Summary
Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.
Abstract
Menselijke implantatie, de apposition en hechting aan het baarmoederoppervlak epithelia en de daaropvolgende invasie van de blastocyst in de moeder decidua, is een kritische maar raadselachtige biologische gebeurtenis die historisch moeilijk te bestuderen als gevolg van technische en ethische beperkingen. Implantatie wordt geïnitieerd door de ontwikkeling van het trophectoderm tot vroege trofoblast en de daaropvolgende differentiatie in verschillende trofoblast sublineages. Afwijkende vroege trofoblast differentiatie kan leiden tot implantatie falen, placentapathologieën, foetale afwijkingen, en miskraam. Onlangs zijn methoden ontwikkeld om menselijke embryo's te laten groeien tot dag 13 na de bevruchting in vitro bij afwezigheid van moederweefsels, een periode die de implantatieperiode bij de mens omvat. Dit heeft onderzoekers de mogelijkheid gegeven om menselijke implantatie te onderzoeken en de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens deze kritieke periode samen te vatten zonder moederinvloeden te verwarren en inherente obstakels te vermijden om vroege embryodifferentiatiegebeurtenissen in vivo te bestuderen. Om verschillende trofoblast sublinages te karakteriseren tijdens implantatie, hebben we bestaande tweedimensionale (2D) uitgebreide kweekmethoden aangenomen en een procedure ontwikkeld om verschillende soorten trofoblastcellen enzymatisch te verteren en te isoleren voor downstream-testen. Embryo's gekweekt in 2D-omstandigheden hebben een relatief afgeplatte morfologie en kunnen suboptimaal zijn in het modelleren in vivo driedimensionale (3D) embryonale architecturen. Echter, trofoblast differentiatie lijkt minder worden beïnvloed, zoals blijkt uit de verwachte morfologie en genexpressie veranderingen in de loop van de uitgebreide cultuur. Verschillende trofoblast sublineages, met inbegrip van cytotrophoblast, syncytiotrophoblast en trekkende trofoblast kan worden gescheiden door grootte, locatie, en temporele opkomst, en gebruikt voor verdere karakterisering of experimenten. Onderzoek van deze vroege trofoblastcellen kan een instrument zijn om menselijke implantatie te begrijpen, gemeenschappelijke placentapathologieën te behandelen en de incidentie van zwangerschapsverlies te verzachten.
Introduction
Menselijke implantatie en de opkomst van de vroege placenta zijn historisch moeilijk te onderzoeken en blijven grotendeels onbekend omdat menselijke weefsels ontoegankelijk zijn in dit stadium wanneer de zwangerschap klinisch niet op te sporen is. Diermodellen zijn ontoereikend, omdat menselijke placentatie zijn eigen unieke eigenschappen heeft in vergelijking met andere eutherische zoogdieren. Bijvoorbeeld, menselijke placenta binnendringt diep in de decidua met een aantal trofoblastcellen het bereiken van ten minste het binnenste derde van de baarmoeder myometrium, terwijl andere cellen remodelleren de baarmoeder spiraalslagaders. Zelfs onze naaste evolutionaire voorouders, de niet-menselijke primaten, vertonen verschillen in placentamorfologie en trofoblast interacties met de moederdeciduele weefsels1,,2,3. Het verkrijgen van pre-implantatie menselijke embryo's in vitro was niet mogelijk tot in de jaren 1980 toen klinische menselijke in vitro fertilisatie (IVF) begon als een routinepraktijk voor de behandeling van onvruchtbaarheid4. Nu kunnen menselijke blastocysten in vitro worden gekweekt om de selectie van meer levensvatbare embryo's voor overdracht mogelijk te maken, evenals veilige genetische tests mogelijk te maken. Verbetering van de embryocultuur technieken, evenals het toenemende gebruik van IVF heeft geleid tot veel overtollige blastocysten die overblijft na de behandeling van de patiënt cycli zijn voltooid. Met toestemming van de patiënt, IRB goedkeuring, en met bepaalde beperkingen, kunnen deze blastocysten worden gebruikt voor onderzoeken. Ze zijn uitgegroeid tot een onschatbare hulpbron die werden gebruikt voor de afleiding van menselijke embryonale stamcellen5, inzicht in de overgang van de innerlijke celmassa naar embryonale stamcellen6,7, en meer recentelijk, zijn met succes gekweekt tot dag (D) 13 om menselijke implantatie te verbouwen8,9. Door gebruik te maken van recent ontwikkelde eencellige omics benaderingen, heeft de toegang tot deze implantatiefase menselijke embryoweefsels unieke mogelijkheden geboden om de moleculaire mechanismen te beschrijven die dit zeer dynamische celdifferentiatieproces reguleren, dat voorheen onmogelijk was om10,11,12,13te verkennen .
