Summary
Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.
Abstract
La implantación humana, la aposición y adhesión a la epitelia superficial uterina y la posterior invasión del blastocisto en la decidua materna, es un evento biológico crítico pero enigmático que ha sido históricamente difícil de estudiar debido a limitaciones técnicas y éticas. La implantación se inicia mediante el desarrollo del trofctodermo al trofoblasto temprano y la posterior diferenciación en sublineaciones de trofoblastos distintos. La diferenciación aberrante temprana de trofoboblastos puede conducir a insuficiencia de implantación, patologías placentarias, anomalías fetales y aborto espontáneo. Recientemente, se han desarrollado métodos para permitir que los embriones humanos crezcan hasta el día 13 después de la fertilización in vitro en ausencia de tejidos maternos, un período de tiempo que abarca el período de implantación en humanos. Esto ha dado a los investigadores la oportunidad de investigar la implantación humana y recapitular la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante este período crítico sin confundir las influencias maternas y evitando obstáculos inherentes para estudiar los primeros eventos de diferenciación embrionaria in vivo. Para caracterizar diferentes sublines de trofoblastos durante la implantación, hemos adoptado métodos de cultivo extendidos bidimensionales (2D) existentes y desarrollado un procedimiento para digerir y aislar enzimáticamente diferentes tipos de células trofoblastas para ensayos posteriores. Los embriones cultivados en condiciones 2D tienen una morfología relativamente aplanada y pueden ser subóptales en el modelado de arquitecturas embrionarias tridimensionales in vivo (3D). Sin embargo, la diferenciación de trofoblastos parece verse menos afectada como lo demuestran los cambios previstos en la morfología y la expresión génica a lo largo de la cultura extendida. Diferentes sublineages de trofoblastos, incluyendo citotroblasto, sincitiotrofobia y trofoblasto migratorio pueden separarse por tamaño, ubicación y emergencia temporal, y utilizarse para una mayor caracterización o experimentación. La investigación de estas células trofoblastas tempranas puede ser fundamental para comprender la implantación humana, tratar patologías placentarias comunes y mitigar la incidencia de pérdida del embarazo.
Introduction
La implantación humana y la aparición de la placenta temprana son históricamente difíciles de investigar y permanecen en gran medida desconocidas porque los tejidos humanos son inaccesibles en esta etapa en la que el embarazo es clínicamente indetectable. Los modelos animales son inadecuados, ya que la placentación humana tiene sus propias características únicas en comparación con otros mamíferos euterianos. Por ejemplo, la placenta humana invade profundamente la decidua con algunas células trofoblastas que alcanzan al menos el tercio interno del miometrio uterino, mientras que otras células remodelan las arterias espirales uterinas. Incluso nuestros ancestros evolutivos más cercanos, los primates no humanos, muestran diferencias en la morfología placentaria y las interacciones trofoblastas con los tejidos deciduales maternos1,,2,,3. La obtención de embriones humanos preimplantacionales in vitro no fue posible hasta que en la década de 1980, cuando la fecundación in vitro humana clínica (FIV) comenzó como una práctica rutinaria para el tratamiento de la infertilidad4. Ahora, los blastocistos humanos se pueden cultivar in vitro para permitir la selección de embriones más viables para la transferencia, así como para permitir pruebas genéticas seguras. La mejora de las técnicas de cultivo de embriones, así como el uso cada vez mayor de la FIV ha producido muchos blastocistos excedentes que permanecen después de que se hayan completado los ciclos de tratamiento del paciente. Con el consentimiento del paciente, la aprobación del IRB, y con ciertas restricciones, estos blastocistos pueden ser utilizados para estudios de investigación. Se han convertido en un recurso invaluable que se utilizaron para la derivación de células madre embrionarias humanas5, la comprensión de la transición de la masa celular interna a las células madre embrionarias6,,7,y más recientemente, se han cultivado con éxito hasta el día (D) 13 para remodelar la implantación humana8,,9. Mediante la utilización de enfoques omics de células únicas desarrollados recientemente, el acceso a estos tejidos embrionarios humanos en etapas de implantación ha ofrecido oportunidades únicas para describir los mecanismos moleculares que regulan este proceso de diferenciación celular altamente dinámico, que antes eran imposibles de explorar10,,11,,12,,13.
