Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Erwärmung verglaster menschlicher Blastozysten, die sie durch die Implantationsphase in vitro kultivieren, sie in einzelne Zellen verdauen und frühe Trophoblastenzellen für weitere Untersuchungen sammeln.
Abstract
Die menschliche Implantation, die Apposition und Haftung an der Gebärmutteroberflächenepithelie und die anschließende Invasion der Blastozyste in die mütterliche Dekliste, ist ein kritisches, aber rätselhaftes biologisches Ereignis, das aufgrund technischer und ethischer Einschränkungen historisch schwierig zu untersuchen war. Die Implantation wird durch die Entwicklung des Trophektoderms zu frühen Trophoblasten und die anschließende Differenzierung in unterschiedliche Trophoblasten-Unterlinien eingeleitet. Aberrante frühe Trophoblastendifferenzierung kann zu Implantationsversagen, Plazentapathologien, fetalen Anomalien und Fehlgeburten führen. Kürzlich wurden Methoden entwickelt, die es menschlichen Embryonen ermöglichen, bis zum Tag 13 nach der Befruchtung in vitro in Abwesenheit von mütterlichem Gewebe zu wachsen, eine Zeit, die die Implantationszeit beim Menschen umfasst. Dies hat den Forschern die Möglichkeit gegeben, die menschliche Implantation zu untersuchen und die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während dieser kritischen Periode zu rekapitulieren, ohne mütterliche Einflüsse zu verwirren und inhärente Hindernisse zu vermeiden, um frühe Embryodifferenzierungsereignisse in vivo zu untersuchen. Um verschiedene Trophoblast-Unterlinien während der Implantation zu charakterisieren, haben wir bestehende zweidimensionale (2D) erweiterte Kulturmethoden übernommen und ein Verfahren entwickelt, um verschiedene Arten von Trophoblastenzellen für nachgeschaltete Assays enzymatisch zu verdauen und zu isolieren. Embryonen, die in 2D-Bedingungen kultiviert werden, haben eine relativ abgeflachte Morphologie und können suboptimal bei der Modellierung dreidimensionaler (3D) embryonaler Architekturen in vivo sein. Die Trophoblastendifferenzierung scheint jedoch weniger betroffen zu sein, wie die erwarteten Veränderungen der Morphologie und der Genexpression im Laufe der erweiterten Kultur zeigen. Verschiedene Trophoblast-Unterlinien, einschließlich Cytotrophoblast, Synzytiotrophoblast und migratorischer Trophoblasten, können durch Größe, Position und zeitliche Entstehung getrennt und für weitere Charakterisierungen oder Experimente verwendet werden. Die Untersuchung dieser frühen Trophoblastenzellen kann entscheidend zum Verständnis der menschlichen Implantation, zur Behandlung von häufigen Plazentapathologien und zur Milderung der Inzidenz von Schwangerschaftsverlusten beitragen.
Introduction
Die menschliche Implantation und die Entstehung der frühen Plazenta sind historisch schwer zu untersuchen und bleiben weitgehend unbekannt, da menschliche Gewebe in diesem Stadium, in dem eine Schwangerschaft klinisch nicht nachweisbar ist, unzugänglich sind. Tiermodelle sind unzureichend, da die menschliche Platierweise ihre eigenen Einzigartigen im Vergleich zu anderen eutherischen Säugetieren hat. Zum Beispiel dringt die menschliche Plazenta tief in die Dezidua ein, wobei einige Trophoblastenzellen mindestens das innere Drittel des Uterusmyometriums erreichen, während andere Zellen die Gebärmutterspiralarterien umgestalten. Selbst unsere nächsten evolutionären Vorfahren, die nichtmenschlichen Primaten, zeigen Unterschiede in der plazentatren Morphologie und trophoblastischen Wechselwirkungen mit den mütterlichen deziduellen Geweben1,2,3. Die Beschaffung von vorderimplantationen menschlichen Embryonen in vitro war erst in den 1980er Jahren möglich, als die klinische menschliche In-vitro-Fertilisation (IVF) als Routinepraxis zur Behandlung von Unfruchtbarkeit begann4. Jetzt können menschliche Blastozysten in vitro angebaut werden, um die Auswahl lebensfähigerer Embryonen für den Transfer zu ermöglichen und sichere genetische Tests zu ermöglichen. Die Verbesserung der Embryokulturtechniken sowie der zunehmende Einsatz von IVF haben zu vielen überschüssigen Blastozysten geführt, die nach Abschluss der Behandlungszyklen des Patienten erhalten geblieben sind. Mit Zustimmung des Patienten, IRB-Zulassung, und mit bestimmten Einschränkungen, Diese Blastozysten können für Forschungsstudien verwendet werden. Sie sind zu einer unschätzbaren Ressource geworden, die für die Ableitung menschlicher embryonaler Stammzellen verwendet wurde5, das Verständnis des Übergangs der inneren Zellmasse zu embryonalen Stammzellen6,7, und in jüngerer Zeit, wurden erfolgreich bis zum Tag (D) 13 kultiviert, um die menschliche Implantationumzugestalten 8,9. Durch die Verwendung von kürzlich entwickelten einzelzelligen Omics-Ansätzen bietet der Zugang zu diesen implantationsphase menschlichen Embryogeweben einzigartige Möglichkeiten, die molekularen Mechanismen zu beschreiben, die diesen hochdynamischen Zelldifferenzierungsprozess regulieren, die bisher unmöglich zu erforschen waren10,11,12,13.