Hier beschrijven we de methoden die in onze recente publicatie worden gebruikt en karakteriseren we de dynamiek van trofoblastdifferentiatie tijdens menselijke implantatie12. Dit protocol omvat de opwarming van verglaasde blastocysten, uitgebreide embryocultuur tot D12 na IVF, enzymatische vertering van het embryo in enkele cellen en celverzameling voor downstream-tests(figuur 1). Dit uitgebreide kweeksysteem ondersteunt de ontwikkeling van peri-implantatiefase menselijke embryo's zonder maternale input en recapituleert trofoblastdifferentiatie die in overeenstemming lijkt met de waarnemingen van histologische specimens vele jaren geleden14,15,16,17. Tijdens de implantatie bestaat de trofoblastpopulatie uit ten minste twee celtypen: de mononucleated progenatorachtige cytotrophoblast (CTB) en de terminaal gedifferentieerde, multinucleated syncytiotrophoblast (STB). Bij trypsine spijsvertering, de CTB zijn kleine, ronde cellen die morfologisch niet te onderscheiden zijn van andere cellijnen (Figuur 2A, linker paneel). Scheiding van CTB van andere cellijnen, zoals epiblast en primitief endoderm, kan worden bereikt door hun verschillende transcriptomische profielen onthuld door single cell RNA sequencing. Syncytiotrophoblastcellen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd als onregelmatige gevormde structuren die aanzienlijk groter zijn dan de andere celtypen en zich voornamelijk bevinden aan de periferie van het embryo(figuur 2A, middenpaneel; Figuur 2B, linkerpaneel). Trekkende trofoblastcellen (MTB) zijn een andere trofoblast sublineage gevonden tijdens embryo uitgebreide cultuur en kan worden herkend als schijnbaar weg van het hoofdlichaam van het embryo (Figuur 2A, rechter paneel, Figuur 2B, rechter paneel). Migrerende trofoblast, hoewel het uitdrukken van veel van dezelfde markers als extra villous trofoblast (EVT), mag niet worden aangeduid als EVT, omdat de villous structuren in de placenta niet zijn ontstaan in dit zeer vroege stadium van ontwikkeling.
Experimenteel konden we kleine CTB en grote STB verzamelen die gemakkelijk te onderscheiden zijn nadat embryo's zijn verteerd tot enkele cellen bij D8, D10 en D12(figuur 2A,B). Trekkende trofoblasten ontstaan in de latere stadia van uitgebreide embryocultuur en kunnen bij D12 worden verzameld vóór enzymatische vertering van het hele embryo (figuur 2A,B). Door feotisch deze drie trofoblast sublineages te scheiden voor eencellige analyse, kunnen we specifieke transcriptomische markers identificeren en de biologische rol van elk celtype definiëren. Cytotrophoblast zijn zeer proliferative en fungeren als voorloper cellen in de levering van de STB en MTB gedifferentieerde afstammingen10,11,12,13. Syncytiotrophoblast zijn betrokken bij de productie van placentahormonen om de zwangerschap te handhaven en kan ook verantwoordelijk zijn voor de embryo's graven in het endometrium10,11,12,13. Trekkende trofoblast heeft nog sterkere kenmerken van een invasief, migrerend fenotype en zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor een diepere en uitgebreidere kolonisatie van het baarmoeder- endometrium10,11,12,13. Na het definiëren van de transcriptomische handtekening van elk celtype, clustering analyses hebben ook twee extra subsets van cellen die morfologisch niet te onderscheiden van CTB en had transcriptomen met kenmerken van STB en MTB, respectievelijk12. Deze tussenstadiumcellen zijn waarschijnlijk in het proces van het differentiëren van CTB aan of de sublineages MTB of STB en zouden over het hoofd gezien zijn als de embryo's blind werden verteerd en de cellen door transcriptoom alleen werden gescheiden.