Aquí, describimos los métodos utilizados en nuestra reciente publicación que caracteriza la dinámica de la diferenciación de trofoblastos durante la implantación humana12. Este protocolo incluye el calentamiento de blastocistos vitrificados, el cultivo de embriones extendido hasta D12 después de la FIV, la digestión enzimática del embrión en células individuales y la recolección celular para ensayos posteriores (Figura 1). Este sistema de cultivo extendido apoya el desarrollo embrionario humano en etapa periimplantacional sin aportes maternos y recapitula la diferenciación trofoblasta que parece coherente con las observaciones hechas de especímenes histológicos hace muchos años14,,15,,16,,17. Durante la implantación, la población de trofoblastos se compone de al menos dos tipos de células: el citotrofoblasto mononucleado similar a un progenitor (CTB) y el sintiotrofoboque multinucleado diferenciado terminalmente (STB). Tras la digestión de la trippsina, las CTB son células pequeñas y redondas que son morfológicamente indistinguibles de otros linajes celulares(Figura 2A,panel izquierdo). La separación de CTB de otros linajes celulares, como el epíblasto y el endodermo primitivo, se puede lograr mediante sus distintos perfiles transcriptómicos revelados por la secuenciación de ARN de una sola célula. Las células de sincitiotrofoblastos se pueden identificar fácilmente como estructuras de forma irregular que son significativamente más grandes que los otros tipos de células y se encuentran principalmente en la periferia del embrión (Figura 2A,panel medio; Figura 2B, panel izquierdo). Las células trofoblastas migratorias (MTB) son otro sublineaje trofoblasto encontrado durante el cultivo extendido embrionario y pueden reconocerse como aparentemente alejarse del cuerpo principal del embrión(Figura 2A,panel derecho, Figura 2B,panel derecho). El trofoblasto migratorio, aunque expresa muchos de los mismos marcadores que el trofoblasto villoso extra (EVT), no debe denominarse EVT, ya que las estructuras villosas de la placenta no han surgido en esta etapa muy temprana de desarrollo.
Experimentalmente, pudimos recoger pequeños CTB y STB grandes que son fácilmente distinguibles después de que los embriones se digieren en células individuales en D8, D10 y D12(Figura 2A,B). Los trofoblastos migratorios surgen en las etapas posteriores del cultivo embrionario prolongado y se pueden recoger en D12 antes de la digestión enzimática de todo el embrión (Figura 2A,B). Al separar fenotípicamente estos tres sublines trofoblastos antes del análisis de una sola célula, podemos identificar marcadores transcriptómicos específicos y definir el papel biológico de cada tipo de célula. Citotrofoblast son altamente proliferativos y actúan como células progenitoras en el suministro de los linajes diferenciados STB y MTB10,,11,12,,13. Syncytiotrophoblast está implicado en la producción de hormonas placentarias para mantener el embarazo y también puede ser responsable de los embriones que se entierran en el endometrio10,11,12,13. El trofoblasto migratorio tiene características aún más fuertes de un fenotipo invasor, migratorio y es probable que sea responsable de una colonización más profunda y extensa del endometrio uterino10,,11,,12,,13. Después de definir la firma transcriptómica de cada tipo de célula, los análisis de agrupación en clústeres también han revelado dos subconjuntos adicionales de células que eran morfológicamente indistinguibles de CTB y tenían transcriptomas con características de STB y MTB, respectivamente12. Es probable que estas células de estadio intermedio se dilecen de CTB a los sublineages MTB o STB y se habrían pasado por alto si los embriones se digieren ciegamente y las células estuvieran separadas por transcriptoma solo.
El protocolo descrito aquí utiliza un sistema de cultivo bidimensional (2D) y puede no ser óptimo para apoyar el desarrollo estructural tridimensional (3D), como sugiere una publicación reciente que describe un sistema de cultivo 3D recién desarrollado13. Sin embargo, en este sistema 2D la diferenciación del trofoblasto temprano parece ser consistente con las observaciones hechas de especímenes in vivo14,,15,,16,,17. Este protocolo también se puede adaptar fácilmente para su uso en el sistema de cultivo 3D13 recientemente descrito con cambios mínimos. Todos los pasos se llevan a cabo con una pipeta de micromanipulación de mano con puntas desechables disponibles comercialmente o una pipeta de boca de una pipeta de vidrio finamente tirada unida a tubos de goma, un filtro y una boquilla.