Hier beschreiben wir die Methoden, die in unserer jüngsten Publikation verwendet werden, die die Dynamik der Trophoblastendifferenzierung während der menschlichen Implantation12charakterisiert. Dieses Protokoll umfasst die Erwärmung verglaster Blastozysten, die erweiterte Embryokultur bis D12 nach DerIVF, die enzymatische Verdauung des Embryos in einzelne Zellen und die Zellentnahme für nachgeschaltete Assays (Abbildung 1). Dieses erweiterte Kultursystem unterstützt die Entwicklung des peri-implantationsstadiums menschlicher Embryonen ohne mütterlichen Input und rekapituliert die Trophoblastendifferenzierung, die mit den Beobachtungen aus histologischen Proben vor vielen Jahrenübereinstimmt 14,15,16,17. Während der Implantation besteht die Trophoblastenpopulation aus mindestens zwei Zelltypen: dem mononukleierten Vorläufer-ähnlichen Zytotrophoblasten (CTB) und dem endlos differenzierten, multinukleierten Synzytiotrophoblast (STB). Bei der Trypsinverdauung sind die CTB kleine, runde Zellen, die morphologisch nicht von anderen Zelllinien zu unterscheiden sind(Abbildung 2A, linkes Panel). Die Trennung von CTB von anderen Zelllinien, wie Epiblast und primitivem Endoderm, kann durch ihre unterschiedlichen transkriptomischen Profile erreicht werden, die durch einzellige RNA-Sequenzierung aufgedeckt werden. Syncytiotrophoblast-Zellen können leicht als unregelmäßig geformte Strukturen identifiziert werden, die deutlich größer als die anderen Zelltypen sind und sich hauptsächlich an der Peripherie des Embryos befinden(Abbildung 2A, mittleres Panel; Abbildung 2B, linkes Bedienfeld). Migratory trophoblast cells (MTB) are another trophoblast sublineage found during embryo extended culture and can be recognized as apparently moving away from the main body of the embryo (Abbildung 2A, rechtes Panel, Abbildung 2B, rechtes Panel). Migrierender Trophoblast, obwohl er viele der gleichen Marker wie extra villous trophoblast (EVT) ausdrückt, sollte nicht als EVT bezeichnet werden, da die villous Strukturen in der Plazenta in diesem sehr frühen Entwicklungsstadium nicht entstanden sind.
Experimentell konnten wir kleine CTB und große STB sammeln, die leicht zu unterscheiden sind, nachdem Embryonen in einzelnen Zellen bei D8, D10 und D12 verdaut wurden (Abbildung 2A,B). Wandernde Trophoblasten entstehen in den späteren Stadien der erweiterten Embryokultur und können bei D12 vor der enzymatischen Verdauung des gesamten Embryos gesammelt werden (Abbildung 2A,B). Durch phäotypische Trennung dieser drei Trophoblasten-Unterlinien vor der Einzelzellanalyse können wir spezifische transkriptomische Marker identifizieren und die biologische Rolle jedes Zelltyps definieren. Cytotrophoblast sind hoch proliferativ und fungieren als Vorläuferzellen bei der Versorgung der STB und MTB differenzierten Linien10,11,12,13. Syncytiotrophoblast sind an der Herstellung von Plazentahormonen zur Aufrechterhaltung der Schwangerschaft beteiligt und können auch für die Embryonen verantwortlich sein, die sich in das Endometrium10,,11,12,13graben. Wandernder Trophoblast hat noch stärkere Merkmale eines invasiven, wandernden Phänotyps und ist wahrscheinlich für eine tiefere und umfassendere Besiedlung des Uterusendometriums10,11,12,13verantwortlich. Nach der Definition der transkriptomischen Signatur jedes Zelltyps haben Clustering-Analysen auch zwei zusätzliche Teilmengen von Zellen aufgedeckt, die morphologisch nicht von CTB zu unterscheiden waren und Transkriptome mit Merkmalen von STB und MTB bzw.12hatten. Diese Zwischenstadiumzellen sind wahrscheinlich dabei, sich von CTB auf die MTB- oder STB-Unterlinien zu differenzieren und wären übersehen worden, wenn Embryonen blind verdaut und Zellen allein durch Transkriptom getrennt worden wären.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein zweidimensionales (2D) Kultursystem und ist möglicherweise nicht optimal für die Unterstützung der dreidimensionalen (3D) strukturellen Entwicklung, wie eine kürzlich erschienene Veröffentlichung zur Beschreibung eines neu entwickelten 3D-Kultursystems13. Dennoch scheint in diesem 2D-System die Differenzierung des frühen Trophoblasten mit Beobachtungen aus in vivo Proben14,15,16,17vereinbar zu sein. Dieses Protokoll kann auch leicht für den Einsatz im kürzlich beschriebenen 3D-Kultursystem13 mit minimalen Änderungen angepasst werden. Alle Schritte werden mit einer handgeführten Mikromanipulationspipette mit handelsüblichen Einwegspitzen oder einer Mundpipette aus einer fein gezogenen Glaspipette durchgeführt, die an Gummischläuchen, einem Filter und einem Mundstück befestigt ist.
