Summary
В этой статье представлены четыре наиболее распространенных метода визуализации положительных клеток BrdU для измерения взрослого нейрогенеза у крыс. Эта работа включает в себя инструкции по получению реагента, введению аналога тимидина, транскардиальной перфузии, препарату ткани, иммуногистохимической реакции пероксидазы, иммунофлуоресценции, усилению сигнала, контрокрашиванию, микроскопической визуализации и анализу клеток.
Abstract
Одной из наиболее важных вещей в области нейрогенеза гиппокампа взрослых (AHN) является идентификация вновь генерируемых клеток. Иммунодетекция аналогов тимидина (таких как 5-Бром-2'-дезоксиуридин (BrdU)) является стандартным методом, используемым для визуализации этих вновь генерируемых клеток. Поэтому BrdU обычно вводят мелким животным внутрибрюшинно, поэтому аналог тимидина включается в делящиеся клетки во время синтеза ДНК. Обнаружение осуществляется иммуногистохимическим анализом срезов мозга. Каждая исследовательская группа, которая использовала эту технику, может оценить, что она требует особого внимания к мельчайшим деталям для достижения успешного пятна. Например, важным шагом является денатурация ДНК HCl, которая позволяет ей достичь ядра клетки, чтобы окрасить ее. Однако существующие научные отчеты подробно описывают очень немногие из таких шагов. Поэтому стандартизация метода является сложной задачей для новых лабораторий, поскольку для получения положительных и успешных результатов может потребоваться несколько месяцев. Целью данной работы является подробное описание и разработка шагов по получению положительных и успешных результатов методики иммуноокрашивания при работе с аналогом тимидина BrdU. Протокол включает в себя подготовку и установку реагента, введение аналога тимидина у грызуна, транскардиальную перфузию, препарат ткани, иммуногистохимическую реакцию пероксидазы, применение комплекса авидин-биотин, иммунофлуоресценцию, контрокрашивание, микроскопическую визуализацию и анализ клеток.
Introduction
Идея о том, что новые нейроны генерируются в мозге взрослого человека на протяжении всей жизни, очаровывала научное сообщество на протяжении десятилетий. Знание о том, что мозг генерирует новые нейроны на протяжении всей своей жизни, было достигнуто путем обнаружения клеток под делением 1,2. Обнаружение вновь генерируемых нейронов во взрослом мозге было впервые идентифицировано путем внутрикраниального введения тритиированного тимидина (тимидина-H3) у крыс и обнаружения клеток в клеточном цикле с помощью ауторадиограмм 1,2. Сообщалось о делении клеток глии и наличии нейробластов, что стало первыми перспективными данными о постнатальном нейрогенезе1. Тем не менее, использование и обнаружение тимидина-H3 подразумевало использование радиоактивности, которая может быть вредной для людей, которые им управляют. Первая попытка изучить пригодность иммуногистохимии BrdU в изучении пролиферации, миграции и происхождения клеток в нервной системе появилась в 1988 году Миллером и Новаковски3. В 1998 году статья, опубликованная Эрикссоном и его коллегами, показала, что новые нейроны были визуализированы посмертно в мозге взрослого человека пациентов, которым вводили 5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU)4. Эти пациенты получали инъекцию BrdU (250 мг внутривенно) для маркировки роста опухолей4. Этот метод был принят на животных моделях. Внедрение этих методов стало важной вехой для этой области, поскольку это позволило обнаружить вновь генерируемые клетки без использования радиоактивных соединений. Эта процедура стала золотым стандартом для измерения пролиферации клеток в нишах мозга взрослых для содействия дальнейшим исследованиям в этой области.
Ограничение метода аналога тимидина заключается в том, что он не позволяет определить клеточную идентичность для вновь генерируемых клеток. Тем не менее, иммуногистохимия позволяет нам проводить технику двойной или тройной маркировки одной и той же клетки, которая подтверждает клеточную судьбу вновь генерируемых клеток и даже их стадии созревания, что приводит к дальнейшей эволюции поля. Этот метод характеризовался для дифференцировки вновь генерируемых клеток в глию, недифференцированные нейроны или полностью зрелую гранулированную клетку и даже для определения того, активно ли они участвуют в схеме. Еще одним прорывом в этой области стало использование трансгенных моделей для идентификации недифференцированных клеток в домене нестина. Трансгенные мыши nestin-GFP экспрессируют улучшенный зеленый флуоресцентный белок (GFP), который находится под контролем промотора нестина. Нестин является промежуточной нитью, характеризующейся клетками-предшественниками5. Трансгенные мыши nestin-GFP позволили установить ранние этапы развития, участвующие в нейрогенезе6. Однако существенным ограничением является возможность поддерживать колонию трансгенных мышей nestin-GFP в особых условиях в лабораторных условиях, которая становится экономически эффективной для некоторых научных групп, особенно из развивающихся стран.
Методы, упомянутые выше, имеют преимущества и недостатки. Тем не менее, идентификация пролиферирующих клеток с помощью иммуногистохимии (IHC) и возможность проведения метода двойной или тройной маркировки иммунофлуоресценцией для идентификации стадии созревания клеток или судьбы клеток представляет собой наиболее осуществимый способ измерения нейрогенеза взрослых. Процесс идентификации с использованием иммуногистохимии состоит из маркировки белков, белкового домена или нуклеотидов специфическим антителом, которое позволяет распознавать их, известные как первичные антитела. Последнее распознается вторичным антителом, которое маркируется хромогеном (например, пероксидазой хрена) или фторхромом (например, FITC) в сочетании с вторичным антителом. Микроскопы могут обнаруживать как хромогены, так и фторхромные сигналы. Используя IHC, можно идентифицировать мембранные белки, белки цитоскелета или ядерные компоненты, такие как BrdU. С другой стороны, BrdU можно найти в клеточном ядре, поскольку он включен в ДНК во время S-фазы путем конкуренции. Поэтому решающим шагом является денатурация ДНК HCl, которая открывает связи ДНК, чтобы позволить антителу BrdU получить доступ к BrdU в ДНК. Важно знать, что BrdU присутствует в насыщенной концентрации в сыворотке мышей и крыс в течение 15 и 60 мин соответственно, после внутрибрюшинного введения, затем быстро падает до неопределяемых уровней через 60 и 120 мин соответственно7.
Здесь мы описываем четыре различных, но тесно связанных метода IHC: хромогенное косвенное обнаружение с использованием реакции пероксидазы хрена (HRP) с DAB (3,3'-диаминобензидин) без усиления сигнала (этап 4.1), амплификация комплекса авидин-биотин (ABC) (шаг 4.1), обнаружение непрямой иммунофлуоресценции без усиления сигнала (шаг 4.4) и амплификация меченого стрептавидина-биотина (LSAB) (шаг 4.3). Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки и может быть полезен для конкретных потребностей тканей (см. Таблицу 1). Мы решили следовать косвенным методам ICH из-за их доступности и простоты, чтобы внести изменения от хромогенных к флуоресцентным методам обнаружения при использовании неконъюгированных первичных антител. Подход HRP является широко используемым методом IHC из-за его доступности, высокой стабильности, высокой скорости оборота и полной доступности субстратов. Тем не менее, мы рекомендуем использовать положительный контроль, чтобы подтвердить, что метод окрашивания работает точно, и использовать отрицательный контроль для эффективного тестирования функции антител. Множественные иммуноокрашивания или мультиплексные методы IHC (см. шаг 6) являются мощными инструментами для получения больших объемов данных из участка ткани в одном эксперименте. Этот метод особенно важен, когда доступность образцов ограничена. Другим преимуществом является возможность одновременной идентификации специфических белков, совместно экспрессируемых в одном и том же клеточном пространстве, сохраняя при этом целостность тканей. Мультиплекс позволяет окрашивать различные маркеры, выраженные во время конкретных пролиферативных стадий (например, нестин, GFAP, DCX, Ki-67), что позволяет нам достичь более детального исследования пролиферации и дифференциации8. Крайне важно выбрать антитела, совместимые с техникой фиксации, используемой для предотвращения перекрестной реактивности. Мы рекомендуем тестировать каждое новое антитело (включая BrdU) индивидуально, чтобы скорректировать и усовершенствовать метод. Затем вводят двойное последовательное окрашивание и, наконец, запускают одновременный процесс иммуноокрашения, когда последовательный метод полностью доминирует. Крайне важно выбрать соответствующие вторичные антитела для этого метода.
