Summary
Aqui, descrevemos um método para aquecer blastocistos humanos vitrificados, culminando-os através do período de implantação in vitro, digerindo-os em células únicas e coletando células trophoblastas precoces para uma investigação mais aprofundada.
Abstract
A implantação humana, a apposição e a adesão à epitélia da superfície uterina e a subsequente invasão do blastocisto na decidua materna, é um evento biológico crítico, mas enigmático, historicamente difícil de estudar devido a limitações técnicas e éticas. A implantação é iniciada pelo desenvolvimento do trophectoderm ao trophoblasto e posterior diferenciação em sublineagens trophoblastos distintas. A diferenciação do trophoblasto precoce aberrante pode levar à falha de implantação, patologias placentárias, anormalidades fetais e aborto. Recentemente, foram desenvolvidos métodos para permitir que embriões humanos cresçam até o dia 13 pós-fertilização in vitro na ausência de tecidos maternos, período de tempo que abrange o período de implantação em humanos. Isso deu aos pesquisadores a oportunidade de investigar a implantação humana e recapitular a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante esse período crítico sem confundir influências maternas e evitar obstáculos inerentes ao estudo de eventos de diferenciação de embriões precoces in vivo. Para caracterizar diferentes sublinemas trophoblastos durante a implantação, adotamos métodos de cultura estendidos bidimensionais (2D) existentes e desenvolvemos um procedimento para digerir esnzimaticamente e isolar diferentes tipos de células trophoblastos para ensaios a jusante. Embriões cultivados em condições 2D têm uma morfologia relativamente achatada e podem ser subótimos na modelagem in vivo tridimensionais (3D) arquiteturas embrionárias. No entanto, a diferenciação do trophoblasto parece ser menos afetada, como demonstrado pela morfologia antecipada e mudanças na expressão genética ao longo da cultura estendida. Diferentes sublineagens trophoblastos, incluindo citotrofoblasto, sinintólogo e trophoblasto migratório podem ser separadas por tamanho, localização e emergência temporal, e usadas para caracterização ou experimentação. A investigação dessas células trophoblastos precoces pode ser fundamental na compreensão da implantação humana, no tratamento de patologias placentárias comuns e na mitigação da incidência de perda de gravidez.
Introduction
A implantação humana e o surgimento da placenta precoce são historicamente difíceis de investigar e permanecem em grande parte desconhecidos porque os tecidos humanos são inacessíveis nesta fase em que a gravidez é clinicamente indetectável. Modelos animais são inadequados, pois a placenta humana tem suas próprias características únicas em comparação com outros mamíferos euterianos. Por exemplo, a placenta humana invade profundamente a decidua com algumas células trophoblastas atingindo pelo menos o terço interno do miométrio uterino, enquanto outras células remodelam as artérias espiral uterinas. Mesmo nossos ancestrais evolutivos mais próximos, os primatas não humanos, mostram diferenças na morfologia placentária e interações trophoblastos com os tecidos deciduais maternos1,,2,3. A obtenção de embriões humanos pré-implantação in vitro não era possível até a década de 1980, quando a fertilização in vitro humana clínica (FIV) começou como uma prática de rotina para o tratamento da infertilidade4. Agora, blastocistos humanos podem ser cultivados in vitro para permitir a seleção de embriões mais viáveis para transferência, bem como permitir testes genéticos seguros. A melhoria das técnicas de cultura de embriões, bem como o uso crescente de FIV, produziram muitos blastocistos excedentes que permanecem após a conclusão dos ciclos de tratamento do paciente. Com o consentimento do paciente, aprovação do IRB e com certas restrições, esses blastocistos podem ser utilizados para estudos de pesquisa. Tornaram-se um recurso inestimável que foi utilizado para a derivação de células-tronco embrionárias humanas5, entendendo a transição da massa celular interna para células-tronco embrionárias6,,7e, mais recentemente, foram cultivadas com sucesso até o dia (D) 13 para remodelar a implantação humana8,,9. Ao utilizar abordagens de omics unicelulares recém-desenvolvidas, o acesso a esses tecidos embriões humanos em estágio de implantação tem oferecido oportunidades únicas para descrever os mecanismos moleculares que regulam esse processo de diferenciação celular altamente dinâmico, que antes eram impossíveis de explorar10,,11,,12,13.
