stamceller14,18 ved konsentrasjoner fra 25 000 celler / μL til 50 000 celler / μL gel. Bruken av en hydrogel resulterte i en økning i celle levedyktighet og differensiering. Andre laboratorier har også rapportert celledifferensiering og økt vevregenerering som svar på hydrogeler som brukes til å transplantere stamceller etter hjerneslag 22-24. I tillegg har vi injisert hydrogeler med vekstfaktorer etter hjerneslag som fører til vevregenerering og atferdsforbedring etter hjerneslag13,14. Når det gjelder materialdesign, er injiserbarhet en verdifull funksjon som tjener til å minimere invasivitet; Derfor bør hydrogeler formuleres som enten solgeler (væske-til-fast), skjærtynning (G' > G" under statiske forhold; G" > G' under strømning), eller granulære geler som består av byggeklosser hvis diameter er mindre enn den indre diameteren på en nål12,25,26. Optimalisering bør deretter utføres for å teste diffusjon av legemidler eller vekstfaktorer, celle levedyktighet under en rekke cellekonsentrasjoner, gelforhold og injeksjonsparametere, for eksempel hastighet, nålemåler, injeksjonsdybde og injeksjonsdag i forhold til når hjerneslag ble indusert. For eksempel har dagen for materialinjeksjon variert fra en dag etter hjerneslag til, så lenge tre uker etter hjerneslag27,28. Her rapporterer vi fem dager, men har tidligere injisert syv dager etter hjerneslag ved transplantasjon av celler. Disse dagene ble valgt basert på tidslinjen for inflammatorisk respons samt toppaktiviteten til angiogenese og nevrogenese sett en uke etter hjerneslag5,29,30,31. Volumkarakterisering bør også utføres ved hvert injeksjonstidspunkt, da slagvolumet vil avta over tid på grunn av atrofi. Gitt at disse parametrene er optimalisert før injeksjon, metodene her er tilstrekkelig til å veilede brukerne til å injisere biomaterialer med tilsetning av celler og / eller vekstfaktorer og narkotika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at TS er en grunnlegger i Tempo Therapeutics, som søker å kommersialisere MAP hydrogeler.
Acknowledgments
Vi liker å anerkjenne National Institutes of Health og National Institute of Neurological Disorders and Stroke for funding (R01NS079691).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Normal Goat Serum | VWR | 100504-028 | For blocking buffer |
| 2-ply alcohol pre pad, Sterile, Medium | Medline | MDS090735 | |
| 25uL Hamilton Syringe 702RN, no needle | Fishcer Scientific | 14824663 | Syringes used to inject biomaterials |
| 25uL Positive displacement pipette | Gilson | M-25 | |
| 2x Beam Expander, 400-650nm | Thorlabs | GBE02-A | Laser beam expander |
| Adjustable Stage Platform | Kopf Instruments | 901 | |
| Anti-Glucose Transporter GLUT1 antibody, rabbit | Abcam | ab113435 | |
| Anti-Iba1 Antibody, goat | abcam | ab5076 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Sets. 25G, 12" | Medsupply | 367294 | For perfusions |
| BKF12- Matte Black Aluminum Foil | Thorlabs | BKF12 | To cover anything that is reflective when using laser. |
| Bone Iris Mini Scissors - 3-1/2" | Sklar surgical instruments | 64-2035 | |
| C57BL/6 Mice | Jackson Laboratory | 000664 | 8-12 weeks of age |
| Cage Assembly Rob | Thorlabs | ER3-P4 | 3" Long, diameter 6mm, 4 pack - for attaching laser to sterotax |
| Carbon Steel Burrs -0.5mm Diameter | Fine Science Tools | 19007-05 | For creating burr hole |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate | VWR | EM1.01036.0250 | |
| Compact Controller for pigtailed lasers | Thorlabs | CLD1010LP | |
| Cotton Swabs | VWR | 89031-288 | |
| CP 25 pipette tips | Gilson | F148012 | |
| Donkey anti-goat IgG H&L (488) | abcam | ab150129 | |
| Donkey Anti-rabbit IgG H&L (647) | abcam | ab150075 | |
| Donkey Anti-rat IgG H&L (555) | abcam | ab150154 | |
| EMS DPX Mountant | Elecron Microscopy Sciences | 13512 | Mounting solution for slides |
| EMS Gelatin Powder Type A 300 Bloom | Electron Microscopy Sciences | 16564 | For gelatin coating slides |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 45 PFA |
| ESD Worstation kit | Elmstat | WSKK5324SB | Need for setting up the laser |