| Метод | Специфический метод | Преимущества | Недостатки |
| Метод косвенного обнаружения | Пероксидазная реакция с DAB | 1. Более высокая чувствительность, чем метод прямого обнаружения и косвенной флуоресценции. 2. Более высокая устойчивость к фотоотбеливанию, чем фторхромы. 3. Более низкая стоимость, чем метод обнаружения флуоресценции |
1. Сложно для мультиплексирования с меньшим количеством цветных красителей. 2. Сложные для Коэкспрессии мишени в одном клеточном пространстве. 3. Уменьшенный динамический диапазон для одновременных дефицитных и высокообильных мишеней на одной и той же ткани. |
| Свечение | 1. Лучший и самый простой для мультиплексирования с большим количеством цветовых красителей. 2. Лучше всего подходит для коэкспрессированных мишеней в одном и том же клеточном пространстве. 3. Улучшенный динамический диапазон для одновременных дефицитных и обильных мишеней на одной и той же ткани. 4. Никаких дополнительных шагов. |
1. Более низкая чувствительность, чем при непрямой пероксидазной реакции методом DAB. 2. Слабая устойчивость к фотоотбеливанию с течением времени. 3. Дороже. |
|
| Метод усиления сигнала | Комплекс Авидин-Биотин (ABC) | 1. Более высокая чувствительность, чем метод прямого и косвенного обнаружения. 2. Уменьшите фон |
1. Дополнительные шаги. 2. Более дорогое, чем не усиление. |
| Меченый стрептавидин-биотин (LSAB) | 1. Более высокая чувствительность, чем метод прямого и косвенного обнаружения. 2. Более существенное проникновение в ткани, чем метод ABC. 3. Уменьшите фон |
1. Дополнительные шаги. 2. Дороже, чем метод ABC. |
|
| Не дополнительный метод усиления | 1. Более низкая стоимость. 2. Никаких дополнительных шагов. 3. Идеально подходит для высоких обильных целей. |
1. Более низкая чувствительность: проблематично без обильных целей. |
Таблица 1: Преимущества/недостатки методов МГК. В этой таблице показаны преимущества/недостатки непрямых методов обнаружения: пероксидазная реакция с (3,3'-диаминобензидином) DAB и флуоресценцией; и методы усиления сигнала: авидин-биотиновый комплекс (АВС), меченый стрептавидин-биотин (LSAB), а не метод дополнительной амплификации.
Изображение с высоким разрешением имеет основополагающее значение для выполнения надлежащего анализа и представления результатов. Существует два подхода к улучшению разрешения: 1) использование лучшей конструкции микроскопа (например, конфокального, многофотонного) или 2) численная инвертирование процесса размытия для улучшения изображений с использованием деконволюции9. К сожалению, конфокальная микроскопия не является доступной из-за высокой стоимости оборудования и его обслуживания10. Широкоугольный эпифлуоресцентный микроскоп и последующая деконволюция изображений z-стека обеспечивают подходящую, недорогую альтернативу конфокальной микроскопии 8,9. Как отмечалось выше, целью деконволюции является восстановление исходного сигнала, который был деградирован системойсбора 9, путем уменьшения размытия, расфокусированной дымки и искажений, показанных на изображении, полученном эпифлуоресцентным или конфокальным микроскопом, с использованием математических алгоритмов удаления10. Полученное размытое изображение может быть математически смоделировано в результате свертывания наблюдаемых объектов с помощью 3D-функции разброса точек (PSF). PSF представляет собой теоретическую дифракционную картину точек света, излучаемых образцом ткани и собранных микроскопом. Файл PSF создается с учетом конкретных условий каждого изображения, таких как расстояние между ПЗС-ячейками камеры, показатель преломления используемой среды, числовая диафрагма объектива, длина волны излучения флуорофора, размеры изображения, количество изображений в методе обработки z-стека и пространство между ними (см. техническую спецификацию в таблице 2). Другими словами, файл PSF суммирует эффекты настройки визуализации на наблюдения микроскопа9. Тем не менее, мы используем дифракционный PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) для создания нашего собственного конкретного PSF-файла для каждого изображения z-stack. Изображения Z-стека представляют собой серию оцифрованных оптических участков с определенной глубины (ось z) в одном и том же месте XY слайда. Компьютер компилирует информацию, полученную из плоскости фокусировки, путем переназначения сигналов, которые исходили от объектов, расположенных в других фокальных плоскостях. Для создания z-стековых изображений необходимо брать изображения из разных сфокусированных слоев слайдов (например, десять разных изображений одной и той же области XY на глубине 1 мкм). Затем мы используем программное обеспечение для микроскопии, предоставленное производителем или Фиджи, для создания z-стека или 3D-изображения. Результатом будет один файл изображения стека (например, десять изображений с разными фокусами). Существует несколько специализированных для клиента инструментов и программных решений, таких как программное обеспечение с открытым исходным кодом для деконволюционной микроскопии. Мы покажем результаты процесса деконволюции с помощью DeconvolutionLab29, который является плагином Fiji11 (дистрибутив ImageJ12). Деконволюция поможет улучшить разрешение конечных микроснимков (см. Рисунок 1B, C). Для получения дополнительной информации и инструкций мы настоятельно рекомендуем прочитать ссылку13.
Рисунок 1: Репрезентативное изображение 3D-деконволюции для нескольких цветовых каналов. (A) DG при низком увеличении. (B) Исходные изображения z-стека для каждого канала и объединенное изображение. (C) 3D-деконволютированные изображения z-стека для каждого канала и объединенного изображения. Этот мозг был от крысы, которая была частью группы физической активности. Использован метод амплификации меченого стрептавидина-биотина (LSAB). Он показал конъюгированное антитело Cy3 стрептавидин для указания BrdU (красный), DAPI в качестве контрокрашащего (синий) и глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в качестве астроглиального маркера (зеленый). ML = молекулярный слой; GCL = гранулированный клеточный слой; SGZ = субгранулярная зона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Целью данной работы является предоставление подробного описания шагов для получения положительных и успешных результатов с иммуноокрашиванием и перечисление часто используемых шагов в исследованиях на основе BrdU без использования конфокального микроскопа. Окрашивание BrdU - это техника, которая требует нескольких шагов, которые необходимо тщательно соблюдать для достижения успешного окрашивания. Стандартизация этих методов окрашивания обычно занимает месяцы и требует много времени и ресурсов. Мы ожидали, что эта статья может предоставить информацию группам, начиная с этой области, за счет сокращения времени и ошибок.
Protocol
Все процедуры соответствуют руководству Национального института здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию (NIH Publications N°. 8023, пересмотренному в 1978 году) и местным мексиканским законам, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания. Комитет по этике Ибероамериканского университета одобрил экспериментальные протоколы использования животных в этом исследовании.
1. Подготовка и настройка реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство растворов можно приготовить за несколько дней до использования, если не указано иное.
- Решение BrdU
- Извлеките раствор BrdU из морозильной камеры с температурой -20 °C и дайте ему уравновеситься при комнатной температуре (RT).