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van een tweedimensionaal (2D) cultuursysteem en is mogelijk niet optimaal voor het ondersteunen van driedimensionale (3D) structurele ontwikkeling, zoals wordt gesuggereerd door een recente publicatie waarin een nieuw ontwikkeld 3D-cultuursysteem13wordt beschreven. Niettemin lijkt de differentiatie van vroege trofoblast in dit 2D-systeem in overeenstemming te zijn met waarnemingen van in vivo specimens14,15,16,17. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik in het onlangs beschreven 3D-cultuursysteem13 met minimale wijzigingen. Alle stappen worden uitgevoerd met een handheld micromanipulatie pipet met commercieel verkrijgbare wegwerptips of een mondpipet van een fijn getrokken glazen pipet aan rubberen buizen, een filter en een mondstuk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke embryo's zijn gedoneerd met toestemming voor gebruik in onderzoek. Protocollen voor uitgebreide menselijke embryocultuur zijn goedgekeurd door de Western Institutional Review Board (studie nr. 1179872) en volgen internationale richtlijnen. Elk gebruik van menselijke embryo's moet worden beoordeeld door de juiste ethische en bestuursorganen die aan de onderzoeksinstelling zijn gekoppeld aan het gebruik van dit protocol.
1. Voorbereiding
- Bereid media en herstelplaten een dag voor de opwarming van het embryo in een steriele laminaire stroomkap voor.
- Bereid 2 mL blastocyst cultuurmedia (BM) voor met 10% v/v serumeiwitvervanger (SPS).
OPMERKING: Blastocyst cultuur media kunnen al dan niet bevatten toegevoegd eiwit. Hier gebruikten we een medium dat moet worden aangevuld met 10% van de aangegeven albumine eiwit. Controleer de richtlijnen van de fabrikant voor variatie in deze suppletie. Alle media moeten worden gefilterd met behulp van een steriel 0,22 μM-filter dat vóór evenwicht aan een steriele spuit is bevestigd. - Vul twee centrum-goed orgaancultuurwasgerechten met 500 μL BM met 10% v/v SPS bedekt met 500 μL embryo kweekkwaliteit olie.
- In een 60 mm weefselkweekschotel, laag 8 mL embryocultuurolie en veranker vervolgens 20 μL druppels BM met 10% v/v SPS aan de onderkant van de kweekplaat. Maak 1 druppel voor elk embryo opgewarmd.
LET OP: Meer media, druppels en afwasschotels kunnen worden gemaakt als dat nodig is. Druppels kunnen ook worden toegevoegd aan de schotel voordat de olie is gelaagd. Verankering druppels onder de olie zal helpen verminderen verdamping en eventuele latere veranderingen in osmolaliteit. - Equilibrate BM met 10% v/v SPS wasschotels en herstelplaat in een couveuse bij 37 °C, 6% CO2, 5% O2 voor ten minste 4 uur.
- Ontdooi een flesje van de eerste stap van uitgebreide cultuurmedia (IVC1) in 4 °C of op de bank.
- Bereid een wasschaal van 500 μL IVC1 zonder olieoverleg. Aliquot ongeveer 4 mL van IVC1 in een 5 mL snap cap buis.
- Equilibrate IVC1 wasschaal en kleine snap cap buis van IVC1 in 37 °C, 6% CO2, en atmosferische O2 voor ten minste 4 uur.
- Bereid 2 mL blastocyst cultuurmedia (BM) voor met 10% v/v serumeiwitvervanger (SPS).
- Bereid uitgebreide kweekplaten een dag voor de opwarming van het embryo in een steriele laminaire stroomkap.
- Verdun fibronectine uit menselijk serum in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 30 μg/mL. 250 μL van 30 μg/mL fibronectine per embryo is nodig om de kamers te coaten.
