Summary
ここでは、ガラス化されたヒト胚盤胞を温め、インビトロでの移植期間を通じてそれらを培養し、それらを単一細胞に消化し、さらなる調査のために早期の栄養芽細胞を採取する方法を説明する。
Abstract
ヒト移植、子宮表面上皮への有理および接着、およびその後の胚盤胞の母体デシドゥアへの侵入は、技術的および倫理的な制限のために歴史的に研究が困難であった重大でありながら謎めいた生物学的事象である。移植は、栄養細胞の初期に対する栄養細胞の発達と、その後の分化によって始まり、別個の栄養芽細胞サブラインに移行する。異常な早期の栄養芽細胞分化は、移植不全、胎盤病変、胎児異常、流産を引き起こし得る。最近では、ヒトの移植期間を包含する期間である母体組織がない場合、ヒト胚が13日目まで体外で受精して成長できるようにする方法が開発されている。これにより、研究者は、母親の影響を混乱させ、生体内の初期胚分化事象を研究するための固有の障害を避けることなく、この重要な期間中にヒト移植を調査し、栄養芽細胞分化のダイナミクスを再現する機会を与えました。移植時に異なる栄養芽細胞のサブラインを特徴付けるために、既存の2次元(2D)拡張培養法を採用し、下流アッセイ用の異なるタイプの栄養芽細胞を酵素的に消化および単離する手順を開発しました。2D条件で培養された胚は比較的平坦な形態を有し、生体内3次元(3D)胚アーキテクチャのモデリングにおいて最適でない可能性がある。しかし、栄養芽細胞分化は、拡張培養の過程で予想される形態および遺伝子発現の変化によって示されるように、影響を受けにくいようです。細胞トトロフォブラスト、シンクチオトロホブラスト、回遊性栄養芽細胞を含む異なる栄養芽細胞サブリニアは、サイズ、位置、および時間的出現によって分離することができ、さらなる特徴付けまたは実験に使用される。これらの初期の栄養芽細胞の調査は、ヒト移植の理解、一般的な胎盤病理の治療、および妊娠喪失の発生率の軽減に役立つ可能性がある。
Introduction
ヒト移植と初期胎盤の出現は、妊娠が臨床的に検出できないこの段階ではヒト組織にアクセスできないため、歴史的に調査することは困難であり、ほとんど知られていない。ヒトの胎盤は他のユーテリア哺乳類と比較して独自の特徴を持つため、動物モデルは不十分です。例えば、ヒト胎盤は、いくつかの栄養芽細胞が子宮筋膜の少なくとも3分の1に達し、他の細胞が子宮渦巻動脈を改造しながら、デシドゥアに深く侵入する。私たちの最も近い進化の祖先、非ヒト霊長類でさえ、胎盤形態と栄養芽細胞の相互作用の違いを母体の異形組織11、2、32,と示す。インビトロで移植前ヒト胚を得る術体は、臨床ヒト体外受精(IVF)が不妊治療のための日常的な診療として始まった1980年代まで不可能であった4。現在、ヒト胚盤胞をインビトロで増殖させて、より実行可能な胚を移動可能にし、安全な遺伝子検査を可能にすることができる。胚培養技術の改善、ならびにIVFの使用の増加は、患者の治療サイクルが完了した後も残っている多くの余剰胚盤胞を生み出した。患者の同意、IRBの承認、および一定の制限により、これらの胚盤胞は研究研究のために利用することができる。それらはヒト胚性幹細胞5の誘導に用いられた貴重な資源となっており、胚性幹細胞6、77への内細胞塊の転移を理解し、さらに最近6では、ヒト移植88,99を改造するために日(D)13まで培養に成功している。最近開発された単一細胞オミクスアプローチを利用することにより、ヒト胚組織の移植段階へのアクセスは、この非常に動的な細胞分化プロセスを調節する分子メカニズムを記述するユニークな機会を提供10,11,12,してきた。