- Рассчитайте массу BrdU, необходимую для дозы 50 мг/кг в соответствии с массой тела крысы. Рассчитать объем 0,9% физиологического раствора (0,9 г NaCl в 100 мл стерильногоH2O), необходимого для получения рабочего раствора 20 мг/мл. Приготовьте избыток, чтобы обеспечить не менее 0,5 мл на крысу на инъекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доза, вводимая подопытным животным, должна быть безопасной, с минимальными побочными эффектами и эффективной. Сообщалось, что продолжительность окрашивания 100 мг/кг BrdU не превышает потенциально более высокую токсичность по сравнению с дозой 50 мг/кг7. Не было обнаружено существенных различий в количестве меченых BrdU клеток/мм3 для 50 и 100 мг/кг i.p. у крыс7. Предпочтительно вводить небольшую дозу, чтобы свести к минимуму страдания животных. - Взвесьте раствор BrdU и добавьте его в физиологический раствор в конической трубке и вихре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагрейте физиологический раствор при 45\u201250 °C на водяной бане для объемов более 1 мл. - Поместите трубку на водяную баню при 50 °C в течение 10\u201215 мин и вихрь каждые 2\u20123 мин до полного растворения. Процедите раствор шприцевым фильтром для стерильных инъекций. Накройте трубку оловянной фольгой, охладите ее при комнатной температуре и немедленно используйте.
ВНИМАНИЕ: Раствор BrdU токсичен и потенциально канцерогенен. Приготовьте его в вытяжном шкафу. Раствор BrdU должен обрабатываться с надлежащим защитным оборудованием (СИЗ). Рекомендуется готовить раствор непосредственно перед употреблением. Тем не менее, раствор стабилен в течение 24 ч под RT. Пожалуйста, защитите его от света.
- Для приготовления 1 л 0,1 М фосфата буферного физиологического раствора (PBS) при рН 7,4 добавляют 240 мг моноосновного фосфата калия (KH2PO4), 1,44 г двухосновного фосфата натрия (Na2HPO4), 200 мг хлорида калия (KCl) и 8 г хлорида натрия (NaCl) до 800 мл двойной дистиллированной воды (ddH2O) при постоянном перемешивании. Отрегулируйте рН до 7,4 и добавьте двойной дистиллированныйH2Oдо общего объема 1 л. Хранить при 4 °C в течение 1 недели.
- Для 100 мл PBS+ добавьте 3% (3 мл) нормальной лошадиной сыворотки и 0,3% (300 мкл) Triton X-100 до 0,1 M PBS (рН 7,4). Хранить в аликвотах 20\u201250 мл при -20 °C до 3 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, TBS можно использовать вместо PBS. Подойдет любая другая сыворотка, отличная от антител хозяина и экспериментальной ткани. - На 100 мл PBS++ добавляют 10% (10 мл) нормальной лошадиной сыворотки и 0,3% (300 мкл) Triton X-100 до 0,1 M PBS pH 7,4. Хранить в аликвотах 20\u201250 мл при -20 °C до 3 месяцев.
- На 1 л раствора криопротектора смешать 250 мл этиленгликоля и 250 мл глицерина, постоянно перемешивать до перемешивания. Медленно доведите до 1 л с PBS. Фильтр с фильтровальной бумагой класса 4 (20\u201225 мкм). Хранить при температуре 4 °C или RT до 1 года.
- Готовят 4% параформальдегид в 0,1 М PBS (раствор PFA) следующим образом. На 1 л раствора добавляют 40 г порошка параформальдегида медленно до 800 мл 60\u201265 °C 0,1 М PBS при постоянном перемешивании. Перемешивайте до полного растворения параформальдегида, контролируя температуру (60\u201265 °C). При необходимости добавляют несколько капель 1 М NaOH для уточнения раствора. Когда раствор достигнет комнатной температуры, процеживают фильтровальной бумагой класса 4 (20-25 мкм).
ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и подозревается в том, что он является канцерогеном, готовят в вытяжном шкафу. Хранить при температуре 4 °C и предпочтительно использовать в течение 2 дней. Готовое к использованию решение PFA является коммерчески доступным. - Для 1 л 10 мМ буфера цитрата натрия (SCB) при рН 6 добавляют 1,204 г цитрата натрия (дигидрата) и 1,134 г лимонной кислоты к 800 мл двойного дистиллированногоH2Oпри постоянном перемешивании. Отрегулируйте pH до 6,0 и добавьте ddH2O до 1 л. Храните при 4 °C в течение 6 месяцев.
- Готовят 50 мл 2 N HCl, медленно добавляя 8,25 мл 12 N HCl (концентрированный раствор) к 41,75 мл ddH2O при постоянном перемешивании.
ВНИМАНИЕ: Подготовьтесь в вытяжном шкафу. Раствор необходимо приготовить непосредственно перед применением.
ПРИМЕЧАНИЕ: 2 N HCl будет использоваться для денатурации ДНК, что является решающим шагом. Поскольку BrdU включен в ДНК, HCl используется для открытия связей ДНК, позволяющих антителу BrdU получить доступ к BrdU в ДНК. - Готовят эндогенный раствор, блокирующий пероксидазу, следующим образом. Готовят 100 мл 0,6% перекиси водорода путем смешивания 2 мл 30% перекиси водорода с 98 мл ddH2Oпри постоянном перемешивании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием. Держите его в темноте, так как H2O2 светочувствительна. PBS или TBS можно использовать вместо воды. - Готовят раствор авидин-биотинового комплекса (АВС) в соответствии с инструкцией производителя. На 5 мл АВС в 0,1 М ПБС добавляют 2 капли (≈100 мкл) реагента А и перемешивают, а затем добавляют 2 капли (≈100 мкл) реагента В и перемешивают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием раствор необходимо подготовить и дать свернуть его в течение 20\u201230 мин. - Приготовьте СУБСТРАТ DAB (Diaminobenzidine) Peroxidase (HRP) с помощью комплекта, следуя инструкциям производителя. К 5 мл ddH2Oдобавляют 2 капли (≈ 84 мкл) реагента 1 и смешивают, добавляют 4 капли (≈ 100 мкл) реагента 2 и перемешивают, затем добавляют 2 капли (≈ 80 мкл) реагента 3 и перемешивают. Наконец, при желании добавляют 2 капли (≈ 80 мкл) реагента 4 (никель) и перемешивают.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.
ВНИМАНИЕ: DAB токсичен и потенциально канцерогенен. С ним необходимо обращаться осторожно и выбрасывать в соответствии с правилами об опасных отходах в каждом учреждении. Для инактивации DAB добавляют несколько капель отбеливателя (гипохлорит натрия); раствор почернеет. - Готовят 100 мл раствора крезил-фиалки, добавляя 100 мг крезилового ацетата и 250 мкл уксусной кислоты к 80 мл ddH2Oпри 55\u201260 °C. Отрегулируйте объем до 100 мл, отфильтруйте и храните при 4 °C в сосуде темного цвета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователю рекомендуется протестировать различные концентрации раствора крезил-фиалки перед его использованием на ценных образцах тканей. Результат может быть более темным для контрокрашивания с некоторыми образцами тканей, что может снизить способность точно подсчитывать положительные клетки BrdU.
2. Введение Тимидина аналогом БрдУ
- Удерживайте подопытное животное (например, 90-дневного самца крысы Wistar весом 350 г), иммобилизуя нижнюю брюшную полость.
- Вводят раствор BrdU (50 мг/кг) внутрибрюшинно (т..) с помощью иглы 23 г и шприца 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте объем инъекции в соответствии с весом животного. Используйте иглу 23\u201227 G и шприц 1\u20125 мл для взрослых крыс. Максимально допустимый объем внутрибрюшинной инъекции у взрослой крысы составляет 10 мл. Для администрирования раствора BrdU14 могут использоваться различные маршруты. Например, внутрибрюшинная инъекция или пероральное введение через питьевую воду.
3. Подготовка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Трехмесячным крысам был разрешен доступ ad libitum к физической активности (бесконечное колесо) в течение семи дней. На 6-й день крысам вводили BrdU (шаг 2) 3 раза с интервалом 12 ч. Выполните шаги в разделе 3 через 8 ч после последней инъекции BrdU.
- Введите пентобарбитал (50 мг/кг в..) и подождите несколько минут, пока животное не будет глубоко обезболено.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что животное полностью обезболено, прежде чем продолжить. Осторожно зажмите одну из ног или хвост. Если животное реагирует на раздражитель, подождите еще несколько минут. Если животное не реагирует на защемление, переходите к следующему шагу. - Обнажите сердце, разрезав кожу брюшной полости ниже грудины, разобрав ребра и разрезав диафрагму.