| Fiber Bench Wall Plate, unthreaded | Thorlabs | HCA3 | Need for connecting laser to Kopf shaft |
| FiberPort | Thorlabs | PAF-X-5-A | FC/APC& APC, f=4.6mm, 350-700nm, diameter 0.75mm |
| Fine Scissors - straight/sharp-blunt/10cm | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| GFAP Antibody, rat | Thermo Fisher Scientific | 13-0300 | |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | For staining slides |
| IMPAC 6-Integrated Multi Patient Anesthesia Center | VetEquip | 901808 | |
| Iodine Prep Pads | Medx Supple | MED MDS093917H | |
| Jewlers Forceps #5 | GFS chemicals | 46085 | |
| Laser Safety Glasses | Thorlabs | LG10B | Amber Lenses, 35% Visible light (googles versions available too) |
| M27-1084 Powerful LED Dual Goose-neck | United Scope | LED-11C | |
| Medical USP Grade Oxygen | Airgas | OX USP250 | |
| Miltex Adson Dressing Forceps, Disecting-grade | Intefra Miltex | V96-118 | |
| Mini Cord/Cordless Small Animal Trimmer | Harvard aparatus | 72-6110 | |
| Mini-pump variable flow | Thomas Scientific | 70730-064 | Pump for perfusions |
| Mouse Brain Matrices, Coronal Slices, 1mm | Kent Scientific | RBMA-200c | For TTC slices |
| Mouse Gas Anethesia Head Holder | Kopf Instruments | 923-B | |
| Nanojet Control Box | Chemyx | 10050 | |
| Nanojet pump header | Chemxy | 10051 | Attach to stereotaxic device for injecting biomaterial |
| Needle RN 30G PT STY 3, 0.5 inch | Fishcer Scientific | NC9459562 | |
| Non-rupture ear bars 60º | Kopf Instruments | 922 | |
| PBS buffer pH 7.4 | VWR | 97062 338 | |
| Pigtaled laser 520 nm, 100mW, 5G Pin | Thorlabs | LP520-MF100 | |
| Positive charge glass slides | Hareta | AHS90-WH | |
| Power engergy meter | Thorlabs | PM100D | Used to measure your mW laser output |
| Puralube Vet Ointment | Dr. Foster Smith | 9N-76855 | |
| Rectal Probe Mouse | kopf Instruments | Ret-3-ISO | |
| Rose Bengal Dye 95% | Sigma-Aldrich | 330000-5G | |
| Shaft Modified 8-32 threaded hole 1/2" depth | Kopf Instruments | 1770-02 | For connecting laser to sterotaxic device |
| Slim photodiode power sensor | Thorlabs | S130VC | Used with power energy meter |
| SM1-Threaed 30 mm Cage Plate 0.35" thick 2 Retaining | Thorlabs | CP02 | For connecting laser expander |
| Sol-M U-100 Insuline syringe with 1/2 unit markings 0.5 mL | VWR | 10002-726 | To inject rose bengal |
| StainTray Slide Staining System | Simport Scientific | M920-2 | For staining slides |
| Sterotaxic device | Kopf Instruments | 940 | Small Animal Stereotaxic Instrument |
| Student Adson Forceps -1x2 teeth | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Student Fine Forceps - straight/broad Shanks | Fine Science Tools | 91113-10 | |
| Temperature Controller | Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR | 25608-930 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Upper Bracket Clamp | Kopf Instruments | 1770-c | For connecting laser to sterotaxic device |
| Vetbond Tissue Adhessive 3mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | |
| Vogue Professional My Manicurist | Bargin Source | 6400 | For Burrs |
| VWR Bead Sterilizers | VWR | 75999-328 | |
| Tissue Tek OCT compound | Sakura | 4583 | For tissue embeding |
References
- National Center for Health Statistics. Health, United States, 2015: With Special Feature on Racial and Ethnic Health Disparities. , U.S. Department of Health and Human Services. Hyattsville, MD. No. 2016-123 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2017 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 135 (10), 229 (2017).
- Rosamond, W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69 (2017).
- Ovbiagele, B., et al. Forecasting the future of stroke in the united states: A policy statement from the American heart association and American stroke association. Stroke. 44 (8), 2361-2375 (2013).
- Carmichael, S. T. Themes and strategies for studying the biology of stroke recovery in the poststroke epoch. Stroke. 39 (4), (2008).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx: the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3), (2005).