- Open de 8 goed chambered coverslip pakket onder de motorkap, terwijl het verzorgen van niet aan te raken de putten. Voorzichtig pipette 250 μL van 30 μg/mL fibronectin in elke put.
- Breng het deksel terug naar de chambered coverslip en plaats in 4 °C voor 20-24 uur.
- Bereid uitgebreide cultuurplaat voor in de ochtend van het opwarmen van het embryo.
- Haal de chambered coverslip met fibronectin en plaats in laminaire stroom kap. Verwijder het fibronectinemengsel met een pipet van 1 mL en gooi het weg in de afvalcontainer.
- Haal opgewarmde, geëquilibreerde IVC1-media uit kleine 5 mL snap cap buis.
- Pipette 300 μL van geëquilibreerde IVC1 in elke put. Zorg ervoor dat er geen vloeistof het deksel raakt, omdat dit het risico op besmetting verhoogt.
- Breng de chambered coverslip met IVC1 terug om in 37 °C, 6% CO2 en atmosferische O2 in te broeden tot verwijdering van de zona pellucida in stap 4.
2. Opwarming van de verglaasde D5 menselijke embryo's
OPMERKING: Andere fabrikanten kunnen iets verschillende protocollen hebben volgens hun eigen vitrification-technologie. Zie de gebruiksaanwijzing van de fabrikant voor gebruik indien van toepassing.
- Warme 3,0 mL ontdooiingsoplossing (TS) in 35 mm schotel tot 37 °C. Breng 300 μL verdunningsoplossing (DS) en twee putten van 300 μL wasoplossing (WS) in een 6 putplaat op kamertemperatuur.
- Verwijder met behulp van tangen de hoes van het cryo-apparaat voorzichtig en zorg ervoor dat het verglaasde embryo altijd onder vloeibare stikstof blijft.
- Verplaats het cryo-apparaat snel uit vloeibare stikstof en stort de punt van het cryo-apparaat in TS bij 37 °C. Stel een timer in voor 1 min en houd het cryo-apparaat ondergedompeld totdat het embryo loskomt in de TS.
OPMERKING: Warme embryo's één voor één om embryo-identiteiten bij te houden, aangezien deze betrekking kunnen hebben op demografische gegevens van patiënten in downstream-analyse. - Verwijder tijdens de incubatie van 1 min in TS voorzichtig het cryo-apparaat en pak het embryo voorzichtig op en beweeg naar de andere kant van de TS-schotel.
OPMERKING: Als het kweken van meerdere embryo's, ijverig om embryo's gescheiden te houden om ervoor te zorgen dat de juiste identiteiten worden gehandhaafd. - Na 1 min, pak het embryo voorzichtig op met een kleine hoeveelheid TS, ongeveer 2 μL. Verplaats het embryo naar de bodem van de 300 μL DS goed terwijl u het embryo bedekt in een dunne laag TS van de pipet. Stel een timer in voor 3 minuten en plaats de 6-put plaat op de bank op kamertemperatuur.
- Na 3 min, pak het embryo op met een kleine hoeveelheid DS, ongeveer 2 μL, en verplaats het embryo naar de bodem van de volgende put met 300 μL WS. Nogmaals, voorzichtig laag een kleine hoeveelheid DS van de pipet over het embryo. Stel een timer in voor 5 minuten en keer terug naar de bank.
- Na 5 minuten, pak het embryo met een minimaal volume van WS en ga naar de top van de laatste put van 300 μL WS. Het embryo zal langzaam vallen en wassen door de WS naar de bodem. Verdrijft alle bewaarde WS uit de pipet in een lege put.
- Pak het embryo met minimaal volume en keer terug naar de top van dezelfde 300 μL put van WS. Het embryo zal opnieuw op de bodem van de put vallen. Stel een timer in voor 1 min en breng de 6-put plaat terug naar de bovenkant van de bank.
3. Herstel van verwarmde embryo's
- Verplaats verwarmde embryo's één voor één in een orgaanweefselschotel met 500 μL geëquilibrated BM met 10% v/v SPS onder 500 μL van geëquilibreerde embryokweekolie.