- Транскардиальная перфузионная фиксация
- Вставьте иглу в левый желудочек и сделайте небольшой разрез в правом предсердии. Используя насос или гравитацию, перфью (скорость потока 5\u20127 мл/мин.) 0,1 М PBS до тех пор, пока вся кровь не будет дренирована, и раствор не станет прозрачным.
- Используя насос или гравитацию, выполните холодную перфузию (скорость потока 5\u20127 мл/мин) раствором PFA, чтобы зафиксировать ткань до тех пор, пока хвост не станет жестким.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно крысе весом 300 г требуется около 100\u2012150 мл раствора PFA. Тканевая фиксация необязательна. Таким образом, мозг может быть извлечен для использования в различных процессах, чтобы свести к минимуму использование животных в экспериментах.
- Рассечение и постфиксация
- Обезглавить животное и аккуратно извлечь мозг из черепа. Погрузите мозг в коническую трубку, содержащую раствор PFA (~ 40 мл для крысы 250 мг) в течение 1\u20122 дней при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не следует чрезмерно зацикливаться (более 48 ч), потому что это может истощить окрашивание тканей из-за отсутствия антигенов. - Готовят 100 мл 30% раствора сахарозы, добавляя 30 г сахарозы к 70 мл раствора 0,1 М PBS при постоянном перемешивании. Добавьте 0,1 М раствора PBS в 100 мл. Погрузите мозг в коническую трубку с 30% раствором сахарозы (35 мл) в течение примерно 1\u20122 дней при 4 °C, пока мозг не опустится на дно трубки.
- Обезглавить животное и аккуратно извлечь мозг из черепа. Погрузите мозг в коническую трубку, содержащую раствор PFA (~ 40 мл для крысы 250 мг) в течение 1\u20122 дней при 4 °C.
- Разрезание корональных отделов мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование криостата-микротома требует руководства и обучения. Подробные инструкции см. в ссылке15.- Погрузите весь мозг в изопентан при -80 °C и держите его при -80 °C в течение 10 минут. Поместите мозг во встраиваемую матрицу на криостат-микротомовую пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: При определенных условиях быстрое замораживание мозга при -80 °C может вызвать перелом или повреждение ткани. Пользователь должен знать об этой проблеме. Если это так, используйте изопентан -20 ° C, чтобы заморозить мозг. - С помощью криостата-микротома (температура от -25 до -20 °C) разрезают корональные срезы толщиной 40 мкм. Последовательно перенесите секции в 24-луночную пластину клеточной культуры с криозащитным раствором, следуя руководству на рисунке 2. Хранить при температуре -20 °C до использования, в течение нескольких месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого обработать всю ткань в свободно плавающих серийных секциях по 40 мкм в 12-луночных пластинах с сетчатыми вставками в щадящем и непрерывном перемешивании (10 об/мин). Можно хранить участки мозга годами при правильных условиях.
- Погрузите весь мозг в изопентан при -80 °C и держите его при -80 °C в течение 10 минут. Поместите мозг во встраиваемую матрицу на криостат-микротомовую пластину.
Рисунок 2: Схематическая иллюстрация последовательного переноса срезов из криостата-микротома в 24-луночную клеточную культуральную пластину с криопротекторным раствором. Начните с А1-лунки и поместите следующие срезы в строку А; после А6-скважины перейдите в следующий ряд В, так далее. Прибыв на D6, вернитесь на A1 и продолжайте. Такое расположение позволяет N-му (например, шестому для нейрогенеза, эквивалентному содержанию одного столбца) участку количественной оценки всей области мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: Краткое изложение преимуществ и недостатков каждого метода см. в таблице 1 .
- Обнаружение BrdU с помощью пероксидазной реакции с DAB
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4.1.1 по 4.1.5 на 1-й день.- Переложить срезы из криозащитного раствора до 0,1 М PBS при комнатной температуре. Смойте три раза в течение 10 минут каждый, с 0,1 М PBS.
- Инкубировать ломтики в течение 30 мин в эндогенном растворе, блокирующем пероксидазу, для инактивации эндогенной пероксидазы. Смойте 3 раза, по 10 мин, по 0,1 М PBS. При желании выполните извлечение антигена (см. раздел 5). Инкубировать ломтики в течение 20 мин с 2 N HCl при 37 °C. Промыть в 0,1 М боратного буфера (8,5 рН) в течение 10 мин. Смойте 3 раза по 10 мин каждый, со льдом 0,1 М PBS.
- Инкубировать ломтики в течение 2 ч при комнатной температуре с PBS++ (блокирующим раствором). Инкубировать с первичным антителом против BrdU (мышиным хозяином) в концентрации 1:250 в PBS+ в течение ночи при 4 °C.
- На 2 день смойте ломтики 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать с 1:250 HRP-конъюгированным вторичным антителом (антимышечным) в PBS+ в течение 2\u20124 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Переложите ломтики в субстрат DAB Peroxidase (HRP) и инкубируйте в течение 2\u201210 мин. Когда срезы становятся темно-серыми, визуализируйте ткань с помощью увеличительного стекла или микроскопа. При наличии положительных клеток смойте 3 раза (по 15 мин каждая) водопроводной водой (для уменьшения фона). Промыть 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Аккуратно нанесите ломтики на желатинизированные горки с помощью мягкой щетки, высушите на воздухе ночью при комнатной температуре. Противодействовать (см. раздел 7.1), добавить постоянный монтажный носитель и разместить крышки. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Обнаружение BrdU с помощью пероксидазной реакции с комплексом авидин-биотин-пероксидаза
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4.2.1 по 4.2.5 на 1-й день.- Переложить срезы из криозащитного раствора до 0,1 М PBS довести до комнатной температуры. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать в течение 30 мин с эндогенным пероксидазным блокирующим раствором для инактивации эндогенной пероксидазы. Смойте 3 раза по 10 мин каждый в 0,1 М PBS. При желании выполните извлечение антигена (см. раздел 5).
- Инкубировать в течение 20 мин с 2 N HCl при 37 °C. Промыть в 0,1 М боратного буфера (рН 8,5) в течение 10 мин. Промыть 3 раза по 10 мин холодным 0,1 м PBS.
- Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре в PBS++ (блокирующий раствор).
- Инкубировать с первичным антителом против BrdU (мышиный хозяин) 1:250 в PBS+ в течение ночи при 4°C.
- На 2 день смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать с биотинилированным вторичным антителом 1:250 (антимышечное) в PBS+ в течение 2\u20124 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать в растворе ABC в течение 1 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Переложить ломтики в субстратный раствор DAB пероксидазы (HRP) и инкубировать в течение 2\u201210 мин. Когда срезы становятся темно-серыми, визуализируйте ткань с помощью увеличительного стекла или микроскопа. Если положительные клетки присутствуют, смойте 3 раза (по 15 мин каждая) водопроводной водой (для уменьшения фона), а затем 3 раза по 0,1 М PBS промыть в течение 10 мин каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прилипания срезов мозга друг к другу из-за нерегулярных темных пятен в тканях. - Аккуратно установите ломтики на желатинизированные слайды с помощью мягкой щетки, а затем высушите на воздухе всю ночь при комнатной температуре.
- При необходимости восстановите пятна (см. шаг 7.1), добавьте постоянный монтажный носитель и поместите крышки. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Обнаружение BrdU иммунофлуоресценцией с использованием меченой амплификации Стрептавидин-Биотин (LSAB)
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4.3.1 по 4.3.4 на 1-й день.- Переложить срезы из криозащитного раствора до 0,1 М PBS при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS. При желании выполните извлечение антигена (см. раздел 5).
- Инкубировать в течение 20 мин в 2 N HCl при 37 °C. Промыть в 0,1 М боратного буфера (8,5 рН) в течение 10 мин. Смойте 3 раза по 10 мин каждый в ледяном 0,1 М PBS.
- Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре в PBS++ (блокирующий раствор). Инкубировать с первичным антителом 1:250 против BrdU (мышиный хозяин) в PBS+ в течение ночи при 4 °C.