ここでは、ヒト移植時の栄養芽細胞分化のダイナミクスを特徴づける最近の刊行物で用いる方法を説明する12.このプロトコルには、ガラス化胚盤胞の温暖化、D12ポストIVFまでの拡張胚培養、胚を単一細胞に酵素的に消化すること、および下流アッセイ用の細胞採取が含まれる(図1)。この拡張培養システムは、母親の入力なしにヒト胚発生期の培養期をサポート,し、14年前、15年、16,16年、17年前の組織学的標本からの観察と一致して出現する栄養芽細胞分化を再現する。移植中、栄養芽細胞集団は、少なくとも2つの細胞タイプで構成される:単核化前駆細胞様細胞栄養芽細胞(CTB)および末端分化された多核同期栄養芽細胞(STB)。トリプシン消化の際、CTBは、形態学的に他の細胞系語と区別がつかない小さな丸い細胞である(図2A、左パネル)。エピブラストや原始の内胚葉などの他の細胞系統からのCTBの分離は、単一細胞RNAシーケンシングによって明らかにされるそれらの明確なトランスクリプトミックプロファイルによって達成することができる。同期性TROPhoblast細胞は、他の細胞型よりも著しく大きく、主に胚の周囲に位置する不規則な形状の構造として容易に同定することができる(図2A、中間パネル;図2B、左パネル)。回遊性栄養芽細胞(MTB)は、胚拡張培養中に見られるもう一つの栄養芽細胞サブリリネージであり、胚の本体から離れて移動しているように見える(図2A、右パネル、図2B、右パネル)。遊覧栄養芽球は、余分な絨毛性トロホブラスト(EVT)と同じマーカーの多くを表現するが、胎盤の絨毛構造が開発のこの非常に初期の段階で出現していないので、EVTと呼ばれるべきではない。
実験的に、胚がD8、D10、およびD12で単一細胞に消化された後に容易に識別可能な小さなCTBおよび大きなSTBを収集することができた(図2A、B)。渡り性栄養芽細胞は、拡張胚培養の後期段階で生じ、胚全体の酵素消化の前にD12で収集することができる(図2A,B)。単一細胞解析の前にこれら3つの栄養芽細胞副系統を分けることによって、我々は特定の転写マーカーを同定し、各細胞タイプの生物学的役割を定義することができる。細胞トトロホブラストは増殖性が高く、STBおよびMTB分化系統10、11、12、13,12,を供給する前駆細胞として作用する。10,13シンクジオトロフォブラストは、妊娠を維持するために胎盤ホルモンの産生に関与し、子宮内膜10、11、12、13,11,12に巣を掘る胚の原因でもある。,13回遊性栄養芽球は、侵襲的な、回遊性表現型のさらに強い特徴を有し、子宮内膜10、11、12、13,11,12のより深く、より広範なコロニー形成を担う可能性が高い。,13各細胞型の転写シグネチャを定義した後、クラスタリング分析はまた、CTBと形態学的に区別がつかない細胞の2つの追加サブセットを明らかにし、それぞれSTBおよびMTBの特徴を有する転写体を有していた12を有する。これらの中間段階の細胞は、CTBからMTBまたはSTBのサブリニアのいずれかに分化する過程にある可能性が高く、胚が盲目的に消化され、細胞がトランスクリプトームだけで分離された場合、見落とされていたであろう。
ここで説明するプロトコルは、2次元(2D)培養系を利用しており、3次元(3D)構造開発を支持するのに最適でない可能性があり、新開発された3D培養システム13を記述する最近の刊行物で示唆されている。それにもかかわらず、この2D系では、初期の栄養芽細胞の分化は、生体内試料14、15、16、1715,16,17からの観測と一致しているようです。14このプロトコルはまた、最近説明した3D培養システム13における使用に対して、最小限の変更で容易に適応され得る。すべてのステップは、市販の使い捨てチップを備えたハンドヘルドマイクロマニピュレーションピペット、またはゴムチューブ、フィルター、マウスピースに取り付けられた細かく引っ張られたガラスピペットからの口ピペットで行われます。
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Protocol
すべてのヒト胚は、研究に使用するための同意を得て寄付されています。拡張ヒト胚培養の議定書は、西洋制度審査委員会(研究第1179872)によって承認され、国際的なガイドラインに従っている。ヒト胚の使用は、このプロトコルを使用して研究機関に関連する適切な倫理および統治機関によって見直されなければならない。