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Protocol
Todos los embriones humanos han sido donados con consentimiento para su uso en la investigación. Los protocolos para el cultivo prolongado de embriones humanos han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional Occidental (estudio n.o 1179872) y siguen las directrices internacionales. Cualquier uso de embriones humanos debe ser revisado por los órganos de ética y de gobierno apropiados asociados con la institución de investigación que utilice este protocolo.
1. Preparación
- Preparar los medios y las placas de recuperación un día antes del calentamiento del embrión en una campana de flujo laminar estéril.
- Preparar 2 ml de medios de cultivo de blastocisto (BM) con 10% v/v sustituto de proteína sérica (SPS).
NOTA: Los medios de cultivo de Blastocyst pueden o no contener proteínas añadidas. Aquí, utilizamos un medio que debe complementarse con el 10% de la proteína de albúmina indicada. Consulte la guía del fabricante para la variación en esta suplementación. Todos los medios deben filtrarse utilizando un filtro estéril de 0,22 m unido a una jeringa estéril antes del equilibrio. - Llene dos platos de lavado de cultivo de órganos de pozo central con 500 l de BM con 10% v/v SPS cubierto con 500 l de aceite de grado de cultivo embrionario.
- En un plato de cultivo de tejido de 60 mm, capa 8 mL de aceite de cultivo embrionario y luego anclaje 20 gotas de BM con 10% v/v SPS en la parte inferior de la placa de cultivo. Haga 1 gota por cada embrión calentado.
NOTA: Se pueden hacer más medios, gotas y platos de lavado según sea necesario. También se pueden añadir gotas al plato antes de que el aceite esté en capas. Las gotas de anclaje debajo del aceite ayudarán a reducir la evaporación y cualquier cambio posterior en la osmolalidad. - Equilibre BM con 10% v/v platos de lavado SPS y placa de recuperación en una incubadora a 37oC, 6% CO2, 5% O2 durante al menos 4 h.
- Descongelar un vial del primer paso de medios de cultivo extendidos (IVC1) en 4 oC o en la parte superior del banco.
- Prepare un plato de lavado de 500 l de IVC1 sin recubrimiento de aceite. Aliquot aproximadamente 4 ml de IVC1 en un tubo de tapa de presión de 5 ml.
- Plato de lavado Equilibrado IVC1 y pequeño tubo de tapa de presión de IVC1 en 37oC, 6% CO2 y atmosférico O2 durante al menos 4 h.
- Preparar 2 ml de medios de cultivo de blastocisto (BM) con 10% v/v sustituto de proteína sérica (SPS).
- Preparar placas de cultivo extendidas un día antes del calentamiento del embrión en una campana de flujo laminar estéril.
- Diluir la fibronectina del suero humano en solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 30 g/ml. Se necesitarán 250 l de fibronectina de 30 g/ml por embrión para recubrir las cámaras.
- Abra el paquete de cubreobjetos de 8 bien acaneados debajo del capó mientras tiene cuidado de no tocar los pozos. Pipetear suavemente 250 l de fibronectina de 30 g/ml en cada pocópido.
- Vuelva a colocar la tapa en el cubreobjetos con cámara y colóquela a 4oC durante 20-24 h.
- Preparar una placa de cultivo extendida en la mañana del calentamiento embrionario.
- Recupere el cubreobjetos con fibronectina y colóquelo en la campana de flujo laminar. Retire la mezcla de fibronectina con una pipeta de 1 ml y deseche en el contenedor de residuos.
- Recupere medios IVC1 calentados y equilibrados de un pequeño tubo de tapa de presión de 5 ml.
- Pipetear 300 l de IVC1 equilibrado en cada pocól. Tenga cuidado de no dejar que ningún líquido toque la tapa, ya que esto aumentará el riesgo de contaminación.