- На 2 день смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать с биотинилированным вторичным антителом 1:250 (антимышечное) в PBS+ в течение 2\u20124 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS. Инкубировать с фторхром-конъюгированным стрептавидином (Cy3) 1:250 в PBS (не использовать сыворотку) в течение 1\u20122 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сыворотка может содержать биотин и не должна добавляться в разбавители. Вместо этого используйте PBS, содержащий 0,3% Triton X-100. - Аккуратно установите ломтики на желатинизированные слайды с помощью мягкой щетки, высушите на воздухе в течение ночи при комнатной температуре или сразу же установите с помощью соответствующей монтажной среды. Противодействовать (см. шаг 7.2), добавить постоянный монтажный носитель и разместить крышки. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Обнаружение BrdU непрямой иммунофлуоресценцией
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 4.4.1 по 4.4.4 на 1-й день.- Переложить срезы из криозащитного раствора до 0,1 М PBS до тех пор, пока он не достигнет комнатной температуры. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS. При необходимости выполните извлечение антигена (необязательно, см. раздел 5).
- Инкубировать в течение 20 мин в 2 N HCl при 37 °C. Промыть в 0,1 М боратного буфера (8,5 рН) в течение 10 мин. Смойте 3 раза по 10 мин каждый ледяным 0,1 М PBS. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре с PBS++ (блокирующим раствором). Инкубировать с первичным антителом 1:250 против BrdU (мышиный хозяин) в PBS+ в течение ночи при 4 °C.
- На 2 день смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Инкубировать с 1:250 фторхром-конъюгированным вторичным антителом (антимышечным) в PBS+ в течение 2\u20124 ч при комнатной температуре. Смойте 3 раза по 10 мин каждый с 0,1 М PBS.
- Аккуратно установите ломтики на желатинизированные слайды с помощью мягкой щетки, высушите на воздухе в течение ночи при комнатной температуре или сразу же установите с помощью соответствующей монтажной среды. Противодействовать (см. шаг 7.2), добавить постоянный монтажный носитель и разместить крышки. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
5. Извлечение антигена (необязательно)
ПРИМЕЧАНИЕ: Извлечение антигена является необязательным шагом, предназначенным для исправления потери антигенности, вызванной фиксацией, которая изменяет третичную и четвертичную структуру многих антигенов, делая их неопределяемыми антителами. Этот шаг может быть добавлен к исходному протоколу.
- В микроволновой печи или на водяной бане предварительно нагрейте 10 мМ раствора цитрата натрия (SCB) pH 6 до 90\u201295 °C (в зависимости от высоты раствор начинает кипеть около этой температуры). Заполните 80% конической трубки объемом 50 мл (40 мл) предварительно нагретым SCB. Переложите срезы на сетчатые вставки в коническую трубку с SCB. Накройте трубку винтовой крышкой с отверстиями, выполненными иглой 18\u201220 G.
- Держите ломтики в течение 30 минут в SCB при 80\u201285 °C, чередуя циклы нагрева в микроволновой печи при минимальном уровне мощности. При необходимости наполните коническую трубку SCB. Сразу после этого переложить ломтики вместе с сетчатыми вставками в ледяной 0,1 М PBS и промыть 3 раза по 10 мин каждая.
6. Множественные иммуноокрашивания (необязательно)
ПРИМЕЧАНИЕ: Обоснование этого шага приведено в разделе введения.
- Одновременные множественные иммуноокрашивания
- Приготовьте коктейль с первичными антителами к мишени (например, мышиным анти-BrdU и кроликом анти-GFAP) в PBS+. Используйте разные хозяева для каждого используемого первичного антитела. Инкубировать в течение ночи при 4 °C. Выполните следующие действия для каждого протокола.
- Приготовьте коктейль с соответствующими вторичными антителами для каждого используемого первичного антитела (например, козий антимыший FITC, козий анти-кролик TRITC) в одном и том же растворе разбавителя для каждого протокола. Выполните следующие действия для каждого протокола. В идеале используйте вторичные антитела, которые поступают от одних и тех же хозяев, чтобы избежать перекрестной реакции.
- Последовательные множественные иммунонарушения.
- Следуйте протоколу для первой мишени антител (например, мышиный анти-BrdU) и остановитесь перед установкой срезов. Инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре с PBS++ (блокирующим раствором).
- Инкубировать второе первичное антитело (например, против кролика -GFAP) в PBS+ в течение ночи при 4 °C. Следуйте следующим шагам для каждого протокола, включая инкубацию второго вторичного антитела (например, козьего анти-кролика TRITC). Переходите к следующим шагам для каждого протокола до конца.
7. Контрокрашивание (необязательно)
- Для протоколов, использующих пероксидазную реакцию, предварительно нагрейте раствор крезил-фиалки до 60 °C. Увлажняйте слайды ddH2O в течение 1 мин. Инкубировать горки в горячем растворе крезил-фиалки в течение 5\u201220 мин.
- Промойте слайды ddH2O в течение 1 мин. Промойте горки 70%, 80%, 90% и 100% этиловым спиртом по 1\u20123 мин каждая. Промойте горки ксилолом в течение 1\u20123 мин.
- Добавьте постоянную гидрофобную монтажную среду и поместите крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев. Можно использовать самодельную монтажную среду, содержащую ПВА (поливиниловый спирт)-DABCO.
- Для протоколов, использующих иммунофлуоресценцию, добавьте небольшой объем (25\u201250 мкл) гидрофильной монтажной среды с DAPI, йодидом пропидия или аналогичным. Запечатайте по периметру лаком для ногтей или пластиковым герметиком. Хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
8. Визуализация и анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 2 для спецификаций настройки микроскопа. Обычно подсчет окрашенных новых клеток производится с использованием окрашенных срезов пероксидазной реакции (более дешевый метод), но это также может быть выполнено с использованием иммунофлуоресценции.
- Чтобы количественно оценить клетки, во-первых, правильно идентифицируйте зубчатую извилину с помощью линзы с 4-кратным увеличением (дополнительные инструкции по анатомическим деталям DG см. Amaral et al.16).
- Поиск в гранулярном клеточном слое зубчатой извилины на наличие ядер, помеченных BrdU (с помощью линзы 40-кратного увеличения). Выполняйте поиск ячеек исчерпывающе вдоль оси z, так как новые ячейки могут быть распределены в разных слоях (см. Видео 1).
- Выберите интервальный участок для поиска клеток по всей зубчатой извилине (например, каждый 6-й участок ткани, эквивалентный каждому 240 мкм).
- Подсчитайте все положительные клетки BrdU. Морфология меченого ядра может изменяться в зависимости от того, сколько BrdU включено в клетку (см. Рисунок 3 в качестве руководства). Медленно перемещайтесь по оси Z, чтобы количественно оценить все несколько ядер, которые интегрируют кластер (см. Видео 2).
- Умножьте общее количество подсчитанных ячеек с выбранным интервальным участком (например, 6), чтобы оценить общее количество новых клеток, помеченных BrdU.
- В идеале, в обычном эксперименте, подсчитайте не менее десяти секций на животное и не менее пяти животных на группу.
- Деконволюция изображения (опционально)
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу введения для получения важной информации об этом шаге. Для этой процедуры требуются монохроматические изображения (оттенки серого). Преобразуйте цветные изображения в оттенки серого. Если изображения являются составными RGB, сначала разделите каналы и объедините их как одно изображение (не составное), а затем преобразуйте в 8-битные оттенки серого.- Создайте z-стековый файл из микроснимков.
- Создайте файл функции разброса точек (PSF), открыв плагин Diffraction PSF 3D (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) из меню опции Плагины . Заполните все необходимые данные (см. таблицу 2). Нажмите OK и сохраните файл.
- Откройте плагин DeconvolutionLab29 из меню плагинов (http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/). Перетащите соответствующее изображение z-стека и PDF-файл в соответствующий слот окна.
- Выберите алгоритм деконволюции (например, Ричардсон-Люси) и количество итераций (например, 20). Нажмите кнопку ВЫПОЛНИТЬ.