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Protocol
Alle menschlichen Embryonen wurden mit Zustimmung zur Verwendung in der Forschung gespendet. Protokolle für eine erweiterte menschliche Embryokultur wurden vom Western Institutional Review Board (Studie Nr. 1179872) genehmigt und folgen internationalen Richtlinien. Jede Verwendung menschlicher Embryonen muss von den zuständigen Ethik- und Leitungsgremien überprüft werden, die mit der Forschungseinrichtung unter Verwendung dieses Protokolls verbunden sind.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie Medien und Rückgewinnungsplatten einen Tag vor der Embryoerwärmung in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor.
- Bereiten Sie 2 ml Blastozystenkulturmedien (BM) mit 10% v/v Serumproteinersatz (SPS) vor.
HINWEIS: Blastozystenkulturmedien können zugesetztes Protein enthalten oder auch nicht. Hier haben wir ein Medium verwendet, das mit 10% des angegebenen Albuminproteins ergänzt werden muss. Überprüfen Sie die Herstelleranleitung für Variation in dieser Supplementierung. Alle Medien sollten vor dem Ausgleich mit einem sterilen 0,22-M-M-Filter gefiltert werden. - Füllen Sie zwei Mittel-Well-Organkultur-Waschschüsseln mit 500 l BM mit 10% v/v SPS, die mit 500 l embryokultursgradem Öl abgedeckt sind.
- In einer 60 mm Gewebekulturschale Schicht 8 ml Embryokulturöl und dann 20 L Tropfen BM mit 10% v/v SPS an der Unterseite der Kulturplatte verankern. Machen Sie 1 Tropfen für jeden embryonal ente.
HINWEIS: Mehr Medien, Tropfen und Waschgeschirr können nach Bedarf hergestellt werden. Tropfen können auch der Schale hinzugefügt werden, bevor das Öl geschichtet wird. Verankerung Stropfen unter dem Öl wird dazu beitragen, Verdunstung und alle nachfolgenden Veränderungen in der Osmolalität zu reduzieren. - Equilibrate BM mit 10% v/v SPS Waschgeschirr und Rückgewinnungsplatte in einem Inkubator bei 37 °C, 6%CO2, 5% O2 für mindestens 4 h.
- Eine Durchstechflasche des ersten Schritts der erweiterten Kulturmedien (IVC1) in 4 °C oder auf der Bankplatte auftauen.
- Bereiten Sie eine Waschschale von 500 l IVC1 ohne Ölüberlagerung vor. Aliquot ca. 4 ml IVC1 in ein 5 ml Fangkappenrohr.
- Equilibrate IVC1 Waschschale und kleine Schnappkappenröhre von IVC1 in 37 °C, 6%CO2 und atmosphärischemO2 für mindestens 4 h.
- Bereiten Sie 2 ml Blastozystenkulturmedien (BM) mit 10% v/v Serumproteinersatz (SPS) vor.
- Bereiten Sie erweiterte Kulturplatten einen Tag vor der Embryoerwärmung in einer sterilen laminaren Strömungshaube vor.
- Fibronectin aus humanem Serum in Phosphatgepufferter Saline (PBS) auf 30 g/ml verdünnen. Für die Beschichtung der Kammern werden 250 l von 30 g/ml Fibronectin pro Embryo benötigt.
- Öffnen Sie das 8 gut gekammerte Coverslip-Paket unter der Haube und achten Sie darauf, die Brunnen nicht zu berühren. Sanfte Pipette 250 l von 30 g/ml Fibronectin in jeden Brunnen.
- Den Deckel auf den kammerförmigen Deckelabrutsch eitern und 20-24 h in 4 °C platzieren.
- Bereiten Sie erweiterte Kulturplatte am Morgen der Embryoerwärmung.
- Holen Sie den kammerierten Deckelmitrutsch mit Fibronectin ab und legen Sie ihn in eine laminare Durchflusshaube. Die Fibronectin-Mischung mit einer 1 ml Pipette entfernen und in den Abfallbehälter entsorgen.
- Abrufen erwärmter, ausgeglichener IVC1-Medien aus einem kleinen 5-ml-Snap-Cap-Rohr.
- Pipette 300 l gleichgestelltes IVC1 in jeden Brunnen. Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit den Deckel berührt, da dies das Risiko einer Kontamination erhöht.