Aqui, descrevemos os métodos utilizados em nossa recente publicação caracterizando a dinâmica da diferenciação do trophoblasto durante a implantação humana12. Este protocolo inclui o aquecimento de blastocistos vitrificados, cultura de embriões estendida até D12 pós FIV, digestão enzimática do embrião em células únicas e coleta de células para ensaios a jusante(Figura 1). Este sistema de cultura estendida apoia o desenvolvimento de embriões humanos em estágio de peri-implantação sem insumo materno e recapitula a diferenciação do trophoblasto que parece consistente com as observações feitas a partir de espécimes histológicos há muitos anos14,,15,,16,17. Durante a implantação, a população de trophoblasto é composta por pelo menos dois tipos de células: o citotrofoblasto progenitor mononucleado (CTB) e o sintiotrofost (STB) internucleado, diferenciado terminalmente diferenciado. Após a digestão da trippsina, o CTB são células pequenas e redondas que são morfologicamente indistinguíveis de outras linhagens celulares(Figura 2A, painel esquerdo). A separação do CTB de outras linhagens celulares, como epiblasto e endoderme primitivo, pode ser alcançada por seus distintos perfis transcriômicos revelados pelo sequenciamento de RNA de célula única. As células sincitotrofoblastos podem ser facilmente identificadas como estruturas de forma irregular que são significativamente maiores que os outros tipos de células e localizadas principalmente na periferia do embrião (Figura 2A, painel médio; Figura 2B, painel esquerdo). As células de trophoblasto migratório (MTB) são outra sublineagem trophoblasto encontrada durante a cultura estendida do embrião e podem ser reconhecidas como aparentemente se afastando do corpo principal do embrião (Figura 2A, painel direito, Figura 2B, painel direito). O trophoblasto migratório, embora expresse muitos dos mesmos marcadores do trophoblasto extra villous (EVT), não deve ser referido como EVT, uma vez que as estruturas villous na placenta não surgiram neste estágio inicial de desenvolvimento.
Experimentalmente, conseguimos coletar pequenos CTB e STB grandes que são facilmente distinguíveis depois que embriões são digeridos em células únicas em D8, D10 e D12 (Figura 2A,B). Os trophoblastos migratórios surgem nos estágios posteriores da cultura de embriões estendidos e podem ser coletados em D12 antes da digestão enzimática de todo o embrião (Figura 2A,B). Ao separar fenotipicamente essas três sublineagens trophoblastos antes da análise de células únicas, podemos identificar marcadores transcriômicos específicos e definir o papel biológico de cada tipo de célula. O citotrofoblasto é altamente proliferativo e atua como células progenitoras no fornecimento das linhagens diferenciadas STB e MTB10,,11,,12,,13. O sinintismotrofã está envolvido na produção de hormônios placentários para manter a gravidez e também pode ser responsável pelos embriões que penetram no endométrio10,,11,12,13. O trophoblasto migratório tem características ainda mais fortes de um fenótipo migratório invasivo e migratório e são provavelmente responsáveis pela colonização mais profunda e extensa do endométrio uterino10,,11,,12,13. Após a definição da assinatura transcriômica de cada tipo de célula, as análises de agrupamento também revelaram dois subconjuntos adicionais de células que eram morfologicamente indistinguíveis da CTB e tinham transcriptomes com características de STB e MTB,respectivamente 12. Essas células de estágio intermediário provavelmente estão no processo de diferenciação do CTB para as sublineagens MTB ou STB e teriam sido negligenciadas se os embriões fossem digeridos cegamente e as células fossem separadas apenas por transcriptome.
O protocolo descrito aqui utiliza um sistema de cultura bidimensional (2D) e pode não ser ideal para suportar o desenvolvimento estrutural tridimensional (3D), como sugerido por uma publicação recente descrevendo um recém-desenvolvido sistema de cultura 3D13. No entanto, neste sistema 2D a diferenciação do trophoblast precoce parece ser consistente com observações feitas a partir de espécimes in vivo14,,15,,16,17. Este protocolo também pode ser facilmente adaptado para o uso no recém-descrito sistema de cultura 3D13 com mudanças mínimas. Todas as etapas são realizadas com uma pipeta de micromanipulação portátil com pontas descartáveis comercialmente disponíveis ou uma pipeta bucal de uma pipeta de vidro finamente puxada presa a tubos de borracha, um filtro e um porta-voz.