- Объедините деконволютированные изображения в одно изображение z-стека, выбрав «Стеки» в меню « Изображение » вверху. Затем щелкните Проект Z. Выберите «Максимальная интенсивность» в раскрывающемся меню «Тип проекции », нажмите OK и сохраните файл.
- Создайте RGB-изображение, используя один файл изображения z-stack, созданный на шаге выше, с нужным псевдоцветом, выбрав «Цвет » в меню «Изображение» вверху. Затем нажмите «Объединить каналы». Установите соответствующее изображение на нужный цветовой канал из выпадающего меню. Снимите флажок Create Composite, нажмите OK и сохраните файл (см. рисунок 4).
- Если изображение канала несколько, повторите шаги 8.2.1\u20128.2.5. Создайте файл изображения RGB после шага 8.2.6, открыв по крайней мере два файла изображений и выбрав различные цветовые каналы для каждого файла изображения (см. рисунок 4).
Representative Results
Методы, описанные выше, применялись для количественной оценки клеток новорожденных в гиппокампе взрослой крысы после добровольной физической активности, в отличие от контрольной группы без какой-либо дополнительной физической активности. Мы использовали постнатальный гиппокамп крыс в качестве положительного контроля. Самцы крыс в возрасте 3 месяцев находились под добровольным протоколом физической активности (бесконечное колесо) в течение семи дней. На 6-й день крысам вводили BrdU (раздел 2), а каждые 12 ч после этого до трех полных инъекций. Для завершения трех делений клеточного цикла животных транскардиально перфузировали (секция 3) через 8 ч после последней инъекции BrdU. Та же процедура была использована на трехмесячных крысах, которые не подвергались физической активности для использования в качестве сравнительного контроля. В качестве положительного контроля однодневным крысиным детенышам (послеродовой день 1) вводили BrdU один раз, как описано в разделе 2 выше. Через день после инъекции (послеродовой день 2) щенков усыпляли, а их головы погружали в раствор PFA, как описано в шаге 3.4. Взрослых крыс глубоко анестезировали (стадия 3.1), транскардиально перфузировали, как описано в шаге 3.2. Мозги были рассечены и постфиксированы (шаг 3.4). Мозг разрезали на 40 мкм корональных сечений (шаг 3,5). Срезы обрабатывали для иммуногистохимии BrdU, как описано на этапе 4.
Мы использовали реакцию пероксидазы хрена с DAB IHC для окрашивания (этап 4.1) и подсчета BrdU-положительных клеток в DG. На рисунке 5 показан раздел DG с ячейками, мечеными BrdU. На рисунке 5C,D показана репрезентативная часть секции DG при большем увеличении. Помеченные клетки показали интенсивное темное окрашивание, которое было отмечено стрелками. Вставка показывает среднее количество меченых клеток в экспериментальной и контрольной группах (подсчитанные положительные клетки, умноженные на шесть, как описано в шаге 8.1). T-тест Стьюдента выявил различия в значимости между числами BrdU-положительных клеток (t(10) = 2,704, p = 0,0222). Контрольная группа, которая не подвергалась физической активности, показала 2040 ± 314 клеток (n = 6 крыс). Для сравнения, группа физической активности показала, в среднем, 3 606 ± 486 (n = 6 крыс) BrdU-положительных клеток. Как наблюдалось, воздействие физической активности увеличивает BrdU-положительные клетки. Таким образом, эти результаты согласуются с другими сообщенными результатами, которые показывают, что физическая активность увеличивает клеточную пролиферацию во взрослой зубчатой извилине17.
Рисунок 3: Примеры различной морфологии меченого BrdU клеточного ядра. BrdU - это маркер синтеза ДНК, который маркирует ядро. В области гиппокампа BrdU-положительные ядра имели полуовальную форму, расположенную в зубчатой извилине субгранулярной зоны. Поскольку BrdU включен конкуренцией, количество, включенное для каждой клетки, будет иметь вариацию, которая позже отразится на том, как ядро будет визуализировано. (А) Изображение иммунофлуоресценции. (B) Представлено изображение с использованием пероксидазной реакции без дополнительного метода амплификации. Желтые стрелки показывают артефакты и неспецифические сигналы. Черные или белые стрелки показывают ячейки BrdU+. 1 – Полностью заполненное ядро, полуовальные ядра сильно окрашены. 2 – Ядра с точками, граница ядер отмечена и имеет внутри несколько точек. 3 – Ядра с несколькими точками, граница ядер отмечена и имеет небольшое количество точек внутри. 4 - Маленькое ядро - это возможные клетки в другой стадии дифференцировки, но все еще часть ниши. 5 – Кластеры являются клетками-предшественниками, находящимися под делением, поэтому можно наблюдать несколько клеток вместе в конденсированные группы. В этих группах подсчет должен проводиться особенно осторожно, чтобы избежать неправильной маркировки положительных клеток. Красные стрелки показывают ядро под делением, которое можно спутать с одной клеткой. Каждая ячейка заключена в коробку и может быть различима в плоскости оси Z в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативное RGB-изображение для одиночных и объединенных каналов. На верхнем изображении показано исходное изображение z-стека, а на нижнем — 3D-деконволютивное изображение z-стека. (A) Низкое увеличение ГД. (B) RGB-изображение для каждого канала и (C) RGB-объединенное изображение. Это был мозг из контрольной группы. Иммунофлуоресценцию применяли без дополнительного метода амплификации. BrdU (красный), DAPI как контрокрашащий (синий) и GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок) в качестве астроглиального маркера (зеленый). ML = молекулярный слой; GCL = гранулированный клеточный слой; SGZ = субгранулярная зона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативная секция DG с мечеными BrdU клетками (интенсивный темный) для каждой экспериментальной группы. Пероксидазную реакцию применяли методом комплексной амплификации авидин-биотин-пероксидазы. (А, Б) Показать низкое увеличение DG и (C, D) показать площадь коробки при большем увеличении. Панели A и C - это ткани из группы физической активности, панели B и D - из контрольной группы. Вставка показывает среднее количество меченых клеток в группе физической активности и контрольной группе (подсчитанные положительные клетки, умноженные на шесть, как описано в шаге 8.1). ML = молекулярный слой; GCL = гранулированный клеточный слой; SGZ = субгранулярная зона; стрелки обозначают ячейки BrdU+. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Видео, показывающее различный фокус положительных ячеек вдоль оси Z, распределенных в разных слоях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Видео, показывающее различный фокус положительных кластеров клеток вдоль оси Z, распределенных в разных слоях. Медленно перемещайтесь по оси Z, чтобы количественно оценить все несколько ядер, которые интегрируют кластер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
| Тип микроскопа: | Эпифлуоресцентный микроскоп Olympus BX53 | ||||
| Источник света: | Ртутная дуговая лампа высокого давления мощностью 130 Вт (U-HGLGPS) | ||||
| Программное обеспечение для приобретения: | Стандарт CellSens | ||||
| Наборы фильтров: | Номер в каталоге | Диапазон возбуждения | Дихроматическое зеркало | Дальность подавления | |
| У-ФУУ | 340 - 490 нм | 410 морских миль | 420 морских миль | ||
| U-FBW | 460 - 495 морских миль | 505 морских миль | 510 морских миль | ||
| У-ФГВ | 530 - 550 нм | 570 морских миль | 575 морских миль | ||
| Фотоаппарат: | Модель: | ПЗС-камера UC50 | |||
| Спектральный диапазон: | 290 – 1000 нм | ||||
| Размер ПЗС-чипа: | 2/3 in, 2588 (Ширина *7) X 1960 (Высота *8) пикселей | ||||
| Размер пикселя: | 3,4 X 3,4 мкм | ||||
| Фторхром: | Имя | Длина волны возбуждения (нм) | Излучение *3 Длина волны (нм) | Эмиссионный цвет | |
| 4, 6-диамидин-2-фенил-индол HCI (DAPI) | 345 | 455 | Синий | ||
| Тетраметилродамин-изотиоцианат (TRITC) | 541 | 572 | Красный | ||
| Флуоресцеин-изотиоцианат (FITC) | 494 | 519 | Зеленый | ||
| Cy3 | 552 | 565 | Красный | ||
| Монтажное среднее и погружное масло: | Имя | Показатель преломления среды *1 | |||
| Воздух (ничего между слайдом и объективом) | 1.00029 | ||||
| Антизатухающий монтажный носитель с DAPI | 1.45 | ||||
| Permount Монтажный носитель | 1.519 | ||||
| Погружное масло с низкой автофлуоресценцией (MOIL-30 Тип F) | 1.518 | ||||
| Увеличительная линза (план флюорита) | Увеличение | Числовая диафрагма (NA) *2 | Разрешение (мкм) | Интервал между пикселями изображения (нм) *5 | Интервал между срезами по оси Z (нм) *6 |
| в 4 раза | 0.13 | 2.12 | 850 | 3000 | |
| в 10 раз | 0.3 | 0.92 | 340 | 3000 | |
| в 20 раз | 0.5 | 0.55 | 170 | 2000 | |
| в 40 раз | 0.75 | 0.37 | 85 | 1000 | |
| в 100 раз | 1.3 | 0.21 | 34 | 1000 | |
Таблица 2: Спецификации настройки микроскопа и требования к созданию файлов psF. В окне дифракционного плагина PSF 3D есть 11 слотов для создания файла PSF. Каждая щель описывается следующим образом: *1 - Показатель преломления среды: показатель преломления для среды между затвором и линзой (например, воздух = 1,00029). *2 - Числовая диафрагма: NA используемого объектива (она должна быть исправлена, когда используется другая иммерсионная среда и назначается объектив). *3 - Длина волны: максимальная длина волны излучения фторхрома (нм). *4 - Продольная сферическая аберрация: 0,00. *5 - Расстояние между пикселями изображения: размер ПЗС-пикселя (нм)/увеличение (например, объектив 3,4 мкм и объектив 100X, 3400/100 = 34 нм). *6 - Расстояние между изображениями по оси Z. *7 - Ширина: Введите ширину изображения, которое будет деконвировано в пикселях. *8 - Высота: Введите высоту изображения, которое будет деконвировано в пикселях. *9 - Глубина, срезы: количество изображений в z-стеке. *10 - Нормализация: Сумма значений пикселей = 1. *11 - Название: Желаемое имя для PSF-файла. Файл должен совпадать с уникальным заданным изображением z-stack.