- Devolver el cubreobjetos con cámara con IVC1 para incubar en 37oC, 6% CO2 y atmosférico O2 hasta la eliminación de la zona pellucida en el paso 4.
2. Calentamiento de embriones humanos D5 vitrificados
NOTA: Otros fabricantes pueden tener protocolos ligeramente diferentes de acuerdo con su propia tecnología de vitrificación. Consulte las instrucciones de uso del fabricante cuando corresponda.
- Caliente 3,0 ml de solución de descongelación (TS) en un plato de 35 mm a 37oC. Llevar 300 l de solución de dilución (DS) y dos pocillos de 300 l de solución de lavado (WS) en una placa de 6 pozos a temperatura ambiente.
- Con fórceps, retire cuidadosamente el manguito del dispositivo crio mientras se asegura de que el embrión vitrificificado permanezca siempre bajo nitrógeno líquido.
- Mueva rápidamente el dispositivo criollado de nitrógeno líquido y sumerja la punta del dispositivo crio en TS a 37 oC. Ajuste un temporizador durante 1 min y mantenga el dispositivo crio sumergido hasta que el embrión se desprenda en el TS.
NOTA: Embriones calientes de uno en uno para realizar un seguimiento de las identidades de los embriones, ya que pueden relacionarse con la información demográfica del paciente en el análisis posterior. - Durante la incubación de 1 min en TS, retire cuidadosamente el crio dispositivo y levante suavemente el embrión y muévase al lado opuesto de la placa TS.
NOTA: Si se cultivan varios embriones, sea diligente en mantener los embriones separados para garantizar que se mantengan las identidades adecuadas. - Después de 1 min, recoja suavemente el embrión con una pequeña cantidad de TS, aproximadamente 2 l. Mueva el embrión a la parte inferior del pozo DS de 300 l mientras cubre el embrión en una capa delgada de TS de la pipeta. Ajuste un temporizador durante 3 minutos y coloque la placa de 6 pozos en la parte superior del banco a temperatura ambiente.
- Después de 3 min, recoja el embrión con una pequeña cantidad de DS, aproximadamente 2 oL, y mueva el embrión al fondo del siguiente pozo que contiene 300 l de WS. Una vez más, coloque suavemente una pequeña cantidad de DS de la pipeta sobre el embrión. Ajuste un temporizador durante 5 minutos y vuelva a la mesa de trabajo.
- Después de 5 min, recoja el embrión con un volumen mínimo de WS y muévase a la parte superior del pozo final de 300 l WS. El embrión caerá lentamente y se lavará a través del WS hasta el fondo. Expulse cualquier WS retenido de la pipeta a un pozo vacío.
- Recoger el embrión con un volumen mínimo y volver a la parte superior del mismo pozo de 300 l de WS. El embrión volverá a caer al fondo del pozo. Ajuste un temporizador durante 1 min y devuelva la placa de 6 pozos a la parte superior del banco.
3. Recuperación de embriones calentados
- Uno a la vez, mueva los embriones calentados a un plato de tejido de órganos de pozo central que contenga 500 l de BM equilibrado con 10% v/v SPS por debajo de 500 l de aceite de grado de cultivo de embriones equilibrado.
- Lave los embriones recogiendo cada embrión y moviéndolos a varias áreas del plato mientras sopla los medios antiguos entre movimientos. Recoger el embrión y moverlo a una caída de cultivo individual de 20 l de BM equilibrado con 10% v/v SPS bajo aceite.
- Deje que los embriones calentados se recuperen durante 2 h en una incubadora a 37oC, 6% CO2, 5% O2.
4. Eliminación de zonas
- Después de una recuperación de 2 horas, evalúe los embriones para su re-expansión y tome fotografías de cada embrión.
- Mueva los embriones individualmente en 500 ml de un medio de manipulación con ácido proponámico (MOPS) de 3-(N-morpholino) con un medio de manipulación con búfer de ácido (MOPS) con un 5% (v/v) de suero de ternero fetal (FCS) antes del tratamiento con la solución ácida de Tyrode.