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Protocol
Todos os embriões humanos foram doados com consentimento para uso em pesquisa. Os protocolos para a cultura estendida do embrião humano foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional ocidental (estudo nº 1179872) e seguem diretrizes internacionais. Qualquer uso de embriões humanos deve ser revisto pelos órgãos de ética e governo adequados associados à instituição de pesquisa por meio deste protocolo.
1. Preparação
- Prepare a mídia e as placas de recuperação um dia antes do aquecimento do embrião em um capô de fluxo laminar estéril.
- Prepare 2 mL de mídia de cultura blastocisto (BM) com 10% v/v substituto de proteína sérico (SPS).
NOTA: A mídia de cultura blastocisto pode ou não conter proteína adicionada. Aqui, utilizamos um meio que deve ser suplementado com 10% da proteína albumina indicada. Verifique as orientações do fabricante para obter a variação desta suplementação. Todas as mídias devem ser filtradas usando um filtro estéril de 0,22 μM conectado a uma seringa estéril antes do equilíbrio. - Encha dois pratos de lavagem de cultura de órgãos de centro-bem com 500 μL de BM com 10% v/v SPS cobertos com 500 μL de óleo de grau de cultura embrionária.
- Em um prato de cultura de tecido de 60 mm, camada 8 mL de óleo de cultura de embriões e, em seguida, ancorar 20 gotas de μL de BM com 10% v/v SPS para o fundo da placa de cultura. Faça 1 gota para cada embrião aquecido.
NOTA: Mais mídia, gotas e lavar pratos podem ser feitos conforme necessário. As gotas também podem ser adicionadas ao prato antes que o óleo seja em camadas. As gotas de ancoragem sob o óleo ajudarão a reduzir a evaporação e quaisquer alterações subsequentes na osmolalidade. - Equilibre a BM com 10% v/v SPS lavar pratos e placa de recuperação em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO2, 5% O2 por pelo menos 4h.
- Descongele um frasco da primeira etapa da mídia de cultura estendida (IVC1) em 4 °C ou na parte superior do banco.
- Prepare um prato de lavagem de 500 μL de IVC1 sem sobreposição de óleo. Alíquota de aproximadamente 4 mL de IVC1 em um tubo de tampa de snap de 5 mL.
- Equilibre o prato de lavagem IVC1 e pequeno tubo de tampa de estalo de IVC1 em 37 °C, 6% CO2 e O2 atmosférico por pelo menos 4 h.
- Prepare 2 mL de mídia de cultura blastocisto (BM) com 10% v/v substituto de proteína sérico (SPS).
- Prepare placas de cultura estendidas um dia antes do aquecimento do embrião em uma capa de fluxo laminar estéril.
- Fibronectina diluída do soro humano em soro tamponado de fosfato (PBS) a 30 μg/mL. Serão necessários 250 μL de fibronectina de 30 μg/mL por embrião para revestir as câmaras.
- Abra o pacote de tampas bem câmara sob o capô enquanto toma cuidado para não tocar nos poços. Pipeta suavemente 250 μL de 30 μg/mL fibronectina em cada poço.
- Retorne a tampa para o deslizamento de cobertura câmara e coloque em 4 °C para 20-24 h.
- Prepare a placa de cultura estendida na manhã do aquecimento do embrião.
- Recupere o deslizamento de cobertura com fibronectina e coloque na capa de fluxo laminar. Remova a mistura de fibronectina com uma pipeta de 1 mL e descarte no recipiente de resíduos.
- Recuperar mídia IVC1 aquecida e equilibrada a partir de um pequeno tubo de tampa de snap de 5 mL.
- Pipeta 300 μL de IVC1 equilibrado em cada poço. Tenha cuidado para não deixar nenhum fluido tocar na tampa, pois isso aumentará o risco de contaminação.
- Retorne o deslizamento de cobertura câmara com IVC1 para incubar em 37 °C, 6% DE CO2 e atmosférico O2 até a remoção da zona pellucida na etapa 4.
2. Aquecimento vitrificado D5 embriões humanos
NOTA: Outros fabricantes podem ter protocolos ligeiramente diferentes de acordo com sua própria tecnologia de vitrificação. Consulte as instruções do fabricante para uso quando aplicável.