Discussion
Взрослый нейрогенез — это процесс, который чаще всего происходит в нишах взрослых нейронных клеток-предшественников, которые могут генерировать новые нейроны на протяжении всей своей жизни. Маркировка бромодезоксиуридином (BrdU) широко используется в иммунологии для характеристики количества вновь генерируемых клеток во взрослом мозге. BrdU будет в основном включаться в клетки дискретных областей мозга (нейрогенных зон). Эти клетки расположены в субвентрикулярной зоне (SVZ), зубчатой извилине гиппокампа — между хилусом и гранулярными клетками, известными как субгрекулярная зона (SGZ)1,2,18. Кроме того, существуют различные области мозга, характеризующиеся более низкой пролиферативной способностью во взрослом возрасте, включая гипоталамус, полосатое тело, неокортекс и миндалину19. Как упоминалось ранее, окрашивание BrdU является широко используемым методом исследования нейрогенеза взрослых для обнаружения пролиферации клеток. Однако использование BrdU в качестве маркера имеет ограничения и подводные камни. Во-первых, BrdU является маркером клеточного цикла. Поэтому двойное или тройное окрашивание должно быть выполнено для идентификации клеточной судьбы и включения клеточных маркеров для обнаружения конкретной стадии развития меченых клеток. Еще одна проблема с BrdU заключается в том, что это токсичный и мутагенный раствор, который модифицирует стабильность ДНК, может изменять клеточную функцию и клеточные циклы. Следует учитывать предыдущую информацию при принятии решения о соблюдении протокола введения и введения доз (50\u2012600 мг/кг). Еще одна важная особенность заключается в том, что BrdU является маркером синтеза ДНК, а не маркером пролиферации клеток14. Поэтому важно отличать пролиферацию клеток от других событий, таких как репарация ДНК, абортивное возвращение клеточного цикла и дупликация генов. Исследователи должны следовать соответствующим мерам контроля, чтобы обеспечить надлежащее использование BrdU. Для более подробного обсуждения этих проблем и ограничений мы рекомендуем ознакомиться с работой Таупина14. Процесс стандартизации протокола иммуногистохимии может быть медленным и сложным. В этой работе мы представили все общие шаги по управлению успешным протоколом IHC. Тем не менее, мы рекомендуем каждой исследовательской группе заранее протестировать и оценить ткани, антитела и условия. Тесты и оценки должны проводиться по крайней мере с тремя различными уровнями инкубации, этапов промывки и силы для каждого тестируемого антитела и ткани. Мы также рекомендуем исследователям пересмотреть дополнительные протоколы, чтобы иметь возможность выбрать лучший, который отвечает конкретным потребностям и требованиям 20,21,22,23,24,25.
Как упоминалось ранее, процедура включает в себя несколько шагов и методологических соображений, которые обычно используются и упоминаются в научных статьях, которые будут обсуждаться позже. Мы рекомендуем исследователям выбирать антитела тщательно и правильно с точки зрения техники, бюджета, оборудования, настройки и основной цели исследования. Антитела должны быть протестированы с тем же типом ткани, который позже будет протестирован в эксперименте. Мы также рекомендуем использовать антитело, которое было протестировано с той же целью (IHC) (то есть не только в методах вестерн-блоттинга или проточной цитометрии), чтобы проверить его совместимость с техникой фиксации. Различные пути могут быть использованы для введения окрашивания BrdU, такие как внутрибрюшинная инъекция, внутрибрюшинная инфузия, пероральный прием внутрь или внутрижелудочковая инфузия (для более подробного описания каждого метода см. ссылку26). Если выбрана внутрибрюшинная инъекция, убедитесь, что BrdU вводится в брюшинную полость, избегая области кишечника. Поскольку кишечник имеет несколько клеток в дупликации, которые могут истощить BrdU, прежде чем он попадет в мозг, что повлияет на количество меченых клеток. Крайне важно получить тонкие срезы, поскольку они обеспечивают лучшее проникновение растворов. Корональные срезы толщиной 40 мкм разрезали ростроково-каудально и переносили в 24-луночную клеточную культуральную пластину в соответствии со стереологической процедурой, предложенной Kempermann et al.27. Иммуногистохимия может проводиться с тканями, установленными на слайдах или в виде свободно плавающих секций. Поскольку BrdU расположен глубоко в ядрах клеток, он позволяет проникать растворам в свободно плавающие участки, что обеспечивает лучшие результаты и лучший доступ к интересующей области. Важно открыть связи ДНК (денатурация ДНК), чтобы обеспечить первичный доступ антитела к BrdU. В этой работе мы провели эти специфические процедуры с использованием инкубации HCI. С другой стороны, процесс блокировки неспецифических эпитопов позволил более точно идентифицировать клеточный сигнал.
Хорошая мембранная пермеабилизация позволяет антителам правильно проникать в область интереса. Добавление пермеабилизатора, такого как Triton X-100, к решениям PBS++ и PBS+ улучшает пермеабилизацию мембраны. В этом протоколе могут использоваться как реагенты PBS, так и Tris-буферный физиологический раствор (TBS). С точки зрения бюджета, TBS может быть относительно дешевле, чем PBS. Тем не менее, PBS может влиять на антифосфатные антитела и ингибировать щелочно-фосфатазно-конъюгированные антитела, поэтому избегайте использования PBS, если мишень посттрансляционно модифицирована фосфорилированием (то есть фосфорилирована). Мы использовали PBS для этой работы, и мы обнаружили, что шаги промывания тканей дают более конкретный сигнал. Мы также рекомендуем исследователям выполнять по крайней мере три цикла стирки, используя либо TBS, либо PBS. Растворы должны быть свежеприготовленными. Извлечение антигенов (AR) - это метод, предназначенный для уменьшения потери антигенности, вызванной фиксацией, которая изменяет структуру третичных и четвертичных антигенов. Это снижение делает антигены неопределяемыми антителами28,29. Термоиндуцированный поиск эпитопов (HIER), используемый в этом протоколе, пытался обратить вспять химические реакции между формальдегидом и белками путем высокой температуры или сильного щелочного гидролиза (с другими буферными растворами в виде ЭДТА рН 8,5 или Tris рН 9,5). Важно тестировать новые антитела с различными протоколами AR, чтобы сравнить результаты и выбрать лучший для протокола. Этот последний шаг может быть факультативным в обычном протоколе; тем не менее, мы обработали ткани протоколом извлечения антигена, чтобы обеспечить лучшие результаты для этого протокола.