- Was embryo's door het oppakken van elk embryo en verplaatsen ze rond naar verschillende gebieden in de schotel, terwijl het uitblazen van oude media tussen bewegingen. Pak het embryo op en verplaats het naar een individuele 20 μL cultuurdaling van geëquilibreerde BM met 10% v/v SPS onder olie.
- Laat de opgewarmde embryo's 2 uur terugwinnen in een couveuse bij 37 °C, 6% CO2, 5% O2.
4. Zona verwijdering
- Na een herstel van 2 uur, beoordeel embryo's voor heruitbreiding en maak foto's van elk embryo.
- Verplaats embryo's individueel in 500 μL van een 3-(N-morpholino)-propaanzuur (MOPS)-gebufferd behandelingsmedium met 5% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS) voorafgaand aan de behandeling met zure Tyrode's oplossing.
- Beweeg een embryo snel door 300 μL van opgewarmde zure Tyrode's oplossing terwijl actief kijken door de microscoop. De zona pellucida zal visueel beginnen op te lossen. Dit duurt ongeveer 5 s.
- Verplaats het embryo met oplossende zona onmiddellijk in 300 μL van opgewarmd MOPS gebufferd medium om de oplossing van de zure Tyrode te doven.
- Verplaats het embryo met minimaal volume MOPS gebufferd medium in een centrum-goed orgaanweefselschotel met 500 μL geëquilibreerde BM met 10% v/v SPS onder 500 μL van geëquilibreerde embryo kweekkwaliteit olie te wassen.
- Breng het embryo terug naar de hersteldaling van 20 μL vanaf stap 3.2.
OPMERKING: Na visueel onderzoek na zona-verwijdering kunnen embryo's met behouden zona pellucidae indien nodig verder worden behandeld met de oplossing van zure Tyrode, door stap 4.2-4.6 te herhalen. Het minimaliseren van de blootstelling aan de oplossing van de Tyrode is gewenst.
5. Blastocyst uitgebreide cultuur
- Verplaats de embryo's individueel naar de wasschaal met geëquilibreerde IVC1-media vanaf stap 1.1.6. Beweeg zorgvuldig één embryo aan één goed van de chambered coverslip met geëquilibreerde IVC1 en behoudt embryoidentificatie.
LET OP: Deze stap moet zo snel mogelijk worden voltooid om gemiddelde verdamping te minimaliseren. - Retourkappenlip naar een couveuse van 37 °C, 6% CO2, atmosferische O2 gedurende 2 dagen.
LET OP: Zorg ervoor dat u media ontdooit en in evenwicht houdt in 37 °C, 6% CO2, atmosferische O2 voor de media-uitwisseling 4 uur van tevoren. - Bij uitgroei D2 (D7 post bevruchting), zorgvuldig onderzoeken van de gehechtheid van embryo's onder de microscoop en voeren media-uitwisseling.
- Let op welk embryo aan de schotel is bevestigd voordat u media uitwisselt. Tik voorzichtig op de plaat en controleer of een embryo stevig aan de plaat onder de microscoop is bevestigd.
- Verwijder het deksel en verwijder voorzichtig 150 μL IVC1 en gooi het bijgevoegde embryo niet uit. Als een embryo nog niet aan de plaat is bevestigd, wissel dan de media niet uit, omdat het serum in IVC1 zal helpen bij embryobevestiging.
- Pipette 150 μL van geëquilibreerde uitgebreide cultuurmedia, IVC2, langzaam in elke put en het deksel terug te geven aan de chambered coverslip.
LET OP: Zorg ervoor dat het verwijderen van het deksel van de chambered coverslip wordt geminimaliseerd om gemiddelde verdamping te voorkomen.
- Breng de chambered coverslip voorzichtig terug naar de couveuse zonder media op het deksel te spatten. Herhaal media-uitwisseling en bijlage controle elke dag van uitgebreide cultuur tot embryo's zijn klaar voor fixatie of eencellige spijsvertering.
6. Optionele verzameling van gebruikte media
- Optioneel, verzamelen besteed media tijdens de uitwisseling van cultuur media na D7 of een dag daarna. Tijdens stap 5.3.2, in plaats van het verwijderen van de medium snap-freeze de 150 μL van verwijderde IVC1 in een steriele, laag-bind 0,5 mL buis voor toekomstige analyse.