1. 準備
- 無菌層流れフードで胚の温暖化の1日前に培地と回収プレートを準備します。
- 10%v/v血清タンパク質代替(SPS)で2mLの胚盤胞培養培地(BM)を調製します。
注:胚盤胞培養培地は、タンパク質を添加して含有する場合と含まない場合があります。ここでは、示されたアルブミンタンパク質の10%を補わなければならない培地を用いた。この補給のバリエーションについては、製造元のガイダンスを確認してください。すべてのメディアは、平衡化前に滅菌シリンジに取り付けられた無菌0.22 μMフィルタを使用してフィルタリングする必要があります。 - 500 μL の胚培養グレードオイルで覆われた 10% v/v SPS で、2 つのセンターウェル臓器培養洗浄皿に BM 500 μL を充填します。
- 60mmの組織培養皿では、胚培養油の層8 mLを、培養プレートの底に10%v/v SPSでBMの20μL滴を固定する。温めた胚ごとに1滴を作ります。
メモ:必要に応じて、メディア、ドロップ、洗い物を増やしてください。油を重ねる前に、滴を皿に加えてもよい。油の下に滴を固定することは蒸発およびオスモルのそれ以降の変化を減らすのに役立つ。 - BMを37°Cのインキュベーターで10%v/v SPS洗浄皿と回収プレートと平衡化し、6%CO2、5%O2を少なくとも4時間分のインキュベーターで洗浄します。2
- 拡張培養培地(IVC1)の第1工程のバイアルを4°Cまたはベンチトップに解凍します。
- オイルオーバーレイなしでIVC1の500 μLの1つの洗浄皿を準備します。アリコート約4 mLのIVC1を5mLスナップキャップチューブにします。
- IVC1洗浄皿とIVC1の小型スナップキャップチューブを37°C、6%CO2、大気O2を少なくとも42時間平衡化する。
- 10%v/v血清タンパク質代替(SPS)で2mLの胚盤胞培養培地(BM)を調製します。
- 無菌層流れフードで胚の温暖化の1日前に拡張培養プレートを準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でヒト血清から30μg/mLにシブロネクチンを希釈。250 μL の 30 μg/mL フィブロネクチン 1 胚あたりは、チャンバーをコーティングする必要があります。
- 井戸に触れないように気をつきながら、ボンネットの下に8ウェルチャンバーカバースリップパッケージを開きます。ピペット250μLの30μg/mLフィブロネクチンを各ウェルにそっと入れ込みます。
- 蓋をチャンバーカバースリップに戻し、4°Cに20〜24時間置きます。
- 胚の温暖化の朝に拡張培養プレートを準備します。
- フィブロネクチンでチャンバーカバースリップを取り出し、ラミナーフローフードに入れます。フィブロネクチン混合物を1 mLピペットで取り除き、廃液容器に捨てます。
- 小さい5 mLのスナップキャップの管から温め、平衡化されたIVC1メディアを取り出す。
- 平衡化されたIVC1のピペット300 μLを各ウェルに入れます。汚れのリスクが高まるので、液体が蓋に触れないように注意してください。
- IVC1でチャンバーカバースリップを戻し、ステップ4で透明帯を除去するまで37°C、6%CO2、大気O2でインキュベートします。2,
2. ガラス化D5ヒト胚の温暖化
注: 他のメーカーは、独自のガラス化技術に応じて、わずかに異なるプロトコルを持っている可能性があります。該当する場合は、製造元のマニュアルを参照してください。
- 35mm皿で3.0mLの解凍液(TS)を37°Cに温めます。 300 μL の希釈液 (DS) と 300 μL の洗浄液 (WS) 2 つのウェルを 6 ウェルプレートに室温に入れます。
- 鉗子を使用して、慎重に凍結装置の袖を取り外し、ガラス化胚が常に液体窒素の下に残っていることを確認する。