- Aqueça 3,0 mL de solução de descongelamento (TS) em prato de 35 mm a 37 °C. Leve 300 μL de solução de diluição (DS) e dois poços de 300 μL de solução de lavagem (WS) em uma placa de 6 poços à temperatura ambiente.
- Usando fórceps, remova cuidadosamente a manga do dispositivo criogeno, garantindo que o embrião vitrificado permaneça sempre sob nitrogênio líquido.
- Mova rapidamente o dispositivo criogeno de nitrogênio líquido e mergulhe a ponta do dispositivo criogeno em TS a 37 °C. Defina um temporizador por 1 min e mantenha o dispositivo criomerado até que o embrião se desprende no TS.
NOTA: Embriões quentes um de cada vez para acompanhar as identidades dos embriões, pois podem estar relacionados com informações demográficas dos pacientes na análise a jusante. - Durante a incubação de 1 min em TS, remova cuidadosamente o dispositivo criogeno e pegue suavemente o embrião e mova-se para o lado oposto do prato TS.
NOTA: Se aculturar vários embriões, seja diligente para manter os embriões separados para garantir que as identidades adequadas sejam mantidas. - Após 1 min, pegue suavemente o embrião com uma pequena quantidade de TS, aproximadamente 2 μL. Mova o embrião para o fundo do poço de 300 μL DS enquanto cobre o embrião em uma fina camada de TS da pipeta. Coloque um temporizador por 3 minutos e coloque a placa de 6 poços na parte superior do banco à temperatura ambiente.
- Após 3 min, pegue o embrião com uma pequena quantidade de DS, aproximadamente 2 μL, e mova o embrião para o fundo do próximo poço contendo 300 μL de WS. Novamente, coloque suavemente uma pequena quantidade de DS da pipeta sobre o embrião. Defina um temporizador por 5 minutos e retorne ao banco de cima.
- Depois de 5 min, pegue o embrião com volume mínimo de WS e passe para o topo do poço final de 300 μL WS. O embrião cairá lentamente e lavará através do WS até o fundo. Expulse qualquer WS retido da pipeta para um poço vazio.
- Pegue o embrião com volume mínimo e retorne ao topo do mesmo poço de 300 μL de WS. O embrião cairá mais uma vez para o fundo do poço. Defina um temporizador por 1 min e devolva a placa de 6-well para o banco de cima.
3. Recuperação de embriões aquecidos
- Um de cada vez, mova embriões aquecidos para um prato de tecido de órgãos de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado.
- Lave embriões pegando cada embrião e movendo-os para várias áreas do prato enquanto sopram a velha mídia entre os movimentos. Pegue o embrião e mova-o para uma queda de cultura individual de 20 μL de BM equilibrada com 10% v/v SPS sob óleo.
- Deixe os embriões aquecidos se recuperarem por 2h em uma incubadora a 37 °C, 6% DE CO2, 5% O2.
4. Remoção da zona
- Após uma recuperação de 2h, avalie os embriões para a reese expansão e tire fotos de cada embrião.
- Mova embriões individualmente em 500 μL de um ácido 3-(N-morpholino)-ácido propanesulfônico (MOPS) com soro de bezerro fetal (V/v) antes do tratamento com solução ácida de Tyrode.
- Mova um embrião rapidamente através de 300 μL da solução de Tyrode ácido aquecido enquanto observa ativamente através do microscópio. A zona pellucida começará a se dissolver visualmente. Isso vai levar aproximadamente 5 s.
- Mova imediatamente o embrião com zona dissolução em 300 μL de mops aquecido médio tamponado para saciar a solução do ácido Tyrode.
- Mova o embrião com volume mínimo de mops tamponado médio em uma antena de tecido de órgão de poço central contendo 500 μL de BM equilibrado com 10% v/v SPS abaixo de 500 μL de óleo de grau de cultura de embriões equilibrado para lavar.
- Retorne o embrião à queda de recuperação de 20 μL da etapa 3.2.
NOTA: Após o exame visual após a remoção da zona, quaisquer embriões com pellucida zona retida podem ser tratados com solução de Tyrode ácida, se necessário, repetindo as etapas 4.2-4.6. É desejado minimizar a exposição à solução do Tyrode.
5. Cultura estendida do blastocisto
- Mova os embriões individualmente para o prato de lavagem com mídia IVC1 equilibrada a partir da etapa 1.1.6. Mova cuidadosamente um embrião para um poço do deslizamento de coberturas com IVC1 equilibrado e mantenha a identificação do embrião.