- Geben Sie den kammerierten Deckelmitrutsch mit IVC1 in 37 °C, 6% CO2 und atmosphärischemO2 zurück, bis die Zona pellucida in Schritt 4 entfernt wird.
2. Erwärmung verglaster D5 menschlicher Embryonen
HINWEIS: Andere Hersteller können je nach ihrer eigenen Verglasungstechnologie leicht unterschiedliche Protokolle haben. Siehe ggf. Gebrauchsanweisung des Herstellers.
- 3,0 ml Auftaulösung (TS) in 35 mm Schale auf 37 °C erwärmen. Bringen Sie 300 l Verdünnungslösung (DS) und zwei Bohrungen mit 300 l Waschlösung (WS) in einer 6-Well-Platte auf Raumtemperatur.
- Entfernen Sie mit Zangen vorsichtig die Hülse des Kryogeräts, während Sie sicherstellen, dass der verglaste Embryo immer unter flüssigem Stickstoff verbleibt.
- Bewegen Sie das Kryogerät schnell aus flüssigem Stickstoff und tauchen Sie die Spitze des Kryogeräts in TS bei 37 °C ein. Stellen Sie einen Timer für 1 min ein und halten Sie das Kryogerät unter Wasser, bis sich der Embryo in das TS löst.
ANMERKUNG: Warme Embryonen nacheinander, um die Embryoidentitäten nachzuverfolgen, da sie sich auf demografische Informationen der Patienten in der nachgelagerten Analyse beziehen können. - Entfernen Sie während der 1 min Inkubation in TS vorsichtig das Kryogerät und nehmen Sie den Embryo vorsichtig auf und bewegen Sie sich auf die gegenüberliegende Seite der TS-Schale.
HINWEIS: Wenn Sie mehrere Embryonen kultivieren, sollten Sie sorgfältig darauf achten, Embryonen getrennt zu halten, um sicherzustellen, dass die richtige Identität erhalten bleibt. - Nach 1 min, nehmen Sie den Embryo vorsichtig mit einer kleinen Menge tS, ca. 2 l. Bewegen Sie den Embryo auf den Boden des 300-L-DS-Brunnens, während Sie den Embryo in einer dünnen TS-Schicht aus der Pipette abdecken. Stellen Sie einen Timer für 3 min ein und legen Sie die 6-Well-Platte bei Raumtemperatur auf die Tischplatte.
- Nach 3 min nehmen Sie den Embryo mit einer kleinen Menge dS, ca. 2 l, auf und bewegen Sie den Embryo auf den Boden des nächsten Brunnens, der 300 l WS enthält. Erneut eine kleine Menge DS aus der Pipette vorsichtig über den Embryo schichten. Stellen Sie einen Timer für 5 min und kehren Sie zur Bankspitze zurück.
- Nach 5 min, nehmen Sie den Embryo mit minimalem Volumen von WS und bewegen Sie sich an die Spitze der letzten Bohrung von 300 L WS. Der Embryo fällt langsam und wäscht sich durch das WS nach unten. Vertreiben Sie alle zurückgehaltenen WS aus der Pipette in einen leeren Brunnen.
- Nehmen Sie den Embryo mit minimalem Volumen auf und kehren Sie an die Spitze des gleichen 300-L-Brunnens von WS zurück. Der Embryo fällt wieder auf den Boden des Brunnens. Stellen Sie einen Timer für 1 min und geben Sie die 6-Well-Platte an die Bankspitze zurück.
3. Wiederherstellung von erwärmten Embryonen
- Nacheinander wärmte Embryonen in eine zentrisch-gut organische Gewebeschale, die 500 l äquilibriertes BM mit 10% v/v SPS unter 500 l gleichgewichtiver embryokulturelles Öl enthält.
- Waschen Sie Embryonen, indem Sie jeden Embryo aufnehmen und in mehrere Bereiche der Schale bewegen, während sie zwischen den Bewegungen alte Medien ausblasen. Nehmen Sie den Embryo auf und bewegen Sie ihn zu einem individuellen 20-L-Kulturtropfen gleichgefälliger BM mit 10% v/v SPS unter Öl.
- Lassen Sie die erwärmten Embryonen für 2 h in einem Inkubator bei 37 °C, 6%CO2, 5%O2 erholen.
4. Zona Entfernung
- Bewerten Sie nach einer 2 h-Erholung Embryonen zur Erneutexpansion und fotografieren Sie jeden Embryo.
- Bewegen Sie Embryonen einzeln in 500 l einer 3-(N-Morpholino)-Propanesulfonsäure (MOPS)-gepufferten Handhabungsmedium mit 5% (v/v) fetalem Kalbsserum (FCS) vor der Behandlung mit saurer Tyrodes Lösung.
- Bewegen Sie einen Embryo schnell durch 300 l der erwärmten sauren Tyrodes Lösung, während Sie aktiv durch das Mikroskop beobachten. Die Zona pellucida beginnt sich optisch aufzulösen. Dies dauert ca. 5 s.