- 液体窒素から迅速にクライオ装置を移動し、37°CでTSでクライオデバイスの先端を突き落とします。 1分間タイマーを設定し、胚がTSに切り離されるまでクライオデバイスを水没させ続けます。
注:温かい胚は、下流の分析における患者の人口統計情報に関連する可能性があるため、胚の同一性を追跡するために一度に1つずつ。 - TSの1分インキュベーション中に、慎重にクライオデバイスを取り外し、胚をそっと拾い、TS皿の反対側に移動します。
注:複数の胚を培養する場合は、適切なアイデンティティが維持されるように胚を別々に保つために勤勉である。 - 1分後、少量のTS(約2μL)でゆっくりと胚を拾います。胚をピペットからTSの薄い層で覆いながら、胚を300μL DSの底によく動かします。タイマーを3分間セットし、6ウェルプレートを室温でベンチトップに置きます。
- 3分後、少量のDS(約2μL)で胚をピックアップし、300μLのWSを含む次のウェルの底に胚を移動します。繰り返しますが、胚の上にピペットから少量のDSを穏やかに重ねます。5分間タイマーを設定し、ベンチトップに戻ります。
- 5分後、最小量のWSで胚を拾い上げ、300 μL WSの最終ウェルの一番上に移動します。胚はゆっくりと落下し、WSを通って底まで洗います。保持された WS をピペットから空の井戸に排出します。
- 最小の容積で胚を拾い、WSの同じ300 μLの井戸の上に戻る。胚は再び井戸の底に落ちるでしょう。タイマーを1分間セットし、6ウェルプレートをベンチトップに戻します。
3. 温められた胚の回復
- 温めた胚を、500μLの平衡型胚培養グレードオイルの500μL下に10%v/v SPSで平衡型のBMの500 μLを含む中ウェル臓器組織皿に移動させます。
- 各胚を拾い、移動の間に古い媒体を吹き飛ばしながら、皿の中のいくつかの領域にそれらを移動することによって胚を洗います。胚をピックアップし、油の下で10%のv /v SPSと平衡化されたBMの個々の20 μL培養液の低下に移動させる。
- 温めた胚を37°Cのインキュベーターで2時間回収させ、6%CO2、5%O2 を得た。
4. ゾナ除去
- 2時間の回復後、胚の再拡張を評価し、各胚の写真を撮る。
- 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝用培地の500 μLで胚を個別に移動させ、酸性タイローデの溶液で処理する前に5%(v/v)胎児子牛血清(FCS)を用いた。
- 顕微鏡を積極的に見ながら、300μLの温めた酸性タイローデの溶液を通して1つの胚を素早く動かします。透明帯は視覚的に溶解し始めます。これには約5sかかります。
- すぐに溶解したソナを含む胚を300 μLの温められたMOPS緩衝媒体に移し、酸タイローデの溶液を急いで止めます。
- MOPS緩衝培地の最小体積で胚を、500μL以下の平衡胚培養グレードオイルの500μL以下の10%v/v SPSを有する平衡型BMの500μLを含むセンターウェル臓器組織皿に移して洗浄する。
- ステップ3.2から20μLの回収降下に胚を戻します。
注:ゾナ除去後の目視検査の際、透明帯を保持している胚は、必要に応じて酸性タイローデの溶液でさらに処理され、ステップ4.2〜4.6を繰り返す。タイローデの溶液への暴露を最小限に抑えるのが望ましい。
5. 胚盤胞拡張培養
- ステップ1.1.6から平衡化されたIVC1培地で、胚を洗い皿に個別に移動します。1つの胚を平衡化されたIVC1でチャンバーカバースリップの1つの井戸に慎重に移動し、胚の識別を維持する。
注: この手順は、中程度の蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ早く完了する必要があります。 - チャンバーカバースリップを37°C、6%CO2、大気中O2に2日間セットしたインキュ2ベーターに戻します。
注:37°C、6%CO2、大気中O2でメディア交換4時間前に解凍して平衡2化してください。 - 成長D2(受精後D7)では、顕微鏡下で胚の付着を注意深く調べ、培地交換を行う。