NOTA: Esta etapa precisa ser concluída o mais rápido possível para minimizar a evaporação média. - Deslizamento de cobertura com câmara de retorno para uma incubadora definida para 37 °C, 6% CO2, atmosférico O2 por 2 dias.
NOTA: Certifique-se de descongelar e equilibrar a mídia em 37 °C, 6% DE CO2, o atmosférico O2 para a troca de mídia 4h de antecedência. - No outgrowth D2 (D7 pós fertilização), examine cuidadosamente a fixação de embriões sob o microscópio e realize a troca de mídia.
- Observe qual embrião está preso ao prato antes de trocar mídia. Bata suavemente na placa e examine se um embrião está firmemente preso à placa sob o microscópio.
- Retire a tampa e remova cuidadosamente 150 μL de IVC1 e descarte sem perturbar o embrião anexado. Se um embrião ainda não tiver ligado à placa, não troque a mídia, pois o soro em IVC1 ajudará na fixação de embriões.
- Pipeta 150 μL de mídia de cultura estendida equilibrada, IVC2, lentamente em cada poço e retornar a tampa para o deslizamento de cobertura câmara.
NOTA: Certifique-se de que a remoção da tampa da tampa de câmara é minimizada para evitar a evaporação média.
- Devolva cuidadosamente a tampa de câmara para a incubadora sem espirrar qualquer mídia na tampa. Repita a troca de mídia e verifique o anexo todos os dias de cultura estendida até que os embriões estejam prontos para fixação ou digestão de células únicas.
6. Coleta opcional de mídia gasta
- Opcionalmente, colete mídia gasta durante a troca de mídia cultural após d7 ou qualquer dia depois. Durante a etapa 5.3.2, em vez de descartar o snap-freeze médio os 150 μL do IVC1 removido em um tubo estéril e de baixa ligação de 0,5 mL para análise futura.
7. Fixação opcional para imunofluorescência
- Use uma pipeta de 200 μL para lavar embriões com trocas de mídia de 1/2 de PBS por 3x antes da fixação para remover quaisquer detritos extracelulares. Lavar detritos e proteínas em excesso ajudará a otimizar a clareza e reduzir o fundo em imagens obtidas com imunofluorescência.
- Remova todas as mídias e adicione lentamente 200 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) no PBS ao poço. O embrião vai querer grudar na superfície do fluido. Várias lavagens de 150 μL com 4% de PFA antes de remover todo o fluido ajudarão a minimizar qualquer dano ao embrião.
- Incubar os embriões em 4% de PFA por 20 minutos para fixação.
- Lave os embriões 3x por 10 min por lavagem com 200 μL de 0,1% v/v polisorbato 20 em PBS fresco.
- Armazene embriões fixos em 0,1% v/v polisorbate 20 em PBS a 4 °C antes de prosseguir com o protocolo de imunofluorescência.
8. Digestão celular única com Trippsin
NOTA: Embriões frescos (não fixos) são usados para digestão celular única.
- Lave o embrião uma vez com 200 μL de PBS e adicione 200 μL de solução de trippsina a cada poço. Devolva a tampa de câmara para a incubadora por 5 minutos.
- Remova a tampa de câmara da incubadora e examine os embriões sob um estereoscópio. As células da periferia do embrião começarão a se retrair e o MTB ainda deve ser anexado à placa onde estão remotamente localizados a partir do embrião.
- Use uma pipeta pequena ou uma pipeta bucal finamente puxada para pegar MTB individual antes de quebrar todo o embrião. Pule para a etapa 9.1 para salvar mtb e volte à etapa 8.4 após a etapa 9.3.
- Use uma pipeta de micromanipulação portátil ou pipeta bucal para dissociar suavemente o embrião aspirando para cima e para baixo.
- As células começarão a se dissociar de todo o embrião. Continue aspirando o embrião suavemente e repetidamente usando uma ponta de pipeta de diâmetro menor ou pipeta bucal até que o embrião tenha sido incubado por um total de 10 minutos em trippsina.
9. Seleção de células únicas e coleta de amostras
- Com trippsina mínima, mova as células dissociadas através de três gotas de lavagem de 20 μL PBS + 0,1% de polivinylpyrrolidone (PVP) sob óleo de cultura de embriões com o cuidado de não perder nenhuma célula.