- Den Embryo sofort mit lösender Zona in 300 L gewärmtes MOPS-gepuffertes Medium bewegen, um die Lösung der Säure Tyrodes zu löschen.
- Bewegen Sie den Embryo mit minimalem Volumen von MOPS gepuffertem Medium in eine zentr-well Organgewebeschale, die 500 l äquilibierteBM mit 10% v/v SPS unter 500 l gleichgewichtiver embryokultursgrades Öl zum Waschen enthält.
- Bringen Sie den Embryo ab Schritt 3.2 auf den 20-L-Rückgewinnungsabfall zurück.
HINWEIS: Bei einer visuellen Untersuchung nach der Zonaentfernung können Embryonen mit zurückgehaltenem Zona pellucidae gegebenenfalls mit der sauren Tyrodeslösung weiter behandelt werden, indem die Schritte 4.2-4.6 wiederholt werden. Die Minimierung der Exposition gegenüber der Tyrode-Lösung ist erwünscht.
5. Blastozysten erweiterte Kultur
- Bewegen Sie die Embryonen einzeln in die Waschschale mit ausgeglichenen IVC1-Medien ab Schritt 1.1.6. Bewegen Sie vorsichtig einen Embryo auf einen Brunnen des kammerierten Deckelslips mit ausgeglichenem IVC1 und halten Sie die Embryo-Identifikation aufrecht.
HINWEIS: Dieser Schritt muss so schnell wie möglich abgeschlossen werden, um die mittlere Verdunstung zu minimieren. - Zurückkammer-Coverslip zu einem Inkubator auf 37 °C, 6%CO2, atmosphärischO2 für 2 Tage.
HINWEIS: Achten Sie darauf, Medien in 37 °C, 6%CO2, atmosphärischo2 für den Medienaustausch 4 h im Voraus aufzutauen und auszubessern. - Bei Auswachsen D2 (D7 nach der Befruchtung), sorgfältig untersuchen, die Befestigung von Embryonen unter dem Mikroskop und führen Medienaustausch.
- Beachten Sie, welcher Embryo vor dem Medienaustausch an der Schale befestigt ist. Tippen Sie vorsichtig auf die Platte und untersuchen Sie, ob ein Embryo sicher an der Platte unter dem Mikroskop befestigt ist.
- Entfernen Sie den Deckel und entfernen Sie vorsichtig 150 l IVC1 und entsorgen Sie, ohne den angeschlossenen Embryo zu stören. Wenn ein Embryo noch nicht an der Platte befestigt ist, tauschen Sie die Medien nicht aus, da das Serum in IVC1 bei der Anhaftung des Embryos hilft.
- Pipette 150 L ausgeglichene erweiterte Kulturmedien, IVC2, langsam in jeden Brunnen und geben Sie den Deckel an den kammerierten Deckelabschlag zurück.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Entfernen des Deckels aus dem kammerförmigen Deckelschlupf minimiert wird, um eine mittlere Verdunstung zu vermeiden.
- Geben Sie den kammerkammerierten Coverslip vorsichtig an den Inkubator zurück, ohne Medien auf den Deckel zu spritzen. Wiederholen Sie den Medienaustausch und die Anhaftungsprüfung jeden Tag der erweiterten Kultur, bis die Embryonen zur Fixierung oder Einzelzellverdauung bereit sind.
6. Optionale Sammlung von verbrauchten Medien
- Optional können Sie verbrauchte Medien während des Austauschs von Kulturmedien nach D7 oder einen Tag danach sammeln. In Schritt 5.3.2 werden die 150 L entfernten IVC1 für zukünftige Analysen in ein steriles, niedrig bindendes 0,5 ml-Rohr eingeschläfert, anstatt das Medium Snap-Freeze zu entsorgen.
7. Optionale Fixierung auf Immunfluoreszenz
- Verwenden Sie eine 200-L-Pipette, um Embryonen mit einem 1/2-Medienaustausch von PBS für 3x vor der Fixierung zu waschen, um außerzelluläre Ablagerungen zu entfernen. Das Wegwaschen überschüssiger Trümmer und Proteine trägt dazu bei, die Klarheit zu optimieren und den Hintergrund von Bildern zu reduzieren, die mit Immunfluoreszenz gewonnen wurden.
- Entfernen Sie alle Medien und fügen Sie langsam 200 l 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in den Brunnen. Der Embryo wird an der Oberfläche der Flüssigkeit kleben wollen. Mehrere 150-L-Wässungen mit 4% PFA vor dem Entfernen aller Flüssigkeit enden dazu, Schäden am Embryo zu minimieren.
- Inkubieren Sie die Embryonen in 4% PFA für 20 min zur Fixierung.
- Waschen Sie Embryonen 3x für 10 min pro Wäsche mit 200 l 0,1% v/v Polysorbat 20 in frischem PBS.
- Feste Embryonen in 0,1% v/v Polysorbat 20 in PBS bei 4 °C lagern, bevor Sie mit dem Immunfluoreszenzprotokoll fortfahren.