- Mueva un embrión rápidamente a través de 300 ml de solución de Tyrode ácido caliente mientras observa activamente a través del microscopio. La zona pellucida comenzará a disolverse visualmente. Esto tomará aproximadamente 5 s.
- Mueva inmediatamente el embrión con zona de disolución a 300 l de medio amortiguado MOPS calentado para apagar la solución del ácido Tyrode.
- Mueva el embrión con un volumen mínimo de medio tamponado MOPS en una placa de tejido de órganos de pozo central que contenga 500 ml de BM equilibrado con 10% v/v SPS por debajo de 500 l de aceite de grado de cultivo embrionario equilibrado para lavar.
- Devuelva el embrión a la caída de recuperación de 20 l del paso 3.2.
NOTA: Tras el examen visual después de la eliminación de la zona, los embriones con zona pellucida retenida pueden ser tratados con la solución ácida de Tyrode si es necesario, repitiendo los pasos 4.2-4.6. Se desea minimizar la exposición a la solución de Tyrode.
5. Blastocyst cultivo extendido
- Mueva los embriones individualmente al plato de lavado con medios IVC1 equilibrados del paso 1.1.6. Mueva cuidadosamente un embrión a un pozo del cubreobjetos con cámara con IVC1 equilibrado y mantenga la identificación de embriones.
NOTA: Este paso debe terminarse lo más rápido posible para minimizar la evaporación media. - Volver encuesado cubreobjetos a una incubadora ajustada a 37oC, 6% CO2, O2 atmosférico durante 2 días.
NOTA: Asegúrese de descongelar y equilibrar los medios en 37 oC, 6% CO2, O2 atmosférico para el intercambio de medios 4 h de antelación. - En el crecimiento D2 (D7 post fertilización), examine cuidadosamente la unión de embriones bajo el microscopio y realice el intercambio de medios.
- Tenga en cuenta qué embrión se une al plato antes de intercambiar medios. Toque suavemente la placa y examine si un embrión se ha unido firmemente a la placa bajo el microscopio.
- Retire la tapa y retire cuidadosamente 150 ml de IVC1 y deseche mientras no moleste el embrión conectado. Si un embrión aún no se ha unido a la placa, no cambie el medio, ya que el suero de IVC1 ayudará en la fijación de embriones.
- Pipetear 150 l de medios de cultivo extendidos equilibrados, IVC2, lentamente en cada pocópta y devolver la tapa al cubreobjetos con cámara.
NOTA: Asegúrese de que la extracción de la tapa del cubreobjetos con cámara se minimice para evitar la evaporación media.
- Devuelva cuidadosamente el cubreobjetos con cámara a la incubadora sin salpicar ningún medio en la tapa. Repita el intercambio de medios y la verificación de fijación todos los días del cultivo extendido hasta que los embriones estén listos para la fijación o la digestión de una sola célula.
6. Colección opcional de medios gastados
- Opcionalmente, recopile los medios gastados durante el intercambio de medios de cultivo después de D7 o cualquier día posterior. Durante el paso 5.3.2, en lugar de descartar el a presión medio, congelar los 150 ml de IVC1 eliminado en un tubo estéril de 0,5 ml de unión baja para su análisis futuro.
7. Fijación opcional para inmunofluorescencia
- Utilice una pipeta de 200 l para lavar embriones con 1/2 intercambios de medios de PBS durante 3x antes de la fijación para eliminar cualquier residula extracelular. Lavar el exceso de residuos y proteínas ayudará a optimizar la claridad y reducir el fondo en imágenes obtenidas con inmunofluorescencia.
- Retire todos los medios y agregue lentamente 200 l de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS al pozo. El embrión querrá adherirse a la superficie del fluido. Múltiples lavados de 150 l con 4% de PFA antes de extraer todo el líquido ayudará a minimizar cualquier daño al embrión.
- Incubar los embriones en 4% PFA durante 20 min para fijación.
- Lave los embriones 3x durante 10 minutos por lavado con 200 l de polisorbato 0,1% v/v 20 en PBS fresco.
- Almacene los embriones fijos en polisorbato de 0,1% v/v 20 en PBS a 4 oC antes de proceder con el protocolo de inmunofluorescencia.