7. Facultatieve fixatie voor immunofluorescentie
- Gebruik een pipet van 200 μL om embryo's te wassen met 1/2 media-uitwisselingen van PBS voor 3x voor fixatie om extracellulair vuil te verwijderen. Het wegwassen van overtollig vuil en eiwit zal helpen om de helderheid te optimaliseren en de achtergrond in beelden verkregen met immunofluorescentie te verminderen.
- Verwijder alle media en voeg langzaam 200 μL van 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe aan de put. Het embryo zal willen vasthouden aan het oppervlak van de vloeistof. Meerdere 150 μL wasbeurten met 4% PFA voordat alle vloeistof wordt verwijderd, helpen om eventuele schade aan het embryo te minimaliseren.
- Incubeer de embryo's in 4% PFA gedurende 20 minuten voor fixatie.
- Was embryo's 3x gedurende 10 minuten per wasbeurt met 200 μL van 0,1% v/v polysorbate 20 in verse PBS.
- Bewaar vaste embryo's in 0,1% v/v polysorbate 20 in PBS bij 4 °C alvorens verder te gaan met het immunofluorescentieprotocol.
8. Eencellige spijsvertering met Trypsin
LET OP: Verse (niet vaste) embryo's worden gebruikt voor eencellige spijsvertering.
- Was het embryo één keer met 200 μL PBS en voeg 200 μL trypsineoplossing toe aan elke put. Breng de chambered coverslip 5 min terug naar de couveuse.
- Verwijder de chambered coverslip uit de couveuse en onderzoek de embryo's onder een stereoscoop. Cellen aan de periferie van het embryo zullen beginnen zich terug te trekken en MTB moet nog steeds worden bevestigd aan de plaat waar ze zich op afstand van het embryo bevinden.
- Gebruik een kleine pipet of fijn getrokken mondpipet op te halen individuele MTB voor het breken van het hele embryo. Ga vooruit naar stap 9.1 om MTB te redden en ga terug naar stap 8.4 na stap 9.3.
- Gebruik een handheld micromanipulatie pipet of mondpipet om het embryo voorzichtig te scheiden door op en neer te aspireren.
- Cellen zullen zich beginnen te distantiëren van het hele embryo. Blijven het embryo voorzichtig en herhaaldelijk aanzuigen met behulp van een kleinere diameter pipet tip of mond pipet totdat het embryo is geïncubeerd voor een totaal van 10 min in trypsine.
9. Selectie van één cel en monsterverzameling
- Met minimale trypsine, beweeg de gescheiden cellen door drie wasdruppels van 20 μL PBS + 0,1% polyvinylpyrrolidone (PVP) onder embryocultuurolie met zorg om geen cellen te verliezen.
- Gebruik na het wassen van de cellen een fijn getrokken glazen pipet om één cel te selecteren. Voorzichtig pipette de enkele cel in een steriele 0,2 mL low-bind buis met een minimaal volume van PBS + 0,1% PVP.
- Snap bevries enkele cellen in vloeibare stikstof (LN2), en bewaar in -80 °C voor toekomstig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gezonde embryo's vertoonden een voortdurende proliferatie in de loop van de uitgebreide cultuur(figuur 2B). Abnormale embryo's begonnen zich van hun buitenste randen terug te trekken en uiteen te vallen(figuur 2C). Uit onze ervaring, ongeveer 75% van de embryo's werden bevestigd aan de onderkant van de fibronectin gecoate schotel op 48 uur en de gehechtheid steeg tot ongeveer 90% door 72 h in de cultuur. Het succes van embryo-gehechtheid kan grotendeels worden beïnvloed door de initiële kwaliteit van de blastocysten. Embryo's die 72 uur niet bevestigd zijn, zullen het waarschijnlijk niet overleven.