8. Einzelzellverdauung mit Trypsin
HINWEIS: Frische (nicht fixierte) Embryonen werden für die Einzelzellverdauung verwendet.
- Waschen Sie den Embryo einmal mit 200 l PBS und fügen Sie jedem Brunnen 200 L Trypsinlösung hinzu. Geben Sie den kammerierten Deckelrutsch für 5 min an den Inkubator zurück.
- Entfernen Sie den kammerierten Deckelausstrich aus dem Inkubator und untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereoskop. Die Zellen an der Peripherie des Embryos beginnen sich zurückzuziehen, und MTB sollte weiterhin an der Platte befestigt werden, wo sie sich entfernt vom Embryo befinden.
- Verwenden Sie eine kleine Pipette oder eine fein gezogene Mundpipette, um einzelne MTB aufzunehmen, bevor Sie den gesamten Embryo auseinanderbrechen. Fahren Sie mit Schritt 9.1 fort, um MTB zu speichern, und kehren Sie nach Schritt 9.3 zu Schritt 8.4 zurück.
- Verwenden Sie eine Hand-Mikromanipulationspipette oder Mundpipette, um den Embryo sanft zu dissoziieren, indem Sie nach oben und unten ansortisieren.
- Die Zellen beginnen, sich vom gesamten Embryo zu lösen. Den Embryo vorsichtig und wiederholt mit einer Pipettenspitze oder Mundpipette mit kleinerem Durchmesser weiter ansaugen, bis der Embryo insgesamt 10 min in Trypsin inkubiert wurde.
9. Einzelzellenauswahl und Probenentnahme
- Mit minimalem Trypsin bewegen Sie die dissoziierten Zellen durch drei Waschtropfen von 20 L PBS + 0,1% Polyvinylpyrrolidon (PVP) unter Embryokulturöl mit Sorgfalt, um keine Zellen zu verlieren.
- Nachdem Sie die Zellen gewaschen haben, verwenden Sie eine fein gezogene Glaspipette, um eine Zelle auszuwählen. Pipetten Sie die Einzelzelle vorsichtig in ein steriles 0,2 ml Niedrigbindungsrohr mit minimalem PBS+0,1% PVP.
- Fangen Sie einzelne Zellen in flüssigem Stickstoff (LN2) einundgefrieren und lagern Sie sie in -80 °C für die zukünftige Verwendung.
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Representative Results
Gesunde Embryonen zeigten im Laufe der erweiterten Kultur eine anhaltende Proliferation (Abbildung 2B). Abnorme Embryonen begannen, sich von ihren äußeren Rändern zurückzuziehen und zerfallen (Abbildung 2C). Aus unserer Erfahrung wurden ca. 75% der Embryonen bei 48 h am Boden der fibronectinbeschichteten Schale befestigt und die Anhaftung stieg in der Kultur um ca. 90% um 72 h an. Der Erfolg der Embryo-Anhaftung kann weitgehend durch die anfängliche Qualität der Blastozysten beeinflusst werden. Embryonen, die nicht mit 72 h befestigt sind, werden wahrscheinlich nicht überleben.
Bei D8 nach der Befruchtung (D3 der erweiterten Kultur) waren die meisten Zellen in den Embryonen CTB, die positiv für den Trophoblastenmarker GATA3 waren (Abbildung 3A). Cytotrophoblasten hatten bereits begonnen, sich in mehrkernigen STB an der Peripherie des Embryos zu differenzieren(Abbildung 2B, linke Spickplatte, gepunktete Linie). Diese STB hatte ein blattartiges Aussehen und wurden positiv für die menschliche Choriongonadotropin Untereinheit Beta (hCGB; Abbildung 3A, Mittelbereich). Die Embryonen wuchsen schnell, zwischen D8 und D10, was auf eine schnelle Zellproliferation von CTB während dieser Zeit hindeutet. Bei D10 war die Bildung von CGB-positivem MTB ein Maximum, was durch den Anstieg der hCG-Produktion zu diesem Zeitpunkt bestätigt werden konnte (Abbildung 3B). Wandernde Trophoblasten begannen ebenfalls zu entstehen und wanderten vom Embryokörper weg und wurden positiv für den EVT-Marker HLA-G(Abbildung 3A, rechtes Panel) gefärbt. Mit D12 war die STB-Differenzierung rückläufig und die MTB-Produktion wurde stärker, was auf eine Verlagerung der Schwerpunkte von der Hormonproduktion auf D10 auf die Zellmigration auf D12 hindeutet. Diese Veränderungen wurden durch Zeitraffer-Videos beobachtet, die während dieser Peri-Implantationsphase gewonnen wurden (Film 1). Unsere einzelzelligen RNA-Sequenzierungsdaten spiegelten auch solche dynamischen Veränderungen in der Zellfunktion wider. Zusammen deuten diese Daten auf eine frühe Trophoblastendifferenzierung hin und die Entstehung der frühen Plazenta ist ein dynamischer Prozess, bei dem der Embryo hochspezialisierte Zellfunktionen zu sehr spezifischen Zeitpunkten priorisieren kann, um eine erfolgreiche Implantation zu erreichen.