8. Digestión celular única con trippsina
NOTA: Los embriones frescos (no fijos) se utilizan para la digestión de una sola célula.
- Lavar el embrión una vez con 200 ml de PBS y añadir 200 ml de solución de trippsina a cada pocero. Vuelva a colocar el cubreobjetos con cámara en la incubadora durante 5 min.
- Retire el cubreobjetos con cámara de la incubadora y examine los embriones bajo un estereoscopio. Las células de la periferia del embrión comenzarán a retraerse y MTB todavía debe estar unida a la placa donde se encuentran remotamente desde el embrión.
- Utilice una pipeta pequeña o una pipeta de boca finamente tirada para recoger MTB individual antes de romper todo el embrión. Vaya adelante al paso 9.1 para guardar MTB y volver al paso 8.4 después del paso 9.3.
- Utilice una pipeta de micromanipulación de mano o una pipeta de boca para disociar suavemente el embrión aspirando hacia arriba y hacia abajo.
- Las células comenzarán a disociarse de todo el embrión. Continúe aspirando el embrión suavemente y repetidamente usando una punta de pipeta de menor diámetro o pipeta de boca hasta que el embrión haya sido incubado durante un total de 10 minutos en tripina.
9. Selección de celda única y recolección de muestras
- Con una tripina mínima, mueva las células disociadas a través de tres gotas de lavado de PBS de 20 l + 0,1% de polivinilpirrolidona (PVP) bajo aceite de cultivo embrionario con cuidado de no perder ninguna célula.
- Después de lavar las células, utilice una pipeta de vidrio finamente tirada para seleccionar una celda. Pipetee cuidadosamente la célula única en un tubo estéril de 0,2 ml de unión baja con un volumen mínimo de PBS+0,1% PVP.
- Enganche las células individuales en nitrógeno líquido (LN2)y guárdelos en -80 oC para su uso futuro.
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Representative Results
Los embriones sanos mostraron proliferación continua a lo largo del cultivo extendido(Figura 2B). Los embriones anormales comenzaron a retraerse de sus bordes exteriores y desintegrarse (Figura 2C). Según nuestra experiencia, aproximadamente el 75% de los embriones se unieron a la parte inferior del plato recubierto de fibronectina a 48 h y el accesorio aumentó a aproximadamente el 90% en 72 h en cultivo. El éxito de la unión de embriones puede verse afectado en gran medida por la calidad inicial de los blastocistos. Los embriones no unidos por 72 h probablemente no sobrevivirán.
En D8 post fertilización (D3 de cultivo extendido), la mayoría de las células en los embriones eran CTB que eran positivas para el marcador de trofoblasto GATA3 (Figura 3A). Los citotroblastos ya habían comenzado a diferenciarse en STB multinucleado en la periferia del embrión(Figura 2B,panel izquierdo, línea punteada). Estos STB tenían una apariencia similar a una hoja y fueron teñidos positivos para la subunidad de la subunidad de gonadotropina humana beta (hCGB; Figura 3A,panel central). Los embriones crecieron rápidamente, entre D8 y D10, lo que sugiere una rápida proliferación celular de CTB durante este período. En D10, la formación de MTB positivo CGB estaba en un máximo, lo que podría ser confirmado por el aumento de la producción de hCG en este momento(Figura 3B). Los trofoblastos migratorios también comenzaron a emerger y migrarse lejos del cuerpo embrionario y fueron teñidos positivos para el marcador EVT, HLA-G (Figura 3A,panel derecho). Por D12, la diferenciación de STB estaba en declive y la producción de MTB se hizo más prominente, lo que sugiere un cambio de énfasis de la producción de hormonas en la migración de D10 a la célula en D12. Estos cambios se observaron mediante vídeo de lapso de tiempo obtenido durante este período periimplantación(Película 1). Nuestros datos de secuenciación de ARN de celda única también reflejaban tales cambios dinámicos en la función celular. Juntos, estos datos sugieren la diferenciación temprana del trofoblasto y la aparición de la placenta temprana es un proceso dinámico, durante el cual el embrión puede priorizar las funciones celulares altamente especializadas en puntos de tiempo muy específicos para lograr una implantación exitosa.