- メディアを交換する前に、どの胚が皿に取り付けられているかをメモします。プレートを軽くタップし、胚が顕微鏡下のプレートにしっかりと付着しているかどうかを調べます。
- 蓋を外し、IVC1の150μLを慎重に取り除き、取り付けられた胚を邪魔することなく廃棄します。胚がまだプレートに付着していない場合は、IVC1の血清が胚の付着に役立つため、培地を交換しないでください。
- 平衡化された拡張培養培地のピペット150μL、IVC2は、各ウェルにゆっくりと入り、蓋をチャンバーカバースリップに戻す。
注:チャンバーカバースリップから蓋を取り外して、中程度の蒸発を避けるようにしてください。
- 蓋にメディアをはねずにチャンバーカバースリップを慎重に戻します。胚が固定または単一細胞消化の準備が整うまで、拡張培養の毎日のメディア交換と添付ファイルチェックを繰り返します。
6. 使用済みメディアのコレクション (オプション)
- 必要に応じて、D7後またはその日の後に培養メディアの交換中に使用済みメディアを収集します。ステップ5.3.2の間に、除去されたIVC1の150 μLを無菌、低結合の0.5 mLチューブに廃棄して将来の分析を行う代わりに。
7. 免疫蛍光の任意固定
- 200 μL ピペットを使用して、細胞外の破片を除去するために、3x の PBS の 1/2 メディア交換で胚を洗浄します。過剰な破片やタンパク質を洗い流すと、蛍光を用いて得られた画像の明瞭度を最適化し、背景を減らすことができます。
- すべての媒体を取り出し、PBS内の200μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)をウェルにゆっくりと加えます。胚は流体の表面に固執したいと思うでしょう。すべての流体を除去する前に4%PFAで150 μLの複数の150 μLのスリーチは、胚への損傷を最小限に抑えるのに役立ちます。
- 固定のために20分間4%PFAで胚をインキュベートする。
- 新鮮なPBSで200 μLの0.1%vのポリソルベート20で、1回の洗浄につき10分間、胚3倍を洗浄します。
- 固定胚を4°CでPBSに0.1%v/vポリソルベート20で保存してから、免疫蛍光プロトコルを使用します。
8. トリプシンを用いて単細胞消化
注:新鮮な(固定されていない)胚は、単一細胞消化に使用されます。
- 200 μLのPBSで胚を1回洗い、各ウェルに200 μLのトリプシン溶液を加えます。チャンバーカバースリップをインキュベーターに5分間戻します。
- チャンバーカバースリップをインキュベーターから取り外し、ステレオスコープ下の胚を調べます。胚の周囲の細胞は引き込み始め、MTBは依然として胚から遠隔に位置するプレートに取り付けられるべきである。
- 小さなピペットまたは細かく引っ張られた口のピペットを使用して、胚全体を分解する前に個々のMTBを拾います。ステップ 9.1 に進んで MTB を保存し、ステップ 9.3 の後にステップ 8.4 に戻ります。
- ハンドヘルドマイクロマニピュレーションピペットまたは口ピペットを使用して、上下に吸引することによって胚を優しく解きそめます。
- 細胞は胚全体から解離し始める。トリプシンで合計10分間インキュベートされるまで、小径のピペットチップまたは口ピペットを使用して、胚を穏やかに繰り返し吸引し続けます。
9. 単一セル選択とサンプルコレクション
- 最小限のトリプシンで、解離した細胞を20μL PBS+0.1%ポリビニルピロリドン(PVP)の3滴の洗浄液を介して、細胞を失わないように注意して胚培養油の下で移動させます。
- 細胞を洗浄した後、細かく引っ張られたガラスピペットを使用して1つのセルを選択します。PBS+0.1%PVPの最小容量の無菌0.2 mL低結合チューブに慎重に単一の細胞をピペット。
- 液体窒素(LN2)で単一細胞を凍結し、将来の使用のために-80 °Cで保存します。