Abbildung 1: Prozeduraler Schaltplan der erweiterten Kultur und der Einzelzell-Sample-Sammlung.
Workflow der Erwärmung verglaster Embryonen, Zona Pellucida Entfernung, erweiterte Embryokultur, enzymatische Verdauung, und Isolierung von Cytotrophoblast (CTB), Syncytiotrophoblast (STB), und wandernden Trophoblasten (MTB). Diese Zahl wurde von West et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Morphologien von Trophoblastenzellen und Embryonen während der erweiterten Kultur.
(A) Repräsentative Bilder verschiedener Trophoblastenzelltypen nach enzymatischer Verdauung mit Trypsin. Kleiner CTB auf der linken Seite, großer STB in der Mitte und MTB auf der rechten Seite. (B) Repräsentative Bilder gesunder Embryonen bei D8 (links), D10 (Mitte) und D12 (rechts). Gestrichelte Linien im linken Bereich umreißen vermutlich proliferative CTB-Population, während gepunktete Linie den abgeflachten STB umreißt. Rosa Kreise im rechten Bereich umreißen MTB, die sich aus der Ferne vom Embryo entfernt befinden. (C) Repräsentative Bilder von abnormalen Embryonen beginnen, sich bei D8 (links), D10 (Mitte) und D12 (rechts) zurückzuziehen und aufzulösen. Skalenbalken = 200 m. Einige Bilder wurden von West et al.12adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder des Trophoblasten-Markerausdrucks und der hCG-Produktion während der erweiterten Kultur.
(A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Embryonen, die die Expression eines CTB-Markers GATA3 bei D10 (links), stB-Marker CGB bei D10 (Mitte) und MTB-Marker HLA-G bei D12 (rechts) zeigen. Skala ng= 200 m . (B) Repräsentative hCG-Konzentration (mIU/mL) im Laufe der erweiterten Kultur von D8 bis D12 (mittelwert SEM, n = 3). Die statistische Analyse wurde mit One-Way ANOVA durchgeführt, gefolgt von Tukeys Test (P < 0.05). Diese Bilder wurden von West et al.12adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Zeitraffervideo eines menschlichen Embryos in erweiterter Kultur von D8 bis D12. Das Video zeigt den Zusammenbruch des Blastocoels, die Bildung des STB (angezeigt durch die grünen Kreise) und schließlich die Differenzierung und Migration von MTB (angezeigt durch die orangenen Kreise). Dies wurde von West et al.12adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Die Entwicklung des Protokolls zur Kultur menschlicher Embryonen durch Implantation hat es Wissenschaftlern ermöglicht, eine bisher unbekannte Entwicklungszeit zu erforschen8,9. Hier verwenden wir ein erweitertes Kultursystem, um menschliche Embryonen zu kultivieren und die frühe Trophoblastendifferenzierung vor der Bildung einer villous Plazenta zu untersuchen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es uns, verschiedene TB-Unterlinien für die Nachfluss-Einzelzellanalyse zu sammeln. Diese Arbeit gibt der wissenschaftlichen Gemeinschaft die Möglichkeit, diese kritische und rätselhafte Periode in der menschlichen Entwicklung zu verstehen, und kann neue Möglichkeiten für therapeutische Behandlungen bei Fehlgeburten oder anderen Plazentapathologien wie Präeklampsie eröffnen und neue Erkenntnisse über die frühe menschliche Entwicklung liefern.
Dieses Protokoll erfordert Fähigkeiten in der schnellen Manipulation von Embryonen während der Embryoerwärmung, Zonaentfernung und Beschichtung, um Embryostress vor der erweiterten Kultur zu minimieren. Die Minimierung der Medienverdunstung und damit eine Erhöhung der mittleren Osmolalität durch Begrenzung der Belichtungszeit während des Medienaustauschs ist von wesentlicher Bedeutung. Achten Sie darauf, beim Austausch von Mittel- und beweglichen Gerichten die richtige aseptische Technik zu verwenden, um die Kontamination zu minimieren. Die Stabilisierung der Schale bei Verwendung, um mechanische Störungen zu minimieren, sobald Embryonen befestigt wurden, ist ebenfalls wichtig. Embryonen, die gestresst werden, beginnen, ihre synzytialen Projektionen zurückzuziehen und beginnen zu apoptose. Es ist auch wichtig zu vermeiden, dass der Meniskus der Kulturmedien die Oberfläche des Embryos berühren kann, und jegliches Öl in den Brunnen zu minimieren. Beide Szenarien können den Embryo zerstören.