Bij D8 post bevruchting (D3 van uitgebreide cultuur), de meeste cellen in de embryo's waren CTB die positief waren voor trofoblast marker GATA3 (Figuur 3A). Cytotrophoblasten waren al begonnen te differentiëren in multinucleated STB aan de periferie van het embryo (Figuur 2B, linker paneel, stippellijn). Deze STB had een blad-als verschijning en werden gekleurd positief voor de menselijke chorionic gonadotropin subunit bèta (hCGB; Figuur 3A, middenpaneel). De embryo's groeiden snel, tussen D8 en D10, wat wijst op een snelle celproliferatie van CTB in deze periode. Bij D10 was de vorming van CGB positieve MTB maximaal, wat kon worden bevestigd door de toename van de hCG-productie op dit moment (figuur 3B). Migrerende trofoblasten begonnen ook te ontstaan en migreerden weg van het embryolichaam en waren positief gekleurd voor de EVT-marker, HLA-G(figuur 3A, rechterpaneel). Door D12, STB differentiatie was in verval en MTB productie werd meer prominent, wat wijst op een verschuiving van de nadruk van hormoonproductie op D10 naar celmigratie op D12. Deze veranderingen werden waargenomen door time-lapse video verkregen tijdens deze peri-implantatie periode (Movie 1). Onze RNA-sequencinggegevens met één cel weerspiegelden ook dergelijke dynamische veranderingen in de celfunctie. Samen suggereren deze gegevens vroege trofoblastdifferentiatie en de opkomst van de vroege placenta is een dynamisch proces, waarbij het embryo zeer gespecialiseerde celfuncties kan prioriteren op zeer specifieke tijdstippen om succesvolle implantatie te bereiken.
Figuur 1: Procedureel schema van uitgebreide cultuur en eencellige monsterverzameling.
Workflow van opwarming van verglaasde embryo's, zona pellucida verwijdering, uitgebreide embryocultuur, enzymatische spijsvertering, en isolatie van cytotrophoblast (CTB), syncytiotrophoblast (STB), en trekkende trofoblast (MTB). Dit cijfer is gewijzigd van West et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Morfologieën van trofoblastcellen en embryo's tijdens een uitgebreide kweek.
(A) Representatieve beelden van verschillende trofoblastceltypes na enzymatische vertering met trypsine. Kleine CTB aan de linkerkant, grote STB in het midden, en MTB aan de rechterkant. (B) Representatieve afbeeldingen van gezonde embryo's bij D8 (links), D10 (midden) en D12 (rechts). Stippellijnen in het linkerpaneel schetsen vermoedelijk proliferative CTB-populatie, terwijl stippellijn de afgeplatte STB schetst. Roze cirkels in het rechter paneel schetsen MTB die op afstand vanuit het embryo werden geplaatst. (C) Representatieve beelden van abnormale embryo's beginnen zich terug te trekken en uiteen te vallen bij D8 (links), D10 (midden) en D12 (rechts). Schaalbalken = 200 μm. Sommige beelden zijn aangepast van West et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve afbeeldingen van trofoblast markerexpressie en hCG-productie tijdens een uitgebreide cultuur.
(A) Representatieve immunofluorescentiebeelden van embryo's met expressie van een CTB-marker GATA3 bij D10 (links), STB-marker CGB bij D10 (midden) en MTB-marker HLA-G bij D12 (rechts). Schaalstaven= 200 μm. (B) Representatieve hCG-concentratie (mIU/mL) in de loop van de uitgebreide cultuur van D8 naar D12 (gemiddelde± SEM, n = 3). Statistische analyse werd uitgevoerd met One-Way ANOVA gevolgd door tukey's test (P < 0,05). Deze beelden zijn aangepast van West et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: Time-lapse video van een menselijk embryo in uitgebreide cultuur van D8 tot D12. De video toont de ineenstorting van de blastocoel, de vorming van de STB (aangegeven door de groene cirkels), en vervolgens uiteindelijke differentiatie en migratie van MTB (aangegeven door de oranje cirkels). Dit is aangepast van West et al.12. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van het protocol voor de cultuur van menselijke embryo's door middel van implantatie heeft wetenschappers in staat gesteld om een niet eerder in kaart gebrachte tijd in ontwikkeling8,9te verkennen . Hier gebruiken we een uitgebreid cultuursysteem om menselijke embryo's te verkleven en bestuderen we vroege trofoblastdifferentiatie vóór de vorming van villous placenta. De hier beschreven methoden stellen ons in staat om verschillende TB-sublineages te verzamelen voor gebruik in downstream eencellige analyse. Dit werk biedt de wetenschappelijke gemeenschap een kans om deze kritieke en raadselachtige periode in de menselijke ontwikkeling te begrijpen, en kan nieuwe mogelijkheden openen voor therapeutische behandelingen voor miskraam of andere placentapathologieën zoals pre-eclampsie, en nieuwe inzichten te bieden over vroege menselijke ontwikkeling.