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Representative Results
健康な胚は、拡張培養の過程で増殖を続けた(図2B)。異常な胚は外縁から後退し、崩壊し始めた(図2C)。我々の経験から、胚の約75%がフィブロネクチンコーティング皿の底に48時間で付着し、その付着物は培養で約90%増の72時間となった。胚の付着の成功は、胚盤胞の初期品質によって大きく影響を受ける可能性があります。72時間までに付着していない胚は生き残らない可能性が高い。
D8受精後(D3の拡張培養)において、胚の大部分の細胞は、トトロホブラストマーカーGATA3に陽性であったCTBであった(図3A)。細胞栄養芽細胞は、すでに胚の周囲に多核STBに分化し始めていた(図2B、左パネル、点線)。これらのSTBはシート状の外観を持ち、ヒト絨毛性ゴナドトロピンサブユニットβ(hCGB;) 図3A、センターパネル)。胚はD8とD10の間で急速に成長し、この期間中にCTBの急速な細胞増殖を示唆した。D10では、CGB陽性MTBの形成は最大であり、この時点でのhCG産生の盛り上がりによって確認できた(図3B)。回遊性栄養芽細胞も出現し、胚体から離れ、EVTマーカーHLA-G(図3A、右パネル)に陽性染色された。D12によって、STB分化は減少し、MTB産生はより顕著になり、D10のホルモン産生からD12の細胞遊泳への重点のシフトを示唆した。これらの変化は、この移植期の間に得られたタイムラプスビデオ(Movie 1)によって観察された。当社の単一細胞RNAシーケンシングデータは、細胞機能の動的変化も反映しています。これらのデータは一緒に、早期の栄養芽細胞分化を示唆し、早期胎盤の出現は動的プロセスであり、その間、胚は非常に特定の時点で高度に特殊化された細胞機能を優先して移植を成功させることができる。
図 1: 拡張培養および単一細胞サンプル収集の手順図。
地球温暖化性ガラス化胚、透明体除去、拡張胚培養、酵素消化、細胞トトロフォ芽細胞(CTB)、シンジトロホブラスト(STB)、および回遊性トロフォブラスト(MTB)の分離。この図は、西ら12から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:拡張培養中の栄養芽細胞および胚の形態
(A) トリプシンによる酵素消化後の異なる栄養芽細胞タイプの代表的な画像。左側に小さなCTB、中央に大きなSTB、右にMTB。(B) D8(左)、D10(中央)、D12(右)における健康胚の代表的な画像。左パネルの破線は、おそらく増殖性のCTB集団を概説し、点線は平坦化されたSTBを概説する。右パネルのピンクの円は、胚から遠隔に位置していたMTBをアウトラインします。(C)D8(左)、D10(中央)、D12(右)で退避し始める異常胚の代表的な画像。Cスケールバー= 200 μm。いくつかの画像は、西ら12から適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:拡張培養中の栄養芽細胞マーカー発現及びhCG産生の代表的な画像。
(A)D10におけるCTBマーカーGATA3の発現を示す胚の代表的な免疫蛍光画像(左)、D10でのSTBマーカーCGB(中央)、およびD12でのMTBマーカーHLA-G(右)。Aスケールバー= 200 μm(B) D8からD12までの拡張培養の過程における代表的なhCG濃度(mIU/mL)(平均±SEM、n = 3)。統計解析は、一方向 ANOVA を使用した後、Tukey の検定 (P < 0.05) を使用して行いました。これらの画像は、西ら12から適応されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:D8からD12までの拡張培養におけるヒト胚のタイムラプスビデオ。 ビデオは、ブラストコアエルの崩壊、STBの形成(緑の円で示される)、そしてMTBの最終的な分化と移行(オレンジ色の円で示される)を示しています。これは西ら12.から適応されている。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