Die Kultivierung menschlicher Embryonen über das Blastozystenstadium hinaus ist ein sich schnell entwickelndes Feld. Eine aktuelle Studie13 zeigte, dass ein neuartiges Kultursystem, das 10% eines extrazellulären Matrixproteingemisches und ein Medium mit zusätzlicher Supplementierung von Natriumpyruvat, Laktat und Rho-assoziiertem Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor enthält, bei der Modellierung von in vivo 3D embryonalen Architekturen von Vorteil ist und im späteren Stadium der erweiterten Kultur signifikant lebensfähigere Embryonen ergibt als das hier beschriebene erweiterte Kultursystem. Die Validierung dieses neuen Systems zur Nachweis seiner Reproduzierbarkeit ist erforderlich. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Verfahren mit geringfügigen Änderungen an dieses neue 3D-System angepasst werden können und daher der Weiterentwicklung der Methodik in diesem Bereich zugute kommen können.
Dieses Protokoll kann auch angepasst werden, um eine Untersuchung der IVF-Kulturmedienoptimierung zu ermöglichen. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass bei der Maus, Embryo-Entwicklung während der erweiterten Kultur kann den Erfolg der fetalen Entwicklung nach Embryo-Transfer vorhersagen18. Ungewöhnlich befruchtete und ausrangierte menschliche Zygoten mit 3 Vorkernen (PN) können zu Blastozysten auf D5 unter verschiedenen Bedingungen kultiviert werden, die dann ihre Entwicklung während der erweiterten Kultur beeinflussen können. Gespendete D5-Menschliche Blastozysten können unter neuartigen Bedingungen für 48 stunden kultiviert werden, bevor sie zur Leistungsbewertung in das erweiterte Kultursystem aufgenommen werden. Routinemessungen der Epiblastzellzahl, der Gesamtzellzahl, des Auswuchsbereichs und des hCG haben es unserem Labor ermöglicht, besser zu verstehen, wie unterschiedliche Kulturmedienbedingungen die Entwicklung menschlicher Präimplantationsembryonen besser unterstützen und ihren Erfolg nach der Implantation beeinflussen können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten die vielen Patienten am Colorado Center for Reproductive Medicine (CCRM) würdigen, die ihre Embryonen gnädig für die Forschung gespendet haben. Wir danken auch Karen Maruniak und dem klinischen Labor am CCRM für ihre Hilfe bei der Verarbeitung von hCG-Proben sowie Sue McCormick und ihrem klinischen IVF-Embryologie-Team bei CCRM für ihre Hilfe bei der Sammlung, Lagerung, Verfolgung und Spende von Embryonen. Die Finanzierung erfolgte intern durch CCRM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NORM JECT Luer Lock sterile syringe | VWR | 53548-019 | Pack of 100 |
| 3130 or 3110 Forma Series II water-jacketed CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 62406-038 | Case of 500 |
| 5 mL snap cap tube | VWR | 60819-295 | Pack of 25 |
| 60 mm Corning Primaria tissue culture dish | VWR | 25382-687 | Case of 200 |
| 6-well dish | Agtech Inc. | D18 | Pack of 1, 10, or 50 |
| Acidic Tyrode's solution | Millipore Sigma | T1788 | 100 mL |
| Biotix 1250 µL pipette tips | VWR | 76322-156 | Pack of 960 |
| Blast, blastocyst culture media | Origio | 83060010 | 10 mL |
| Dilution Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 in. (146mm); 720/Cs |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Millipore Sigma | D8537 | |
| Embryo culture paraffin oil OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 mL |
| Eppendorf PCR tubes 0.2 mL | VWR | 47730-598 | Pack of 1,000 |
| Eppendorf PCR tubes 0.5 mL | VWR | 89130-980 | Case of 500 |
| Fibronectin from human plasma. Liquid .1% solution | Millipore Sigma | F0895 | 1 mg |
| Gilson 1 mL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 µL |
| Gilson 20 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 µL |
| Gilson 200 µL Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 µL |
| G-MOPS handling media | Vitrolife | 10129 | 125 mL |
| Handling media | Origio | 83100060 | 60 mL |
| Ibidi 8 well chambered coverslip | Ibidi | 80826 | 15 slides per box |
| IVC1/IVC2 | Cell Guidance Systems | M11-25/ M12-25 | 5-5mL aliquots |
| K System T47 Warming Plate | Cooper Surgical | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex Sterile Syringe Filters with Durapore PVFD Membrane | Fisher Scientific | SLGVR33RS | Pack of 50 |
| Mouth pieces | IVF Store | MP-001-Y | 100 pieces |
| Oosafe center well dish | Oosafe | OOPW-CW05-1 | Case of 500 |
| Quinn's Advantage SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 mL |
| Rubber latex tubing for mouth pieces | IVF Store | IVFS-NRL-B-5 | 5 ft. |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1270 | |
| Stripper tips | Cooper Surgical | MXL3-275 | 20/pk 275 µm |
| Thawing Solution | Kitazato | VT802 | 2 x 4 mL |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 x 100 mL |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | 25 mL bottle |
| VWR 1-20 µL pipette tips | VWR | 76322-134 | Pack of 960 |
| VWR 1-200 µL pipette tips | VWR | 89174-526 | Pack of 960 |
| Washing Solution | Kitazato | VT802 | 1 x 4 mL |
References
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- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
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