Dit protocol vereist vaardigheden in het snel manipuleren van embryo's tijdens het opwarmen van embryo's, zonaverwijdering en beplating om embryostress te minimaliseren voorafgaand aan uitgebreide kweek. Het minimaliseren van mediaverdamping en dus een toename van medium osmolaliteit door het beperken van de tijd van blootstelling tijdens media-uitwisseling is essentieel. Het nemen van zorg om de juiste aseptische techniek te gebruiken bij het uitwisselen van medium en bewegende gerechten zal helpen bij het minimaliseren van verontreiniging. Het stabiliseren van de schotel bij gebruik om mechanische verstoring te minimaliseren zodra de embryo's hebben bevestigd is ook belangrijk. Embryo's die gestrest raken zullen beginnen hun syncytiale projecties af te wijken en beginnen te apoptose. Het is ook van cruciaal belang om te voorkomen dat de meniscus van de cultuurmedia het oppervlak van het embryo raakt en om olie in de putten te minimaliseren. Een van deze scenario's kan het embryo vernietigen.
Het kweken van menselijke embryo's buiten het blastocyststadium is een snel evoluerend veld. Een recente studie13 toonde aan dat een nieuw cultuursysteem dat 10% van een extracellulair matrix-eiwitmengsel en een medium met extra suppletie van natriumpyruvaat, lactaat en rho-associate protein kinase (ROCK) remmer bevat, voordelig is bij het modelleren in vivo 3D embryonale architecturen en aanzienlijk meer levensvatbare embryo's heeft opgeleverd in een later stadium van uitgebreide cultuur in vergelijking met het uitgebreide cultuursysteem dat hier wordt beschreven. Validatie van dit nieuwe systeem om de reproduceerbaarheid aan te tonen zal nodig zijn. Wij zijn van mening dat de hier beschreven procedures kunnen worden aangepast aan dit nieuwe 3D-systeem met kleine veranderingen en kunnen daarom de vooruitgang op het gebied van methodologie op dit gebied ten goede komen.
Dit protocol kan ook worden aangepast om onderzoek naar IVF cultuur media optimalisatie mogelijk te maken. We hebben onlangs aangetoond dat in de ontwikkeling van muizen, embryo's tijdens de uitgebreide cultuur het succes van de foetale ontwikkeling na embryo-overdracht18kan voorspellen. Abnormaal bevruchte en afgedankte menselijke zygotes met 3 pronuclei (PN) kan worden gekweekt om blastocysten op D5 in verschillende omstandigheden die vervolgens hun ontwikkeling tijdens uitgebreide cultuur kunnen beïnvloeden. Geschonken D5 menselijke blastocysten kunnen worden gekweekt voor 48 uur in nieuwe omstandigheden alvorens te worden geplaatst in de uitgebreide cultuur systeem voor prestatie-evaluatie. Routinemetingen van epiblast celnummer, totaal celnummer, uitgroei gebied, en hCG hebben ons laboratorium om beter te begrijpen hoe verschillende cultuur media voorwaarden beter kunnen ondersteunen menselijke pre-implantatie embryo ontwikkeling en invloed hebben op hun post-implantatie succes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag de vele patiënten in het Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) die gracieus hun embryo's hebben gedoneerd voor onderzoek te erkennen. We willen ook Karen Maruniak en het klinisch laboratorium van CCRM bedanken voor hun hulp bij de verwerking van hCG-monsters, evenals Sue McCormick en haar klinische IVF-embryologieteam bij CCRM voor hun hulp bij het verzamelen, opslaan, volgen en doneren van embryo's. De financiering werd intern verstrekt door CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