Figura 1: Esquema de procedimiento de referencia cultural extendida y colección de muestras de celda única.
Flujo de trabajo de los embriones vitrificados de calentamiento, eliminación de zona pellucida, cultivo prolongado de embriones, digestión enzimática y aislamiento de citotrofoblasto (CTB), sintiotrofoblasto (STB) y trofoblasto migratorio (MTB). Esta cifra ha sido modificada de West et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfologías de células trofoblastas y embriones durante el cultivo prolongado.
(A) Imágenes representativas de diferentes tipos de células trofoblastas después de la digestión enzimática con tripsina. CTB pequeño a la izquierda, STB grande en el medio y MTB a la derecha. (B) Imágenes representativas de embriones sanos en D8 (izquierda), D10 (medio) y D12 (derecha). Las líneas discontinuas en el esquema del panel izquierdo presumiblemente proliferan la población CTB, mientras que la línea punteada delinea el STB aplanado. Círculos rosados en el panel derecho delinean MTB que se encontraban remotamente desde el embrión. (C) Imágenes representativas de embriones anormales que comienzan a retraerse y desintegrarse a las D8 (izquierda), D10 (centro) y D12 (derecha). Barras de escala a 200 m. Algunas imágenes han sido adaptadas de West et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de la expresión del marcador de trofoblasto y la producción de hCG durante el cultivo extendido.
(A) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de embriones que muestran la expresión de un marcador CTB GATA3 a D10 (izquierda), el marcador STB CGB en D10 (medio) y el marcador MTB HLA-G en D12 (derecha). Barras de escala de 200 m. (B) Concentración representativa de hCG (mIU/mL) en el curso del cultivo extendido de D8 a D12 (media SEM, n a 3). El análisis estadístico se realizó con ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey (P < 0.05). Estas imágenes han sido adaptadas de West et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: Vídeo de lapso de tiempo de un embrión humano en cultivo extendido de D8 a D12. El video muestra el colapso del blastocóculo, la formación del STB (indicado por los círculos verdes), y luego la eventual diferenciación y migración de MTB (indicado por los círculos naranjas). Esto ha sido adaptado de West et al.12. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El desarrollo del protocolo para el cultivo de embriones humanos a través de la implantación ha permitido a los científicos explorar un tiempo previamente desconocido en el desarrollo8,,9. Aquí, utilizamos un sistema de cultivo extendido para cultivar embriones humanos y estudiar la diferenciación temprana de trofobos antes de la formación de placenta villosa. Los métodos descritos aquí nos permiten recopilar diferentes sublineaciones de TB para su uso en el análisis de una sola célula descendente. Este trabajo permite a la comunidad científica la oportunidad de entender este período crítico y enigmático en el desarrollo humano, y puede abrir nuevas oportunidades para tratamientos terapéuticos para el aborto espontáneo u otras patologías placentarias como la preeclampsia, así como proporcionar nuevas perspectivas sobre el desarrollo humano temprano.
Este protocolo requiere habilidades para manipular rápidamente embriones durante el calentamiento de embriones, la extracción de zona y el enchapado para minimizar el estrés embrionario antes del cultivo prolongado. Minimizar la evaporación de los medios y, por lo tanto, un aumento de la osmolalidad media limitando el tiempo de exposición durante el intercambio de medios es esencial. Tener cuidado de utilizar la técnica aséptica adecuada al intercambiar platos medianos y en movimiento ayudará a minimizar la contaminación. Estabilización del plato cuando se utiliza para minimizar cualquier perturbación mecánica una vez que los embriones se han unido también es importante. Los embriones que se estresan comenzarán a retroceder sus proyecciones sincitiales y comenzarán a apoptizar. También es fundamental evitar permitir que el menisco de los medios de cultivo toque la superficie del embrión y minimizar cualquier aceite en los pozos. Cualquiera de estos escenarios puede destruir el embrión.