- Depois de lavar as células, use uma pipeta de vidro finamente puxada para selecionar uma célula. Pipete cuidadosamente a célula única em um tubo estéril de 0,2 mL de baixa ligação com volume mínimo de PBS+0,1% PVP.
- Esto a 1 a 1 em células únicas de congelamento em nitrogênio líquido (LN2), e armazene em -80 °C para uso futuro.
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Representative Results
Embriões saudáveis apresentaram proliferação contínua ao longo da cultura estendida(Figura 2B). Embriões anormais começaram a se retrair de suas bordas externas e se desintegrarem(Figura 2C). Pela nossa experiência, aproximadamente 75% dos embriões foram anexados ao fundo do prato revestido de fibronectina a 48 h e o acessório aumentou para aproximadamente 90% em 72 h na cultura. O sucesso do apego ao embrião pode ser em grande parte impactado pela qualidade inicial dos blastocistos. Embriões não ligados por 72 h provavelmente não sobreviverão.
Na D8 pós fertilização (D3 de cultura estendida), a maioria das células nos embriões foi de CTB que foram positivas para o marcador trophoblasto GATA3 (Figura 3A). Os citotrofoblastos já haviam começado a se diferenciar em STB multinucleado na periferia do embrião (Figura 2B, painel esquerdo, linha pontilhada). Estes STB tinham uma aparência semelhante a uma folha e foram manchados positivos para o subunit de gonadotropina coriônica humana (hCGB; Figura 3A, painel central). Os embriões cresceram rapidamente, entre D8 e D10, sugerindo uma rápida proliferação celular de CTB durante esse período. Na D10, a formação de CGB positivo de MTB foi no máximo, o que poderia ser confirmado pelo aumento da produção de hCG neste momento(Figura 3B). Os trophoblastos migratórios também começaram a emergir e migraram para longe do corpo do embrião e foram manchados positivos para o marcador EVT, HLA-G (Figura 3A, painel direito). Em D12, a diferenciação do STB estava em declínio e a produção de MTB tornou-se mais proeminente, sugerindo uma mudança de ênfase da produção hormonal em D10 para a migração celular em D12. Essas alterações foram observadas por vídeo de lapso de tempo obtido durante este período de peri-implantação(Filme 1). Nossos dados de sequenciamento de RNA de célula única também refletiram tais mudanças dinâmicas na função celular. Juntos, esses dados sugerem a diferenciação precoce do trophoblasto e o surgimento da placenta precoce é um processo dinâmico, durante o qual o embrião pode priorizar funções celulares altamente especializadas em momentos muito específicos para alcançar a implantação bem sucedida.
Figura 1: Esquema processual de cultura estendida e coleta de amostras de célula única.
Fluxo de trabalho de embriões vitrificados de aquecimento, remoção de zona pellucida, cultura de embriões estendidos, digestão enzimática e isolamento do citotrofoblasto (CTB), sinintismotrofóblástico (STB) e trophoblast migratório (MTB). Este número foi modificado a partir de West et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Morfologias de células trophoblastos e embriões durante a cultura estendida.
(A) Imagens representativas de diferentes tipos de células trophoblastos após digestão enzimática com trippsina. Pequeno CTB à esquerda, STB grande no meio, e MTB à direita. (B) Imagens representativas de embriões saudáveis em D8 (esquerda), D10 (meio) e D12 (direita). Linhas tracejadas no painel esquerdo esboçam a população de CTB presumivelmente proliferativa, enquanto a linha pontilhada descreve o STB achatado. Círculos cor-de-rosa no painel direito esboçam MTB que estavam remotamente localizados a partir do embrião. (C) Imagens representativas de embriões anormais começando a se retrair e desintegrar-se em D8 (esquerda), D10 (meio) e D12 (direita). Barras de escala = 200 μm. Algumas imagens foram adaptadas de West et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas da expressão do marcador trophoblasto e da produção de hCG durante a cultura estendida.