Крайне важно выбрать правильный конечный контрастный цвет и технику контрокрашивания с учетом основного цвета окрашивания и метода, используемого для того, чтобы сделать видимой не окрашивающую структуру и избежать маскировки основного цвета окрашивания от иммунной реакции. Для флуоресцентной микроскопии DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) является очень популярным ядерным и хромосомным контркрупом, который испускает синюю флуоресценцию (поглощение: 360 нм, эмиссия: 460 нм) при связывании с AT-областями ДНК. DaPI-содержащий монтажный носитель доступен и прост в использовании; это обеспечивает отличное удержание сигнала для получения изображения. Для пероксидной реакции IHC был доступен в различных вариантах, таких как крезил-фиолетовый, гематоксилин, нейтральное красное или метил-зеленое окрашивание. Для нескольких методов иммуноокрашения крайне важно выбрать совместимое антитело с техникой фиксации, используемой для предотвращения перекрестной реактивности30. Когда проблемы и осложнения с одиночным окрашиванием решены, введите другое окрашивание цветом по мере необходимости. Крайне важно контролировать неспецифическое связывание между вторичными антителами. Это может быть сделано путем насыщения первичных антител перед использованием вторичного антитела, продуцируемого в том же виде хозяев первичных антител. Например, при использовании антимышечного препарата, продуцированного у кролика, и анти-кролика, продуцированного в козьих вторичных антителах, анти-кролик, продуцированный в козьем антителе, должен быть использован до антимышечного анти-мыши, продуцированного в антителе кролика. Когда последовательный метод преобладает полностью, то может быть инициирован одновременный процесс иммуноокрашения. В этом методе важно правильно выбирать вторичные антитела. В идеале, все эти антитела должны исходить от одного и того же животного-хозяина, чтобы избежать перекрестной реактивности. Мы рекомендуем провести положительный контроль, чтобы подтвердить, что метод окрашивания точно работает в постнатальной ткани гиппокампа (обильный нейрогенез в этом возрасте). Если положительная контрольная ткань показывает проблемы с окрашиванием, просмотрите и просмотрите процедуру, внесите исправления и корректировки и повторяйте до тех пор, пока не будет произведено хорошее окрашивание. Затем запустите отрицательный контроль, чтобы проверить, что антитело работает правильно, опуская или заменяя конкретное первичное антитело нормальной сывороткой (тот же вид, что и первичное антитело). Как упоминалось во введении, деконволюция изображений является мощным инструментом и обеспечивает альтернативу, когда конфокальный микроскоп недоступен. Он может применять деконволюцию изображения ко всем изображениям, полученным с использованием пропускаемого света яркого поля, широкоугольной флуоресценции и конфокальной флуоресцентной микроскопии. Конечной целью деконволюции изображения является реконструкция исходного сигнала о том, что система сбора ухудшается10.
Таким образом, идентификация вновь генерируемых клеток, визуализируемых иммунодетекцией аналога тимидина BrdU, является сложной, но мощной методикой. Эта работа является попыткой помочь ученым, особенно в области нейрогенеза взрослого гиппокампа, более точно количественно оценить новые клетки. Мы надеемся, что эти усилия были полезны для научного сообщества и облегчают тонкую настройку исследования пролиферации клеток с помощью метода иммуногистохимии.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить г-на Мигеля Бургоса и Густаво Лаго за оказание технической помощи. Мы также хотим поблагодарить д-ра Клоринду Ариас, д-ра Карлу Эрнандес и д-ра Оскара Галисию за их любезную поддержку в предоставлении реагентов и материалов. Мы также благодарим Отдел исследований и посграда Ибероамериканского университета Сьюдад-де-Мехико за предоставление финансовых средств для выполнения этой работы и за покрытие расходов на производство видеоматериалов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT PREPARATION AND SETUP | |||
| Donor Horse Serum | BioWest | S0900 | Blocking and incubation solutions in PBS |
| Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | toxic, flammable |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | 746436-500G | |
| Potassium Phosphate, monobasic | J.T Bker | 3246-01 | |
| Sacarose | J.T Baker | 4072-01 | |
| Sodium Chloride | Meyer | 2365-500G | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Corrisive, to calibrate pH |
| Sodium Phophate Dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-5KG | |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 23–27G hypodermic needle | BD PrecisionGlide | ||
| Saline solution | PiSA | 30130032 | |
| Syringes 1 mL | NIPRO | ||
| TISSUE PREPARATION | |||
| 15-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 50-ml polypropylene conical tube | Thermo Scientific | 339652 | |
| Dissecting tools | |||
| Guillotine | Stoelting | ||
| Microtome Cryostat | MICROM | HM525 | |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | 7553-70 | |
| Shaker | IKA | ROKCER 3D Digital | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | 1%, Light sensitive |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | Vector Laboratories | SK-4100 | carcinogenic, light sensitive |
| Hydochloric Acid | J.T.Baker | 9535-05 | Corrosive, to calibrate pH |
| Hydrogen Peroxide, 50% | Meyer | 5375-1L | Toxic, oxidative |
| Permount Mounting Medium | Fisher Chemical | SP15-500 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Light sensitive |
| VECTASTAIN® Elite® ABC Kit Peroxidase (HRP) | Vector Laboratories | PK-6100 | enzymatic, avidin/biotin based amplification system |
| Primary antibodies | |||
| Anti-GFAP antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | HPA056030 | 1:500 |
| Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse | Sigma-Aldrich | B2531 | 1:250 |
| Secondary antibodies | |||
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-065-151 | 1:250 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP | Invitrogen | G-21040 | 1:1000 |
| Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC | Sigma-Aldrich | T5393 | 1:250 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC | Invitrogen | F-2765 | 1:250 |
| Streptavidin, Cy3 | Vector Laboratories | SA-1300 | 1:250 |
| IMAGING AND ANALYSIS | |||
| Computer | Dell Computer Company | T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB | For controlling and monitoring protocols’ processes |
| CCD-camera | Olympus | UC50 | |
| CellSens Standard software | Olympus | cellSens Standard Edition | Acquisition Software |
| Epifluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| High-pressure 130 W mercury arc lamp | Olympus | U-HGLGPS | |
| low autofluorescence immersion oil | Olympus | MOIL-30 Type F | |
| Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24 60 mm) | |||
| Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76 26 mm) | |||
| U-FBW filter cube | Olympus | U-FBW | excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm |
| U-FGW filter cube | Olympus | U-FGW | excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm |
| U-FUW filter cube | Olympus | U-FUW | excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm |
References
- Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals. Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).
- Miller, M. W., Nowakowski, R. S. Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system. Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).
- Eriksson, P. S., et al.
- Filippov, V., et al. Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes. Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).
- Matiašová, A., et al. Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice. Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).
- Von Bohlen Und Halbach, O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus. Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).
- Sage, D., et al. DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy. Methods. 115, 28-41 (2017).
- Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue. Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J.
- Giannini, A., Giannini, J. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual. , Available from: https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p (2016).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Revilla, V., Jones, A.
- Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies). Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).
- Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density. Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).
- Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodríguez-Serrano, L. M., Buenrostro-Jáuregui, M. Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update. Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).
- Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).
- Tischler, A. S. Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).
- Taupin, P. Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments. Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).
- Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).
- Magavi, S. S., MacKlis, J. D. Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo. Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. , 391-399 (2003).
- Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).
- Ramos-Vara, J. A.
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