- Qin, L., et al. An adaptive role for BDNF Val66Met polymorphism in motor recovery in chronic stroke. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2493-2502 (2014).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinshnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Talley Watts, L., Zheng, W., Garling, R. J., Frohlich, V. C., Lechleiter, J. D. Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke. Journal of Visualized Experiments. (100), e52794 (2015).
- Tuladhar, A., Payne, S. L., Scoichet, M. S. Harnessing the potential of biomaterials for brain repair after stroke. Frontiers. 5, 14 (2018).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmicahel, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stoke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advance Materials. 29 (32), (2017).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Duel-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17, 642-651 (2018).
- Cook, D. J., et al. Hydrogel-delivered brain-derived neurotrophic factor promotes tissue repair and recovery after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37, 1030-1045 (2017).
- Lam, J., Lowry, W. E., Carmichael, S. T., Segura, T. Delivery of iPS-NPCs to the stroke cavity within a hyaluronic acid matrix promotes the differentiation of transplanted cells. Advance Functional Materials. 24, 7053-7062 (2015).
- Nih, L. R., et al. Engineered HA hydrogel for stem cell transplantation in the brain: Biocompatibility data using a design of experiment approach. Data in Brief. 10, 202-209 (2016).
- Carmichael, S. T. The 3 Rs of Stroke Biology: Radial, Relayed, and Regenerative. Neurotherapeutics. 13, 348-359 (2016).
- Caicco, M. J., Cooke, M. J., Wang, Y., Tuladhar, A., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. A hydrogel composite system for sustained epi-cortical delivery of Cyclosporin A to the brain for treatment of stroke. Journal of Controlled Release. 166 (3), 197-202 (2013).
- Moshayedi, P., et al. Systematic optimization of an engineered hydrogel allows for selective control of human neural stem cell survival and differentiation after transplantation in the stroke brain. Biomaterials. 105, 145-155 (2016).
- Lu, H., et al. Hemodynamic effects of intraoperative anesthetics administration in photothrombotic stroke model: a study using laser speckle imaging. BMC Neuroscience. 18 (10), (2017).
- Wiersma, A. M., Winship, I. R. Induction of Photothrombotic Stroke in the Sensorimotor Cortex of Rats and Preparation of Tissue for Analysis of Stroke Volume and Topographical Cortical Localization of Ischemic Infarct. Bio-protocol. 8 (10), (2018).
- Liang, H., et al. Region-specific and activity-dependent regulation of SVZ neurogenesis and recovery after stroke. PNAS. 116 (27), 13621-13630 (2019).
- Payne, S. L., Anandakumaran, P. N., Varga, B. V., Morshead, C. M., Nagy, A., Shoichet, M. S. In vitro maturation of human iPSC-derived neuroepithelial cells influences transplant survival in the stroke-injured rat brain. Tissue Engineering Part A. 24, 351-360 (2018).
- Lee, I. H., et al. Delayed epidural transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors enhances functional recovery after stroke. Science Reports. 7, 1943 (2017).
- Somaa, F. A., et al. Peptide-based scaffolds support human cortical progenitor graft integration to reduce atrophy and promote functional repair in a model of stroke. Cell Reports. 20, 1964-1977 (2017).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2016).
- Sideris, E. Y., Aaron, C. J., Carmichael, S. T., Segura, T. Hyaluronic acid particle hydrogels decrease cerebral atrophy and promote pro-reparative astrocyte/axonal infiltration in the core after ischemic stroke. bioRxiv. , (2019).
- Yu, H., et al. Combinated Transplantation of Neural Stem Cells and Collagen Type I Promote Functional Recovery After Cerebral Ischemia in Rats. The Anatomical Record. 293 (5), 911-917 (2010).
- Jin, K., et al. Transplantation of Human Neural Precursor Cells in Matrigel Scaffolding Improves Outcome from Focal Cerebral Ischemia after Delayed Postischemic Treatment in Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (3), 534-544 (2009).
- Gelderblom, M., et al. Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumulation in stroke. Stroke. 40 (5), 1849-1857 (2009).
- Wei, L., Erinjeri, J. P., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Stroke. 32 (9), 2179-2184 (2001).
- Zhang, R., et al. Activated Neural Stem Cells Contribute to Stroke-Induced Neurogenesis and Neuroblast Migration toward the Infarct Boundary in Adult Rats. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 24 (4), 441-448 (2004).