(A) Imagens representativas de imunofluorescência de embriões mostrando expressão de um marcador CTB GATA3 em D10 (esquerda), marcador STB CGB em D10 (médio) e marcador MTB HLA-G em D12 (direita). Barras de escala= 200 μm. (B) Concentração representativa de hCG (mIU/mL) ao longo da cultura estendida de D8 para D12 (média± SEM, n = 3). A análise estatística foi realizada com a ANOVA Unidirecional seguida do teste de Tukey (P < 0,05). Estas imagens foram adaptadas de West et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Vídeo de lapso de tempo de um embrião humano em cultura estendida de D8 para D12. O vídeo demonstra o colapso do blastocoel, a formação do STB (indicado pelos círculos verdes) e, em seguida, eventual diferenciação e migração de MTB (indicado pelos círculos laranja). Isto foi adaptado de West et al.12. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O desenvolvimento do protocolo para cultivar embriões humanos através da implantação permitiu aos cientistas explorar um tempo anteriormente inexplorado no desenvolvimento8,,9. Aqui, usamos um sistema de cultura estendido para cultivar embriões humanos e estudar a diferenciação do trophoblasto precoce antes da formação de placenta villous. Os métodos aqui descritos permitem coletar diferentes sublineagens de TB para uso na análise de células únicas a jusante. Este trabalho permite à comunidade científica a chance de entender esse período crítico e enigmático no desenvolvimento humano, podendo abrir novas oportunidades para tratamentos terapêuticos para aborto ou outras patologias placentárias, como a pré-eclâmpsia, bem como fornecer novas percepções sobre o desenvolvimento humano precoce.
Este protocolo requer habilidades na manipulação rápida de embriões durante o aquecimento do embrião, remoção da zona e revestimento para minimizar o estresse dos embriões antes da cultura estendida. Minimizar a evaporação da mídia e, portanto, um aumento da osmolalidade média limitando o tempo de exposição durante a troca de mídia é essencial. Tomar cuidado para usar a técnica asséptica adequada ao trocar pratos médios e móveis ajudará a minimizar a contaminação. Estabilizar o prato quando estiver em uso para minimizar qualquer perturbação mecânica uma vez que os embriões tenham ligado também é importante. Embriões que se estressam começarão a recuar suas projeções sinciárias e começarão a apoptose. Também é fundamental evitar permitir que o menisco dos meios culturais toque a superfície do embrião e minimize qualquer óleo nos poços. Qualquer um desses cenários pode destruir o embrião.
Culturing embriões humanos além do estágio blastocisto é um campo em rápida evolução. Um estudo recente13 demonstrou que um novo sistema de cultura que contém 10% de uma mistura de proteínas de matriz extracelular e um meio com suplementação adicional de piruvato de sódio, lactato e proteína suplementar (ROCK) inibidor é vantajoso na modelagem in vivo arquiteturas embrionárias 3D e produziu embriões significativamente mais viáveis em estágio posterior de cultura estendida em comparação com o sistema de cultura estendida descrito aqui. A validação deste novo sistema para demonstrar sua reprodutibilidade será necessária. Acreditamos que os procedimentos aqui descritos podem ser adaptados a este novo sistema 3D com pequenas alterações e podem, portanto, beneficiar o avanço da metodologia neste campo.
Este protocolo também pode ser adaptado para permitir a investigação sobre a otimização da mídia de cultura de FIV. Recentemente mostramos que, no desenvolvimento de camundongos, embriões durante a cultura estendida pode prever o sucesso do desenvolvimento fetal após a transferência de embriões18. Zygotes humanos anormalmente fertilizados e descartados com 3 pronucleis (PN) podem ser cultivados a blastocistos em D5 em diferentes condições que podem então influenciar seu desenvolvimento durante a cultura estendida. Os blastocistos humanos D5 doados podem ser cultivados por 48h em novas condições antes de serem colocados no sistema de cultura estendida para avaliação de desempenho. Medições rotineiras do número celular do epiblasto, número total de células, área de crescimento e hCG permitiram ao nosso laboratório entender melhor como diferentes condições de mídia cultural podem apoiar melhor o desenvolvimento de embriões pré-implantação humanas e influenciar seu sucesso pós-implantação.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer os muitos pacientes do Centro de Medicina Reprodutiva do Colorado (CCRM) que graciosamente doaram seus embriões para pesquisa. Também gostaríamos de agradecer a Karen Maruniak e ao laboratório clínico da CCRM por sua ajuda no processamento de amostras de hCG, bem como Sue McCormick e sua equipe clínica de embriologia de FIV na CCRM por sua ajuda na coleta, armazenamento, rastreamento e doação de embriões. O financiamento foi fornecido internamente pela CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
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