Cultivar embriones humanos más allá de la etapa de blastocisto es un campo en rápida evolución. Un estudio reciente13 demostró que un nuevo sistema de cultivo que contiene el 10% de una mezcla de proteína de matriz extracelular y un medio con suplementación adicional de piruvato sódico, lactato e inhibidor de la proteína quinasa rho-associatea (ROCK) es ventajoso en el modelado de arquitecturas embrionarias 3D in vivo y produjo embriones significativamente más viables en una etapa posterior de cultivo extendido en comparación con el sistema de cultivo extendido descrito aquí. Será necesaria la validación de este nuevo sistema para demostrar su reproducibilidad. Creemos que los procedimientos descritos aquí se pueden adaptar a este nuevo sistema 3D con cambios menores y, por lo tanto, pueden beneficiar el avance de la metodología en este campo.
Este protocolo también puede adaptarse para permitir la investigación de la optimización de medios de cultivo de FIV. Recientemente hemos demostrado que en el ratón, el desarrollo embrionario durante el cultivo extendido puede predecir el éxito del desarrollo fetal después de la transferencia de embriones18. Los cigotos humanos anormalmente fertilizados y desechados con 3 pronúcleos (PN) se pueden cultivar a blastocistos en D5 en diferentes condiciones que luego pueden influir en su desarrollo durante el cultivo prolongado. Los blastocistos humanos D5 donados pueden cultivarse durante 48 horas en condiciones novedosas antes de ser colocados en el sistema de cultivo extendido para la evaluación del rendimiento. Las mediciones rutinarias del número de células de la epíblasta, el número total de células, el área de crecimiento y el hCG han permitido a nuestro laboratorio comprender mejor cómo las diferentes condiciones de los medios de cultivo pueden apoyar mejor el desarrollo de embriones preimplantacionales humanos e influir en su éxito postimplantación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría reconocer a los muchos pacientes del Centro de Medicina Reproductiva de Colorado (CCRM) que han donado amablemente sus embriones para la investigación. También queremos agradecer a Karen Maruniak y al laboratorio clínico de CCRM por su ayuda en el procesamiento de muestras de hCG, así como a Sue McCormick y su equipo clínico de embriología de FIV en CCRM por su ayuda con la recolección, almacenamiento, seguimiento y donación de embriones. La financiación fue proporcionada internamente por el CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnenborg, R., Robertson, W. B., Brosens, I., Dixon, G. Review article: trophoblast invasion and the establishment of haemochorial placentation in man and laboratory animals. Placenta. 2, 71-91 (1981).
- Edwards, R. G., Bavister, B. D., Steptoe, P. C. Early stages of fertilization in vitro of human oocytes matured in vitro. Nature. 221 (5181), 632-635 (1969).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- O'Leary, T., et al. Tracking the progression of the human inner cell mass during embryonic stem cell derivation. Nature Biotechnology. 30 (3), 278-282 (2012).
- O'Leary, T., et al. Derivation of human embryonic stem cells using a post-inner cell mass intermediate. Nature Protocols. 8 (2), 254-264 (2013).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Deglincerti, A., et al. Self-organization of the in vitro attached human embryo. Nature. 533 (7602), 251-254 (2016).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Lv, B., et al. Single cell RNA sequencing reveals regulatory mechanism or trophoblast cell-fate divergence in human peri-implantation conceptuses. PLoS Biology. 17 (10), 3000187 (2019).
- West, R. C., et al. Dynamics of trophoblast differentiation in peri-implantation-stage human embryos. Proceedings of the Nationals Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22635-22644 (2019).
- Xiang, L., et al. A developmental landscape of 3D-cultured human pre-gastrulation embryos. Nature. 577 (7791), 537-542 (2020).
- Mall, F. P. Report upon the collection of human embryos at the johns hopkins university. The Anatomical Record. 5 (7), 343-357 (1911).
- Buettner, K. A. Franklin Paine Mall (1862-1917). Embryo Project Encyclopedia. , (2007).
- Carnegie Institution of Washington. Contributions to embryology. , Carnegie Institution of Washington. Washington, D.C. (1915).
- Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C. A description of 34 human ova within the first 17 days of development. American Journal of Anatomy. 98 (3), 435-493 (1956).
- Logsdon, D. M., Ermisch, A. F., Kile, R., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Egg cylinder development during in vitro extended embryo culture predicts the post transfer developmental potential of mouse blastocysts. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 37 (4), 747-752 (2020).