移植を通じてヒト胚を培養するプロトコルの開発は、科学者が開発88、9で未知の時間を探求することを可能にしました。ここでは、ヒト胚を培養し、絨毛胎盤の形成前に早期の栄養芽細胞分化を研究するために拡張培養システムを使用する。ここで説明する方法により、下流の単一細胞解析で使用するために異なる結核サブリネーを収集することができます。この研究は、科学界が人間の発達におけるこの重大かつ謎めいた期間を理解する機会を与え、流産や子癇前症などの他の胎盤病理の治療の新しい機会を開くだけでなく、初期の人間の発達に関する新しい洞察を提供するかもしれない。
このプロトコルは、胚の温暖化、ゾナ除去およびめっきの間に胚を迅速に操作するスキルを必要とし、拡張培養前の胚ストレスを最小限に抑える。メディア交換時の露光時間を制限することで、メディアの蒸発を最小限に抑え、媒体の浸透量を増やしていくことは必須です。媒体を交換し、皿を動かすときに適切な無菌技術を使用するように注意することは、汚染を最小限に抑えるのに役立ちます。胚が付着した後の機械的障害を最小限に抑えるために使用時に皿を安定させることも重要である。ストレスを受ける胚は、同期的な突起を後退させ始め、アポトースを始める。また、培養培地の半月板が胚の表面に触れることを避け、井戸内の油を最小限に抑えることが重要です。これらのシナリオのどちらかが胚を破壊する可能性があります。
胚盤胞期を越えてヒト胚を培養することは、急速に進化する分野である。最近の研究13 は、細胞外マトリックスタンパク質混合物の10%とピルビン酸ナトリウム、乳酸塩、およびrho-関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤の追加補充を含む新しい培養系が、生体内3D胚性アーキテクチャのモデリングにおいて有利であり、ここで説明される拡張培養系と比較して、培養の後の段階で有意に実行可能な胚を生じさせることを実証した。再現性を実証するために、この新しいシステムの検証が必要になります。ここで説明する手順は、この新しい3Dシステムにわずかな変更を加えて適応することができ、したがって、この分野における方法論の進歩に利益をもたらす可能性があると考えています。
このプロトコルは、IVF培養メディアの最適化に関する調査を可能にするためにも適応され得る。我々は最近、マウスにおいて、拡張培養中の胚発生が胚移植18後の胎児の発達の成功を予測するかもしれないことを示した。3つの前核(PN)を有する異常に受精し、廃棄されたヒト接合体は、拡張培養中に発達に影響を及ぼす可能性のある異なる条件でD5上で胚盤胞に培養することができる。寄付されたD5ヒト胚盤胞は、パフォーマンス評価のために拡張培養システムに入れられる前に、新しい条件で48時間培養することができる。エピブラスト細胞数、総細胞数、成長領域、およびhCGの定期的な測定により、異なる培養培地条件がヒトの移植前胚の発達を改善し、移植後の成功に影響を与える方法をよりよく理解することができました。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
コロラド生殖医学センター(CCRM)の多くの患者が、研究のために胚を優雅に寄付したことを認めたいと思います。また、カレン・マルニアックとCCRMの臨床検査室に対し、hCGサンプルの処理に協力してくれたことに感謝し、CCRMのスー・マコーミックと彼女の臨床IVF発生学チームは、胚の収集、保管、追跡、寄付に協力してくれたことに感謝します。資金はCCRMによって内部的に提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
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